Microbiología General y Estomatología ESOD – FACS – UNJBG. 2012

TECNICA DE CULTIVO: SIEMBRA Y AISLAMIENTO DE BACTERIAS

I. INTRODUCCIONUn medio de cultivo permite el crecimiento y reproducción in vitro de las bacterias, para observar sus

propiedades y conseguir un mejor estudio bioquímico e inmunológico, al contar con material en cantidad suficiente. Por ello consta de algunas propiedades (pH adecuado, sales, nutrientes, condicione de aero-anaerobiosis, etc.), que serán las más idóneas para la bacteria que deseamos estudiar y se citan en cada una de ellas en particular, en la bacteriología sistemática.

Los medios de cultivo se dividen por su finalidad en: medios de enriquecimiento que tratan de aumentar el número de bacteria existentes, si consideramos que se encuentran en cantidad muy exigua, a la vez que inhiben la flora de asociación acompañante (y de aislamiento (que tienen por fin conseguir una colonia o clon, es decir, grupo de bacterias procedentes de una sola, con todas sus propiedades); los dos primeros son principalmente líquidos y los segundos, sólidos. Los medios selectivos son aquellos que poseen algún componente que permite o no le crecimiento de una especie bacteriana, carácter de importancias para su identificación, y los diferenciales, aquellos que las diversas especies que hay que testar alteran de forma distinta, por lo que suelen llevar indicadores (sustancias que varían su coloración según el pH del medio) u otros índices de reacciones químicas definidas. Ambos medios selectivos o diferenciales pueden ser líquidos o sólidos. El aislamiento es la separación de los microorganismos en grupos, que puedan identificarse siguiendo los principios de la microbiología.

El aislamiento de un microorganismo para obtener un cultivo puro (Se entiende por cultivo puro a la descendencia (clon) de una sola célula), se realiza principalmente en un medio sólido. Se inicia por la separación de una sola célula a partir de una población y requiere también que la colonia que surja de esta célula se mantenga separada de otras células o colonias.

El aislamiento de un cultivo puro puede hacerse también en medios líquidos, siempre que el organismo predomine en el material de partida. Por una dilución en serie de la suspensión en un medio se consigue que en la última dilución se encuentren unas cuantas que al ser sembradas quedarán separadas.

II. OBJETIVOS Identificar métodos eficaces para el aislamiento de microorganismos. Conocer algunos métodos para obtener un cultivo puro.

III. MATERIALES Muestras de cultivos bacterianos Asas y agujas de inoculación Placas de Petri y tubos de ensayo con medio de cultivo Agar nutritivo Mecheros

IV. METODOS 4.1 TECNICAS DE AISLAMIENTO Y SIEMBRA

A. Aislamiento por estría simple: para muestras con poca cantidad de microorganismos.B. Aislamiento por estría cruzada: Inocular con el asa de Kohlle la placa y realizar las estrías tal y como se

muestra en el siguiente esquema C. Aislamiento por extensión con varilla (asa de Drigalsky)

Para el aislamiento de bacterias, mohos y levaduras podemos realizar la técnica de extensión con varilla, donde el inóculo sobre la placa con el medio es de 0,1 ml. La técnica consiste en colocar el inóculo sobre el medio de cultivo, posteriormente se toma una varilla de vidrio o de acero inoxidable del que tenga la longitud del diámetro de la placa de Petri Esta varilla se introduce en un frasco con alcohol y se flamea a la flama del mechero por lo menos tres veces para esterilizarla, se deja enfriar y se esparce el inoculo sobre la superficie del agar Se deja en posición vertical derecha por 5 minutos, y se incuba

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D. Siembra por la técnica de vertido en placa 1 Colocar 1 mL de la dilución que le indiquen en una caja de Petri y realizar el procedimiento por duplicado. 2 Agregar de 15 a 20 ml de agar cuenta estándar, mantenido a 45°C. 3 Homogenizar mediante 6 movimientos de derecha a izquierda, 6 en el sentido de las manecillas del reloj, 6 en el sentido contrario y 6 de atrás a adelante, sobre una superficie lisa y horizontal hasta lograr una completa incorporación del inoculo en el medio, cuidar que el medio no moje la cubierta de la caja. 4 El tiempo transcurrido desde el momento en que la muestra se incorpora al diluyente hasta que finalmente se adiciona el medio de cultivo a las cajas, no debe exceder de 20 minutos.5 Dejar solidificar el medio e incubar a 35 °C por 24 horas o si es necesario hasta las 48 horas, para el caso de bacterias y para el caso de los mohos y levaduras de 3 a 5 días. Los movimientos rotatorios tienen por objetivo la distribución homogénea del inoculo, claro está que con la ayuda de las diluciones de tal forma que el recuento para bacterias sea de 25 a 250 Unidades Formadoras de colonias (UFC)y para mohos y levaduras de 15 a 150 UFC

E. Siembra en tubos de cultivo con medio sólido Por lo general se emplean para la conservación de un cultivo puro proveniente de una placa o para la siembra de pruebas bioquímicas como el medio OF, SIM y MIO. El pico de flauta del medio agarizado se inocula primero por punción (cuando es necesario), seguido por una estría en el pico de flauta desde el fondo a la parte superior con un movimiento en “S” a medida que se retira el asa. Existen dos variedades de cultivo en tubo: - Por estrías Se utilizan los medios de cultivo inclinados, se toma una muestra de alguna colonia con el

asa estéril y sobre la superficie del medio se desliza ésta en forma de estrías. - Por picadura Se utilizan los medios de cultivo en un tubo solidificado en forma inclinada y en forma

recta, se toma la colonia y se introduce en el medio picándolo longitudinalmente. Cultivo por punto Esta técnica de cultivo, generalmente se utiliza cuando necesitamos una gran cantidad de moho.

F. Cultivo en medio líquido Siembra en medios de cultivo líquidos. La siembra en tubos de cultivo en medio líquido, el tubo debe inclinarse en un ángulo de 30 ° y el asa de inoculación debe tocar la superficie interna del vidrio, justo encima del punto donde la superficie del agar forma un ángulo agudo. Cuando el tubo es vuelto a su posición vertical, el área de inoculación queda sumergida debajo de la superficie, se puede agitar suavemente el asa en el interior del medio líquido.

G. Cultivo en medio semisólidoA partir de un cultivo de 18-24 horas en medio sólido, sembrar por punción profunda con aguja de inoculación recta (no usar ansa con anillo). Se debe inocular el centro del tubo, y la punción debe abarcar 2 tercios de profundidad del medio de cultivo desde la superficie. Es importante que la siembra se realice en línea recta.Siembra en tubos con medio sólido Cultivo en medio líquido Cultivo en medio semisólido

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4.2 MORFOLOGÍA COLONIAL Morfología colonial en placa para bacterias Una vez sembrada la placa la descripción de cada una de las colonias debe incluir: a) TAMAÑO: Diámetro en mm, los límites de tamaño de las colonias varían desde fracciones de milímetros

hasta 10 mm de diámetro. La mayoría de los microorganismos forman colonias de tamaño limitado al tiempo de incubación.

b) FORMA Y ELEVACIÓN FORMA: Es la apreciación general de su figura: ELEVACIÓN: Que puede ser:

c) BORDE O MARGEN: Se refiere al contorno de las colonias y puede ser: Entero, ondulado, Lobulado, crenado, filamentoso o rizado.

BORDE O MARGEN: Otras característicasCOLOR: Blanco, amarillo, marrón, anaranjado,negro, etcSUPERFICIE: Lisa o rugosa ASPECTO: Húmedo, seco, algodonoso, pulverulento, aterciopelado, velloso, granuloso CONSISTENCIA: Suave (butirosa), viscosa, membranosa o dura, esta prueba se tiene que realizar con la ayuda de una asa. LUZ REFLEJADA: colonias pueden ser brillantes o mate LUZ TRANSMITIDA: Las colonias pueden ser translúcidas o transparentes

V. RESULTADOS Observe los diferentes tipos de crecimiento

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