03.02.2015

1

Rusmiddelanalyser -laboratorieanalyser og hurtigtester

Elisabeth Leere Øiestad

Avdeling for rusmiddelforskning og metodeutvikling Folkehelseintituttet

Farmasøytisk InstituttUniversitetet i Oslo

Oversikt

• Rusmidler – hva er nå det i 2015?

• Hurtigtester

– Urin

– Spytt

• Immunologi

• Kromatografi

Hva er rusmidler?

AmfetaminMetamfetaminEcstasyCannabisKokainHeroinLSDFensyklidinKhatGHB

BenzodiazepinerOpioiderAndre legemidler med ruspotensiale

VG 6/1-2015

(EMCDDA European Monitoring Centre for Drugs and Drug Addiction – early warning system)

Synthetic cannabinoids

Cathinones

Phenethylamines

Piperazines

Other(chemicals, plants, medicines)

Tryptamines

Økende mengde nyestoffer

03.02.2015

2

Stoff Antall positive

Prosent2013

2013 2012

1 Etanol 4826 5081 56 %*

2 THC 1884 1821 35 %

3 Klonazepam 1883 1935 35 %

4 Amfetamin 1712 1486 32 %

5 Metamfetamin 1512 1574 28 %

6 Diazepam 1058 1116 20 %

7 Alprazolam 441 402 8 %

8 Oxazepam 263 230 5 %

9 Nitrazepam 224 203 4 %

10 Morfin 193 217 4 %

2014

Stoff Antall positive funn

Etanol 3904

THC 2168

Klonazepam 2045

Amfetamin 2030

Metamfetamin 1098

Diazepam 928

Alprazolam 515

Oxazepam 205

Morfin 203

Nitrazepam 180

Zopiklon 172

Kodein 168

Metadon 168

6-mam 141

Buprenorfin 122

GHB 114

Pregabalin 101

Tramadol 96

Ritalinsyre 92

MDMA 86

Fentanyl 85

Kokain 80

Ketamin 79

Metylfenidat 71

Zolpidem 63

Oksykodon 40

Flunitrazepam 27

Etizolam 9

Flubromazepam 9

Metiopropamin 9

5F-Apinaca 7

Lorazepam 7

Diclazepam 6

Alfa-PVP 5

Fenazepam 5

Midazolam 5

PMMA 5

Bromazepam 4

Meprobamat 3

Etylmorfin 2

Karisoprodol 2

LSD 2

PMA 2

Mefedron 1

Pyrazolam 1

Funn av NPS i kjøresaker 2014

vvvc

v

v

vv

v

vv

vvc

v

Totalt n=56

Hurtigtester“Narkometer”

Laboratorieanalyser

Kromatografiske analyser

Virkning i hjernenLagring i vev

STOFF

Blod

Omdannelse (lever)

Utskillelse (nyrer)

PRØVETAKING

STOFFPRODUKT

Urin

PRODUKT

STOFF-injeksjon-inhalasjon-peroralt

Urin

Stoffkonsentrasjon

InntakTidTimer Dager/uker

Blod

Cmax ofte 12-24 timer etter inntak

spytt

03.02.2015

3

10.02.2011 13

Minutes Hours YearsDays Weeks Months

Blod

Spytt

Svette

Urin

Hår og negler

Påvisningstid i forskjellige biologiske medier

NB! Påvisningstid avhenger alltid av

konsentrasjon i mediet og deteksjonsgrense

Tilpasset fra: Caplan YH, Goldberger BA. Alternative specimens for workplace drug testing. J

Anal Toxicol 2001;25:396-9. 14

Hurtigtester – en immunologisk test

• Baserer seg på reaksjonen med et antistoff og et antigen

(egentlig et kroppsfremmed stoff som danner antistoffer eller i

vårt tilfelle et rusmiddel/legemiddel)

• Gjenkjenner deler av molekylet

• Gjenkjenner ofte deler som er felles for mange stoff

Immunologisk metode

• gjenkjenner deler av

molekylet

• gjenkjenner deler

som er felles

innenfor

stoffgruppen

Direkte Konkurranse«Sandwich»

Benzodiazepiner: ulike stoffer• Diazepam (Valium)• Oxazepam (Sobril)

• Alprazolam (Xanor)• Bromazepam• Midazolam (Dormicum)• Lorazepam

• Nitrazepam (Apodorm)• Flunitrazepam (Flunipam, Rohypnol)• Klonazepam (Rivotril) • Fenazepam

• Zopiklon (Imovane)• Zolpidem (Stilnoct)

BENZO IMM

0

Et immunologisk resultat kan ikke skille mellom benzodiazepiner.

Dersom pasienten står ”lovlig” på Sobril kan han/hun innta ubegrenset av andre benzodiazepiner uten at vi ser det på analyseresultatet.

Hvilket stoff er blitt inntatt?

03.02.2015

4

Interaksjoner

• Beslektede stoffer

– Amfetamin : Efedrin (i bl.a.Tuxidrin og andre hostesafter samt noen

naturpreparater). Rinexin /Monydrin. Nesespray(?). Fenfluramin (slankemidler).

Selegilin (mot parkinson).

– Opiater : Kodein (Paralgin Forte), Valmuefrø. I «gamle dager» Tuxi hostesaft.

• Helt andre stoffer

20

Falsk positiv/falsk negativ

• Falsk negativ – testen er ikke følsom nok

• Finner ikke stoff som er i kroppen

• Falsk positiv - testen reagerer på andre stoffer

Hurtigtester

• Teststripsene lages i store ark

– Kan være ujevne, slik at en batch er «bedre» enn en annen

– Flere leverandører kan ha samme teststripe «i bunnen»

– Påvisningsgrenser satt ut fra ønske evt. hva som er «mulig»

Påvisningsgrenser

Amfetamin Benzo-

diazepiner

Buprenorfin Kokain-

stoffer

Metadon Opiater Cannabis-

stoffer

Påvisnings-

grenser

(ng/ml)300 300 10 300 300 300 50

OK for oxazepam (Sobril), ikke for klonazepam (Rivotril)

Kryssreaktivitet

• Testen er laget basert på ett stoff

• Men både inntatt stoff og metabolitter eller beslektede stoffer gir utslag

Stoff Cut-off (ng/ml) Kryssreaktivitet (%)

Morfin 20 1006-monoacetylmorfin (6-MAM) 35 57

Kodein 25 80

Opiatkonsentrasjon (kombinert) = 100% kons (morfin) + 57% kons(6-MAM) + 80% kons(kodein)

03.02.2015

5

Veikanttesting – ”narkometer”

År: 2004

År: 2009 År: 2013

27

Faste grenser for narkotika og sløvende legemidler i trafikken

• Vegtrafikkloven er endret til å innføre faste grenser for

andre stoffer enn alkohol

• Et utvalg ledet av Jørg Mørland foreslo

konsentrasjonsgrenser i desember 2010

• 20 stoffer: Både narkotika og sløvende legemidler

• Det ble også åpnet for bruk av hurtigtester for spytt

Påvisningsgrenser

Amfetamin Benzo-

diazepiner

Kokain-

stoffer

Opiater Cannabis-

stoffer

URIN

Påvisnings-

grenser

(ng/ml)

300 300 300 300 50

SPYTT

Påvisnings-

grenser

(ng/ml)

60 25 20 40 20

Driving under the influence of alcohol, drugs and medicines

Kjøring under påvirkning av alkohol, andre rusmidler og medisiner

www.druid-project.eu

Påvirkning i forhold til konsentrasjon

Nu

mb

er

of

pers

on

s

Diazepam blood-concentration

Konstruert eksempel valiumbrukere blod

Figur fra H. Gjerde, FHI

03.02.2015

6

Nu

mb

er

of

pers

on

s

Diazepam blood-concentration

1 person

Influenced

Possibly influenced

Not influenced

Påvirkning i forhold til konsentrasjonKonstruert eksempel: Valium brukere (81 personer)

Figur fra H. Gjerde, FHI

Nu

mb

er

of

pers

on

s

Diazepam oral-fluid concentration

Valium-brukere: konsentrasjonsfordeling i spytt

Spytt reflekterer ikke nødvendigvis

blodkonsentrasjonen

1 person

Influenced

Possibly influenced

Not influenced

Påvirkning i forhold til konsentrasjon

Figur fra H. Gjerde, FHI

Undersøkelse av spytt i forhold til blod

• I DRUID-prosjektet ble det samlet inn spytt og blodprøver fra flere hundre bilførere

– I Italia, Belgia og Finland for å undersøke tilfeldige bilister (veikantstudie)

– I Norge for å undersøke bilister som ble mistenkt for ruspåvirket kjøring i samarbeid med Oslo Politikammer

• Spytt og blod ble analysert med sikre metoder (LC-MS)

– Alle prøver ble analysert uavhengig av mistanke

– Lave cutoff-grenser

• Mengden rusmiddel i spytt ble sammenlignet med mengden i blod

Valium (diazepam)

0,0

5,0

10,0

15,0

20,0

0,0 100,0 200,0 300,0 400,0

Diazepam i blod (ng/ml)

Dia

zep

am

i s

pytt

(n

g/m

l)

(I tillegg 5 personer utenfor skalaen)

Hurtigtester i spytt

– Mange falskt negative og noen falskt positive prøverPositive svar må bekreftes

– Spesielt dårlige for påvisning av cannabis

– Kan ikke påvise lav-dose benzodiazepiner unntatt ved stort inntak

– Enkelte er vanskelige i bruk og lite robuste

Immunologiske screeningmetoder

• Mer nøyaktige enn hurtigtester

• Er rask

• Skiller ut negative prøver

• Gir indikasjon på stoffgruppe

• Kan finne nye stoffer med kryssreaktivitet

03.02.2015

7

Immunologiske screeningmetoder

• Positiv screening betyr ikke nødvendigvis at prøven er positiv

• Tar ofte lang tind å inkludere nye stoffer

• Kan ha problemer med følsomhet

• Kan være dyr ved stort repertoar

Analyseprogram

• Amfetaminer

• Opiater

• Kokain-stoffer

• Cannabis

• Benzodiazepiner

• Buprenorfin

• Kreatinin

• pH

• Metadon

• Oxycodon

• 6-MAM

• Barbiturater

• Etylglukronid

• PCP, LSD

• Syntetiske cannabinoider

pH og kreatinin

• pH (surhetsgrad) påvirker utskillelse av visse

stoffer f.eks amfetamin

• pH kan påvirke noen analysemetoder

• kreatinin måles for å kunne korrigere for

vanninnhold i urinen

• kontroll av evt. manipulering

Urinmanipulering

• Før prøvetaking: – Fortynning av urin ved inntak av store

væskemengder.

– Inntak av sure stoffer (sitron etc)

• Under prøvetaking: – Annens urin.

• Etter prøvetaking: – Tilsetting av diverse, fortynning med vann.

• Kun fantasien setter grenser!

• Ikke så aktuelt med kjemikalier

• Finnes også produkter å få kjøpt for å forstyrre spyttanalyser

• Lettere å ta prøvene under observasjon gir mindre risiko for manipulering

• Nytt spytt dannes kontinuerlig

– Kan skylle munnen og vente en stund ved mistanke

Manipulering av spytt? Rettssikker analyse

• 2 uavhengige analysemetoder

• 2 uavhengige prøveuttak

MottakRegistrering

Screening BekreftelseVurdering

påvist stoff(er)

Ikke påvist Ikke påvist

negativ negativ

pos pos

Immunologi

Kromatografi

03.02.2015

8

Kvalitetskrav FHI

• Akkrediterte analyser

• Standard prosedyrer

• Standarder og kontroller analyseres sammen med reelle prøver

• Strenge krav til resultatene på kontrollprøvene (både positive og negative kontroller)

• Intern og ekstern kvalitetskontroll

• Reanalyse

Kromatografiske analyser

• Ønsker å skille mellom alle de ulike

stoffene = ønsker spesifikk metode

1 2 3 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

4

1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0

Retention time (min)

1 2 3 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

4

1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0

Retention time (min)

1.Benzoylecgonin 5. Oksymorfon 9. Dihydrokodein 13. Acetylkodein2.Norkodein 6. 6-mam 10. Folkodin 14. Kokain3.Morfin 7. Kodein 11. Oksykodon4.Hydromorfon 8. Hydrokodon 12. Etylmorfin

Eksempel fra opiat/kokain-bekreftelse Cosylan - hostesaft

Paralgin forte – smertestillende 6-MAM – fra heroin

Time1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 6.50 7.00 7.50 8.00

%

0

100

1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 6.50 7.00 7.50 8.00

%

0

100

1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 6.50 7.00 7.50 8.00

%

0

100

1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 6.50 7.00 7.50 8.00

%

0

100

1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 6.50 7.00 7.50 8.00

%

0

100

1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 6.50 7.00 7.50 8.00

%

0

100

1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 6.50 7.00 7.50 8.00

%

0

100

1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 6.50 7.00 7.50 8.00

%

0

100

1001_34417_03 4: MRM of 14 Channels ES+ 319.9 > 273.9 (Klonazepam d4)

8.83e5

3.70

3.81 4.014.14

1001_34417_03 4: MRM of 14 Channels ES+ 319 > 268 (Metadon d9)

2.00e7

3.77

4.14

1001_34417_03 4: MRM of 14 Channels ES+ 315.9 > 269.9 (Klonazepam)

2.45e5

3.70

3.784.05

1001_34417_03 4: MRM of 14 Channels ES+ 315.9 > 182 (Bromazepam)

1.46e5

3.65

3.72

1001_34417_03 4: MRM of 14 Channels ES+ 313.9 > 268 (Flunitrazepam)

1.29e5

3.78

1001_34417_03 4: MRM of 14 Channels ES+ 310 > 265 (Metadon)

6.61e6

3.78

4.01 4.08

1001_34417_03 4: MRM of 14 Channels ES+ 309 > 280.9 (Alprazolam)

1.39e6

4.01

3.763.67 4.12

1001_34417_03 4: MRM of 14 Channels ES+ 286.9 > 240.9 (Oksazepam)

3.00e6

3.93

3.763.694.03

4.17

Oksazepam

Metadon

Klonazepam

Bromazepam

Flunitrazepam

Alprazolam

Ved kromatografi koblet til MS kan man se flere stoffer samtidig

- ett signal per stoff

Ikke mulig med en FID eller UV-detektor

Analyse av isomere

• Beta-Hydroxy butyrsyre er et “ketonlegeme” sliksom aceton eller acetoacetate

• Mye ketonlegemer indikerer diabetisk elleralkoholisk ketoacidose

• For alkoholisk ketoacidose er det høyestkonsentrasjon av BHB

BHB

• Jevnlig saker med muligketoacidose

• Kunne vi separere GHB og BHB iGHB-metoden?– Kvantisere BHB

• Eller kunne BHB gi falsk positivGHB i obduksjonssaker?

GHB

BHB

03.02.2015

9

Time0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40

%

0

100

0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40

%

0

100

0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40

%

0

100

0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40

%

0

100

43040_103_2_03 2: MRM of 2 Channels ES+ 111.242 > 93.231 (GHB-d6)

4.77e6

1.09

43040_103_2_03 5: MRM of 4 Channels ES+ 166.13 > 148.12 (Pregabalin-d6)

1.32e7

1.97

43040_103_2_03 6: MRM of 3 Channels ES+ 160.13 > 142.12 (Pregabalin)

5.95e6

1.98

43040_103_2_03 3: MRM of 3 Channels ES+ 105.242 > 87.231 (GHB/BHB)

1.85e6

1.43

1.12

1.52

GHB BHB

Relativt lett å inkludere nye stoffer

• For å inkludere et nytt stoff må man

– Ha renstoff

– Bestemme retensjonstid (og evt. MS-overganger/UV-

spekter)

– Sjekke om prøveopparbeidelsesmetoden får med stoffet

– Sjekke mulige forstyrrelser

– NB! Mer validering ved akkreditering

Mescalin

http://www.deadiversion.usdoj.gov/drug_chem_info/nbome.pdf

• 2.5I-NBOMe i standard

• 2.5I-NBOMe i spyttprøve fra Oslos uteliv

Syntetiske cannabinoider – hva skal man lete etter i urin?

Enklere med blod eller spytt hvor stoffet selv kan analyseres

Bruke flere kromatografiske kolonner for forskjellig

selektivitet

Compound:

1. JWH-073 N-butanoic acid

2. JWH-018 N-pentanoic acid

3. UR-144 N-5-OH-pentanoic

acid-degradant

4. UR-144 N-5-OH-pentanoic acid

5. RCS-4 N-5-OH-pentyl

6. Diazepam-D5

7. JWH-073 N-4-OH-butyl

8. AM-2201 N-4-OH-pentyl

9. JWH-018 N-5-OH-pentyl

10. MAM-2201 N-4-OH-pentyl

11. JWH-122 N-5-OH-pentyl

12. AM-2233

13. UR-144 N-5-OH-pentyl

14. MAM-2201

6 14 13 10 8 5 11 9 7 12 4 3 2 1

1.25 1.50 1.75 2.00 2.25 2.50 2.75 3.00 3.25 3.50 Time (min) =>

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

2.6 2.8 3.0 3.2 3.4 3.6 3.8 4.0 Time (min) =>

UPC2-MS/MS analyse

UPLC-MS/MS analyse

03.02.2015

10

Ukjente rusmidler….

RT = 6.36Ion ratio 9

RT = 6.41Ion ratio 28

Men hva er dette?5F-APINACA

Kromatografiske analyser

• Spesifikk metode

• Kan gi kvantitative svar

– Vurdering av påvirkning

– Vurdering av nye inntak

• Relativt lett å legge til stoffer

• Finner vanligvis bare det vi ser etter

Spørsmål ?