1

Regulation of calcium-sensing receptor by amyloid-beta-42: implications for Alzheimer’s disease 

2ste Master Biomedische WetenschappenJabar Zada Freba

 

Academiejaar: 2012 – 2013 Promotor: Prof. Dr. K. D’Herde Co-promotor: Dr. A. Diez Fraile

2

Overzicht

1. Probleemstelling2. Hypothese3. Materiaal en methode4. Resultaten en discussie5. Conclusies

3

1. Probleemstelling

De ziekte van Alzheimer Neurodegeneratief

Microscopisch: • tau-eiwit kluwens • amyloid-β plaques

Verhoogde secretie van Amyloid-β (Aβ) peptide

Vicieuze cirkel

4

1. Probleemstelling

De pathogenese van Alzheimer Oorzaak?

Stoornis in calcium homeostase

Calcium-sensing receptor (CaSR)

Amyloid-β een agonist van CaSR

GPCR wijdverspreid in het CZS

5

2. Hypothese CaSR is betrokken in Aβ42 gemedieerde activatie van

astrocyten.

6

3. Materialen en methoden

Celcultuur• NHA = Normale Humane Astrocyten

Reagentia• Oligomere humane Aβ42 (1-20µM; 6 &12h)• CaSR agonist, NPS-R-568 (0,1-10µM; 6&12h)

Methoden• Transmissie elektronenmicroscopie (TEM)• Immunocytochemie• F-actine kleuring• RT-qPCR

4. Resultaten1. Transmissie-electronenmicroscopie

• NHA cellijn weinig gekend• Karakteristatie van NHA

subculturen• Glycogeen opstapeling• Geëlongeerde

mitochondriën• Cytoplasmatische

extensies• Gecoate Vesikels en

caveolae• Gap juncties

Astrocyten

4. Resultaten2. Immunocytochemie

Niet-gepermeabiliseerd Gepermeabiliseerd

CaSRKern

4. Resultaten

Controle Aβ42

Hu J, Akama KT, Krafft GA, Chromy BA, Van Eldik LJ (1998). Amyloid-beta peptide activates cultured astrocytes: morphological alterations, cytokine induction and nitric oxide release. Brain research 785:195-206.

3. Aβ42-gemedieerde activatie van astrocyten

3.1. F-actine kleuring en DAPI• 6h amyloïd-β-42

• Geen geactiveerde morfologie te zien

4. Resultaten

3.2. Evaluatie van iNOS, TNF-α en IL-1β door RT-qPCR

• Geen detectie van iNOS en TNF-α• Lichte upregulatie van IL-1β na 6 h incubatie met 1 µM Aβ42

4. Resultaten

Amyloid-beta-42 NPS-R-568

1.Oligomere vorm van Aβ42? Negatieve kleuring en TEM

2.GFAP (Glial Fibrillary Acidic protein)-kleuring

4. Resultaten

Ahmed M, Davis J, Aucoin D, et al (2007) Structural conversion of neurotoxic amyloid-beta(1-42) oligomers to fibrils. Nat Struct Mol Biol. 17: 561-556.

fibrillair oligomeer

4. Evaluatie van mogelijke valkuilen

5. Conclusie Astrocyten: ultrastructurele kenmerken CaSR expressie geen dosis- en tijdsafhankelijke morfologische activatie na incubatie

met Aβ42 of NPS-R-568 Geen verhoogde productie van onderzochte pro-inflammatoire

moleculen Aβ42 juist geaggregeerd GFAP negatiefOndanks de aanwezigheid van CaSR geen activatie van NHA door

Aβ42 of NPS-R-568 waargenemen.Hypothese: Mogelijks hebben de GFAP negatieve astrocyten een verlaagde responsiviteit aan Aβ42.

14

Bedankt voor uw aandacht ! Vragen?