panduan praktikum fitokimia

PANDUAN PRAKTIKUM ANALISIS FITOKIMIA

SEMESTER 4

Ferry Ferdiansyah Sofian

Ami Tjitraresmi

Yasmiwar Susilawati

Dudi Runadi

Disusun oleh :

LABORATORIUM FARMAKOGNOSI-FITOKIMIA

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS PADJADJARAN

2015

PANDUAN PRAKTIKUM ANALISIS FITOKIMIA 2015

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS PADJADJARAN i

KATA PENGANTAR

Praktikum analisis fitokimia merupakan bagian dari paket materi

kuliah fitokimia yang diberikan kepada mahasiswa agar mahasiswa

mengetahui cara-cara analisis komponen kimia dalam tumbuhan,

khususnya tumbuhan obat. Materi praktikum disusun sedemikian rupa

sehingga dapat menunjang serta sekaligus memberikan gambaran yang

lebih jelas mengenai materi yang diberikan pada perkuliahan. Melalui

praktikum yang terarah diharapkan dapat meningkatkan motivasi dan

merangsang inovasi baru dari mahasiswa dalam teknis praktis.

Buku panduan praktikum analisis fitokimia ini diupayakan dapat

memberi gambaran mengenai tahapan analisis fitokimia yang biasa

dilakukan oleh para peneliti bahan alam, dimulai dengan tahapan

pengenalan metabolit sekunder dalam tanaman obat melalui penapisan

fitokimia, metode ekstraksi untuk memisahkan sebagian besar komponen

kimia, metode pemisahan metabolit sekunder dengan teknik

kromatografi, serta metode pemurniannya, sehingga diperoleh komponen

tunggal/isolat. Selain itu, juga dipelajari mengenai isolasi minyak atsiri

dengan metode destilasi, enfleurasi, dan ekstraksi dari hasil pemerasan.

Teknik yang diberikan dalam buku panduan ini merupakan teknik

dasar namun dapat diterapkan di laboratorium dan cukup terandalkan.

Harapan kami semoga buku Panduan Praktikum Analisis Fitokimia

ini dapat dimanfaatkan sebaik-baiknya untuk proses pembelajaran di

Fakultas Farmasi Universitas Padjadjaran, khususnya dalam mata kuliah

Fitokimia.

Jatinangor, Februari 2015

Penyusun

PANDUAN PRAKTIKUM ANALISIS FITOKIMIA 2015

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS PADJADJARAN ii

DAFTAR ISI

Halaman KATA PENGANTAR ............................................................ i

DAFTAR ISI ..................................................................... ii

PENDAHULUAN ............................................................... 1

Bahan Praktikum ............................................................... 2

Pembagian Tugas Grup Praktikum ........................................ 3

Jadwal Praktikum ............................................................... 8

Modul Praktikum 1 ........................................................... 9

Penapisan Fitokimia Simplisia Tumbuhan Obat ....................... 9

Lembar kerja 1 ................................................................... 17

Modul Praktikum 2 ........................................................... 20

Ekstraksi Metabolit Sekunder dari Simplisia Tumbuhan Obat ... 20

Lembar kerja 2 ................................................................... 27

Modul Praktikum 3 ........................................................... 30

Metode Pemisahan Ekstrak ................................................... 30

Lembar kerja 3A ................................................................. 36

Lembar kerja 3B ................................................................. 38

Modul Praktikum 4 .......................................................... 41

Metode Pemurnian Fraksi .................................................... 41

Lembar kerja 4A ................................................................ 48

Lembar kerja 4B ................................................................ 50

Modul Praktikum 5 .......................................................... 52

Isolasi dan Penetapan Kadar Minyak Atsiri .............................. 52

Lembar kerja 5 .................................................................. 56

PANDUAN PRAKTIKUM ANALISIS FITOKIMIA 2015 1

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS PADJADJARAN PENDAHULUAN

PENDAHULUAN

Fitokimia ialah suatu ilmu yang terletak antara kimia organik bahan

alam dan biokimia tumbuhan. Bidang yang menjadi perhatiannya adalah

aneka ragam senyawa organik yang dibentuk dan ditimbun oleh

tumbuhan, meliputi struktur kimianya, biosintesisnya, perubahan dan

metabolismenya, penyebarannya secara alamiah, serta fungsi biologinya.

Untuk melakukan analisis fitokimia diperlukan pengetahuan

mengenai metode pemisahan, pemurnian, dan identifikasi kandungan

kimia dalam tumbuhan. Pemanfaatan teknik analisis fitokimia yang sudah

dikenal secara umum dan inovasinya terhadap teknik tersebut

diharapkan mampu menangani masalah-masalah yang timbul dalam

analisis fitokimia yang terjadi di kemudian hari.

Buku ini berupa panduan praktikum analisis fitokimia bagi

mahasiswa, terdiri dari beberapa topik, dimulai dengan penapisan

fitokimia, ekstraksi, fraksinasi, pemurnian/isolasi, serta isolasi minyak

atsiri dengan destilasi, enfleurasi, dan ekstraksi dari hasil pemerasan.

Metode penapisan fitokimia merupakan praktikum paling mendasar

yang bertujuan untuk mengetahui golongan metabolit yang terkandung

dalam simplisia dan merupakan panduan untuk melakukan ekstraksi,

pemisahan, dan identifikasi isolatnya.

Ekstraksi dapat dilakukan dengan beberapa metode yaitu ekstraksi

dengan menggunakan pelarut atau tidak menggunakan pelarut organik;

dengan penambahan suhu (cara panas) atau pada suhu kamar (cara

dingin); atau dengan beberapa metode ekstraksi lainnya. Pemilihan

metode ekstraksi tergantung pada sifat kimia dari kandungan tumbuhan

tersebut. Ekstrak yang diperoleh dari proses ekstraksi mengandung

berbagai macam metabolit primer dan sekunder. Untuk pemisahan

metabolit dalam ekstrak tersebut, dapat digunakan beberapa cara

metode fraksinasi seperti ekstraksi cair-cair (ECC) dan kromatografi

dipercepat (Fast Chromatography).

Metode pemurnian fraksi dimaksudkan untuk memperoleh suatu

isolat/komponen yang terdapat dalam fraksi. Pemurnian dapat dilakukan



dengan satu atau gabungan beberapa teknik kromatografi, seperti

kromatografi datar dan metode kromatografi kolom.

Topik lain membahas metode penetapan kadar minyak atsiri

menggunakan metode destilasi dengan alat destilasi Stahl. Metode

penetapan kadar minyak atsiri menggunakan alat destilasi Stahl ini

merupakan metode yang paling sederhana tetapi mempunyai ketepatan

dan ketelitian yang dapat diandalkan, sehingga metode ini dapat

dikatakan menjadi metode baku bagi penetapan kadar minyak atsiri

dalam suatu simplisia. Selain itu, dilakukan isolasi minyak atsiri

menggunakan destilasi air, serta destlasi uap dan air untuk jumlah

simplisia yang lebih banyak dari bagian tanaman. Selain itu, isolasi

minyak atsiri pun dapat dilakukan metode enfleurasi untuk simplisia dari

bagian bunga tanaman, serta metode ekstraksi hasil pemerasan dari

bagian kulit buah tanaman.

BAHAN PRAKTIKUM

a. PENAPISAN FITOKIMIA (MODUL 1)

Grup I

1. Morindae citrifoliae fructus

2. Chinae cortex

Grup II

1. Retrofracti fructus

2. Coffeae semen

Grup III

1. Andrographidis herba

2. Guazumae folium

Grup IV

1. Curcumae domesticae rhizoma

2. Rhei radix

Catatan : Jumlah simplisia yang digunakan 10 gram.

b. ISOLASI (MODUL 2 S/D MODUL 4)

1. Morindae citrifoliae fructus (Buah Mengkudu) ; 250 gram

2. Retrofracti fructus (Buah Cabe Jawa) ; 250 gram

3. Andrographidis herba (Herba Sambiloto) ; 250 gram

4. Curcumae domesticae rhizoma (Rimpang Kunyit) ; 250 gram

Catatan : untuk metode Refluks dan Soxhlet, jumlah simplisia yang

digunakan sebanyak 100 gram.



c. ISOLASI DAN PENETAPAN KADAR MINYAK ATSIRI

(MODUL 5)

1. Caryophylli flos (200 g), menggunakan destilasi uap dan air.

2. Jasmini Flos (100 g), menggunakan metode enfleurasi.

3. Canangae odoratae Flos (100 g), menggunakan metode

enfleurasi.

4. Zingiberis Rhizoma (100 g/500 g), menggunakan destilasi air

atau destilasi uap dan air.

5. Citri aurantifoliae Percarpium (500 g), menggunakan metode

pemerasan dan ekstraksi.

6. Melaleucae leucadendrae Folium (100 g/500 g), menggunakan

metode destilasi air atau destilasi uap dan air.

PEMBAGIAN TUGAS GRUP PRAKTIKUM

Satu kelompok praktikum dibagi dalam 4 grup dengan pembagian

tugas sebagai berikut :

KELOMPOK 1 : SENIN (13.00-16.00)

a. ISOLASI SENYAWA

GRUP BAHAN METODE

EKSTRAKSI

METODE

FRAKSI-NASI

METODE

ISOLASI

TARGET ISOLASI

SENYAWA

I

Morindae citrifoliae fructus (Buah Mengkudu)

Maserasi (etanol 70%)

KCV K.Kolom Fenolat (misal : skopoletin, antrakuinon)

II

Retrofracti fructus (Buah Cabe Jawa)

Dengan Alat Refluks (etanol 95%)

ECC K.Kolom Alkaloid (misal : piperin)

III

Andrographidis herba (Herba Sambiloto)


ECC KLT Preparatif

Terpenoid (misal : andrografolid)

IV

Curcumae domesticae rhizoma (Rimpang Kunyit)

Dengan alat Soxhlet (etanol 95%)

KCV KLT Preparatif

Curcuminoid (misal : curcumin)

b. ISOLASI MINYAK ATSIRI

GRUP BAHAN METODE ISOLASI

I Caryophylli Flos (Bunga Cengkeh) Destilasi uap dan air

II Jasmini Flos (Bunga Melati) Enfleurasi

III Zingiberis Rhizoma (Rimpang Jahe) Destilasi air

IV Citri aurantifoliae Percarpium (Kulit Jeruk Manis) Pemerasan dan ekstraksi



KELOMPOK 2 : SELASA (10.00-13.00)

a. ISOLASI SENYAWA

GRUP BAHAN METODE

EKSTRAKSI

METODE FRAKSI-

NASI

METODE ISOLASI

TARGET ISOLASI SENYAWA

I



KCV KLT Preparatif

Fenolat (misal : skopoletin, antrakuinon)

II



KCV K.Kolom Alkaloid (misal : piperin)

III



ECC KLT Preparatif


IV



ECC K.Kolom Curcuminoid (misal : curcumin)



I Caryophylli Flos (Bunga Cengkeh) Destilasi uap dan air

II Canangae odoratae Flos (Bunga Kenanga) Enfleurasi

III Melaleucae leucadendrae Folium (Daun Kayu Putih) Destilasi air


KELOMPOK 3 : RABU (10.00-13.00)

a. ISOLASI SENYAWA

GRUP BAHAN METODE

EKSTRAKSI

METODE FRAKSI-

NASI

METODE

ISOLASI

TARGET ISOLASI

SENYAWA

I



ECC KLT Preparatif


II



KCV KLT Preparatif

Alkaloid (misal : piperin)

III



KCV K.Kolom Terpenoid (misal : andrografolid)

IV








I Melaleucae leucadendrae Folium (Daun Kayu Putih) Destilasi uap dan air


III Zingiberis Rhizoma (Rimpang Jahe) Destilasi air


KELOMPOK 4 : RABU (13.00-16.00)

a. ISOLASI SENYAWA

GRUP BAHAN METODE

EKSTRAKSI

METODE

FRAKSI-NASI

METODE ISOLASI


I



KCV KLT Preparatif


II



ECC K.Kolom Alkaloid (misal : piperin)

III



KCV K.Kolom Terpenoid (misal : andrografolid)

IV



ECC KLT Preparatif




I Zingiberis Rhizoma (Rimpang Jahe) Destilasi uap dan air


III Melaleucae leucadendrae Folium (Daun Kayu Putih) Destilasi air




KELOMPOK 5 : KAMIS (10.00-13.00)

a. ISOLASI SENYAWA

GRUP BAHAN METODE

EKSTRAKSI

METODE FRAKSI-

NASI

METODE ISOLASI


I



KCV K.Kolom Fenolat (misal : skopoletin, antrakuinon)

II



KCV KLT Preparatif

Alkaloid (misal : piperin)

III



ECC KLT Preparatif


IV






I Zingiberis Rhizoma (Rimpang Jahe) Destilasi uap dan air


III Caryophylli Flos (Bunga Cengkeh) Destilasi air


KELOMPOK 6 : JUMAT (07.00-10.00)

a. ISOLASI SENYAWA

GRUP BAHAN METODE

EKSTRAKSI

METODE

FRAKSI-NASI

METODE

ISOLASI

TARGET ISOLASI

SENYAWA

I



ECC K.Kolom Fenolat (misal : skopoletin, antrakuinon)

II



KCV K.Kolom Alkaloid (misal : piperin)

III



KCV KLT Preparatif


IV



ECC KLT Preparatif






I Melaleucae leucadendrae Folium (Daun Kayu Putih) Destilasi uap dan air


III Caryophylli Flos (Bunga Cengkeh) Destilasi air




JADWAL PRAKTIKUM

Semua grup melakukan Modul Praktikum 1 (Penapisan fitokimia)

sampai Modul Praktikum 5 (isolasi minyak atsiri) yang dikerjakan sesuai

dengan jadwal praktikum berikut ini :

Pertemuan

ke- KEGIATAN

1 Responsi : Teori Metode Pemisahan Senyawa Bahan Alam

2 a. Presentasi metode isolasi sampel.Persiapan alat, bahan, dan responsi studi literatur metode isolasi

b. Ekstraksi (2 Kelompok awal)

3 a. Diskusi : Metode Isolasi Sampel

b. Ekstraksi (2 Kelompok akhir)

c. Pemekatan Ekstraksi (2 Kelompok awal)

4 a. Penapisan Fitokimia (masing-masing kelompok 2 sampel)

b. Pemekatan Ekstraksi (2 Kelompok akhir)

c. Pemeriksaan Kadar Air (2 Kelompok awal)

5 Evaluasi mutu ekstrak :

a. Perhitungan Rendemen Ekstrak

b. Perhitungan Bobot Jenis Ekstrak

c. Pemeriksaan Kadar Air (2 Kelompok akhir)

d. Pemantauan KLT, dan

e. Pemantauan Pola Dinamolisis

6 Fraksinasi : ECC dan KCV

7 a. Fraksinasi Lanjutan : ECC dan KCV

b. KLT fraksi dan penetapan senyawa identitas

c. Isolasi Minyak atsiri dengan Destilasi Stahl

8 a. Persiapan isolasi senyawa identitas, penetapan eluen KK dan pengembang KLT preparatif

b. KLT minyak atsiri

9 Isolasi senyawa identitas dengan KK atau KLT preparatif dari ekstrak dan minyak atsiri

10 a. KLT isolat

b. Uji kemurnian isolat dengan KLT dua dimensi

11 a. KLT isolat (Lanjutan)

b. Uji kemurnian isolat dengan KLT dua dimensi (Lanjutan)

c. Perhitungan rendemen isolat

12 Presentasi Akhir (2 kelompok)

13 Presentasi Akhir (2 kelompok)


FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS PADJADJARAN MODUL PRAKTIKUM 1

MODUL PRAKTIKUM 1

Penapisan Fitokimia

Simplisia Tumbuhan Obat

TUJUAN PERCOBAAN

Melakukan pengujian penapisan fitokimia terhadap beberapa

simplisia tumbuhan obat sehingga diketahui golongan metabolit sekunder

yang terkandung dalam simplisia tersebut.

TUJUAN INSTRUKSIONAL

Setelah melakukan praktikum ini, mahasiswa mampu menganalisis

kandungan metabolit sekunder suatu simplisia tumbuhan obat atas dasar

hasil pengujian penapisan fitokimia.

TEORI

Tumbuhan obat adalah tumbuhan atau bagian-bagiannya yang

digunakan baik untuk pencegahan ataupun pengobatan penyakit-

penyakit tertentu, atas dasar pengggunaan secara empirik ataupun

pengujian ilmiah. Pengujian khasiat suatu tanaman obat dilakukan

melalui uji pra klinik hingga uji klinik.

Pengembangan obat tradisional di Indonesia semakin menunjukkan

kemajuan yang mengarah kepada upaya memasuki jalur pelayanan

kesehatan formal. Obat tradisional yang akan memasuki jalur pelayanan

kesehatan formal dituntut mempunyai kualitas yang memenuhi standar

yang telah ditetapkan. Evaluasi kualitas ini diperlukan untuk

mendapatkan obat tradisional yang memenuhi persyaratan, memiliki

khasiat, dan aman digunakan.

Khasiat atau aktivitas farmakologi yang menjadi tumpuan bagi

penggunaan suatu tumbuhan sebagai tumbuhan obat ditentukan oleh

kandungan senyawa metabolit sekunder dalam tumbuhan atau bagian

tumbuhan tersebut. Kandungan senyawa metabolit sekunder yang

mempunyai arti penting dalam kaitan dengan khasiat atau aktivitas



farmakologi tumbuhan obat adalah senyawa metabolit sekunder

kelompok alkaloid, tanin dan polifenolat, mono dan sesquiterpen,

senyawa kuinon, glikosida jantung, flavonoid, triterpenoid dan steroid,

serta saponin.

Uji fitokimia terhadap kandungan senyawa kimia metabolit sekunder

merupakan langkah awal yang penting dalam penelitian mengenai

tumbuhan obat atau dalam hal penelusuran senyawa aktif baru yang

berasal dari bahan alam yang dapat menjadi prekursor bagi sintesis obat-

obat baru atau menjadi prototype senyawa obat dengan aktivitas

tertentu. Oleh karenanya, metode uji fitokimia harus merupakan uji

sederhana tetapi terandalkan. Metode uji fitokimia yang banyak

digunakan adalah metode reaksi warna dan pengendapan yang dapat

dilakukan di lapangan atau di laboratorium.

METODE EVALUASI FITOKIMIA

Metode evaluasi fitokimia meliputi penapisan fitokimia dan

pencarian senyawa identitas melalui analisis kromatografi.

1. PENAPISAN FITOKIMIA

a. Alkaloid

Alkaloid adalah senyawa metabolit sekunder yang dalam

struktur molekulnya terdapat atom Nitrogen (umumnya heterosiklik).

Adanya pasangan elektron bebas pada atom Nitrogen ini

menyebabkan alkaloid dapat membentuk kompleks yang tidak larut

dengan logam-logam berat. Fenomena ini merupakan dasar bagi

reaksi pengenalan adanya alkaloid dalam simplisia tumbuhan obat.

Alkaloid adalah kelompok atau golongan senyawa kimia

metabolit sekunder asal tumbuhan atau hewan dengan struktur yang

mempunyai atom Nitrogen (umumnya terikat dalam lingkar

heterosiklik), bersifat basa, serta mempunyai aktivitas fisiologis

tertentu.



Berdasarkan biosintesisnya, alkaloid terbagi atas:

(1) True alkaloid (alkaloid sesungguhnya), biosintesisnya berasal

dari asam amino, bersifat basa, umumnya mempunyai atom

Nitrogen dalam lingkar heterosiklik

(2) Proto alkaloid, merupakan amina yang bersifat sederhana

dengan atom Nitrogen yang tidak terdapat dalam lingkar

heterosiklik. Contoh meskalin, efedrin

(3) Pseudo alkaloid, biosintesisnya tidak berasal dari asam amino.

Contohnya basa purin (antara lain kafein)

Umumnya alkaloid bersifat basa karena adanya pasangan

elektron bebas pada atom Nitrogennya (Teori Asam-Basa Lewis).

Dalam tumbuhan biasanya alkaloid terdapat dalam bentuk garam

(tartrat, laktat, sitrat). Sifat kimia alkaloid ini merupakan dasar bagi

cara isolasi maupun pengenalannya. Pengenalan alkaloid didasarkan

pada kemampuannya membentuk senyawa kompleks tidak larut

dengan pereaksi-pereaksi yang mengandung logam berat, misalnya

pereaksi Mayer (mengandung kalium ioda dan raksa (II) klorida),

pereaksi Dragendorff (mengandung Bismuth subnitrat dan raksa (II)

klorida). Alkaloid dengan pereaksi Mayer akan memberikan endapan

putih, sedangkan pereaksi Dragendorff akan memberikan endapan

jingga coklat. Walaupun reaksi pengenalan alkaloid dengan kedua

pereaksi tersebut merupakan reaksi pengenalan umum tetapi

beberapa senyawa non alkaloid dapat mengendap dengan pereaksi-

pereaksi tersebut di atas, misalnya protein, kumarin, -piron,

hidroksi flavon serta tannin. Reaksi pengenalan palsu tersebut

terkenal dengan sebutan reaksi positif palsu (false positive). Perlu

menjadi perhatian, selain adanya reaksi positif palsu, dengan metode

ini senyawa alkaloid kuarterner dalam simplisia tidak dapat diubah

menjadi alkaloid bentuk basa dan akan tetap tinggal dalam sel,

sehingga tidak dapat dikenali dengan metode pengendapan oleh

reaksi-reaksi tersebut di atas. Keadaan seperti itu disebut sebagai

reaksi negatif palsu (false negative).



Metode:

Simplisia dibasakan dengan ammonia encer, digerus dalam

mortir, kemudian ditambahkan beberapa milliliter kloroform sambil

terus digerus. Setelah disaring, filtrat dikocok dengan asam klorida 2

N. Lapisan asam dipisahkan kemudian dibagi menjadi tiga bagian dan

diperlakukan sebagai berikut :

(1) Bagian pertama digunakan sebagai blangko

(2) Bagian kedua ditetesi dengan larutan pereaksi Mayer, kemudian

diamati ada atau tidaknya endapan berwarna putih

(3) Bagian ketiga ditetesi dengan larutan pereaksi Dragendorff,

kemudian diamati ada atau tidaknya endapan jingga coklat

b. Flavonoid

Flavonoid adalah senyawa metabolit sekunder yang memberikan

berbagai warna pada tumbuhan. Flavonoid mempunyai struktur yang

sangat bervariasi, namun pada umumnya mempunyai struktur dasar:

Gambar. Struktur dasar Flavonoid

Pengenalan flavonoid didasarkan pada reaksi reduksi gugusan

karbonil pada lingkar -lakton menjadi gugusan alkohol membentuk senyawa hidroksi yang berwarna-warna tergantung pada gugusan

fungsional yang terikat pada lingkar A atau B. warna yang terjadi

dapat ditarik oleh amil alkohol.

Metode:

Senyawa dipanaskan dengan campuran logam Magnesium dan

asam klorida 5N, kemudian disaring. Adanya flavonoid akan

menyebabkan filtrat berwarna merah yang dapat ditarik oleh amil



alkohol. Untuk lebih memudahkan pengamatan sebaiknya digunakan

percobaan blangko.

c. Tanin dan Polifenol

Tanin dan senyawa polifenolat alam mudah dikenali melalui

pengenalan gugusan fenol yang dapat memberikan warna biru-hitam

dengan pereaksi besi (III) klorida. Untuk membedakan tanin dengan

polifenolat alam, digunakan sifat tanin yang dapat mengendapkan

larutan gelatin 1%.

Metode:

Simplisia digerus dan dipanaskan dengan air di atas tangas air,

kemudian disaring panas-panas. Sebagian kecil filtrat ditetesi larutan

besi (III) klorida. Terbentuknya warna biru-hitam menunjukkan

adanya tanin dan polifenol alam. Sebagian kecil filtrat diuji ulang

dengan penambahan larutan gelatin 1%. Adanya endapan putih

menunjukkan bahwa dalam simplisia terdapat tanin.

d. Saponin

Saponin adalah senyawa metabolit sekunder dalam tumbuhan

yang bersifat dapat membentuk busa, serta dapat menghemolisis sel

darah merah. Struktur kimia umumnya merupakan glikosida, yang

bila dihidrolisis akan menghasilkan bagian glikon (senyawa gula) dan

aglikon (senyawa non gula). Struktur aglikon tannin umumnya

merupakan struktur triterpenoid dan struktur steroid, hingga ditinjau

dari strukturnya saponin dapat dipilah menjadi saponin-triterpenoid

dan saponin-steroid. Reaksi pengenalan saponin didasarkan pada

sifatnya yang mampu memberikan busa pada pengocokan dan

persisten pada penambahan sedikit asam atau pada pendiaman.

Metode:

Di atas tangas air, dalam tabung reaksi, simplisia dicampur

dengan air dan dipanaskan beberapa saat, kemudian disaring.

Setelah dingin filtrat dalam tabung reaksi dikocok kuat-kuat selama



lebih kurang 30 detik. Pembentukan busa sekurang-kurangnya

setinggi 1 cm dan persisten selama beberapa menit serta tidak hilang

setelah penambahan 1 tetes asam klorida encer menunjukkan bahwa

dalam simplisia terdapat saponin.

e. Monoterpenoid dan Sesquiterpenoid

Monoterpenoid dan sesquiterpenoid adalah senyawa-senyawa

C10-C15 yang tersusun dari unit isoprene (C5H8). Senyawa

monoterpenoid dan sesquiterpenoid ini merupakan komponen-

komponen penyusun minyak atsiri. Reaksi pengenalan didasarkan

pada kemampuannya membentuk warna-warna dengan pereaksi

anisaldehid-asam sulfat atau pereaksi vanillin-sulfat.

Metode:

Simplisia disari dengan eter, kemudian sari eter diuapkan hingga

kering. Pada residu diteteskan pereaksi anisaldehid-asam sulfat atau

pereaksi vanillin-sulfat dari pinggir cawan. Terbentuknya warna-

warna menunjukkan adanya senyawa monoterpenoid dan

sesquiterpenoid.

f. Steroid dan Triterpenoid

Senyawa kelompok steroid dan triterpenoid adalah senyawa-

senyawa kelompok metabolit sekunder yang mempunyai struktur

dasar yang hampir sama.

(a) (b)

Gambar. (a) Steroid, (b) Triterpenoid



Pengenalan senyawa triterpenoid dan steroid didasarkan

kemampuannya membentuk warna dengan pereaksi Liebermann-

Burchard.

Pereaksi Liebermann-Burchard dibuat dengan cara mencampurkan 20

bagian asam asetat anhidrat dengan 1 bagian asam sulfat pekat.

Pereaksi ini harus digunakan dalam media bebas air.

Metode:

Simplisia disari dengan eter, kemudian sari eter diuapkan hingga

kering. Pada residu diteteskan pereaksi Liebermann-Burchard.

Terbentuknya warna ungu menunjukkan bahwa dalam simplisia

mengandung senyawa kelompok triterpenoid, sedangkan bila

terbentuk warna biru-hijau menunjukkan adanya senyawa kelompok

steroid.

g. Senyawa Kuinon

Senyawa kuinon umumnya merupakan turunan p-benzokuinon.

Gambar. p-benzokuinon

Pengenalan senyawa ini didasarkan pada kemampuannya

membentuk garam berwarna antara hidrokuinon dengan larutan

alkali kuat (NaOH atau KOH).



Gambar. Reaksi hidrokuinon dengan larutan alkali kuat

Metode:

Simplisia digerus dan dipanaskan dengan air, kemudian disaring.

Filtrat ditetesi dengan larutan NaOH. Terbentuknya warna kuning

hingga merah menunjukkan adanya senyawa kelompok kuinon.

PUSTAKA

Farnsworth, N.R. 1966. Biological and Phytochemical Screening Of Plants.J. Pharm. Sci. 55(3): 243-269

Harborne, J.B. 1984. Metode Fitokimia. Terjemahan K. Padmawinata

dan I. Sudiro.: Penerbit ITB. Bandung Marini, C.P. 1981. Plant Screening By Chemical And Chromatography

Prosedure in the Field Condition. J. Chromatogr. 213:117-122



LEMBAR KERJA 1 PRAKTIKUM ANALISIS FITOKIMIA FAKULTAS FARMASI-UNIVERSITAS PADJADJARAN

PRAKTIKUM 1 : Penapisan Fitokimia Simplisia Tumbuhan Obat

NAMA MAHASISWA : .............................................................

NPM : .............................................................

KELOMPOK : .............................................................

NAMA TANAMAN : .............................................................

NAMA SIMPLISIA : .............................................................

METODE DAN HASIL :

No Golongan Senyawa

Prosedur Hasil (+/-)

Paraf Asisten

1 ALKALOID 1. 1 gram serbuk simplisia dibasakan dengan 10 mL amonia 10%, digerus menggunakan mortar.

2. Tambahkan 5 mL kloroform, gerus kuat.

3. Lapisan kloroform dipipet sambil disaring menggunakan pipet yang disumbat dengan kapas, masukkan ke dalam tabung reaksi.

4. Tambahkan kedalamnya HCl 2N (1:10 v/v). Kocok kuat hingga terbentuk 2 lapisan.

5. Lapisan asam dipipet,kemudian dibagi menjadi 3 bagian : a. Filtrat 1 :

ditambahkan pereaksi Mayer, terjadinya kekeruhan atau endapan

putih menunjukkan adanya alkaloid.

b. Filtrat 2 : ditambahkan pereaksi Dragendorff, terjadinya endapan jingga coklat menunjukkan adanya alkaloid.

c. Filtrat 3 : digunakan sebagai blanko.

2 SENYAWA

POLIFENOLAT

1. 50 mg serbuk simplisia dalam tabung reaksi dididihkandalam 50 mL air selama 15 menit,



No Golongan

Senyawa Prosedur

Hasil

(+/-)

Paraf

Asisten

kemudian didinginkan dan disaring (Filtrat A).

2. Kedalam filtrat ditambahkan larutan pereaksi FeCl3 1%. Terbentuknya warna biru-hitam menunjukkan adanya senyawa polifenolat.

3 TANIN 3. Kedalam Filtrat A ditambahkan larutan gelatin 1%, terbentuknya endapan putih menunjukkan adanya tanin.

4 FLAVONOID 1. 1 gram serbuk simplisia ditambahkan 50 mL air panas, dididihkan selama 5 menit, lalu disaring.

2. Filtrat yang dihasilkan ditambahkan sedikit serbuk Mg dan 5 mL HCl 2N.

3. Kemudian tambahkan amillalkohol, lalu dikocok kuat-kuat dan dibiarkan hingga memisah. Terbentuknya warna kuning hingga merah yang dapat ditarik

dengan amil alkohol menunjukkan adanya flavonoid.

5 MONO-

TERPENOID DAN

SESQUI-

TERPENOID

1. 1 gram simplisia digerus dengan 5 mL eter, kemudian dipipet sambil disaring menggunakan pipet yang disumbat dengan kapas (Filtrat B).

2. Filtrat ditempatkan dalam cawan penguap, kemudian dibiarkan menguap hingga kering.

3. Ke dalam residu diteteskan larutan vanilin 10% dalam H2SO4 pekat melalui pinggir cawan, terbentuknya warna-warna menunjukkan adanya mono dan sesquiterpenoid.

6 STEROID DAN

TRITERPENOID

4. Filtrat B ditempatkan dalam cawan penguap, kemudian dibiarkan menguap hingga kering.



No Golongan

Senyawa Prosedur

Hasil

(+/-)

Paraf

Asisten

5. Ke dalam residu diteteskan 2 hingga 3 tetes pereaksi Liebermann Burchard. Terbentuknya warna ungu menunjukkan adanya golongan triterpenoid, sedangkan terbentuknya warna biru hijau

menunjukkan adanya golongan steroid.

7 KUINON 6. Kedalam Filtrat A ditambahkan larutan KOH 5% terbentuknya warna kuning hingga merah menunjukkan adanya golongan kuinon

8 SAPONIN 7. Sejumlah 10 ml Filtrat A, dikocok vertikal dalam tabung reaksi selama 10 detik.

8. Terbentuknya busa yang persisten pada penambahan asam klorida atau pada pendiaman selama lebih kurang 10 menit, menunjukkan adanya golongan saponin.

KESIMPULAN :

Dalam simplisia yang diperiksa, diperkirakan terdapat senyawa

metabolit sekunder golongan:

1. ................................................................................

2. ................................................................................

3. ................................................................................

4. ................................................................................

5. ................................................................................

6. ................................................................................

Paraf Asisten Praktikum Paraf Praktikan

Hari/Tanggal :

( )

Hari/Tanggal :

( )



MODUL PRAKTIKUM 2

Ekstraksi Metabolit Sekunder dari Simplisia

Tumbuhan Obat

TUJUAN PERCOBAAN

Melakukan penyarian metabolit sekunder dari simplisia tumbuhan

obat dengan beberapa metode ekstraksi.


Setelah melakukan praktikum ini, mahasiswa dapat memahami dan

mampu melakukan penyarian metabolit sekunder dari simplisia tumbuhan

obat dengan cara sederhana namun terandalkan.

TEORI

Pada analisis fitokimia tumbuhan obat idealnya digunakan bahan

baku segar yang dididihkan dengan alkohol selama beberapa menit

segera setelah dikumpulkan. Hal ini dimaksudkan untuk menonaktifkan

enzim, supaya tidak terjadi reaksi enzimatis selama percobaan dilakukan.

Kadang-kadang tumbuhan yang akan diteliti tidak dapat diperoleh dengan

segera dan bahkan mungkin kolektornya tinggal di daerah atau benua

lain, sehingga bahan baku dikeringkan terlebih dahulu sebelum dilakukan

ekstraksi. Pengeringan ini harus dilakukan dengan hati-hati dan dijaga

jangan sampai terjadi perubahan kimia. Oleh karena itu, tumbuhan

sesegera mungkin dikeringkan diudara terbuka tanpa menggunakan

panas tinggi. Setelah kering, bahan bisa disimpan lama sebelum dilakukan

ekstraksi.

Ekstraksi merupakan tahap awal pada jalur isolasi metabolit

sekunder dari tumbuhan obat. Ekstraksi dapat dibagi menjadi beberapa

golongan tergantung dari beberapa keadaan yang menyertainya.

Ditinjau dari suhu, ekstraksi dibagi menjadi dua golongan, yaitu

ekstraksi dingin dan ekstraksi panas. Ekstraksi dingin misalnya maserasi

dan perkolasi. Ekstraksi dingin dilakukan terhadap bahan tumbuhan yang



mengandung senyawa yang bersifat termolabil. Metode ini memerlukan

waktu yang relatif lebih lama bila dibandingkan dengan ekstraksi panas.

Ekstraksi panas misalnya dengan cara infus, dekok, refluks, dan

menggunakan alat soxhlet.

Ditinjau dari banyaknya ulangan proses, ekstraksi dibagi menjadi

dua golongan pula, yaitu ekstraksi satu kali, misalnya maserasi dan

ekstraksi berulang kali, misalnya dengan alat soxhlet. Dalam hal ini

efektivitas proses ekstraksi akan ditentukan oleh banyaknya pengulangan

proses ekstraksi. Ekstraksi berulang akan lebih efektif dibanding dengan

ekstraksi satu kali, sesuai dengan perumusan sebagai berikut :

Wn = Jumlah zat yang belum terekstraksi Wo = Jumlah zat mula-mula K = Koefisien partisi zat V = Volume awal S = Volume larutan pengekstraksi n = Jumlah pengulangan ekstraksi

Persamaan di atas umumnya digunakan untuk ekstraksi cair-cair,

namun untuk ekstraksi padat-cair secara umum persamaan tersebut juga

dapat diterapkan.

Ditinjau dari penggunaan pelarut, metode ekstraksi terdiri atas

metode yang menggunakan pelarut seperti maserasi, perkolasi, soxhlet,

refluks, infus, dekok dan digesti dan metode ekstraksi tanpa pelarut

misalnya destilasi uap yaitu pemisahan berdasarkan perbedaan titik uap.

Terdapat beberapa metode ekstraksi lainnya misalnya ekstraksi dengan

karbondioksida superkritik, ekstraksi ultrasonik dan ekstraksi energi

listrik.

Cara ekstraksi yang tepat tergantung pada jaringan tumbuhan,

kadar air dan golongan senyawa yang akan diisolasi. Pada umumnya

diperlukan mematikan jaringan tumbuhan terlebih dahulu dengan etanol

mendidih supaya tidak terjadi oksidasi enzimatis atau hidrolisis. Etanol

merupakan pelarut yang baik untuk ekstraksi tahap awal dan dapat

digunakan untuk menghilangkan klorofil yang terdapat pada simplisia,

misalnya daun yang berwarna hijau. Pada ekstraksi pertama klorofil akan



tertarik dan pada ekstraksi selanjutnya dengan etanol diharapkan

simplisia telah bebas dari klorofil.

Berdasarkan pengertian bahwa ekstraksi adalah metode penarikan

metabolit sekunder dari tumbuhan atau bagian tumbuhan dengan pelarut

yang sesuai, maka dalam pemilihan pelarut pengekstraksi berlaku prinsip:

polar loves polar, nonpolar loves nonpolar, artinya bila kita akan

mengekstraksi senyawa polar, harus digunakan pelarut polar dan apabila

kita akan mengekstraksi senyawa nonpolar, maka harus digunakan

pelarut nonpolar. Namun pada prakteknya ekstraksi dilakukan dengan

menggunakan pelarut dalam gradasi kepolaran, mulai dari nonpolar ke

polar atau dari polar ke nonpolar. Contoh pelarut polar adalah air,

metanol, etanol, pelarut semi polar adalah aseton, etil asetat, kloroform

dan pelarut nonpolar adalah n-heksana, eter minyak tanah, toluen,

benzene. Pelarut-pelarut nonpolar benzena, kloroform dan karbon

tetraklorida sekarang jarang digunakan, karena sifatnya hepatotoksik atau

karsinogenik. Pelarut metanol merupakan pelarut yang baik daripada

etanol tetapi kini dihindari karena memiliki sifat toksik akut dan kronik.

Untuk memperoleh ekstrak total, pelarut yang digunakan dipilih yang

dapat melarutkan hampir semua metabolit sekunder yang terkandung

dalam simplisia tanaman obat. Campuran pelarut alkohol-air merupakan

campuran yang baik untuk ekstraksi awal dan diperbolehkan menurut

peraturan . Faktor utama untuk mempertimbangkan pemilihan cairan

pernyari adalah selektivitas, kemudahan bekerja/proses dengan cairan

tersebut, ekonomis, ramah lingkungan dan keamanan.

Ekstrak yang diperoleh dipekatkan dengan penguap vakum putar

pada tekanan rendah (rotavapor=rotary evaporator) hingga diperoleh

ekstrak kental. Terhadap ekstrak kental dilakukan pemeriksaan kualitas

ekstrak yang meliputi parameter kimia dan fisika seperti organoleptik,

pola kromatogram (lapis tipis dan dinamolisis), kadar air, dan bobot jenis

ekstrak.



PROSEDUR EKSTRAKSI

1. MASERASI

Bagian dasar maserator dilapisi dengan kapas sebagai penyaring.

Kemudian dimasukkan sebanyak 250 gram serbuk simplisia ke dalam

maserator. Tambahkan pelarut etanol 70% atau 95% secukupnya dan

biarkan selama kira-kira 10 menit agar terjadi proses pembasahan

simplisia, kemudian ditambahkan pelarut etanol sampai seluruh

serbuk simplisia terendam. Didiamkan selama 24 jam sambil sesekali

diaduk. Ekstrak cair yang diperoleh kemudian. Ekstraksi diulangi

sampai ekstrak cair yang diperoleh hampir tidak berwarna. Ukur

volume ekstrak cair yang diperoleh kemudian dipekatkan dengan

rotavapor pada suhu 30-40 oC sehingga diperoleh ekstrak kental.

2. EKSTRAKSI DENGAN ALAT SOXHLET

Tuangkan 250 mL pelarut etanol 95% ke dalam labu alas bulat

atau sampai kurang lebih 1/2-2/3 bagian volume labu dan

ditambahkan batu didih. Serbuk simplisia sebanyak 50 gram disiapkan

dalam kertas saring whatman dan dimasukkan ke dalam tabung

Soxhlet. Pasang alat soxhlet sesuai tempatnya dan tambahkan 50 mL

pelarut dari bagian atas tabung soxhlet untuk pembasahan simplisia

dan nyalakan heating mantle sampai suhu mencapai titik didih

pelarut. Ekstraksi simplisia sampai tetesan pelarut hampir tidak

berwarna. Kemudian ekstrak yang diperoleh dipekatkan dengan

rotavapor sehingga menjadi ekstrak kental.

3. EKSTRAKSI DENGAN CARA REFLUKS

Sebanyak 50 gram serbuk simplisia dimasukkan ke dalam labu

alas bulat, tambahkan kedalamnya pelarut etanol 95% sebanyak 250

ml. Pasangkan kondensor dengan alat refluks dan nyalakan heating

mantle sampai suhu titik didih pelarut. Ekstraksi dilakukan sampai

tetesan pelarut hampir tidak berwarna. Kemudian ekstrak yang

diperoleh dipekatkan dengan rotavapor sehingga menjadi ekstrak

kental.



PEMERIKSAAN PARAMETER EKSTRAK:

Pemeriksaan parameter ekstrak perlu dilakukan untuk mengetahui

kualitas ekstrak dilihat dari sifat fisik dan kandungan kimianya.

Parameter yang diperiksa adalah sebagai berikut :

1. Organoleptik Ekstrak

Pemeriksaan menggunakan panca indera untuk mendiskripsikan

bentuk, warna, bau dan rasa dari ekstrak yang diperoleh.

2. Rendemen Ekstrak

Rendemen dapat ditetapkan dengan rumus sebagai berikut :

%

Untuk menetapkan rendemen ekstrak, sejumlah tertentu ekstrak

kental dalam cawan penguap ditimbang kemudian diuapkan di atas

penangas air dengan temperatur 40-50C sampai bobot tetap.

Tentukan berat ekstrak setelah penguapan dengan mengurangkan

dengan bobot cawan kosong, kemudian hitung rendemen ekstrak (%

b/b) sesuai dengan rumus di atas.

3. Bobot Jenis Ekstrak

Penetapan bobot jenis ekstrak dapat dilakukan sebagai berikut.

Ditimbang piknometer dengan volume tertentu dalam keadaan

kosong. Kemudian piknometer diisi penuh dengan air dan ditimbang

ulang. Kerapatan air dapat ditetapkan. Kemudian piknometer

dikosongkan dan diisi penuh dengan ekstrak, lalu ditimbang. Melalui

berat ekstrak yang mempunyai volume tertentu, dapat ditetapkan

kerapatan ekstrak. Bobot jenis ekstrak ditetapkan dengan rumus

sebagai berikut :



4. Kadar Air Ekstrak

Penetapan kadar air ekstrak dapat dilakukan dengan beberapa

cara misalnya dengan titrasi langsung atau tidak langsung (pereaksi

Karl-Fischer), destilasi atau gravimetri. Pada praktikum ini akan

dilakukan penetapan kadar air dengan destilasi menggunakan destilasi

toluene.

Prosedur :

Ke dalam labu bersih dan kering dimasukkan sejumlah ekstrak

kental yang telah ditimbang seksama kemudian tambahkan 200 ml

toluene, hubungkan alat. Tuangkan toluene ke dalam labu penerima

melalui alat pendingin. Panaskan labu hati-hati selama 15 menit.

Setelah toluen mendidih, suling dengan kecepatan lebih kurang 2

tetes tiap detik, hingga sebagian air tersuling, kemudian naikkan

kecepatan penyulingan hingga 4 tetes tiap detik. Setelah semua air

tersuling, biarkan tabung penerima mendingin hingga suhu kamar.

Setelah air dan toluene memisah sempurna, baca volume air. Hitung

kadar air dalam % v/b

5. Pola Kromatogram Lapis Tipis

Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dilakukan dengan fasa diam silika

gel GF 254 dan fasa gerak/pengembang kombinasi pelarut dengan

perbandingan yang cocok. Untuk memperoleh perbandingan

pengembang yang optimal, dapat diperoleh dari literatur atau data-

data penelitian atau mencoba dengan perbandingan pelarut polar,

semipolar atau non polar yang umum.

Prosedur :

Pelat silika gel disiapkan dengan ukuran tertentu kemudian

ekstrak cair ditutulkan pada garis awal dengan menggunakan pipa

kapiler, biarkan beberapa saat hingga pelarutnya menguap. Pelat

silika kemudian dimasukkan ke dalam bejana kromatografi yang

sebelumnya telah dijenuhkan dengan cairan pengembang. Proses

kromatografi dihentikan sampai cairan pengembang sampai ke garis



depan. Amati pola kromatogram dibawah lampu UV 254 dan 366 nm

dan hitung Rf setiap bercak yang teramati. Penampak bercak dapat

juga menggunakan asam sulfat 10% dalam metanol.

6. Pola Dinamolisis

Dinamolisis dapat dilakukan dengan cara sebagai berikut. Kertas

saring Whatman diameter 10 cm, titik pusatnya dilubangi, kemudian

dipasang sumbu yang terbuat dari kertas saring. Kertas saring

bersumbu ini kemudian ditutupkan pada cawan petri yang berisi

maserat/ekstrak cair. Biarkan terjadi proses difusi sirkular selama

kurang lebih 10 menit. Pola dinamolisis diamati.

PUSTAKA

Harborne, J.B. 1973. Phytochemical Methods , A Guide to Modern Techniques of Plant Analysis. Chapmann and Hall. London, 1-32.

Depkes RI. 2000. Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan

Obat. Dirjen POM. Direktorat Pengawasan Obat Tradisional. 9-17. Depkes RI. 1980. Materia Medika Indonesia, jilid IV. 154-157



LEMBAR KERJA 2 PRAKTIKUM FITOKIMIA FAKULTAS FARMASI-UNIVERSITAS PADJADJARAN

PRAKTIKUM 2 : Ektraksi Metabolit Sekunder dari Simplisia

Tumbuhan Obat

NAMA MAHASISWA : .............................................................

NPM : .............................................................

KELOMPOK : .............................................................

NAMA SIMPLISIA : .............................................................

METODE EKSTRAKSI : .............................................................

HASIL PERCOBAAN :

1. Organoleptik Ekstrak

Bentuk : ....................

Warna : ....................

Bau : ....................

Rasa : ....................

2. Rendemen Ekstrak

Volume ekstrak kental : ................. mL

Berat cawan kosong : ................. g

Berat cawan + ekstrak : ................. g

Berat cawan+ekstrak setelah penguapan : ................. g

Berat simplisia awal : ................. g

Rendemen ekstrak : ................. % b/b

3. Bobot Jenis Ekstrak

Berat piknometer kosong : ................. g

Berat piknometer + air : ................. g

Berat air : ................. g

Volume piknometer : ................. ml

Kerapatan air : ................. g/mL

Berat piknometer + ekstrak : ................. g

Volume piknometer : ................. mL

Berat ekstrak : ................. g



Kerapatan ekstrak : ................. g/mL

Bobot jenis ekstrak : .................

4. Kadar Air Ekstrak

Berat ekstrak uji : ................. g

Volume air : ................. mL

Kadar air : ................. % v/b

5. Pola Kromatogram Lapis Tipis

No.bercak Rf

PENGAMATAN

Sinar

tampak UV 254 nm

UV 366

nm H2SO4 10%



6. Pola Dinamolisis

Keterangan :

Diameter 1 : ........ cm ; warna .........................






Hari/Tanggal :

( )

Hari/Tanggal :

( )


FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS PADJADJARAN

MODUL PRAKTIKUM 3

MODUL PRAKTIKUM 3

Metode Pemisahan Estrak

TUJUAN PERCOBAAN

Melakukan pemisahan metabolit sekunder dari ekstrak atau

fraksinasi tumbuhan obat dengan metode ekstraksi cair-cair (ECC) dan

fast chromatography.


Setelah melakukan praktikum ini, mahasiswa dapat memahami dan

mampu melakukan pemisahan metabolit sekunder dari ekstrak tumbuhan

obat dengan berbagai metode pemisahan.

TEORI

Pada sistem pemisahan selalu berhubungan dengan tiga hal, yaitu

sampel dan dua pelarut yang saling tidak bercampur satu sama lain.

Sampel akan terpartisi atau terdistribusi ke dalam kedua pelarut dan

pemisahan akan berakhir setelah terjadi kesetimbangan. Ada tiga macam

penggolongan metode pemisahan yang didasarkan pada jenis kedua

pelarut, jenis dari pelarut pertama (initial phase), dan pelarut kedua

(second phase). Pada masing-masing metode pemisahan kedua pelarut

mempunyai nama yang berlainan. Sebagai contoh nama pelarut-pelarut

tersebut diperlihatkan pada Tabel 1.

Tabel 1. Nama Pelarut pada Beberapa Metode Pemisahan

Metode

Pemisahan Pelarut I Pelarut II

Kromatografi Fase diam Fase gerak

ECC Rafinat Ekstraktan

Dialisis Renetat Difusat



MODUL PRAKTIKUM 3

Pada pengerjaan pemisahan setelah selesai selalu didiamkan sampai

terjadi pemisahan sempurna, perbandingan konsentrasi sampel

(komponen) pada kedua pelarut menjadi konstan dan dapat diekspresikan

sebagai konstanta kesetimbangan yang dinyatakan dengan koefisien

distribusi (KD) atau koefisien partisi (Kp). Jika terdapat dua macam

sampel (A dan B) dan kedua pelarut (1 dan 2), maka :

a. Untuk sampel A :

=! ! " ....................................(1)

! # ! #"

b. Untuk sampel B :

=!!" ....................................(2)

! # ! #"

Jika sampel (komponen) hanya satu, maka berlaku rumus sebagai

berikut.

= $ %$ %"

....................................(3)

[A] = menunjukkan konsentrasi molar komponen

Persamaan di atas merupakan persamaan yang sederhana dan

hanya berlaku kalau sampel (komponen) terdapat dalam satu bentuk.

Untuk perhitungan koefisien partisi yang akurat, persamaan di atas ditulis

sebagai berikut.

" $ % $ %" "

....................................(4)

di mana = koefisien aktivitas

Persamaan (4) dapat dituliskan juga sebagai berikut :

$ %$ %" ' ()

.' (") ."

....................................(5)



MODUL PRAKTIKUM 3

Dimana :

WA = berat A dalam gram MWA = BM sampel A V = Volume pelarut

Apabila BM A diabaikan, maka :

= $ %"$ %"

....................................(6)

(WA)1/(WA)2 = perbandingan berat A dalam pelarut 1 dan pelarut 2,

disebut perbandingan partisi atau faktor kapasitas, diberi simbol k dan

merupakan perbandingan molekul, maka

= , ", " ....................................(7)

Perbandingan volume pelarut disebut , jadi

- ./.0 ....................................(8)

Kp = k ....................................(9)

Persamaan (9) ini merupakan persamaan hubungan fundamental

teori kesetimbangan pada metode pemisahan.

EKSTRAKSI CAIR-CAIR (ECC)

Ekstraksi cair-cair merupakan metode pemisahan yang sangat

populer, yang menggunakan dua pelarut yang tidak bercampur satu

sama lain, yang disebut raffinate dan extractant. Pada pemisahan sampel

Q, maka sampel ini akan terpartisi ke dalam rafinat dan ekstraktan dan

persamaan-persamaan yang berlaku adalah sebagai berikut :

= 122 = "

3 ....................................(10)

=122 =

" ....................................(11)

4 .5.5678.9

006:; ................................(12)



MODUL PRAKTIKUM 3

dan untuk sampel yang tidak terekstraksi:

1 @ 4 1 @ .5.5678.9 .5678.91.5.5678.9

78.9.5678.9 =>

=>60 ............(13)

Kalau kedua volume pelarut sama, = 1, persamaan 12 dan 13

menjadi :

4 07860 ................................(14) dan

1 @ 4 787860 ................................(15)

Prosedur :

Sebanyak 1 gram ekstrak yang diperoleh dari hasil ekstraksi dengan

metode maserasi atau soxhlet dilarutkan dalam 100 ml air kemudian

dimasukkan ke dalam corong pisah dan ditambah n-heksana sama

banyak dengan pelarut pertama (100 ml), didiamkan. Kemudian dikocok,

sesekali udara di dalam corong pisah dikeluarkan, lalu dikocok lagi dan

didiamkan sampai kedua pelarut terpisah sempurna. Pemisahan diulang

sampai diperoleh fraksi n-heksana yang hampir tidak berwarna. Fraksi n-

heksana dan fraksi air dipisahkan. Pada fraksi air kemudian ditambahkan

pelarut etil asetat 100 ml dan dikocok seperti prosedur diatas. Fraksi n-

heksana, etil asetat dan air kemudian diuapkan dan dihitung rendemen

masing-masing fraksi.

FAST CHROMATOGRAPHY

Kromatografi dipercepat atau Fast Chromatography merupakan

metode kromatografi kolom yang dimodifikasi dengan cara pengurangan

tekanan melalui penghisapan dengan kompresor. Akibat pengurangan

tekanan ini kecepatan aliran pelarut (eluen) dalam kolom akan

meningkat dengan pesat. Hal ini merupakan solusi untuk mengatasi

lamanya waktu yang dibutuhkan pada kromatografi kolom konvensional.

Seperti halnya kromatografi konvensional, pemisahan komponen

pada kromatografi dipercepat dilakukan atas dasar perbedaan migrasi



MODUL PRAKTIKUM 3

diferensial melalui kolom yang berisi fasa diam. Ekstrak yang akan

dipisahkan ditempatkan di bagian atas penjerap dalam kolom, kemudian

dielusi dengan pelarut yang bertindak sebagai fasa gerak. Di dalam

kolom, komponen-komponen akan terpisah sebagai pita-pita yang pada

elusi seterusnya akan keluar meninggalkan kolom sebagai fraksi-fraksi

komponen yang terpisah. Larutan fraksi komponen yang keluar kolom

ditampung sebagai fraksi (disebut eluat atau efluen) untuk kemudian

dianalisis lebih lanjut.

Kecepatan perpindahan masing-masing komponen dalam kolom

ditentukan oleh kombinasi beberapa faktor yang mengatur karakterisasi

sistem adsorpsi dan partisi. Pemisahan dalam kolom adsorpsi tergantung

pada antar aksi antara permukaan penjerap, komponen yang dipisahkan,

serta sistem pelarut elusi. Pemisahan dalam kolom partisi merupakan

proses yang menyangkut partisi komponen dalam fasa gerak dan fasa

diam yang berupa lapisan tipis pada zat pendukung hidrofilik.

Pemilihan sistem penjerap untuk kolom kromatografi cepat dan

pemilihan sistem pelarut elusi dapat dilakukan dengan bantuan metode

kromatografi lapis tipis. Data kromatografi lapis tipis sebagai acuan

dalam pemilihan sistem penjerap dan sistem pelarut elusi.

Pengembangan sistem kromatografi lapis tipis sebagai model untuk

teknik kromatografi kolom memerlukan perhatian pada nilai Rf atau hRf

komponen yang dipisahkan. Komponen yang dapat dipisahkan dengan

baik melalui metode kromatografi cepat adalah komponen yang

mempunyai nilai hRf 20-30 pada sistem kromatografi lapis tipis. Makin

besar nilai hRf pada sistem kromatografi lapis tipis makin buruk hasil

pemisahan dengan sistem kromatografi cepat atau kromatografi kolom

konvensional.

Seperti halnya pada kromatografi lapis tipis, pada kromatogafi

kolom, baik kromatografi kolom konvensional maupun kromatografi

dipercepat, jenis atau tipe penjerap yang digunakan merupakan faktor

penting yang menentukan keberhasilan suatu pemisahan. Namun dari

berbagai jenis dan tipe penjerap dengan segala perbedaan dan sifat-sifat

fisikokimianya, alumina dan silika gel G merupakan penjerap yang umum

untuk pengerjaan kromatografi kolom, termasuk kromatografi kolom

dipercepat.



MODUL PRAKTIKUM 3

Prosedur :

Kolom diisi dengan 50 gram silika gel, sehingga dari tinggi

kolom terisi silika gel, kemudian vakum dijalankan dan permukaan silika

gel ditekan dengan batang pengaduk yang bersalut hingga menjadi padat

dan rapat. Setelah itu dimasukkan pelarut yang kepolarannya paling

rendah untuk mencoba apakah kolom telah sempurna. Jika kolom

sempurna, pelarut tersebut akan turun secara horizontal. Disamping itu

ekstrak ditimbang sebanyak 2 gram dan ditambahkan silika gel dengan

berat yang sama dengan ekstrak. Kemudian silika gel yang tersalut

ekstrak tersebut digerus hingga homogen dan halus kemudian diangin-

anginkan beberapa saat agar campuran silika gel dan ekstrak yang akan

dimasukkan kedalam kolom dalam keadaan kering. Setelah itu campuran

ekstrak dan silika gel dimasukkan dalam kolom dan diratakan kemudian

dilapisi dengan kertas saring. Pelarut dimasukkan dan vakum dijalankan

hinggga pelarut mengelusi komponen kimia dan kering didalam kolom,

setelah kering vakum dimatikan. Selanjutnya dimasukkan pelarut lain

yang tingkat kepolarannya lebih tinggi dari pelarut pertama dan vakum

dijalankan kembali. Begitu seterusnya hingga pelarut yang digunakan itu

memiliki tingkat kepolaran yang tinggi yang dapat mengelusi semua

komponen kimia dalam ekstrak. Hasil fraksi ditampung dalam botol 150

mL kemudian dianalisis lebih lanjut menggunakan KLT.

PUSTAKA

Miller, J.M. 1975. Separation Methods in Chemical Analysis. John Wiley & Sons : New York. 1-9.

Gritter, R.J.,Bobbitt, J.M., Schwarting, A.E. 1991. Pengantar Kromatografi, terbitan ke-2, Terj.: Dr. Kosasih P. Penerbit ITB : Bandung. 1-18, 89-96.



MODUL PRAKTIKUM 3

LEMBAR KERJA 3A PRAKTIKUM FITOKIMIA FAKULTAS FARMASI-UNIVERSITAS PADJADJARAN

PRAKTIKUM 3A : Metode Pemisahan Ekstrak

NAMA MAHASISWA : ............................................................

NPM : ............................................................

KELOMPOK : ............................................................

NAMA SIMPLISIA : ............................................................

METODE PEMISAHAN : EKSTRAKSI CAIR-CAIR

PROSEDUR :

I. EKSTRAKSI CAIR-CAIR (ECC)

1. Timbang 1 gram ekstrak yang diperoleh dari hasil ekstraksi

dengan metode maserasia tau soxhlet kemudian dilarutkan dalam

100 mL aquades. Cara melarutkannya adalah kepada ekstrak

ditambahkan sedikit demi sedikit aquades sampai ekstrak

tercampur homogen

2. Masukkan larutan ekstrak ke dalam corong pisah dan tambahkan

pelarut kedua (n-heksana) sama banyak dengan pelarut pertama

3. Kocok larutan dalam corong pisah dengan seksama sambil

sesekali udara dalam corong dikeluarkan

4. Diamkan larutan dalam corong pisah sampai kedua pelarut

terpisah sempurna dan pisahkan lapisan n-heksana.

5. Ulangi proses pengocokan sampai diperoleh fraksi n-heksana

yang hampir tidak berwarna (3x)

6. Lapisan airdalam corong pisah kemudian dikocok kembali dengan

pelarut etil asetat dengan cara yang sama seperti dengan pelarut

n-heksana.

II. Analisis kromatografi lapis tipis ekstrak dan fraksi-fraksi

Fraksi-fraksi dianalisis dengan metode kromatografi lapis tipis,

penjerap silika gel G atau silika gel GF 254, pengembang pelarut

campuran n-heksana dan etil asetat (7 : 3) atau disesuaikan dengan

pustaka, penampak bercak visual atau sinar ultraviolet 254 nm



MODUL PRAKTIKUM 3

HASIL PERCOBAAN :

Pola kromatogram ekstrak dan fraksi-fraksi:

Penjerap : ................................

Pengembang : ................................

Penampak bercak : ................................

Ekstrak Etanol Fraksi n-heksan Fraksi etil asetat Fraksi Air

Rf Warna Rf Warna Rf Warna Rf Warna


Hari/Tanggal :

( )

Hari/Tanggal :

( )



MODUL PRAKTIKUM 3

LEMBAR KERJA 3B PRAKTIKUM FITOKIMIA FAKULTAS FARMASI-UNIVERSITAS PADJADJARAN

PRAKTIKUM 3B : Metode Pemisahan Ekstrak

NAMA MAHASISWA : ............................................................

NPM : ............................................................

KELOMPOK : ............................................................

NAMA SIMPLISIA : ............................................................

METODE PEMISAHAN : FAST CHROMATOGRAPHY

PROSEDUR :

1. Kolom untuk kromatografi cepat disiapkan. Bagian alasnya dilapisi

kertas saring, kemudian ke dalamnya dimasukkan penjerap hinga

batas tertentu. Perhatikan keserbasamaan penjerap ke semua tempat

dalam kolom, karena adanya rongga-rongga udara dalam kolom atau

ketidakserbasamaan penjerap dalam kolom akan berpengaruh buruk

pada proses pemisahan.

2. Setelah kolom didiamkan sambil direndam dengan eluen

(pengkondisian kolom), ekstrak yang akan dipisahkan ditempatkan

diatas lapisan penjerap dalam bentuk lapisan tipis yang rata diatas

seluruh permukaan penjerap. Setelah itu dilakukan proses elusi

dengan campuran pelarut berbagai perbandingan. Elusi dipercepat

dengan cara penghisapan melalui pompa vakum.

3. Eluen diganti dengan campuran yang mempunyai perbandingan

berbeda dengan volume eluen yang sama dengan volume eluen pada

proses pertama. Pengerjaan dilakukan berulang seperti proses

pertama. Fraksi yang keluar kolom ditampung dan digunakan untuk

analisis lanjutan.

Komposisi larutan eluen adalah sebagai berikut:

No n-Heksana

(mL)

Etil Asetat

(mL)

1 100 0 2 90 10 3 80 20 4 70 30 5 60 40 6 50 50 7 40 60



MODUL PRAKTIKUM 3

8 30 70 9 20 80 10 10 90 11 0 100

4. Analisis kromatografi lapis tipis fraksi-fraksi

Fraksi-fraksi dianalisis dengan metode kromatografi lapis tipis,

penjerap silika gel G atau silika gel GF 254, pelarut campuran n-

heksana dan etil asetat (4:1) atau disesuaikan dengan pustaka,

penampak bercak visual atau sinar ultraviolet 254 nm.

HASIL PERCOBAAN :

I. DATA FRAKSI :

Fraksi Warna Fraksi Warna

1 7

2 8

3 9

4 10

5 11

6 12

II. DATA Rf :

Penjerap : .....................................

Pengembang : .....................................

Penampak bercak : .....................................

Fraksi Rf Fraksi Rf

1 7

2 8

3 9

4 10

5 11

6 12



MODUL PRAKTIKUM 3

POLA KROMATOGRAM : KESIMPULAN :


Hari/Tanggal :

( )

Hari/Tanggal :

( )



MODUL PRAKTIKUM 4

MODUL PRAKTIKUM 4

Metode Pemurnian Fraksi

TUJUAN PERCOBAAN

Melakukan pemurnian fraksi yang diperoleh dari hasil fraksinasipada

praktikum 3 sehingga dapat memisahkan suatu senyawa/bercak/isolat

dengan metode Kromatografi Lapis Tipis Preparatif atau Kromatografi

Kolom.


Setelah melakukan praktikum ini mahasiswa mampu memahami

dan mampu melakukan pemurnian fraksi sehingga diperoleh suatu isolat

dengan berbagai metode kromatografi.

TEORI

Pemurnian fraksi dimaksudkan untuk memisahkan suatu komponen

dari komponen lainnya yang sama-sama terkandung dalam suatu fraksi.

Terdapat beberapa metode untuk melakukan pemisahan komponen dan

biasanya dilakukan dengan satu atau beberapa kombinasi teknik

kromatografi. Teknik kromatografi yang biasa digunakan adalah

kromatografi lapis tipis, kromatografi kolom, kromatografi cair kinerja

tinggi dan kromatografi gas cair.

KLT (Kromatografi Lapis Tipis) merupakan salah satu teknik

kromatografi, yaitu suatu teknik atau metode pemisahan / pemurnian

senyawa kimia berdasarkan pada perbedaan koefisien partisi senyawa

dalam fasa diam dan fasa gerak, atau berdasarkan daya adsorpsi

senyawa pada adsorben yang bertindak sebagai fasa diam. Fasa diam

adalah fasa yang terikat pada pendukung, sedangkan fasa gerak adalah

fasa yang bergerak melalui fasa diam.

Senyawa yang akan dipisahkan ikut bergerak bersama fasa gerak.

Selama senyawa bergerak terjadi proses partisi komponen di antara fasa

gerak dan fasa diam, atau terjadi proses adsorpsi senyawa oleh adsorben

yang bertindak sebagai fasa diam. Akibat adanya perbedaan koefisien



MODUL PRAKTIKUM 4

partisi dan / atau afinitas adsorpsi, terjadilah perbedaan kecepatan

gerakan senyawa-senyawa yang menyebabkan terjadinya pemisahan.

Berdasarkan jenis fasa gerak dan fasa diam, kromatografi dapat

dibedakan atas berbagai tipe sebagai berikut :

FasaGerak FasaDiam Tipe

Kromatografi

Cairan Padatan Kr. Cair-Padat

Gas Padatan Kr. Gas-Padat

Cairan Cairan Kr. Cair-Cair

Gas Cairan Kr. Gas-Cair

Selain itu, penggolongan kromatografi juga dapat dilakukan

berdasar pada jenis fasa geraknya saja, berdasarkan mekanisme

pemisahan, berdasarkan jenis pendukung, atau berdasarkan proses

pengembangannya.

Penggolonggan berdasarkan fasa gerak memberikan dua tipe

kromatografi sebagai berikut :

Fasa

Gerak

Tipe

Kromatografi DasarPemisahan

Gas Kr. Gas Keatsirian dan kestabilan termal

senyawa

Cairan Kr. Cair Proses partisi atau adsorpsi

Penggunaan kromatografi berdasarkan mekanisme pemisahan :

Mekanisme

Pemisahan Tipe Kromatografi

Adsorpsi Kr. Adsorpsi

Partisi Kr. Partisi

Pertukaran Ion Kr. Pertukaran Ion

Perbedaan Ukuran

Partikel

Kr. Saringan Gel

Kr. Eksklusi Molekular



MODUL PRAKTIKUM 4

Pembagian kromatografi berdasarkan jenis pendukungnya adalah

sebagai berikut :

JenisPendukung Tipe Kromatografi

Kertas Kr. Kertas

Kaca/Lempeng

logam tipis

Kr. Lapis Tipis (KLT)

Kolom Kr. Kolom

Fast Chromatography

Berdasarkan arah pengembangannya kromatografi dapat dibedakan

atas beberapa tipe, yaitu :

Arah Pengembangan TipeKromatografi

Horizontal Kr. Horizontal

Vertikal Menurun Kr. VertikalMenurun

Vertikal Menaik Kr. VertikalMenaik

Sirkular Kr. Sirkular

Dua Arah TegakLurus Kr. Dua Arah

Pada kromatografi dibedakan istilah pengembangan dan elusi.

Istilah pengembangan digunakan untuk kromatografi datar yang fasa

geraknya berjalan melalui fasa diam tanpa terjadi pengeluaran senyawa

dari fasa diamnya. Istilah ini digunakan pada kromatografi datar seperti

kromatografi kertas dan kromatografi lapis tipis (KLT). Istilah elusi

digunakan pada kromatografi yang fasa geraknya melalui fasa diam

sambil membawa senyawa keluar dari fasa diam. Istilah ini digunakan

pada kromatografi kolom.

Kromatografi lapis tipis adalah salah satu tipe dari kromatografi

datar, dengan fasa diam berupa adsorben yang melekat pada pendukung

berupa lempeng kaca atau logam tipis.Penjerap yang berbeda-beda

dapat disaputkan pada pelat kaca atau penyangga lain, seperti silika gel,

alumunium oksida,celite, kalisium hidroksida, damar penukar ion,



MODUL PRAKTIKUM 4

magnesium sulfat, poliamida, sephadex, polifenilpirolidon, selulosa atau

campuran dua atau lebih bahan diatas.

Pemisahan pada KLT dapat berlangsung melalui dua mekanisme,

yaitu mekanisme adsorpsi dan mekanisme partisi. Bertitik tolak dari

kedua mekanisme tersebut, pada KLT selain polaritas sistem yang

merupakan penentu keberhasilan pemisahan, pemilihan sistem adsorpsi,

sistem partisi, serta pelarut merupakan faktor-faktor yang harus

diperhatikan.

Selain pemilihan pelarut yang berdasar pada falsafah polar loves

polar, adsorben merupakan faktor yang harus diperhatikan untuk

keberhasilan pemisahan pada metode KLT. Berbagai adsorben dapat

digunakan pada KLT, namun yang paling umum digunakan adalah silika

gel, alumina, kieselguhr (tanah diatomae), dan selulosa. Pemisahan

adsorben untuk suatu pemisahan KLT selain mempertimbangkan sifat

kimia senyawa sifat kimia adsorben juga harus diperhatikan tingkat /

derajat aktif adsorbennya. Menurut Brockmann, derajat aktif adsorben ini

dapat dilihat dari kandungan air dalam adsorben tersebut. Adsorben

dengan kandungan air paling rendah merupakan adsorben yang

mempunyai derajat aktif tertinggi dan dinyatakan sebagai adsorben

dengan derajat aktif I, sedangkan adsorben dengan derajat aktif

terendah dinyatakan sebagai adsorben derajataktif V. Adsorben derajat

aktif 1 dapat ditingkatkan derajat aktifnya dengan cara memanaskan

adsorben tersebut pada suhu 105o C dalam waktu tertentu. Proses

tersebut dikenal dengan sebutan pengaktifan adsorben.

Proses pengembangan pada KLT umumnya dibedakan atas

pengembangan satu kali dan pengembangan berulang. Metode

pengembangan berulang ini merupakan modifikasi dari pengembangan

biasa, yaitu kromatogram dikembangkan dengan suatu fasa gerak,

kemudian diangkat dan dikeringkan tanpa pemanasan. Setelah itu

kromatogram dikembangkan dengan fasa gerak yang sama. Banyaknya

pengulangan proses pengembangan yang optimal untuk memperoleh

pemisahan yang baik dinyatakan oleh Thomas dengan persamaan :

AB8C 1

ln1 @ FG

Atau :



MODUL PRAKTIKUM 4

AB8C 1

2,303log1 @ FG

Nilai Rf merupakan ukuran relatif letak suatu bercak senyawa dalam

kromatogram terhadap garis akhir pergerakan fasa gerak.

FG NOPOQROASTUVWXYZ[\WARO]ONOPOQROASTUVWXYZ[GO\OSWPOQ

Berbeda dengan kromatografi kertas, keterulangan

(reproduksibilitas) nilai Rf pada KLT sangat tidak dapat diharapkan

karena berbagai faktor penyebab seperti misalnya derajat aktif adsorben,

kejenuhan tabung pengembang, kondisi pengembangan, homogenitas

adsorben, suhu, dan lain-lain.

Selain pengembangan satu arah (menaik atau menurun, tetapi

umumnya menaik), KLT juga dapat dikembangkan dalam dua arah yang

saling tegak lurus dengan fasa gerak yang sama atau berbeda.

Pengembangan seperti itu dikenal dengan sebutan KLT dua arah.

Sebagai pendeteksi bercak pada kromatogram dapat dilakukan

dengan visual untuk komponen yang berwarna, sinar UV 254 nm dan 366

nm, pereaksi penampak bercak seperti uap iodium,asam sulfat pekat

dalam etanol, asam sulfat kromat, ninhidrin dalam butanol, asam difenil

borat, vanillin sulfat, dragendorff, dan sebagainya.

KLT PREPARATIF

Kromatografi lapis tipis preparatif dimaksudkan untuk memisahkan

senyawa dalam jumlah gram. Pelat dapat dipersiapkan lebih tebal (0,5

2 mm). Sampel diteteskan ke pelat dengan alat syringe membentuk

suatu pita (band). Pendeteksian senyawa tidak boleh merusak senyawa.

Pita yang akan dipisahkan dapat dikerok dan dilarutkan dalam pelarut

untuk mendapatkan senyawa yang diinginkan.

Cara pembuatan pelat Silika gel pada penyangga kaca :

Bersihkan dulu kaca yang sudah diatur di atas alat Desaga dengan

aseton, supaya bebas dari lemak. Buat bubur Silika gel 25 g dalam 50

ml air suling dan dikocok kuat dalam labu erlenmeyer. Tuangkan semua



MODUL PRAKTIKUM 4

bubur ke dalam tabung desaga lalu cepat-cepat dibalik diatas kaca

pertama, kemudian segera diratakan pada kaca berikutnya sampai kaca

terakhir. Diamkan lapisan silika pada pelat hingga mengering pada suhu

kamar kira-kira 10-20 menit, lalu pelat dikeringkan dalam oven dengan

suhu 110-120 C selama 1-2 jam.

KROMATOGRAFI KOLOM

Kromatografi kolom biasanya digunakan untuk memisahkan

komponen dalam jumlah lebih besar (gram). Mempersiapkan kolom

harus dilakukan dengan hati-hati agar dihasilkan kolom kemas yang

serba sama (homogen). Jika kolom tidak mempunyai penyaring kaca

masir, maka kita harus menyumbat kolom dengan segumpal kaca wool

atau kapas. Sumbat ini harus terendam dengan pelarut pengelusi

setinggi 10 cm. Selanjutnya penjerap dijadikan bubur dalam gelas piala

menggunakan pelarut yang sama, lalu dituangkan hati-hati ke dalam

kolom dan tidak terputus-putus, untuk mencegah terbentuknya lapisan.

Setelah itu penjerap dibiarkan turun dan kelebihan pelarut dikeluarkan

melalui keran. Pada poliamid dianjurkan kemasan direndam dulu selama

satu jam, supaya mengembang. Langkah pertama pada kromatografi

kolom ialah menempatkan larutan cuplikan pada kolom sedemikian

rupasehingga terbentuk pita yang siap untuk dielusi. Untuk mencapai

iitu, cuplikan harus dilarutkan dalam pelarut yang volumenya sesedikit

mungkin. Pelarut yang dipakai harus sama dengan pelarut pengelusi,

dan sebaiknya pelarut yang kepolarannya paling rendah, walaupun hal ini

tidak selalu dapat dilaksanakan berhubung dengan kelarutannya.

Menempatkan larutan pekat pada kolom harus hati-hati supaya kemasan

kolom tidak terganggu, dan untuk ini dianjurkan menggunakan pipet.

Cuplikan dibiarkan meresap ke dalam kolom, baru proses kromatografi

dimulai.

Jika cuplikan tidak dapat melarutdalam eluen, maka dapat

digunakan cara penjerapan. Cuplikan dilarutkan ke dalam sedikit pelarut

sembarang yang cocok, dan dicampur dengan sedikit penjerap. Lalu

penjerap dikeringkan dan ditaburkan di atas kolom semerata mungkin

sebagai serbuk.



MODUL PRAKTIKUM 4

Gambar. Kromatografi Kolom

PUSTAKA

Gritter, R.J., Bobbitt, J.M., Schwarting A.E. 1991. Introduction of Chromatography (Pengantar kromatografi), terjemahan Kosasih Padmawinata. Penerbit ITB. Bandung.

Hostettmann, K, Hostettman M. 1995. Preparative Chromatography

Techniques (Cara Kromatografi Preparatif). terjemahan Kosasih Padmawinata, Penerbit ITB. Bandung.

Moelyono MW. 1996. Pengantar Kromatografi. Laboratorium

Farmakognosi Jurusan Farmasi FMIPA UNPAD. Sastrohamidjojo, H. 1996. Sintesis Bahan Alam. GajahMadaUniversity

Press. Yogyakarta. Stahl, E. 1973. Drug Analysis by Chromatography and Microscopy :

A Practical Supplement to Pharmacopeias. Ann Arbor Science Publ. Michigan.



MODUL PRAKTIKUM 4

LEMBAR KERJA 4A PRAKTIKUM FITOKIMIA FAKULTAS FARMASI-UNIVERSITAS PADJADJARAN

PRAKTIKUM 4 : Metode Pemurnian Fraksi (KLT Preparatif)

NAMA MAHASISWA : ............................................................

NPM : ............................................................

KELOMPOK : ............................................................

NAMA SIMPLISIA : ............................................................

PROSEDUR KLT PREPARATIF :

1. Pelat kaca dibersihkan dengan aseton dan disusun diatas alat

Desaga.

2. Bubur silika gel dibuat dengan cara mencampurkan 25 gram silika gel

dengan 50 mL aquades dalam Erlenmeyer, kocok kuat-kuat sampai

tercampur homogen

3. Tuangkan semua bubur silika gel ke dalam alat tabung Desaga dan

segera dibalik bubur silika gel sehingga berada diatas kaca, kemudian

segera diratakan pada kaca berikutnya sampai dengan kaca terakhir

4. Biarkan lapisan silika gel mengering pada suhu kamar selama 10-20

menit lalu dipanaskan di dalam oven dengan suhu 110-120C selama

1-2 jam

5. Setelah kering pelat dapat digunakan untuk KLT preparatif.

Caranya: sejumlah fraksi dilarutkan dalam larutan pengembang yang

telah disiapkan dan tutulkan cuplikan secara berderet sehingga

membentuk pita sebagai garis awal pengembangan. Keringkan di

udara beberapa saat.

6. Pelat dimasukkan ke dalam chamber yang telah jenuh dengan larutan

pengembang dan lakukan kromatografi sampai tanda batas

7. Amati pita yang terbentuk secara visual atau dengan sinar UV, kerok

salah satu pita yang terbentuk dan saring hasil kerokan dengan

pelarut pengembang yang digunakan.

8. Lakukan evaluasi terhadap isolat dengan Kromatografi Lapis Tipis.

HASIL PERCOBAAN :

Data analisis kromatografi lapis tipis preparatif :



MODUL PRAKTIKUM 4

Penjerap : ...................................................

Pengembang : ...................................................

Penampak bercak : ...................................................

Jumlah pita yang terbentuk : ..................................................

No. pita yang dikerok : ...................................................

Kromatogram Isolat :

Kesimpulan :


Hari/Tanggal :

( )

Hari/Tanggal :

( )



MODUL PRAKTIKUM 4

LEMBAR KERJA 4B PRAKTIKUM FITOKIMIA FAKULTAS FARMASI-UNIVERSITAS PADJADJARAN

PRAKTIKUM 4 : Metode Pemurnian Fraksi (Kromatografi Kolom)

NAMA MAHASISWA : ............................................................

NPM : ............................................................

KELOMPOK : ............................................................

NAMA SIMPLISIA : ............................................................

PROSEDUR KROMATOGRAFI KOLOM :

1. Larutan pengelusi disiapkan dengan perbandingan yang telah

ditentukan

2. Kolom kromatografi dengan diameter 1 cm disiapkan. Bagian

alasnya dilapisi kapasdan masukkan eluen setinggi kira-kira 10 cm.

3. Penjerap silika gel ditimbang seksama dan dicampurkan dengan

eluen secukupnya hingga dihasilkan bubur silika yang homogen

4. Bubur silika dituangkan ke dalam kolom perlahan-lahan dan tidak

terputus sambil kolom diketuk-ketuk agar penjerap mampat.

Kelebihan eluen dalam kolom dikeluarkan dengan membuka keran

kolom. Perhatikan keserbasamaan penjerap dalam kolom, karena

adanya rongga udara atau ketidakserbasamaan penjerap akan

berpengaruh buruk pada proses pemisahan.

5. Kolom kemudian dielusi dengan larutan pengelusi hingga diperoleh

kolom yang stabil.

6. Cuplikan fraksi yang akan dipisahkan ditimbang sebanyak 1/20 dari

berat silika dan dimasukkan dalam kolom dengan cara kering yaitu :

Cuplikan dikeringkan dengan sedikit silika dan gerus hingga

homogen. Sampel dimasukkan hati-hati diatas penjerap membentuk

lapisan tipis merata.

7. Lakukan elusi dengan perlahan sehingga terjadi pemisahan yang baik

dan terbentuk pita-pita dalam kolom. Eluat ditampung setiap 5 ml ke

dalam vial.

8. Lakukan evaluasi isolat dengan kromatografi lapis tipis.



MODUL PRAKTIKUM 4

HASIL PERCOBAAN :

Data analisis kromatografi Kolom:

Penjerap : ............................................................

Eluen : ............................................................

Berat Silika : ............................................................

Berat cuplikan : ............................................................

Jumlah fraksi : ............................................................

Kromatogram fraksi :

Kesimpulan :


Hari/Tanggal :

( )

Hari/Tanggal :

( )



MODUL PRAKTIKUM 5

MODUL PRAKTIKUM 5

Isolasi dan Penetapan Kadar Minyak Atsiri

TUJUAN PERCOBAAN

Melakukan isolasi minyak atsiri dengan cara destilasi air, destilasi uap dan

air, enfleurasi, dan pemerasan, serta melakukan penetapan kadar minyak

atsirinya menggunakan alat destilasi Stahl.


Setelah melakukan praktikum ini mahasiswa mampu melakukan

isolasi minyak atsiri dari suatu simplisia dengan cara destilasi air,

destilasi uap dan air, enfleurasi, dan pengepresan, serta melakukan

penetapan kadar minyak atsirinya menggunakan alat destilasi Stahl.

TEORI

Minyak atsiri merupakan suatu lipophilic mixtures yang mudah

menguap, yang pada umumnya diperoleh dengan cara destilasi uap dari

bagian-bagian suatu tumbuhan. Minyak atsiri mempunyai bau yang khas

dan tersusun oleh suatu susunan senyawa kimia yang kompleks yang

terdiri atas puluhan hingga ratusan komponen. Sifat umum dari minyak

atsiri adalah mudah menguap, berbau aromatik, bila masih segar

umumnya tidak berwarna atau kekuning-kuningan yang berubah menjadi

gelap pada pendiaman, tidak mengeruhkan air, optis aktif, mempunyai

indeks bias tinggi. Minyak atsiri yang diperoleh dengan cara destilasi bila

diteteskan pada kertas saring, tetesan tersebut tidak akan meninggalkan

bekas seperti bintik lemak.

Secara kimia umumnya minyak atsiri terdiri atas komponen-

komponen terpenoid, umumnya monoterpen dan seskuiterpen sebagai

penyusun utama. Selain itu terdapat berbagai komponen lain yang

merupakan komponen minor, yang terdiri atas senyawa-senyawa kimia

alifatik, aromatik, turunan benzena, dan lain-lain. Pada umumnya

komponen minyak atsiri golongan mono dan seskuiterpen merupakan

senyawa kimia turunan isopren C5H8. Monoterpen tersusun atas 2 unit


FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS

panduan praktikum fitokimia

Documents