Replikacija DNA

Vjeran prijenos genetičke informacije s roditelja na potomstvo Semikonzervativna replikacija – dva lanca DNA mogu se razdvojiti i

služiti kao kalup za sintezu novog lanca – svaka nova molekula DNA sadrži jedan roditeljski lanac

Točna replikacija ključna za život svih stanica i organizma Kad se stanica dijeli cjelokupan genom mora biti udvostručen Potrebna prisutnost cijelog niza enzima Glavni enzim – DNA polimeraza – katalizira spajanje deoksiribonukleozid-

5’-trifosfata (dNTP) Nužna prisutnost korigirajućih mehanizama kako bi učestalost pogrešaka

bila što manja

DNA polimeraze – eukarioti

polimeraze: α,γ,δ i ε. Polimeraza γ – u mitohondrijima Preostala četiri enzima u jezgri

Sve polimeraze sintetiziraju DNA samo u 5’ prema 3’ kraju dodajući dNTP na 3’ hidroksilnu skupinu rastućeg lanca

DNA polimeraze mogu dodati nove dNTP samo na prethodno formirani lanac početnice koje su vodikovim vezama spojene s kalupom

DNA polimeraze ne mogu de novo započeti sintezu novog lanca, za razliku od RNA polimeraza

Sinteza u smjeru 5’→3’

Autoradiografijom s H3 timidinom obilježena je DNA i vizualizirana fotografskim filmom. Ovaj shematski prikaz ilustrira dvije replikacijske rašlje

Replikacijske rašlje

Lanci DNA su antiparalelni, teku u suprotnim smjerovima. Ne mogu se oba kontinuirano sintetizirati u 5’ prema 3’

smjeru. Samo se jedan lanac sintetizira kontinuirano (vodeći lanac), a

drugi u kratkim diskontinuiranim Okazakijevim fragmentima (zaostali, tromi lanac)

RNA polimeraza može započeti sintezu de novo, a enzim nazvan primaza sintetizira kratke fragmente RNA (3-10 nukleotida). Okazakijevi fragmenti sintetiziraju se produljenjem ovih RNA početnica.

DNA ligaza spaja kratke fragmente

Replikacijske rašlje

Sinteza vodećeg i tromog lanca

Inicijacija Okazakijevih fragmenata RNA-početnicama

Uklanjanje RNA početnica i spajanje Okazakijevih fragmenata

Glavna replikacijska polimeraza je polimeraza III koja obavlja sintezu vodećeg lanca i Okazakijevih fragmenata produljenjem RNA početnice

Polimeraza I uklanja RNA početnicu i popunjava pukotine između Okazakijevih fragmenata

Polimeraza I posjeduje 3’→5’ i 5’ → 3’ egzonukleaznu aktivnost

5’ → 3’ egzonukleaznom aktivnošću se uklanjaju ribonukleotidi s 5’ krajeva Okazakijevih fragmenata

Prokarioti – E. coli

Polimeraza α u kompleksu s primazom sudjeluje u sintezi RNA početnica

Polimeraza δ sintetizira vodeći lanac. Polimeraza ε sintetizira tromi lanac. Polimeraza δ također

popunjava pukotine nakon uklanjanja početnice kombiniranim djelovanjem RNaze H i 5’ → 3’ egzonukleazom.

Eukarioti

Uloga DNA polimeraza u E. coli i stanicama sisavaca

Polimeraza III E. coli i eukariotske polimeraze δ i ε združene su s dvije vrste pomoćnih proteina:

Proteini za stavljanje stezaljke (RFC), clamp loading proteins specifično prepoznaju i vežu se na mjesto spajanja početnice i kalupa

Proteini kližuće stezaljke (PCNA), sliding-clamp proteins vežu se na protein za stavljanje stezaljke (RFC) i stvaraju prsten oko DNA kalupa nakon čega se DNA polimeraza veže za PCNA odnosno na mjesto spajanja početnice i kalupa

Prsten stvoren PCNA proteinima održava združenost polimeraze s njenim kalupom

Pomoćni proteini DNA polimeraze

Helikaze su enzimi koji kataliziraju razmotavanje roditeljske DNA ispred replikacijskih rašlji

Proteini koji vežu jednolančanu DNA, single stranded DNA-binding proteins, nakon toga stabiliziraju razmotani DNA kalup održavajući ga ispruženim.

Topoizomeraza katalizira reverzibilno kidanje i ponovno spajanje lanaca DNA. Topoizomeraza I kida samo jedan lanac, a topoizomeraza II oba lanca.

Prekidi nastali djelovanjem topoizomeraze služe za slobodno odmatanje (rotiranje) lanaca DNA oko kalupa da se spriječi uvijanje DNA ispred replikacijskih rašlji

Ostali pomoćni enzimi

Djelovanje helikaze i proteina koji veže jednolančanu DNA

Djelovanje topoizomeraze za vrijeme replikacije DNA

Sinteza tromog i vodećeg lanca se odvija istovremeno Stvaraju se dimeri replikativnih DNA polimeraza s pratećim

proteinima Jedna molekula DNA polimeraze sintetizira vodeći, a druga

tromi lanac Tromi lanac stvara petlju ispod replikacijskih rašlji tako da se

podjedinica DNA polimeraze koja ga sintetizira kreće u istom smjeru kao i podjedinica koja sintetizira vodeći lanac

Model replikacijskih rašlji E. coli

http://sites.sinauer.com/cooper6e/animation0601.html

Učestalost pogrešaka u replikaciji – jedna pogrešno ugrađena baza na svakih 109 do 1010 ugrađenih nukleotida.

na osnovi komplementarnosti sparivanja baza – 1 pogreška na 103 nukleotida.

Polimeraza aktivno diskriminira ugradnju pogrešne baze. Sparivanje komplementarnih nukleotida inducira konformacijske promjene DNA polimeraze koje dovode do ugradnje ispravnog nukleotida u DNA – smanjenje greške pri replikaciji na 10-6

Vjernost replikacije

Korektivna aktivnost DNA polimeraze

Mehanizam odgovoran za daljnju preciznost replikacije Polimeraza I E. coli ima 3’→5’ kao i 5’→3’

egzonukleaznu aktivnost. 5’→3’ aktivnost djeluje u smjeru DNA sinteze i pomaže

uklanjanju RNA-početnice iz Okazakijevih fragmenata. 3’→5’ aktivnost djeluje u suprotnom smjeru od sinteze

DNA i provjerava točnost novog lanca. Smanjivanje pogrešaka na 10-9

Korektivna aktivnost DNA polimeraze

Ishodište replikacije – specifično vezno mjesto za proteine koji iniciraju proces replikacije.

Bakterije – ishodište replikacije je građeno od 245 parova baza. Za to mjesto prvo se veže inicijacijski protein – započinje razmatanje dvostruke uzvojnice.

Veže se helikaza i proteini koji vežu jednolančanu DNA Primaza započinje sintezu vodećeg lanca Formiraju se dvije replikacijske rašlje i sinteza teče u

suprotnim smjerovima.

Ishodište i inicijacija replikacije

Ishodište replikacije E. coli

E. coli (4x106 parova baza) – jedno ishodište replikacije Vrijeme replikacije – 30 min Sisavci (3x109 parova baza) – kada bi bilo jedno ishodište

replikacije trebala bi 3 tjedna za replikaciju cijele DNA Brzina replikacije u stanicama sisavaca 10 puta sporija od

bakterija zbog pakiranja kromatina. Više tisuća replikacijskih mjesta – replikacija unutar nekoliko

sati Ishodišta replikacije udaljena 50-300 kb, humani genom ima

oko 30 000 ishodišta replikacije.

Ishodišta replikacije u eukariotskim kromosomima

Telomere i telomeraza

DNA polimeraze nisu u stanju produljiti krajnje 5’ dijelove linearnih molekula (replikacija ide u 5’→3’) – posebni mehanizmi replikacije

Telomere – terminalni dijelovi kromosoma. Uzastopna ponavljanja jednostavnih sljedova DNA

Enzim telomeraza – sposoban replicirati krajnje dijelove DNA u odsutnosti DNA – kalupa.

Telomeraza je reverzna transkriptaza – sintetizira DNA na osnovu RNA kalupa.

Telomerazni enzimski kompleks sadrži svoj vlastiti RNA-kalup komplementaran s ponavljajućim telomernim sljedovima.

Djelovanje telomeraze

Za bolje razumijevanje pogledati:http://www.youtube.com/watch?v=AJNoTmWsE0s