Prof. dr Tanja Berić

EKOLOGIJA MIKROORGANIZAMA

Metode za procenu diverziteta

mikroorganizama u ekosistemu

Principi ekologije mikroorganizama

Tipovi staništa koje naseljavaju MO

Biofilm

• Odgajivačke i neodgajivačke metode

Metode za procenu diverziteta

mikroorganizama u ekosistemu

Obogaćivanje i izolovanje

• Izolovanje podrazumeva izdvajanje mikroorganizma iz zajednice u kojoj se

nalazi, uglavnom kroz proces obogaćivanja, i dobijanje organizma u vidu

čiste kulture

• Obezbeđivanje uslova (medijum, uslovi inkubiranja...) koji su selektivni za

željeni mikroorganizam i kontraselektivni za neželjene mikroorganizme

• Ceo proces započinje uzorkovanjem iz odgovarajuće sredine (inokulum)

• Odgajivačke i neodgajivačke metode

• Konceptualni tvorac metode obogaćivanja Martinus Beijerinck

• Prvi izolovao azotofiksirajuće bakterije Azotobacter ovom metodom

Izolovanje bakterija Azotobacter sp.

Kolona Vinogradskog

• Veštački mikrobijalni ekosistem.

• Dugoročni izvor bakterija za izolovanje i/ili testiranje mogućnosti razgradnje različitih supstrata.

Pristrasnost metode obogaćivanja

• Vrlo izražena kod obogaćivanja u tečnom medijumu.

• Izrašće mikroorganizmi koji najbrže rastu pod datim uslovima, u laboratoriji.

•Realno, takvi organizmi u prirodnim uslovima su najčešće samo minorne komponente

ekosistema dok će se MO čiji procesi značajni za sam ekosistem ostati „ispod radara”

•Veliki problem u mikrobijalnoj ekologiji.

• Donekle se prevazilazi razblaživanjem inokuluma pre obogaćivanja.

Čista kultura

• Išarana ploča

• Razređenje u agaru

• MPN

Provera čiste kulture:

- mikroskopija

- karakteristike kolonija na/u agaru

- rast u drugim medijumima

Analize sastava zajednica bez gajenja

Bojenja:

Bojenje fluorescentnim bojama (DAPI (slika a), akridin narandžasto, SYBR Green I;

boje koje se vezuju za DNK)

Vijabilno bojenje (zelena boja koja ulazi u sve ćelije, i žive i mrtve; crvena boja koja

ulazi samo u ćelije sa narušenom membranom) (slika b)

najveće ograničenje mikroskopskih metoda: ne otkrivaju filogenetski diverzitet

može se prevazići korišćenjem filogenetskih boja (FISH)

a b

Analize sastava zajednica bez gajenja

Filogenetsko bojenje upotrebom FISH (Fluorescentna In

Situ Hibridizacija)

• fluorescentni oligonukleotidi koji odgovaraju delu

sekvence za 16S rRNK (npr.)

• ulaze u ćelije ne izazivajući lizu, hibridizuju sa targetom i

daju fluorescenciju kad se uzorci posmatraju na

fluorescentnom mikroskopu

• vrlo specifične ili nespecifične probe

• kombinacijom FISH i DAPI bojenja može se odrediti

zastuplenost neke filogenetske grupe u uzorku

• specifični geni kao mera biodiverziteta

• filotip

• tehnike u upotrebi:

- analiza DNK fragmenata elektroforezom (DGGE, T-RFLP,

ARISA)

– molekularno kloniranje

- sekvenciranje DNK i analiza

DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)

• u agarozni gel se dodaje gradijent denaturišućeg agensa

• razdvaja uzorke iste veličine a različite sekvence

• zavisno od primarne sekvence, fragmenti DNK će

denaturisati (i zaustavljati se) u gelu na različitim pozicijama

• razdvojeni fragmenti se mogu sekvencirati

Metode analiza zajednica bazirane na PCR

• jedan gen vs svi geni

• analiza totalnih DNK sekvenci u zajednici

• opisuje funkcionalni kapacitet zajednice

• zavisi od uspona tehnologije sekvenciranja

• metatranskriptomika – analiza totalnih

RNK u zajednici

• daje informacije o ekspresiji gena

• metaproteomika – mera diverziteta i

zastupljenosti različitih proteina u zajednici

Metagenomika

Šta smo naučili?

• iznenađujući rezultati

• otkriveno je mnogo sekvenci 16S rRNK koje se razlikuju od svih laboratorijskih uzoraka

• obično su najzastupljeniji MO u zajednicama oni koji „odbijaju da se odgaje u

laboratoriji”

• odgajivačke metode su nam otkrije jedva 0,1% diverziteta MO u prirodi

• Ekologija - nauka koja proučava međusobne odnose organizama i njihove životne sredine

• Ekosistem – dinamični kompleks biotičkih (zajednice biljaka, životinja i mikroorganizama) i abiotičkih (uslovi nežive prirode) faktora

• čini ga mnogo različitih staništa

• stanište je deo ekositema koji je najpogodniji za jednu (ili nekoliko) populacija

• mikroorganizmi su prisutni u SVIM staništima a neka staništa su naseljena EKSKLUZIVNO mikroorganizmima

• Populacija – grupa MO iste vrste na istom mestu u isto vreme

• Zajednica – asocijacija više populacija različitih vrsta MO, na jednom staništu, koji stupaju u složene međusobne odnose

Ekologija mikroorganizama

• Diverzitet vrsta MO u zajednici definiše se kao:

- bogatstvo vrsta (totalni broj vrsta u zajednici)

- proporcionalna zastupljenost vrste (abundanca)

• vrlo promeljiva kategorija

• u funkciji uslova sredine, ponajviše količine nutrijenata

• metabolički slične populacije MO koje koriste isti resurs

na sličan način čine ESNAF

• stanište koje dele članovi esnafa a koje obezbeđuje

nutrijente i druge uslove je NIŠA

• grupe esnafa formiraju zajednice

Ekologija mikroorganizama

Energija u mikroekosistemu

• energija protiče kroz ekosistem

• ulazi kao sunčeva svetlost, redukovana neorganska jedinjenja i organska jedinjenja

• fotoautotrofi transformišu svetlosnu energiju u hemijsku u sintetisanim organskim jedinjenjima

• hemolitotrofi fiksiraju CO2 i doprinose pulu org. mat.

• ta autohtona org. jedinjenja zajedno sa alohtonim (ona koja ulaze u ekosistem spolja) pokreću kataboličku aktivnost heterotrofa

• heterotrofi oksiduju org. materiju do CO2 procesom disanja i fermentacije

• materija kruži u ekosistemu

• biogeohemijski ciklusi kruženja elemenata

Populacije, esnafi i zajednice

jezerskog ekosistema

Energija u mikroekosistemu

• biogeohemijski ciklus definiše transformaciju elemenata koja je katalizovana bilo hemijskim bilo biološkim (ili oba) agensima

• u mnogim slučajevima MO su jedini biološki agensi koji mogu regenerisati neke forme elemenata

• biogeohemijski ciklus = kruženje nutrijenata

• oksido-redukcione reakcije

• često su ciklusi različitih elemenata povezani

• S i C, npr.

Populacije, esnafi i zajednice

jezerskog ekosistema

Sredina i mikrosredina

• Mikroorganizami - veoma intiman kontakt sa spoljašnjom sredinom (velika površina ćelija prema zapremini), otuda i posebna osetljivost na promene činilaca spoljašnje sredine (t , pH, svetlost, koncetracije organskih i neorganskih jedinjenja, voda, itd.)

• uslovi mikrosredine (sredine koja neposredno okružuje ćelije mikroorganizama) su vrlo značajni

• podložni brzim i čestim promenama uslova

• na ograničenom prostoru veliki broj mikrostaništa

• za bakteriju koja raste i razmnožava se u grumenu zemlje mikrosredina je mnogo važnija od makrosredine (odnosno šume ili polja) u kojoj se grumen nalazi

Distribucija kiseonika u čestici zemljišta

• primarna niša – sredina u kojoj je MO najuspešniji

• može da opstane i izvan primarne niše gde je manje ekološki uspešan

• fundamentalna niša – pun raspon sredinskih uslova pod kojima neki MO može da raste

• niša ≠ mikrosredina

• mikrosredina je specifična lokacija unutar niše

Sredina i mikrosredina

Količina nutrijenata i brzina rasta mikroorganizama izvan

laboratorije

• eksponencijalan rast izuzetno redak

• u ekosistemu (mikrosredini) MO rastu na mahove

• količina i distribucija nutrijenata predstavlja ograničavajući faktor

• vreme generacije E. coli u crevima 12h u labu 20min

• mešovite populacije naspram čiste kulture

• kompeticija i kooperacija

Smena generacija u mikroekositemu

• promena uslova sredine utiče na promenu broja i vrste MO u mikroekosistemu - sukcesija

• dominantna vrsta može biti zamenjena vrstom koja je bila u manjini ako se sredina promenila u korist malobrojne

• sirovo mleko

• Rhodobacter (u uslovima odsustva svetlosti populaciju koja proizvodi fotosintetičke pigmente će veoma brzo zameniti mutantni soj koji ih ne proizvodi)

• bakterije rezistentne na antibiotike

Smena generacija u sirovom mleku

Promene u populaciji Rhodobacter

izazvane promenom svetlosnog režima

• zajednica ćelija MO prilepljenih za neku površinu i obuhvaćenih adhezivnim matriksom koje same produkuju

• funkcionalna zajednica koja raste, ne prosta nakupina ćelija

• matriks – smeša polisaharida koji sadrži i proteine i nukleinske kiseline

• funkcioniše kao lepak i zamka za nutrijente

• biofilm obično gradi nekoliko poroznih slojeva

• zajednica 1, 2 ili više vrsta MO

• biofilm na zubima (plak) gradi nekoliko stotina vrsta bakterija i arhea

• inherentna osobina biofilma – tolerancija na antibiotike i toksine (posledica sporijeg rasta i fizičke nedostupnosti)

Biofilm

• započinje prilepljivanjem nekoliko prethodno pokretnih ćelija za neku površinu (pilima, bičem, specijalnim proteinima...)

• lepljenje za površinu je signal za ekspresiju gena specifičnih za biofilm (intracelularni signalni molekuli koji pokreću formiranje matriksa)

• ćelije gube bič, dele se i komuniciraju sa drugim ćelijama

• prelazak sa planktonskog na sesilni način života (u biofilmu) okida c-di GMP kao sekundarni mesendžer

• prenosi signale iz sredine do ćelijske mašinerije koja generiše odgovor na sredinske uslove (pokretljivost, virulenciju, formiranje biofilma)

• vezuje se za proteine koji moduliraju aktivnost motora flageluma i enzime koji učestvuju u nastanku matriksa

• osim interćelijske potrebna je i intraćelijska komunikacija za razvoj i održavanje biofilma

• quorum sensing

Formiranje biofilma

Formiranje biofilma u čeličnoj cevi za vodu

Zašto biofilm?

1. Vid mikrobijalne samoodbrane koja poboljašava preživljavanje

- biofilm se opire fizičkim silama koje bi inače mogle otkloniti slabo pričvršćene ćelije na nekoj površini

- biofilm odoleva fagocitozi (ćelija imunskog sistema)

- sprečava/smanjuje penetraciju antibiotika i toksina

2. Omogućava ostanak u najpovoljijoj ekološkoj niši

3. Bolja ćelijska komunikacija povećava preživljavanje

4. Tipičan način rasta MO u prirodi („default mode“ za rast prokariota)

Kontrola formiranja biofilma

• izuzetno teška a neophodna

• u medicini i industriji štete od formiranja biofilma mogu biti velike i opasne

• radi se na antimikrobnim agensima koji mogu da prodru u strukturu biofilma ili da spreče samo formiranje biofilma sprečavajući interćelijsku komunikaciju

• furanoni obećavaju kao preventiva za formiranje biofilma na površinama

Mikrobijalni tepih (mat)

• ekstremno debeli biofilm

• grade ga ili cijanobakterije ili hemolitotrofi kao primarni producenti

• ekosistem za sebe

• cijanobakterijski tepih danas ograničen uglavnom na tople izvore i hiperslana staništa

• u ostalim vodenim ekosistemima kompeticija je prejaka

• hemolitotrofni tepih – na površini morskih sedimenata

• sulfat-redukujuća Thioploca sa vakuolama ispunjenim nitratom

Mikrobiologija zemljišta

• kopnena staništa koju čine 2 tipa sredine:

- samo zemljište

- voda u zemljištu i stenama

• Zemljište se razvija tokom dugo vremena kroz kompleksne interakcije materijala (stene, pesak, glina...), topografije, klime i živih organizama

• 2 tipa zemljišta:

- mineralna, od stena i drugog neorganskog materijala (dominantan tip)

- organska, od sedimenata u močvarama i barama

• većina zemljišta predstavlja kombinaciju ova dva tipa

Sastav i formiranje zemljišta

• najmanje 4 komponente:

- neorganske mineralne materije ≈ 40%

- organske materije ≈ 5%

- voda i vazduh ≈ 50%

- mikro- i makroorganizmi ≈ 5%

• na osnovu veličine čestica

pesak > mulj > glina

• nastanku doprinose hemijski, fizički i biološki procesi

• formiranje može trajati stotinama do hiljadama godina

Sastav i formiranje zemljišta

• površinu prvobitno kolonizuju alge, lišaji i mahovine

• proizvedene org. materije podstiču razvoj kompleksnih zajednica hemoorganotrofnih bakterija i arhea

• CO2 iz disanja + voda = H2CO3 koja polako rastvara stene + fizički faktori, produbljuje se profil

• biljke i drveće korenima nastavljaju usitnjavanje, umiranjem obogaćuju zemljište i pospešuju razvoj MO

• oko korenova – rizosfera

• zemljišne životinje doprinose aeraciji

Zemljište kao mikrobijalno stanište

• najekstenzivniji rast na česticama zemljišta blisko površini, u obliku mikrokolonija, u rizosferi

• 1 čestica može da sadrži nekoliko različitih mikrosredina i da podržava rast različitih fizioloških grupa MO

• glavni faktor koji utiče na aktivnost MO je voda koja se može naći u obliku:

- vezane vode (adsorbovana na površini čestica)

- slobodne vode (u obliku filma između čestica)

• dobro oceđena zemljišta su dobro aerisana dok zabarena zemljišta nude samo O2 rastvoren u vodi

• drugi faktor po važnosti – količina nutrijenata (često su limitirajući faktori količina fosfora i azota)

Filogenetska raznovrsnost MO u zemljištu

• mera prokariotskog diverziteta – sekvence gena za 16S rRNK

• filotip – vrsta na osnovu razlike veće od 3% na nivou sekvence gena za 16S rRNK

• površinski sloj zemljišta podržava hiljade raličitih vrsta u 1g

• diverzitet varira u odnosu na tip zemljišta i geografski položaj

• proporcionalna zastupljenost tipova (phylum) prokariota u različitim zemljištima je relativno konstantna

• zastupljenost konkretnih vrsta može značajno da varira

• bakterije zastupljene velikim diverzitetom

• diverzitet arhea minimalan

Filogenetska raznovrsnost MO u zemljištu

Podpovršinski sloj zemlje

• podzemne vode – raširena a slabo istražena sredina za razvoj MO

• MO ima do najmanje 3 km u dubinu zemlje

• čak do 40% ukupne globalne biomase

• mikrobiološki sastav plitkih površinskih voda vrlo je sličan sastavu zemljišta u istom profilu (isti uslovi)

• dublje podpovršinske vode imaju značajno različite sredinske uslove (temperatura iznad 50ºC, anaerobija, limitirani nutrijenti)

• akvifer – podzemni sloj poroznog materijala koji sadrži vodu

• period zadržavanja vode – nedelje do milioni godina (zavisi od dubine sloja i „dopunjavanja“ površinskom vodom)

• alopatrična specijacija

Mikrobiologija dubokog podpovršinskog sloja

• hemolitotrofni i autotrofni pripadnici bakterija i arhea

• izvor redukujuće snage H2 koji nastaje radiolizom vode ili tokom oksidacije minerala

• model fiziologije za duboki podpovršinski sloj: auksotrof, termofil koji oksiduje vodonik i redukuje sulfate (hemolitotrof) a poseduje i gene za fiksaciju azota (vrlo niski nutritivni zahtevi)

• MO izolovan iz rudnika zlata u J. Africi sa dubine od 3km

• broj MO varira u redovima magnitude (102-108), zavisno od dubine sloja i raspoloživosti nutrijenata

• rast spor, vreme generacije može da se meri i desetinama godina

• značajnija istraživanja tek predstoje

Mikrobiologija vode

Slatkovodna staništa

• fototrofi koji proizvode O2 – alge i cijanobakterije (planktonske i bentosne) =

primarni producenti

• diverzitet i brojnost heterotrofa zavise od produktivnosti primarnih producenata

• ako je produktivnost visoka – heterotrofi troše više kiseonika što dovodi do stvaranja anaerobnih uslova u dubljim slojevima vode

• takvi uslovi pogoduju MO koji vrše anaerobnu fotosintezu (gde je svetlost dostupna), respiraciju i fermentaciju

Mikrobiologija vode

Slatkovodna staništa

• u jezerima stub vode je stratifikovan:

- epilimnion (površinski topli sloj, dobro osvetljena trofogena zona u kojoj se odvijaju procesi primarne produkcije)

- hipolimnion (dublji sloj – niska temperatura vode, trofolitički sloj koji se odlikuje odsustvom svetlosti i u kome dominiraju procesi razgradnje organske materije)

• povezuje ih termoklina (neujednačena temperatura)

• transfer kiseonika (i dr.) između slojeva samo difuzijom (sporo)

• dublji slojevi mogu ostati bez kiseonika

• „prevrtanje vode“ u kasnu jesen

Mikrobiologija vode

Slatkovodna staništa

• efekat upliva veće količine nutrijenata u sistem

• dolazi do deficita O2

• meri se kao BOD (biochemical oxygen demand)

• mera količine org. materija koja može biti oksidovana od strane MO u vodi

• veći BOD = manje kiseonika

• povezanost ciklusa ugljenika i kiseonika

• eutrofikacija („cvetanje vode“)

• vode imaju potencijal samoprečišćavanja (autopurifikacije)

Mikrobiologija vode

Okeani i priobalje

• otvoreno more (pelagijal) – zona sa niskim sadržajem i slabim protokom nutrijenata

• oligotrofi izuzetno malih dimenzija (potrebno manje energije za održavanje ali i više transportnih enzima da bi mogli da pribave nutrijente)

• priobalna zona – više nutrijenata, veća i brojnost MO

• tipični pelagijski primarni producent – Prochlorococcus (Prochlorophytes)

• srodnik cijanobakterija koji čini do ½ fotosintetičke biomase u tropskim i suptropskim morima

• nekoliko različitih ekotipova koji fotosintetišu pri različitim intenzitetima svetlosti – stratifikovani od 0-200m dubine

• cijanobakterije, alge malih dimenzija

• aerobni anoksični fotosintetski MO (ATP iz svetlosti, C iz organskih jedinjenja)

Prochlorococcus

Trichodesmium

Mikrobiologija vode

Okeani i priobalje

• od prokariota, u površinskim vodama pelagijala (do

1000m) dominiraju bakterije

• ispod 1000m ravnomerno zastupljene bakterije i arhee

• pelagijske bakterije i arhee ekološki značajne zato što vraćaju C u lanac ishrane okeana

• jedino prokarioti mogu da iskoriste veliku količinu rastvorenih org. materija u okeanima što vraća C u lanac ishrane kad budu pojedeni

• to je neka vrsta sekundarne produkcije

• sve je uravnoteženo predatorstvom (protista) i virusima

• „near-steady state“

zastupljenost A i B u severnom

pacifiku

Mikrobiologija vode

Okeani i priobalje

• Pelagibacter

• oligotrof (heterotrof koji zahteva niske koncentracije org. materija) malih dimenzija, zastupljen sa 105-106/ml

• najmanji genom slobodnoživeće bakterije (1.3 Mbp) koji kodira neuobičajeno veliki broj transportera

• proteorodopsin (srodan bakteriorodopsinu) – protonska pumpa na čiji račun se sintetiše ATP i tako se suplemetira slaba ishrana

• morski virusi

• do 107/ml

• većina bakteriofagi

• regulatori brojnosti prokariota na nivou na kome ekosistem može da funkcioniše

• pokretači razmene genetskog materijala

Pelagibacter

Mikrobiologija vode

Duboko more i sediment

• ispod 300m dubine, potpuno odsustvo svetlosti

• ispod 1000m – minimum biološke aktivnosti

• 3 ekstrema: niska temperatura, visok pritisak i malo nutrijenata

• pijezotoleranti (trpe pritisak do 500 atm ali bolje rastu pri 1atm)

• pijezofili (bolje rastu pri visokom pritisku)

• ekstremni pijezofili (do 10000m dubine)

• bakterije i arhee – do 1600m u sedimentu

• ispod 1 m dominiraju arhee iz tipa Euriarchaeota

Uzorkovanje sedimenta dubokog

mora

Mikrobiologija vode

Hidrotermalni ventili

• visok pritisak ali toplo i nutrijenata (neorganskih) može biti u izobilju

• hemolitotrofi

• hipertermofili i termofili koji žive u temperaturnom gradijentu

• ogroman bakterijski diverzitet i ograničeni diverzitet arhea (ALI arhee dominiraju u uzorcima sa samih zidova „dimnjaka“)

„crni dimnjaci“

krečnjačke formacije

FISH uzorka crnog

dimnjaka