paskaita 4 vugmf baltymu skirstymo sistemos pdf.ppt 4_baltymu skirstymas.pdf · globali proteomika...
TRANSCRIPT
![Page 1: Paskaita 4 VUGMF Baltymu skirstymo sistemos PDF.ppt 4_Baltymu skirstymas.pdf · Globali proteomika Identifikuoti visus esamus baltymusIdentifikuoti visus esamus baltymus Tikslinė](https://reader034.vdocuments.mx/reader034/viewer/2022050722/5a6fab037f8b9a98538b4add/html5/thumbnails/1.jpg)
Baltymų skirstymasy ų y
Chromatografijag jBaltymų elektroforezinis skirstymas
Kapiliarinė elektroforezė SDS/PAGE IzoelektrofokusavimasDvimatė elektroforezė2-DIGE sistema
![Page 2: Paskaita 4 VUGMF Baltymu skirstymo sistemos PDF.ppt 4_Baltymu skirstymas.pdf · Globali proteomika Identifikuoti visus esamus baltymusIdentifikuoti visus esamus baltymus Tikslinė](https://reader034.vdocuments.mx/reader034/viewer/2022050722/5a6fab037f8b9a98538b4add/html5/thumbnails/2.jpg)
Kodėl analizuojamas Kodėl analizuojamas proteomasproteomas??
• DNR seka pilnai neatspindi biologinių funkcijų• Vienas genas gali koduoti daugiau negu vieną baltymą
– Genų persitvarkymai– RNR sukirpimas (splicing)– Baltymų modifikacijosy ų j
• Skirtingai nei genomas proteomas nėra fiksuotasSkirtingai nei genomas, proteomas nėra fiksuotas – S kirtumai tarp skirtingų ląstelės tipų– Audinių skirtumaiAudinių skirtumai– Vystymosi stadijų skirtumai– Aplinkos poveikiai– Aplinkos poveikiai
![Page 3: Paskaita 4 VUGMF Baltymu skirstymo sistemos PDF.ppt 4_Baltymu skirstymas.pdf · Globali proteomika Identifikuoti visus esamus baltymusIdentifikuoti visus esamus baltymus Tikslinė](https://reader034.vdocuments.mx/reader034/viewer/2022050722/5a6fab037f8b9a98538b4add/html5/thumbnails/3.jpg)
Globali proteomikaGlobali proteomika
Identifikuoti visus esamus baltymusIdentifikuoti visus esamus baltymus
Tikslinė proteomika
Identifikuojama ir tiriama baltymų tam tikra grupė
![Page 4: Paskaita 4 VUGMF Baltymu skirstymo sistemos PDF.ppt 4_Baltymu skirstymas.pdf · Globali proteomika Identifikuoti visus esamus baltymusIdentifikuoti visus esamus baltymus Tikslinė](https://reader034.vdocuments.mx/reader034/viewer/2022050722/5a6fab037f8b9a98538b4add/html5/thumbnails/4.jpg)
Tikslinė proteomikaTikslinė proteomika
kiekybiniai pasikeitimai : kiekis
k k bi i i ik iti i t li i ė• kokybiniai pasikeitimai : potransliacinės modifikacijos (PTMs)
• subląstelinės frakcijos : branduoliai, citozolis, membranos, mitochondrijos, citoskeletas.
• funkciniai įvertinimai : baltymų sąveikos
![Page 5: Paskaita 4 VUGMF Baltymu skirstymo sistemos PDF.ppt 4_Baltymu skirstymas.pdf · Globali proteomika Identifikuoti visus esamus baltymusIdentifikuoti visus esamus baltymus Tikslinė](https://reader034.vdocuments.mx/reader034/viewer/2022050722/5a6fab037f8b9a98538b4add/html5/thumbnails/5.jpg)
ChromatografijaChromatografijaChromatografijaChromatografija
Chromatography – “color” ir “to write”
Pirmą kartą aprašyta Tswett 1906 metais; metodas augalų p y gpigmento skyrimui per kolonėlę užpildytą CaCO3; pridėjus augalų ekstrakto buvo gautos spalvotos juostelės plaunant k l ėl i i i i ikli ikolonėlę organiniais tirpikliais
Chromatografijos apibrėžimas:
– metodologija įgalinanti atskirti komponentus pagal skirtingą judėjimą dėl skirtingo poliariškumog j j g
– komponentai yra atskiriami dėl skirtingo afiniškumo
![Page 6: Paskaita 4 VUGMF Baltymu skirstymo sistemos PDF.ppt 4_Baltymu skirstymas.pdf · Globali proteomika Identifikuoti visus esamus baltymusIdentifikuoti visus esamus baltymus Tikslinė](https://reader034.vdocuments.mx/reader034/viewer/2022050722/5a6fab037f8b9a98538b4add/html5/thumbnails/6.jpg)
Chromatografijoje naudojamų matricų tipaiChromatografijoje naudojamų matricų tipaiChromatografijoje naudojamų matricų tipaiChromatografijoje naudojamų matricų tipai
Alberts et al., Molecular Biology of the Cell, 2002
![Page 7: Paskaita 4 VUGMF Baltymu skirstymo sistemos PDF.ppt 4_Baltymu skirstymas.pdf · Globali proteomika Identifikuoti visus esamus baltymusIdentifikuoti visus esamus baltymus Tikslinė](https://reader034.vdocuments.mx/reader034/viewer/2022050722/5a6fab037f8b9a98538b4add/html5/thumbnails/7.jpg)
Kapiliarinė Elektroforezė (Kapiliarinė Elektroforezė (Capillary electrophoresisCapillary electrophoresis, , CECE))• Išvystyta 1960 kapiliarinė elektroforezė (CE) naudojama keletoje
sričių. • CE rutiniškai naudojama daugelyje ligoninių ir klinikų, ypač tiriant j g yj g ų ų, yp
serumo baltymus ir ligų žymenis.• Skirstymas priklauso nuo krūvio/dydžio santykio.• Puikiai skirsto makromolekules su krūviu (baltymai, nukleino
rūgštys)rūgštys)• Naudojama DNR tyrimuose.
Kapiliarinės elektroforezės privalumai:- didelis efektyvumas – šimtai
komponentų gali būti išskirti tuo pačiu metu,automatizuotas- automatizuotas,
- reikia mažai pavyzdžio,- gali būti naudojamas kiekybiniam
įvertinimui.
![Page 8: Paskaita 4 VUGMF Baltymu skirstymo sistemos PDF.ppt 4_Baltymu skirstymas.pdf · Globali proteomika Identifikuoti visus esamus baltymusIdentifikuoti visus esamus baltymus Tikslinė](https://reader034.vdocuments.mx/reader034/viewer/2022050722/5a6fab037f8b9a98538b4add/html5/thumbnails/8.jpg)
Kapiliarinė ElektroforezėKapiliarinė ElektroforezėElektroforezės atskyrimo metodas paremtas dalelių su
krūviu judėjimu elektros lauke. Elektroferograma panaši į chromatogramą. g p į g ą
Metodas vykdomas:Metodas vykdomas:- buferiu užpildytame kapiliare 10 - 100 µm
diametro ir 40 -100 cm ilgio,- kapiliaras patalpinamas tarp dviejų buferio
rezervuarų kuriuose yra elektrodairezervuarų, kuriuose yra elektrodai,- pavyzdys užnešamas i vieną kapiliaro pusę,- tarp dviejų elektrodų 10 -30 kV įtampa,- molekulės registruojamos detektoriumi, kuris
paprastai būna priešingoje kapiliaro pusėje nei užnešamaspaprastai būna priešingoje kapiliaro pusėje nei užnešamas pavyzdys.
![Page 9: Paskaita 4 VUGMF Baltymu skirstymo sistemos PDF.ppt 4_Baltymu skirstymas.pdf · Globali proteomika Identifikuoti visus esamus baltymusIdentifikuoti visus esamus baltymus Tikslinė](https://reader034.vdocuments.mx/reader034/viewer/2022050722/5a6fab037f8b9a98538b4add/html5/thumbnails/9.jpg)
Kapiliarinės elektroforezės tipaiKapiliarinės elektroforezės tipaiKapiliarinės elektroforezės tipaiKapiliarinės elektroforezės tipai
K ili i ė l kt f ėK ili i ė l kt f ė•• Kapiliarinė zonų elektroforezėKapiliarinė zonų elektroforezė•• Kapiliarinis Kapiliarinis izoelektrofokusavimasizoelektrofokusavimas•• Kapiliarinė Kapiliarinė SDS elektroforezėSDS elektroforezėpp•• KapiliarinKapiliarinė ė izotakoforezėizotakoforezė•• Ir kt.Ir kt.
![Page 10: Paskaita 4 VUGMF Baltymu skirstymo sistemos PDF.ppt 4_Baltymu skirstymas.pdf · Globali proteomika Identifikuoti visus esamus baltymusIdentifikuoti visus esamus baltymus Tikslinė](https://reader034.vdocuments.mx/reader034/viewer/2022050722/5a6fab037f8b9a98538b4add/html5/thumbnails/10.jpg)
KapiliarinKapiliarinės elektroforezės trūkumaiės elektroforezės trūkumaiKapiliarinKapiliarinės elektroforezės trūkumaiės elektroforezės trūkumai
• Kai kurias medžiagas sunku paskirstyti KE.Kai kurias medžiagas sunku paskirstyti KE.• Skirstymo pagerinimui yra modifikuojama buferio sudėtis arba įtampa.
![Page 11: Paskaita 4 VUGMF Baltymu skirstymo sistemos PDF.ppt 4_Baltymu skirstymas.pdf · Globali proteomika Identifikuoti visus esamus baltymusIdentifikuoti visus esamus baltymus Tikslinė](https://reader034.vdocuments.mx/reader034/viewer/2022050722/5a6fab037f8b9a98538b4add/html5/thumbnails/11.jpg)
2D2D geliųgelių elektroforezė (2DE IEF/PAGE)elektroforezė (2DE IEF/PAGE)2D 2D gelių gelių elektroforezė (2DE, IEF/PAGE)elektroforezė (2DE, IEF/PAGE)
•Izoelektro fokusavimas (IEF)B l j d l i l k škBaltymas juda pagal savo izoelektro tašką,Baltymas sustoja ties pH, kur baltymo krūvis yra
neutralusneutralus.
•SDS-PAGEbaltymas juda poliakrilamido matriksu pagal
l k li į įmolekulinį svorį.
![Page 12: Paskaita 4 VUGMF Baltymu skirstymo sistemos PDF.ppt 4_Baltymu skirstymas.pdf · Globali proteomika Identifikuoti visus esamus baltymusIdentifikuoti visus esamus baltymus Tikslinė](https://reader034.vdocuments.mx/reader034/viewer/2022050722/5a6fab037f8b9a98538b4add/html5/thumbnails/12.jpg)
Mėginio užnešimas ir pasiskirstymasMėginio užnešimas ir pasiskirstymas(I bili t H G di t IPG)(Imobilizuotas pH Gradientas - IPG)
3 10
“S ” t li
“Išbrinkintas”Rehidratacija
“Sausas” strypelis (Drystrip)
Išbrinkintas strypelis(Drystrip)
+ - 3500 V3 10
n n- +
20 h3 10
Pasiskirstymas pagal baltymo Pi
![Page 13: Paskaita 4 VUGMF Baltymu skirstymo sistemos PDF.ppt 4_Baltymu skirstymas.pdf · Globali proteomika Identifikuoti visus esamus baltymusIdentifikuoti visus esamus baltymus Tikslinė](https://reader034.vdocuments.mx/reader034/viewer/2022050722/5a6fab037f8b9a98538b4add/html5/thumbnails/13.jpg)
kDa2DE2DE
kDa- 200
96
5 h66
50 MW
40
30
1616
10+
![Page 14: Paskaita 4 VUGMF Baltymu skirstymo sistemos PDF.ppt 4_Baltymu skirstymas.pdf · Globali proteomika Identifikuoti visus esamus baltymusIdentifikuoti visus esamus baltymus Tikslinė](https://reader034.vdocuments.mx/reader034/viewer/2022050722/5a6fab037f8b9a98538b4add/html5/thumbnails/14.jpg)
2DE2DE2DE2DE
1 k ti pI1 kryptisPasiskirstymas pagal krūvį(izoelektrinis fokusavimas) pH 3 pH 10
pI
2 k ti2 kryptisPasiskirstymas pagal molekulinį svorį
(SDS-PAGE)kDa
![Page 15: Paskaita 4 VUGMF Baltymu skirstymo sistemos PDF.ppt 4_Baltymu skirstymas.pdf · Globali proteomika Identifikuoti visus esamus baltymusIdentifikuoti visus esamus baltymus Tikslinė](https://reader034.vdocuments.mx/reader034/viewer/2022050722/5a6fab037f8b9a98538b4add/html5/thumbnails/15.jpg)
Baltymų analizė: izoelektrinisy ųfokusavimas (skirstymas pagal krūvį)
Izoelektrinio fokusavimo principai
•Izoelektrinis fokusavimas vyksta pH gradiente. H di f j i li f i ė l k lė ( f li i) i či b f i•pH gradientą formuoja specialios amfoterinės molekulės (amfolitai), turinčios buferio
savybes, esančios laidžios ir tirpios jų pI taške. •pH gradientas yra sukuriamas elektros lauko. Prieš elektros lauko sukūrimą gelis turi
i d H t S kū l kt l k i i k ū į t i t f lit i j d li kvienodą pH-vertę. Sukūrus elektros lauką, neigiamą krūvį turintys amfolitai juda link anodo, teigiamą krūvį turintys – link katodo, o jų greitis priklauso nuo bendro krūvio.•Katodo pusėje yra aukštesnis pH nei anodo pusėje.•Amfolitai “išsirikiuoja” tarp katodo ir anodo priklausomai nuo jų pI ir tokiu būdu•Amfolitai išsirikiuoja tarp katodo ir anodo priklausomai nuo jų pI ir tokiu būdu sąlygoja savo aplinkoje atitinkamą pH. Suformuojamas pH gradientas priklausomai nuo naudojamų amfolitų mišinio. •Kadangi amino rūgštys turi amfoterinių savybių ir turi teigiamą krūvį pH kuris yraKadangi amino rūgštys turi amfoterinių savybių ir turi teigiamą krūvį pH, kuris yra žemiau jų pI ir neigiamą – aukščiau jų pI reikšmės, todėl baltymai elektros lauke juda link jų pI. Daugelio baltymų pI yra tarp 5 ir 8,5.
![Page 16: Paskaita 4 VUGMF Baltymu skirstymo sistemos PDF.ppt 4_Baltymu skirstymas.pdf · Globali proteomika Identifikuoti visus esamus baltymusIdentifikuoti visus esamus baltymus Tikslinė](https://reader034.vdocuments.mx/reader034/viewer/2022050722/5a6fab037f8b9a98538b4add/html5/thumbnails/16.jpg)
AmfolitaiAmfolitai
• Amfolitai – molekulės, turinčios ir rūgštines, ir bazines grupes, todėl yra amfoterinės.
• Iš graikų kalbos ampho- (αµφί-) reiškia “abu". Dėl šių savybių jos yra zviterjonai tam tikroje pH reikšmėje. y ų j y j j p jpH reikšmė, kurioje bendras krūvis lygus “0” yra molekulės izoelektrinis taškas.
![Page 17: Paskaita 4 VUGMF Baltymu skirstymo sistemos PDF.ppt 4_Baltymu skirstymas.pdf · Globali proteomika Identifikuoti visus esamus baltymusIdentifikuoti visus esamus baltymus Tikslinė](https://reader034.vdocuments.mx/reader034/viewer/2022050722/5a6fab037f8b9a98538b4add/html5/thumbnails/17.jpg)
Kas yra IEF?IEF vyksta pH gradiente. Baltymai yra amfoterinės molekulės, turinčios rūgštines ir bazines grupes
Kas yra IEF?
(šoninės grandinės).Bazinėje aplinkoje rūgštinės grupės įgyja neigiamą krūvį.Rūgštinėje aplinkoje bazinės grupės įgyja teigiamą krūvįRūgštinėje aplinkoje bazinės grupės įgyja teigiamą krūvį.Baltymo krūvis yra visų amino rūgščių šoninių grandinių krūvių suma.Izoelektrinis taškas (pI) – tai pH, kuriame baltymo krūvis lygus nuliui.
![Page 18: Paskaita 4 VUGMF Baltymu skirstymo sistemos PDF.ppt 4_Baltymu skirstymas.pdf · Globali proteomika Identifikuoti visus esamus baltymusIdentifikuoti visus esamus baltymus Tikslinė](https://reader034.vdocuments.mx/reader034/viewer/2022050722/5a6fab037f8b9a98538b4add/html5/thumbnails/18.jpg)
pH gradiento sukūrimaspH gradiento sukūrimas
A. Klasikinė IEF metodikaf li i k i diAmfolitai sukuria pH gradientą.
B. Moderni IEF metodikaImobilizuotas pH gradientas.
![Page 19: Paskaita 4 VUGMF Baltymu skirstymo sistemos PDF.ppt 4_Baltymu skirstymas.pdf · Globali proteomika Identifikuoti visus esamus baltymusIdentifikuoti visus esamus baltymus Tikslinė](https://reader034.vdocuments.mx/reader034/viewer/2022050722/5a6fab037f8b9a98538b4add/html5/thumbnails/19.jpg)
A. Klasikinė IEF metodikaAmfolitai sukuria pH gradientą.
Pirmą kartą pasiūlyta Svensson (1961).Praktikoje tai realizavo Vesterberg (1969). Dirbtinai sukurtas pH gradientas: alifatinių oligoamino-oligokarboksilop g ų g grūgščių izomerų sintezė.
CH2 (CH2)xN (CH2)xN (CH2)xCH2 (CH2)xN (CH2)xN (CH2)x
NR
(CH2)x (CH2)x
R H (CH ) COOH X 2 3NR
(CH2)x (CH2)x
R H (CH ) COOH X 2 3COOHNR2 R = H or (CH2)x-COOH, X=2 or 3COOHNR2 R = H ar (CH2)x-COOH, X=2 ar 3
![Page 20: Paskaita 4 VUGMF Baltymu skirstymo sistemos PDF.ppt 4_Baltymu skirstymas.pdf · Globali proteomika Identifikuoti visus esamus baltymusIdentifikuoti visus esamus baltymus Tikslinė](https://reader034.vdocuments.mx/reader034/viewer/2022050722/5a6fab037f8b9a98538b4add/html5/thumbnails/20.jpg)
Sintetiniai amfolitai v.s. natūralūs amfolitaiSintetiniai amfolitai v.s. natūralūs amfolitai
Sintetiniai amfolitai:
Geros buferinės savybės ir geras tirpumas pI taške.Tinkamas elektros laidumas pI taške.Biologinių efektų nebuvimas.Mažas molekulinis svoris.
Natūraliai esantys amfolitai:Amino rūgštys ir peptidai.Neturi savybių, išvardintų aukščiau.Negali būti naudojami IEF.
![Page 21: Paskaita 4 VUGMF Baltymu skirstymo sistemos PDF.ppt 4_Baltymu skirstymas.pdf · Globali proteomika Identifikuoti visus esamus baltymusIdentifikuoti visus esamus baltymus Tikslinė](https://reader034.vdocuments.mx/reader034/viewer/2022050722/5a6fab037f8b9a98538b4add/html5/thumbnails/21.jpg)
Amfolitų krūvis
Neigiamą (-) krūvį turintys amfolitaiJuda link anodo (+).Turi grupes -COO-
T i i ( ) k ū į t i t f lit iTeigiamą (+) krūvį turintys amfolitaiJuda link katodo(-).Turi grupes NH3
+Turi grupes NH3
![Page 22: Paskaita 4 VUGMF Baltymu skirstymo sistemos PDF.ppt 4_Baltymu skirstymas.pdf · Globali proteomika Identifikuoti visus esamus baltymusIdentifikuoti visus esamus baltymus Tikslinė](https://reader034.vdocuments.mx/reader034/viewer/2022050722/5a6fab037f8b9a98538b4add/html5/thumbnails/22.jpg)
Problemos vykdant tradicinę IEF
1. Ilgas IEF vykdymo laikas. Baltymai šalia jų pI yra mažiau judrūs. Denatūruoti polipeptidai gelyje juda lėčiau nei natyvūs baltymai.
2. Gradiento “šleifas”.pH gradientas tampa nestabilus. p g pBaziniai baltymai išeina iš gelio.
3. Baltymai juda kaip papildomai pridėti amfolitai. Baltymai pakeičia pH gradientą.
![Page 23: Paskaita 4 VUGMF Baltymu skirstymo sistemos PDF.ppt 4_Baltymu skirstymas.pdf · Globali proteomika Identifikuoti visus esamus baltymusIdentifikuoti visus esamus baltymus Tikslinė](https://reader034.vdocuments.mx/reader034/viewer/2022050722/5a6fab037f8b9a98538b4add/html5/thumbnails/23.jpg)
B. Moderni IEF metodikaImobilizuotas pH gradientas, IPG
Pirmas pasiūlė Righetti, (1990). Imobilizuotas pH gradientas sukurtas akrilamido junginių (Immobilines) pagalba.(Immobilines) pagalba.Imobilinai yra silpnos rūgštys ar bazės.Bendra struktūra.
CH2 CCN N
H
H
O
CH2 CCN N
HO CH2 CCN N HCH2 CCN N R 2 N
R i k b k il ė
HO
2 N
HO
Ak il idR = amino ar karboksilo grupė Akrilamidas
![Page 24: Paskaita 4 VUGMF Baltymu skirstymo sistemos PDF.ppt 4_Baltymu skirstymas.pdf · Globali proteomika Identifikuoti visus esamus baltymusIdentifikuoti visus esamus baltymus Tikslinė](https://reader034.vdocuments.mx/reader034/viewer/2022050722/5a6fab037f8b9a98538b4add/html5/thumbnails/24.jpg)
Komerciniai imobilizuoto pH gradientogeliai (IPG strips)
Pasiūlyti Gorg. A.
Ref: Gorg. A (1994), Westermeier (2001)( )
Geliai gali būti saugomi -20 to -80 C.
![Page 25: Paskaita 4 VUGMF Baltymu skirstymo sistemos PDF.ppt 4_Baltymu skirstymas.pdf · Globali proteomika Identifikuoti visus esamus baltymusIdentifikuoti visus esamus baltymus Tikslinė](https://reader034.vdocuments.mx/reader034/viewer/2022050722/5a6fab037f8b9a98538b4add/html5/thumbnails/25.jpg)
Amfolitų pasirinkimo kriterijaiAmfolitų pasirinkimo kriterijai
l k ži dži ki i• Platus pH spektras nežinomų pavyzdžių skirstymui.• Pasirinktų baltymų skirstymas siauruose pH gradientuose.• Koncentracija 2-8%.j
![Page 26: Paskaita 4 VUGMF Baltymu skirstymo sistemos PDF.ppt 4_Baltymu skirstymas.pdf · Globali proteomika Identifikuoti visus esamus baltymusIdentifikuoti visus esamus baltymus Tikslinė](https://reader034.vdocuments.mx/reader034/viewer/2022050722/5a6fab037f8b9a98538b4add/html5/thumbnails/26.jpg)
Siauro pH gradiento amfolitų pasirinkimo kriterijai
R li ij i i i• Rezoliucijos pagerinimui• pH gradiento stabilizavimui aukšto ir žemo pH srityse• Siauro pH srityse amfolitai gali būti naudojami kartu su plataus pH
kt f lit ispektro amfolitais• Tačiau naudojant siauro pH spektro amfolitus pasiekiamas geresnis pI
kalibracijos tikslumasSi H di t t j d j i ti t l kt lit i k i i l t• Siauro pH gradiento atveju naudojami tie patys elektrolitai kaip ir plataus pH gradiento atveju
![Page 27: Paskaita 4 VUGMF Baltymu skirstymo sistemos PDF.ppt 4_Baltymu skirstymas.pdf · Globali proteomika Identifikuoti visus esamus baltymusIdentifikuoti visus esamus baltymus Tikslinė](https://reader034.vdocuments.mx/reader034/viewer/2022050722/5a6fab037f8b9a98538b4add/html5/thumbnails/27.jpg)
BBaltymųaltymų vizualizavimas 2DE geliuosevizualizavimas 2DE geliuosey ųy ų gg
Dažymas Matomas baltymų kiekisKumasi >75 ngKumasi >75 ngSidabras >5 ngFluorescentiniai dažai >5 ngg
K i Sidabras Fluorescentiniai dažaiKumasi Sidabras Fluorescentiniai dažai
![Page 28: Paskaita 4 VUGMF Baltymu skirstymo sistemos PDF.ppt 4_Baltymu skirstymas.pdf · Globali proteomika Identifikuoti visus esamus baltymusIdentifikuoti visus esamus baltymus Tikslinė](https://reader034.vdocuments.mx/reader034/viewer/2022050722/5a6fab037f8b9a98538b4add/html5/thumbnails/28.jpg)
2DE gelių analizė ir baltymo dėmių 2DE gelių analizė ir baltymo dėmių g ų y ųg ų y ųįvertinimasįvertinimas
Vaizdo analizės programinė įranga, pvz. Bio-Rad PDQuestį g , p Q
-Vaizdų palyginimaiVaizdų palyginimai,
-Baltymo dėmių įvertinimas,
Baltymo dėmių-Baltymo dėmių charakterizavimas.
![Page 29: Paskaita 4 VUGMF Baltymu skirstymo sistemos PDF.ppt 4_Baltymu skirstymas.pdf · Globali proteomika Identifikuoti visus esamus baltymusIdentifikuoti visus esamus baltymus Tikslinė](https://reader034.vdocuments.mx/reader034/viewer/2022050722/5a6fab037f8b9a98538b4add/html5/thumbnails/29.jpg)
Pasitaikančios klaidos vykdant 2DEPasitaikančios klaidos vykdant 2DEPasitaikančios klaidos vykdant 2DEPasitaikančios klaidos vykdant 2DE
Nesusifokusavęs mėginys
N š hid t i iNešvarus rehidratacinis tirpalas
Pavyzdžio agregacija
Veritkalios juostos dėl polimerizacijos klaidų ir kt.
![Page 30: Paskaita 4 VUGMF Baltymu skirstymo sistemos PDF.ppt 4_Baltymu skirstymas.pdf · Globali proteomika Identifikuoti visus esamus baltymusIdentifikuoti visus esamus baltymus Tikslinė](https://reader034.vdocuments.mx/reader034/viewer/2022050722/5a6fab037f8b9a98538b4add/html5/thumbnails/30.jpg)
Kritiniai veiksniai 2DEKritiniai veiksniai 2DEKritiniai veiksniai 2DEKritiniai veiksniai 2DE
Reproduktyvumas: daugiapakopė procedūra – atvira įvairoveip y g p p p
Patikimumas: ypač kokybiniam įvertinimui
Įtikinamumas: naudoja kitus, papildomus metodus
Pavyzdžio paruošimas:Kruopštus, pastovus metodas sąlygoja nepilną baltymo
tirpumą, disagregaciją, denaūraciją ir redukavimą
![Page 31: Paskaita 4 VUGMF Baltymu skirstymo sistemos PDF.ppt 4_Baltymu skirstymas.pdf · Globali proteomika Identifikuoti visus esamus baltymusIdentifikuoti visus esamus baltymus Tikslinė](https://reader034.vdocuments.mx/reader034/viewer/2022050722/5a6fab037f8b9a98538b4add/html5/thumbnails/31.jpg)
IEF IEF –– ko vengtiko vengtigg
NaCl < 10 mM SDS < 0.25%
Tris < 50 mM fosfatųTris < 50 mM fosfatų
Nukleino rūgščių lipidų
fenolų netirpių medžiagų
šildymošildymo
![Page 32: Paskaita 4 VUGMF Baltymu skirstymo sistemos PDF.ppt 4_Baltymu skirstymas.pdf · Globali proteomika Identifikuoti visus esamus baltymusIdentifikuoti visus esamus baltymus Tikslinė](https://reader034.vdocuments.mx/reader034/viewer/2022050722/5a6fab037f8b9a98538b4add/html5/thumbnails/32.jpg)
ProteomiProteomikoskos eigaeiga
Baltymo išskyrimasBaltymo išskyrimasy yy y
Analizė ir pasirinkimasAnalizė ir pasirinkimas
Baltymo paruošimas proteominei analizei Baltymo paruošimas proteominei analizei (tripsinizacija)(tripsinizacija)p jp j
MasMasių spektrometrijaių spektrometrija
Skaitiniai metodaiSkaitiniai metodai
![Page 33: Paskaita 4 VUGMF Baltymu skirstymo sistemos PDF.ppt 4_Baltymu skirstymas.pdf · Globali proteomika Identifikuoti visus esamus baltymusIdentifikuoti visus esamus baltymus Tikslinė](https://reader034.vdocuments.mx/reader034/viewer/2022050722/5a6fab037f8b9a98538b4add/html5/thumbnails/33.jpg)