Panorama actual de la resistencia a los antibiótico s en gramnegativos y grampositivos Ferran Navarro, Servei de Microbiología, Hospital de la Santa Creu i Sant Pau, Universidad Autónoma, Barcelona El Dr. Ferran Navarro acotó su actuación, por razón de

tiempo, a la prevalencia de resistencia de algunas bacterias,

principalmente a las enterobacterias productoras de

carbapenemasas, al estudio de OXA-48 en hospitales

comarcales de Cataluña y a la importancia de los

bacteriófagos como vehículos de resistencia.

Mapas de resistencia a cefalosporinas de 3ª generac ión en Europa según el eCDC http://ecdc.europa.eu/en/healthtopics/antimicrobial_resistance/database/Pages/map_reports.aspx Resistencia de Escherichia coli 2013

Resistencia de Klebsiella pneumoniae 2013

Escherichia coli productor de β-lactamasas de espectro extendido en el mundo según el Center for Disease Dynamics & Policy 2015. CDDEP

http://resistancemap.cddep.org/

Resistencia a los carbapenémicos en Europa 2013 http://ecdc.europa.eu/en/healthtopics/antimicrobial_resistance/database/Pages/map_reports.aspx

Escherichia coli

Klebsiella pneumoniae

Klebsiella pneumoniae resistente a los carbapenémicos en el mundo según el Center for Disease Dynamics & Policy 2015. CDDEP http://resistancemap.cddep.org

Actividad de las nuevas β-lactamasas y diana antibiótica

Carbapenemasas, clases y acción

Sobre los β-lactámicos

Las cepas productoras de KPC, OXA y metalo-β-lamasas son frecuentemente

miltirresistentes

Limitan opciones terapéuticas

LLiimmiittaann ooppcciioonneess

Difunden Incrementan Diversifican

KKPPCC

OOXXAA

mmeettaalloo

Historia de las carbapenemasas

� KPC:

� 2001. Aparecen en EEUU, concretamente en la Costa Este (NY).

� 2003. Aparecen en Grecia, tardan poco en asociarse con otras β-

lactamasas, como VIM, BLEE o pAmpC.

� 2006. Auge bibliográfico donde se describen estos enzimas en los

cinco continentes.

� 2010. Se describe el primer brote en España.

� OXA-48:

� 2001. Se describe la primera cepa productora de OXA-48, una cepa de

K. pneumoniae aislada en Turquía.

� Adquiere mayor importancia en el área mediterránea (Turquía, Egipto,

Líbano, España), aunque también se ha descrito en UK, Bélgica,

Francia, Irlanda, Senegal, Argentina y la India.

� SMART (2008-2009). Describe una prevalencia del 0,06% en

enterobacterias.

� NDM:

� 2008. NDM-1 aparece en Suecia de un paciente repatriado de Nueva

Delhi, donde aíslan una cepa de E. coli y otra de K. pneumoniae.

� 2010. Se describen en UK, Bélgica, Holanda y Francia, siempre de

pacientes relacionados con la India o Pakistán.

� 2010. European Centre for Disease Prevention and Control (eCDC):

del 01/2008 al 10/2010 se describen 77 pacientes de 13 países

europeos. Nº de casos por año: 8 en 2008, 30 en 2009 y 9 en 2010

(mayoría de UK).

Mapa del origen y distribución de las carbapenemasa s KPC, OXA-48 y NDM

Distintas carbapenemasas en Europa

J. Oteo et al / Enferm Infecc Microbiol Clin. 2014; 32 (Supl 4) :17-23

NDM-type VIM-type

IMP-type

KPC-type OXA-type

Epidemiological stages

Rare cases

Outbreaks

Endemics

No report

Esquema de la detección en el laboratorio de las ca rbapenemasas

Una prueba rápida reciente de tetección de carbapenemasas es el Rapidec

Carba NP (Biomerieux)

Poirel, L, Nordmand, P. J. Clin. Microbiol.-2015; 53:3003-8

El test confirma, en menos de 2 horas, las cepas

productoras de carbapenemasas (Enterobacteriaceae,

Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii)

en los cultivos en agar, por hidrólisis de un substrato

de imipenem con zinc e indicador de rojo de fenol.

Detecta las clases A (KPC), B (metalo-betalactamasas

NDM-1, VIM e IMP) y D (OXA) de carbapenemasas

pero sin distinguirlas.

Sensibilidad reducida a C3G,

aztreonam y/o cefepima

Confirmación por PCR (posibilidad de OXA, temocilina)

Test tridimensional Hodge modificado

Con/sin cloxacilina (250 mg/L)

Impi, Mero ≥ 1 mg/L - ≤ 21 mm Erta ≥ 1 mg/L - ≤ 24 mm

Miriagou V, et al.. CMI 2010; 16: 112–

122

Doyle D, et al. JCM 2012; 50: 3877–80.

Doble disco Discos combinados

Ác. clav., Ac. borónico (KPC)

Positivo

Doble disco Discos combinados

E-Test IMP +/- EDTA o DPA

Interpretación del EUCAST de BLEE, AmpC y carbapen emasas

EUCAST_detection_of_resistance_mechanisms_v1.0_20131211

Ante la detección de carbapenemasas en el laboratorio, hay una pregunta importante

a hacerse:

Consejos reciente EUCAST afirma que, con los puntos de corte bajos, los resultados

de sensibilidad para cefalosporinas y carbapenémicos pueden ser informados "como

adecuados", incluso para las cepas con (BLEE) y carbapenemasas. El CLSI tiene un

consejo similar, pero con mayores puntos de corte para ceftazidima y cefepima que los

de EUCAST. Datos farmacodinámicos y estudios en animales se han utilizado para

apoyar estos puntos de vista, junto con algunos análisis de series de casos clínicos.

David Livermore y cols. sostienen que este tipo de consejos son un error por tres

razones: En primer lugar, mientras que hay casos registrados donde cefalosporinas y

carbapenemes con bajas CMI, productoras de BLEE y carbapenemasas, han

demostrado su eficacia en infecciones, hay un número similar de casos en los que

este tipo de tratamiento ha fracasado; en segundo lugar, las pruebas de sensibilidad

habituales son menos precisas que las de investigación, lo que significa que las

bacterias productoras de BLEE y carbapenemasas con CIM "reales" de 1-8 mg / L

oscilarán entre las distintas categorías de sensibilidad de acuerdo con que pruebas y

cómo se han hecho; en tercer lugar, aunque el EUCAST sigue abogando por la

detección de BLEE y carbapenemasas con fines epidemiológicos, la consecuencia

probable de no buscar estas enzimas con fines de tratamiento es que algunos

laboratorios no las buscarán nunca, lo que lleva a una pérdida de información crítica

de control de infecciones. En resumen, es prudente seguir buscando BLEE y

carbapenemasas directamente por los métodos adecuados.

Livermore DM, et al. Are susceptibility tests enough, or should laboratories still seek ESBLs and carbapenemases di rectly? J Antimicrob Chemother. 2012;67:1569-77.40

Estudio sobre OXA-48 en Cataluña

Los carbapenemes representan actualmente los fármacos de elección para el

tratamiento de infecciones graves causadas por cepas multirresistentes de

enterobacterias de BLEE. Recientemente, sin embargo, la aparición de resistencias a

esta familia de antibióticos es un tema de gran preocupación clínica. El mecanismo

más común para la resistencia a un carbapenem de Klebsiella pneumoniae es la

producción de carbapenemasas (clases A, B o D de Ambler), concretamente la

oxacillinasa OXA-48, detectada inicialmente en Turquía y propagada posteriormente a

la zona mediterránea, y otros países tan distantes como Senegal, Bélgica, Argentina,

Reino Unido, Francia y la India.

Hace 3 años se llevó a cabo un nuevo estudio para detectar la enzima OXA-48 en

varios hospitales de Cataluña:

Año 2012 (enero-diciembre)

Centros participantes: 12 hospitales comarcales

Se aislaron, en 8 de los 12 hospitales, 85 cepas po rtadoras de OXA-48 de

un total de 177 cepas sospechosas.

En la figuras y tabla siguientes se pueden ver los resultados detallados del estudio,

como los aislados totales de K. pneumoniae en los distintos hospitales, su prevalencia

y el entorno génico.

Hospital K. pneumoniae

aisladas Prevalencia

Barcelona (SCIAS) 215 0

Calella 421 0,71%

General de Catalunya 288 0,35%

Granollers 436 5,73%

L'Hospitalet 296 3,40%

Vic 449 6,70%

Martorell 170 0

Municipal de Badalona 389 0

Mataró 383 0,52%

Sant Pau 432 0,92%

Sant Joan de Déu de Manresa 422 2,36%

Sant Joan de Reus 0 0

3901 2,2%

Conclusión del estudio de K. peumoniae productora de OXA-48:

• La prevalencia de Klebsiella pneumoniae productora de OXA-48 en Cataluña

fue del 2,2%.

• El Test de Hodge modificado fue útil para sospechar la presencia de OXA-48

pero fue poco específico.

• Hay dos clones mayoritarios circulando pertenecientes al ST405 y ST101.

• El gen blaOXA-48 se localizó en un plásmido conjugativo del grupo IncL.

• El gen blaOXA-48 se encontraba en el Tn1999.2 y Tn1999.

Difusión de la resistencia y bacteriófagos

La resistencia a los antibióticos puede acaecer por mutaciones espontáneas o

adquiridas, y por la incorporación de genes de resistencia (GRA), que se pueden

extender entre las células mediante el uso de plataformas genéticas conocidas como

elementos genéticos móviles. Los elementos genéticos móviles estudiados con mayor

frecuencia son los plásmidos, transposones, integrones y, más recientemente, los

bacteriófagos

Recientemente, algunos estudios han sugerido que el papel de los fagos que llevan

GRA en el ambiente es mucho más importante de lo que se pensaba. Estos genes han

sido encontrados abundantemente en la fracción de ADN de bacteriófagos de agua

contaminada con materia fecal, y los análisis de metagenómica indican que hay

abundantes GRA en el ADN viral.

Los bacteriófagos

• Están presentes en una importante fracción del genoma bacteriano.

• Son las entidades más abundantes en la biosfera.

• Presentan una elevada persistencia en el medio ambiente.

• Son elementos esenciales en la variabilidad genética bacteriana

Elementos Genéticos

Mutaciones espontáneas Difusión vertical

Incorporación de GRA Difusión horizontal

Plásmidos Transposones Integrones

Bacteriófagos

• Los análisis metagenómicos muestran abundantes GRA en el ADN vírico.

• Los bacteriófagos y sus GRA están presentes en:

� Bacterias Gram positivas:

� Streptococcus pyogenes (tetraciclina, macrólidos-

lincosamidas y clindamicina)

� Bacillus anthracis (fosfomicina)

� Enterococci (tetraciclina y gentamicina)

� Staphylococcus aureus (penicilina y tetraciclina)

�

� Bacterias Gram negativas:

� Pseudomonas aeruginosa (imipenem y cefotaxima)

� Actinobacillus actinomycetemcomitans (tetraciclina)

� Salmonella enterica (tetraciclina, cloranfenicol y

betalactámicos – PSE-1)

Antecedentes del equipo en bacteriófagos y genes de resistencia

antibiótica

Colomer-Lluch, M, L. Imamovic, J. Jofre and M. Muniesa. Bacteriophages carrying antibiotic resistance genes in fecal wastes from cattle, pigs and poultry. Antimicrob Agents Chemother 2011; 55:4908-11. Colomer-Lluch M, Jofre J, Muniesa M. Antibiotic resistance genes in the bacteriophage DNA fraction of environmental samples. PLoS One 2011; 6 (3):e17549. Muniesa M, García A, Miró E, Mirelis B, Prats G, Jofre J, Navarro F. Bacteriophages and diffusion of beta-lactamase genes. Emerg Infect Dis 2004; 10:1134-7. Muniesa M, Colomer-Lluch M, Jofre J. Potential impact of environmental bacteriophages in spreading antibiotic resistance genes. Future Microbiol 2013; 8: 739-51. Quirós, P.; Colomer-Lluch, M.; Martínez-Castillo, A.; Miró, E.; Argente, M.; Jofre, J.; Navarro, F.; Muniesa, M. Antibiotic-resistance genes in the bacteriophage DNA fraction of human fecal samples. 2014. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58: 606-9.

Estudio de bacteriófagos en heces humanas

Análisis de 9 GRA en ADN de bacteriófagos de muestr as de heces

humanas

� Genes a detectar :

• blaTEM (betalactamasa, clase A, penicilinasa)

• blaCTX-M-1 (betalactamasa, clase A, cefalosporinasa)

• blaCTX-M-9 (betalactamasa, clase A, cefalosporinasa)

• mecA (Penicillin binding protein, resistencia a meticilina

en S. aureus)

• armA (metiltransferasa, resistencia a aminoglucósidos)

• qnrA (resistencia a quinolonas)

• qnrS (resistencia a quinolonas)

• blaOXA-48 (resistencia a carbapenems)

• Sul1 (Resistencia a sulfamidas)

� Cuantificación de CG/ml de los GRA por qPCR del ADN total y

del ADN fágico de 113 muestras de heces humanas

� Secuenciación GRA de ADN fágico

Material y métodos

Resultados

Sant Pau (2012-13) Sant Pau (2014)

n=80 n=32

% positivas log GC/g % positivas log GC/g

blaTEM 64% 4-5 43,8% 3,4

blaCTX-M-1 21,3% 3-3.5 9,4% 3,3

qnrA 42,5% 3,5-4 12,5% 2,3

qnrS 1,3% 4,5 3,1% 2,2

mecA 1,3% 5 9,4% 3,2

armA 6,3% 4,5-5 25% 2,3

Conclusiones del estudio

• Todos los genes de resistencia antimicrobiana estudiados están

presentes en las heces.

• Todos los genes de resistencia antimicrobiana estudiados están

presentes en el DNA fágico, aunque en menor proporción.

• En todas la muestras se detectó como mínimo un gen de resistencia.

• En el 77,5% de las muestras se detectó como mínimo un gen de

resistencia asociado a DNA fágico

• Los bacteriófagos pueden actuar como vectores en la difusión de

la resistencia antimicrobiana

Agradecimiento del autor a: Dras. Beatriz Mirelis, M. Alba Rivera, Elisenda Mir ó y

Maite Muniesa

sul1 blaCTXM-1 blaOXA-48 mecA qnrA qnrS armA blaTE blaCTXM-9

% prevalencia de cada GRA en DNA encapsidado

Densidades medias de cada GRA en DNA encapsidado