oscar porfirio gonzalez perez

8/18/2019 Oscar Porfirio Gonzalez Perez

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Dr . Alejandro Manuel Elizalde Lozano Coordinador academico del

Posgrado en Ciencias Fisiológicas

P r e s e n t e

En mi carácter de asesor, he leido en su totalidad la tesis titulada :

“EFECTOS PROFI LACTICOS Y TERAPEUTICOS DEL ACIDO ALFA- L I POI CO Y VITAM INA E SOBRE L A RECUPERACION DELDEFICITMOTOR Y LA EXTENSION DEL DAÑO CEREBRAL POSTI ISQUEMIA POR EMBOLISMO EN RATAS”, que para obtener el gradode Doctorado Ciencias Fisiológicas con especialidad en Fisiología presenta

el Maestro en Ciencias, OSCAR PORFIRIO GONZALEZ PEREZ. Leinformo que apruebo la tesis, la cual reúne los requisitos para la obtención

del mencionado grado.

A TENTAMENTE

ESTUDIA*LUCHA*TRABAJA

Colima, Col., 18 de Mayo de 2002

c. o.p /Archivo

Av. 25 de Julio 965, Colima, Colima, México, C.P. 28000, Apartado postal 199Tel. 01 (312) 316 ll 29, Ext. 47451, Ext. Fax 47452

UNIVERSIDAD DE COLIMACENTRO UNIVERSITARIO DEINVESTIGACIONES BIOMÉDICAS

cb


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Dedicatoria

A E l i zabeth , mi esposa , a m i ga y com pañer a

A Ósca r , m i h i j o , m i , m o t i vo

A m i s p a d r es y h er ma no s, m i t i er r a f i r me.


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Agradecimientos

AGRADECIMIENTOS.

Esta sección es, sin lugar a dudas, una de las que más dificultades me implicó escribir.

Debido, principalmente, al problema de encontrar las palabras exactas, pero sobretodolo suficientemente vastas, para expresar mi agradecimiento hacia todas aquellas

personas e instituciones que hicieron posible la materialización de este arduo trabajo.

He decidido comenzar con las instituciones que contribuyeron tanto los soportes

financieros, como de infraestructura y académicos. He de aclarar que el orden en el

cual se enlistan éstas, no enaltece a unas ni menosprecia a las otras. Todas por igual

tienen para mí un respeto y aprecio muy particular; si alguna de ellas hubiese faltado,

seguramente no hubiera sido fácil coronar este esfuerzo.

Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT)

No. Becario 113786.

Centro de Investigación Biomédica de Occidente (ClBO).

Instituto Mexicano del Seguro Social.

Centro Universitario de Investigaciones Biomédicas (CUIB).

Facultad de Medicina. Universidad de Colima.

Ahora paso a una sección todavía más complicada, el expresar mi total y absoluta

gratitud hacia todas aquellas personas que han dado el soporte físico y moral, pero

sobre todas las cosas, le han dado el motivo de ser, a esta tesis doctoral. Espero,

además, que éstas mismas personas, y porqué no algunas otras, lean y encuentren

interesantes o útiles los datos y hallazgos que este trabajo presenta, puesto qué otra

razón tendría la existencia del conocimiento, si no aquella de ser transmitido a los

demás sin cortapisas ni egoísmo.


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Agradecimientos

Dr. Joaquín García Estrada. Mi asesor y director. Por todo su apoyo en los

momentos complicados de mi llegada a una nueva ciudad, su tolerancia hacia mi

persona, por permitirme colaborar en su laboratorio durante todo este tiempo,

depositado en mí y permitirme realizar con Ud. este trabajo doctoral, pese a los

inconvenientes que en ocasiones esto le implicaba; por todo ello, le estaré siempre

encuentro para poder expresarle mi gratitud, por creer incondicionalmente en mi y por

permitirme el honor de aprender, convivir y trabajar con Ud. iGracias!

M. en C. Rocío Elizabeth González Castañeda, “Chio”. Mil amiga. Por todos

aquellos momentos de convivencia, por tus enseñanzas en el terreno de la vida, por ser

la niñera temporal de ‘mi bebo’ y soportar en ocasiones mis exabruptos, sólo me resta

decirte, de corazón, un millón de gracias y “con los dedos de una mano y me sobran

tres”.

M en C. Martha Eugenia Morales Vázquez, “‘Martinica”

Por haber depositado tu confianza en mí, por los ‘Ruppers’ y al igual que Chío por

soportar ecuánimemente mis berrinches v regaños. según yo. por su “propio bien”

persona que hizo más fácil y llevadera los primeros meses difíciles en esta ciudad, y

por continuar brindándome el placer de su amistad y cordialidad durante todos estos

¡Muchísimas gracias!

agradecido.

Dr. Miguel Huerta Viera. Mi mentor. Por su absoluta confianza, su apoyo

Dr. Diego César Ricardo Ramos remus. Mi maestro y consejero. Pocas palabras

¡Mil gracias!

M.en C. Ulises Alfonso Gómez Pinedo "El Uli" . Mi amigo. Por haber sido la

años ¡Gracias!

compañera y amiga.


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AgradecimientosAgradecimientos

Dra. Alicia Navarro Ruiz. ‘Ah” -nuestra mamá postiza-. Por su apoyo, su sostén

moral y aquellos inolvidables convivios navideños organizados por usted durante mi

estancia en el GIBO, iGracias!

Dra. Alicia Navarro Ruiz. -nuestra mamá postiza-. Por su apoyo, su sostén

moral y aquellos inolvidables convivios navideños organizados por usted durante mi

estancia en el GIBO, iGracias!

Tec. Angélica González Ballesteros. "Ange". iMuchas gracias! Por tu confianza para

convertirme en tu ‘consejero médico de cabecera’, por aquellos bísquets y las aguas

frescas que cariñosa y testarudamente te negaste siempre a cobrar.

Dra. Sonia Luquín de Anda. Siempre detallista en las fechas importantes y cómo

olvidar su apoyo para el desarrollo de este trabajo doctoral, en pleno curso de su

embarazo, Gracias mil!

Dra. Virginia Medina Hernández “Vicky“. Por tu confianza, por permitirmeDra. Virginia Medina Hernández Por tu confianza, por permitirme

trabajar de manera conjunta y por enriquecer esta tesis doctoral con algunas pinceladas

de tus dotes artísticas, iMuchísimas gracias!

MCP Estela Adriana Castellanos ‘Adri”, Psic. Carlos Eduardo Valencia “El

Charlie ‘> MPSS Zarela Lizbeth Chinolla “Liz’! Los tres miembros más nuevos en

MCP Estela Adriana Castellanos ‘Adri”, Psic. Carlos Eduardo Valencia “El

Charlie MPSS Zarela Lizbeth Chinolla “Liz" Los tres miembros más nuevos en

el laboratorio, que enriquecieron el ambiente con sus “puntadas”, su frescura y que me

otorgaron el placer de su confíanza y amistad, iMuchísimas gracias!

Mi último agradecimiento, pero por nada el menos importante, va dirigido a esas

amadas personas a quienes dediqué esta tesis. A mis padres y hermanos, por creer

siempre en mí y haberme dado su amor de manera incondicional. A Elizabeth por tu

amor, por ser siempre la persona capaz de “aterrizarme” en este mundo, otorgarme tu

hombro para apoyarme y por cumplir estoica y cabalmente el juramento de “en lo

próspero y en lo adverso”. A Óscar, mi hijo, por brindarme el honor de aprender de ti,

acerca de la vida y el amor, y por haber sido encantadoramente impertinente durante

todas esas tardes que tomó la escritura de esta tesis. A todos ustedes les manifiesto mi

amor y eterno agradecimiento.

Ósca r P .Gon zál ez


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Índice

ÍNDICE.

ABREVIATURAS.

RESUMEN.

ABSTRACT.

INTRODUCCIÓN.

Enfermedad vascular cerebral.

Definición.

Incidencia.

Caracterización de los tipos de isquemia.

Modelos experimentales de isquemia focal.

Modelo de isquemia focal por embolismo arterial.

Evolución natural del infarto embólico.

Fisiopatología de la isquemia cerebral.

Cascada isquémica.

Especies reactivas de oxigeno (ERO) e isquemia.

Mecanismos de defensa contra las ERO.

Antioxidantes.Vitamina E.

Ácido alfa-lipoico.

Remodelación cerebral.

Sinaptofisina.

Proteína asociada al crecimiento 43 (GAP 43).

ANTECEDENTES.

Sinergismo del ácido alfa-lipoico y vitamina E.PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA.

HIPÓTESIS.

OBJETIVO GENERAL.

OBJETIVOS PARTICULARES.

MATERIALES Y MÉTODO.

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7

7

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12

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2 83 1

3 2

33

33

3 4


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Índice

Diseño experimental

Animales de experimentación.

Grupos de estudio.

Dosis de antioxidantes.Criterios de inclusión.

Criterios de exclusión.

Obtención del émbolo.

Isquemia focal por embolismo.

Parámetros analizados

Evaluación del grado de recuperación motora.

Escala de déficit neurológico.

Índice funcional motor (IFM).

Análisis estadístico.

Determinación de extensión del daño.

Cálculo del edema cerebral.

Cálculo del volumen del infarto.

Perfusión intracardiaca.Determinación de las zonas de infarto.

Cálculo volumétrico del infarto.

Correlación volumen del infarto VS. escala de déficit neurológico. 4 8

Método estadístico. 4 8

Análisis del grado de remodelación del tejido nervioso lesionado. 4 9

Inmunocitoquimica para microscopía de luz. 4 9

Inmunocitoquímica para sinaptofisina. 4 9

Inmunocitoquímica para GAP 43 50

Densitometría. 5 1

Análisis estadístico. 53

RESULTADOS. 5 4

Reproducibilidad del modelo. 5 4

Tasa de mortalidad. 5 4

3 4

35

35

353 6

3 6

3 6

3 7

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39

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4 4

44

44

4 5

454 5

4 6


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índice

Análisis histopatológico.


Escala de déficit neurológico.

Índice funcional motor.


Cálculo del edema cerebral.

Cálculo del volumen del infarto.

Análisis de correlación.

Remodelación neuronal.

DISCUSIÓN.

Modelo isquemia por embolismo arterial.

Propiedades y sinergismo del ácido a-lipoico y vitamina E

Dosis de ácido a-lipoico y vitamina E.

Recuperación funcional.

Determinación de la extensión del daño.

Grado de edema cerebral.

Volumen del infarto.

Remodelación, cerebral.

Perspectivas a futuro

Aportaciones del estudio

CONCLUSIONES.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS.

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5 6

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6 9

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7 4

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Abreviaturas

ABREVIATURAS.

AAL

A BCACM

ADP

ATP

B HE

CAT

DNA

EVC

GPX

HCLO.

I F M

DIFOSFATO DE ADENOSINA

TRIFOSFATO DE ADENOSINA

BARRERA HEMATO-ENCEFÁLICA

CATALASA

3‘3-DIAMINOBENCIDJNA

GAP 43

M A P 2

NADPH

NMDA

NO.

NOS

PBS

ROO.

ÁCIDO a-LIPOICO

COMPLEJO AVIDINA-BIOTINAARTERIA CEREBRAL MEDIA

ÁCIDO DESOXIRRIBONUCLEICO

ESPECIES REACTIVAS DE OXÍGENO

ENFERMEDAD VASCULAR CEREBRAL

GROWTH-ASSOCIATED PROTEIN

PEROXIDASA DE GLUTATIÓN

PEROXIDO DE HIDRÓGENO

ÁCIDO HIPOCLOROSO

ÍNDICE FUNCIONAL MOTOR

MICROTUBULE-ASSOCIATED PROTEIN

DINUCÉOTIDO DE NICOTINAMINA FOSFATADO

FORMA REDUCIDA DEL NADP

N-METIL-D-ASPARTATO

ÓXIDO NÍTRICO

ÓXIDO NÍTRICO SINTASA

TAMPÓN SALINO DE FOSFATOS

PEROXILO

ROOH HIDROPERÓXIDO

T O H

V E

XAO

*ONO2

SISTEMA NERVIOSO CENTRAL

DISMUTASA DE SUPERÓXIDO

TOCOFEROL

VITAMINA E

XANTINA OXIDASA

SUPERÓXIDO

HIDROXILO

PEROXINITRITO

4

1O2

•OH

SINGLETE DE OXÍGENO.

•O2

SNC

SOD

H2O2

NADP

DAB

ERO


11/90

Resumen

RESUMEN.

Introducción. Las especies reactivas de oxígeno (ERO) están directamente involucradas en

los mecanismos de inicio y progresión del daño isquémico. La combinación de ácido alfa-

lipoico (AAL) y vitamina E (VE) ha demostrado efectos sinérgicos benéficos en modelos de

lesión por ER0 en retina y corazón. Objetivo. Analizar los posibles efectos benéficos de la

combinación de AAL y VE en un modelo de isquemia focal por embolismo en ratas.

Materiales y método. Se utilizaron ratas machos Wistar (350-400 g). Se formaron 5 grupos

de estudio (n = 10 por grupo): intacto, isquémico, vehículo (0. lml de aceite de sésamo, V.O.

administrados pre-isquemia durante 30 días), intensivo (AAL 100 mg/kg y VE 140 mg/kg,

V.O. posisquemia) y profiláctico (AAL 20 mg/kg y VE 50 mg/kg, V.O. administrados pre-

isquemia durante 30 días). En todos los casos (salvo el grupo intacto), la lesión isquémica se

realizó por oclusión de la arteria cerebral media con un coágulo introducido a través de la

carótida interna. Para evaluar el efecto benéfico de la mezcla antioxidante, el estudio se

dividió en 3 fases: recuperación funcional (escala de déficit neurológico y el índice funcional

motor -IFM-), los días 1, 3, 7 y 14 pos-isquemia; magnitud del daño (edema cerebral y

cálculo del volumen de infarto), los días 3 y 7 posisquemia; remodelación neurona1

(detección de GAP 43 y sinaptofisina) al día 14 posisquemia. Resultados. La evaluación

global con la escala de déficit neurológico mostró que el grupo profiláctico presentó

menores calificaciones (1.39) respecto a los otros grupos (isquémico = 3.94, vehículo = 3.1,

intensivo = 2.31; P = 0.001, U de Mann-Whitney). El volumen del infarto desarrollado en

los animales tratados pre-isquemia fue considerablemente menor (6.3 mm3) en comparación

a los otros grupos (isquémico = 20.7, vehículo = 22.6, intensivo 12.6 mm3; P = 0.036,

ANOVA-Bonferroni). La sobre-expresión de sinaptofisina y GAP 43 en los grupos tratados

con antioxidantes se incrementó (-20-25 % y 40-45 %, respectivamente) en comparación

los controles (P


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Abstract

ABSTRACT.

Introduction. During a cerebral ischemia, oxygen-derived species have directly been

involved in the initiation and progression of neural damage. Alpha-lipoic acid (ALA) and

vitamin E (VE) combination has demonstrated synergistic beneficial effects in lesion models

induced by oxidant radicals in retina and hearth. Objective. To analyze possible beneficial

effects of ALA and VE combination using a focal ischemia model in rats. Methods. Using

male Wistar rats (350-400 g), five groups were assembled (n = 10 per group): intact,

ischemic, vehicle (0.1 ml sesame oil, p.o. for 30 days pre-ischemia), intensive (100 mg/kgALA plus 140 mg/kg VE p.o. post-ischemia), and prophylactic (20 mg/kg ALA plus 50

mg/kg VE p.o. for 30 days post-ischemia). All groups (save intact group) were ischemized

by arterial thromboembolism through the interna1 carotid artery. In order to evaluate the

beneficial effect of antioxidant combination, this study was performed in 3 phases: functional

recovery (neurological deficit scale and motor functional index -MFI-) at 1, 3, 7 and 14

days, damage magnitude (cerebral edema and infarction volume) at 3 and 7 days, and

neurona1 remodeling (GAP 43 and synaptophysin over-expression) at 14 day. Results. Total

assessment with the neurological deficit scale revealed that prophylactic group showed

lesser scores (1.39) as compared with other groups (ischemic = 3.94, vehicle = 3.1,

intensive= 2.3 1; P = 0.001, Mann-Whitney U test). Infarction volume in pre-ischemic-

treated animals (6.3 mm”) was significantly lesser than other groups (ischemic = 20.7,

vehicle = 22.6, intensive = 12.6 mm3; P = 0.036, ANOVA-Bonferroni). Over-expression of

synaptophysin and GAP 43 in both antioxidant-treated groups was higher (-20-25 % y 40-45 %, respectively), as compared with controls (P


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Introducción

1. INTRODUCCIÓN.

ENFERMEDAD VASCULAR CEREBRAL.

Definición.

La enfermedad vascular cerebral (EVC) es una definición clínica utilizada para

describir los síntomas de una alteración neurológica aguda causada por trastornos en el

aporte sanguíneo cerebral. Los signos y síntomas neurológicos, producto de esta

enfermedad, deben persistir durante al menos 24 h, después su instauración; en casocontrario, el diagnóstico de EVC se descarta.

El 80% de los eventos cerebro-vasculares son de etiología oclusivo-isquémico,

mientras que, el restante 20 % son de origen hemorrágico: subaracnoidea o

intraparenquimatosa (Monis y Schoene, 1987; Ter Horst 1997). Sin importar cual sea la

etiología de la EVC, el común denominador en este proceso mórbido es el cese o

disminución en el adecuado suministro de glucosa y oxígeno hacia el parénquima cerebral,

que conllevan a la aparición de daño celular irreversible, dada la limitada capacidad del

sistema nervioso central (SNC) para efectuar la reparación y regeneración ante el daño.

Incidencia.

La EVC es la tercer tercera causa de morbilidad y la segunda de mortalidad en los

Estados Unidos, Europa y Japón. Su incidencia es de aproximadamente 1 caso por cada

1000 personas mayores de 45 años, esto la ubica solamente por debajo de la incidencia del

cáncer y del infarto al miocardio. Alrededor del 20% de los pacientes que sufren una EVC

fallecen en el transcurso de la primera semana. Casi el 33% de las personas que la padecen,

7


14/90

Introducción

mueren durante el lapso del primer año, como consecuencia de las diversas secuelas

derivadas de la enfermedad (Pulsinelli, 1995; Ter Horst, 1997).

En nuestro país no se tienen estadísticas adecuadas al respecto; sin embargo, laSecretaría de Salud reconoce que de los aproximadamente 270 mil casos de discapacidad

registrados anualmente en nuestro país, 43 mil de ellos son consecuencia de la EVC (fuente:

S.S. y B.S. Febrero de 2002).

II. CARACTERIZACIÓN DE LOS TIPOS DE ISQUEMIA.

Desde el punto de vista clínico y experimental, la isquemia cerebral puede ser focal o

global. La isquemia focal se debe a una falla en la irrigación sanguínea de un área cerebral

bien delimitada, originada por la oclusión directa de una o más arterias cerebrales. En tanto

que, la isquemia global afecta a todo el cerebro y se presenta principalmente en situaciones

muy especificas, tales como, paro cardiaco, oclusiones arteriales masivas o daño traumático

severo.En la isquemia focal, pueden distinguirse básicamente dos zonas morfológicas y

funcionales: un área conocida como núcleo isquémico, cuyas células desarrollan

despolarizaciones anóxicas permanentes, con lipólisis, proteólisis y disgregación de

microtúbulos, que conllevan a la falla bioenergética total con pérdida de la homeostasis

iónica. La segunda zona, comprendida entre el núcleo isquémico y el tejido cerebral normal,

se denomina penumbra isquémica, es un área con flujo sanguíneo restringido, neuronas

eléctricamente silentes y metabolismo energético parcialmente preservado (Pulsinelli, 1995;

Dimagl y cols., 1999).

Si el déficit energético no es restaurado, las neuronas del área de penumbra sufren

transformaciones funcionales dinámicas, tales como, despolarización, edema posisquémico y

muerte celular por necrosis o apoptosis (Siesjö, 1992a; Pulsinelli, 1995; Dirnagl y cok., 1999).


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Introducción

Obviamente, un incremento en la tasa de mortalidad celular acontecida en la zona de

penumbra se reflejará en un aumento de tamaño del infarto cerebral; por lo tanto, una de las

metas principales de los tratamientos para la isquemia se enfoca en la preservación y

“rescate” de la zona de penumbra.

La elección adecuada de los modelos de isquemia es de capital importancia en el

trabajo experimental y dependerá siempre del tipo de variables y análisis que se deseen

analizar. Existen diferentes modelos experimentales para producir isquemia focal en

roedores. De acuerdo con el tipo de oclusión producida en la arteria cerebral media (ACM),

éstos se dividen básicamente en tres categorías:

1 Oclusión arterial mecánica o eléctrica con craneotomía y apertura de la duramadre.

2 Oclusión fotoquímica con craneotomía y sin apertura de la duramadre.

3 Oclusión intraluminal sin craneotomía.

Los modelos de oclusión mecánica o eléctrica de la, ACM más comúnmente utilizados

son: ligadura transorbitaria, ligadura transcraneal y electrofulguración directa de la ACM.

No obstante, pese a que el abordaje y ligadura arterial son relativamente sencillos con este

tipo de modelos, ellos presentan algunos inconvenientes, por ejemplo: la exposición al medio

ambiente del tejido cerebral puede alterar la presión intracraneal y la permeabilidad de la

barrera hematoencefálica (BHE); la cauterización de la ACM, afecta la modulación

autonómica de esta arteria y, en consecuencia, la autor-regulación de la producción de

líquido cefalorraquídeo puede verse modificada; finalmente, el abordaje transorbitario

comúnmente ocasiona daño irreversible del globo ocular del animal que altera la regulación

visual del equilibrio (Tamura y cols., 1997).

Por otra parte, los modelos de lesión fotoquímica sin apertura de la duramadre son

9

III. MODELOS EXPERIMENTALES DE ISQUEMIA FOCAL.


16/90

Introducción

doblemente invasivos, ya que además del abordaje transcraneal de la ACM, necesario para la

aplicación de un rayo láser (562 nm), requieren la aplicación intravenosa de un compuesto

fotorreactivo (generalmente rosa de bengala) y la estabilidad del coágulo intraarterial así

producido no es del todo clara (Tamura y cok., 1997).

Finalmente, los modelos de oclusión intraarterial de la ACM son los más comúnmente

empleados, ya que mantienen la integridad de la bóveda craneana y la técnica de oclusión

arterial es relativamente sencilla. Sin embargo, algunos de ellos, como la embolización con

microesferas plásticas, tienen el inconveniente de no ser modelos de isquemia-reperfusión;

mientras que, la oclusión intravascular con hilo de nylon dificulta el mantenimiento de

oclusiones arteriales mayores de 60 minutos, ya que la herida quirúrgica debe permanecer

expuesta al medio ambiente durante todo ese tiempo, esto hace necesario un soporte

anestésico prolongado que incrementa la tasa de mortalidad de estos animales (Tamura y

cols., 1997). Por todo lo anteriormente expuesto, el modelo de isquemia focal por trombo-|

embolismo arterial es uno de los que ha cobrado mayor auge en el transcurso de la última

década.

Modelo de isquemia focal por embolismo arterial.

El modelo de isquemia focal por embolismo en ratas es un procedimiento experimental

de oclusión intrarterial de la ACM, producida por la introducción intravascular de un

coágulo homólogo que bloquea el dominio vascular de la ACM. La lesión resultante tiene

grandes semejanzas con las que se presenta en los seres humanos que padecen una EVC

isquémica (Overgaard y cols., 1992; Lekieffre y cok., 1997; Tamura y cols., 1997). Por lo tanto,

es el procedimiento de elección cuando se desea desarrollar un modelo de isquemia-

reperfusión, debido a la participación de los mecanismos naturales para la disolución del

coágulo -vía del plasminógeno- (Overgaard y cok., 1992; Lekieffre y cok., 1997).


17/90


18/90

Evolución natural del infarto embólico.

La historia natural del infarto cerebral sucede, según Morris y Schoene (1987), de lasiguiente manera: durante las primeras 24 horas se instaura la muerte neurona1 por necrosis.

En el transcurso de 24-72 horas, la necrosis está firmemente establecida, ocurre el mayor

grado de tumefacción (edema) del tejido adyacente, dado que ha iniciado y proseguido la

disolución del coágulo, que inicia la denominada etapa de reperfusión. Por último, comienza

la extensión de la zona de infarto a expensas, principalmente, de apoptosis neuronal. Entre

72 y 96 horas, la infiltración de macrófagos y proliferación de microglia llega a su punto

máximo, culmina así, la etapa de destrucción neuronal. A partir de la segunda semana, la

astrocitosis es plenamente manifiesta y se consolida la etapa de organización, resolución y

remodelación del tejido nervioso lesionado, la cual prosigue durante varias semanas.

IV. FISIOPATOLOGÍA DE LA ISQUEMIA CEREBRAL.

Cascada isquémica.

En condiciones fisiológicas, durante el metabolismo aeróbico de la glucosa en la

cadena respiratoria mitocondrial, el difosfato de adenosina (ADP) es fosforilado a trifosfato

de adenosina (ATP), esto provee la energía necesaria para mantener el funcionamiento de las

bombas membranales dependientes de ATP y la homeostasis iónica neuronal, necesarias para

la estabilización de los gradientes de concentración transmembranales de sodio, potasio,

calcio, cloro, etc., indispensables para la preservación de la conducción neurona1 y las

funciones sinápticas.

La cascada isquémica es una serie de eventos responsables del daño celular,

desencadenados por la reducción en el aporte de oxígeno y glucosa hacia el tejido cerebral.

Durante la isquemia, escasas cantidades de ATP pueden ser producidas por glucólisis

1 2

Introduccion


19/90

Introducción

anaerobia; sin embargo, los depósitos cerebrales de glucógeno son sumamente escasos y se

depletan pocos minutos después de instaurada la isquemia. Se altera entonces, el equilibrio

iónico transmembranal que induce una serie de procesos muy complejos relacionados entre

si, los cuales se resumen en la figura 2.

De manera sucinta, la cascada de fenómenos acontecidos durante la cascada isquémica

inician con dos eventos fundamentales: reducción en la relación ATP/ADP citosólico e

incremento en el contenido intracelular de ácido láctico. Conforme los niveles de ATP

disminuyen, la actividad de la ATPasa de Na+| y K+ se reduce, esto afecta el equilibro iónico

transmembrana y genera despolarización con influjo masivo de iones Na+

, Cl-| y Ca2+

alinterior de la célula.

Una vez que la membrana se ha despolarizado lo suficiente para disminuir el bloqueo

por Mg2+ de los receptores a N-metil-D-aspar-tato (NMDA). El glutamato, previamente

liberado, activa dichos receptores e incrementa el influjo de Ca2+; de esta forma, la

activación de las bombas de Ca2+ de la membrana plasmática contribuye aún más al consumo

del ATP (Siesjö, 1992a; White y cok., 2000).

13


20/90

Introducción

.EVENTOS MOLECULARES DURANTE LA ISQUEMIA-REPERFUSIÓN.

ISQUEMIA- ATP Despo larización D a ñ o M e m b r a n a 1

tICa2+li Activación de

Act ivación de

ca lpaína Act ivación de Act ivación

Calcineurina Veroxmltritos Libre

REPERFUSIÓN

\

.

Act ivación de

elF2α cinasa

Degradaciónde elF4G yEspectrina

Señalización delFactor de

CrecimientoInh ib ida

I / \ elF2α(P)I iberación

tial d e

t AMPdCitocromo C y

Act ivaciónd e P C A d e

I n h i b i c i ó n

de SíntesisProteica Apoptosis

Muerte Celular

Figura 2. El [Ca2+], activa diversas enzimas, incluidas la proteasa de p-calpaina, fosfatasa de

calcineurina y la fosfolipasa A2 (la fosfolipasa C es activada directamente por la despolarización).

La -calpaína es responsable de la degradación de las proteínas del citoesqueleto y del complejo de

traducción (eIF4G). Por otra parte, la desfosforilación mediada por calcineurina activa la óxido

nítrico sintasa (NOS) y libera al Bad (mediador de apoptosis) de proteínas secuestrinas. Asimismo,

las fosfolipasas liberan ácidos grasos de las membranas, particularmente araquidonato. El ácido

araquidónico causa una disminución de los depósitos de Ca2’ del retículo endoplásmico, que a su vez

Caspasas

14


21/90

Introducción

genera la activación de la cinasa de eIF2α. Por otro lado, la reperfusión permite la generación de

superóxido durante el metabolismo del araquidonato y la producción de óxido nítrico vía NOS, los

cuales de manera conjunta dañan la membrana celular por lipoperoxidación. La señalización

adrenérgica a través de la protein-cinasa A (PCA) inhibe la fosfatasa de la proteína 1 (PPl). Así, de

manera conjunta, la sobrerregulación de la cinasa de eIF2α y la disminución de la PP1 resultan en un

incremento de -20 veces en eIF2α(P), la cual inhibe la síntesis proteica y activa el factor de

trascripción CHOP y la caspasa 3, conocidos promotores de apoptosis. Finalmente, lalipoperoxidación inhibe la señalización del factor de crecimiento anti-apoptótico, que en forma

conjunta con Bad promueven la liberación de Bax, que libera al citocromo C mitocondrial y la

caspasa 9, los cuales a su vez activen la caspasa 3 e inducen la apoptosis. Modificado de White y

cok, (2000).

El influjo de sodio y cloro están involucrados en el arrastre de agua hacia el citoplasma, en

tanto que, el calcio se ha relacionado directamente con diversos mecanismos de daño, tales

como: activación enzimática, excitotoxicidad por glutamato y dopamina, producción de

radicales libres y la inducción de apoptosis. Paralelamente, el incremento en la concentración

intracelular de iones H+ promueve un importante evento, la liberación del hierro unido a

Este hierro libre cataliza la formación de radicales oxidantes:

Fe3+ (libre)

•O2 + Fe3+ O2 + Fe2+

H202 + F e2+ O H + • H + Fe3+

Que simultáneamente con la serie de eventos ilustrados previamente, terminan con la muerte

proteínas:

celular, acontecida tanto por necrosis y fragmentación de las membranas citoplasmáticas,

Transferrina + H+

15


22/90


23/90

Introducción

Reperfusión:

Isquemia:

ATP AMP Adenosina Inosina Hipoxantina

Xantina + 02

De forma simultánea ocurren una serie de eventos, los cuales desencadenan otros

mecanismos de producción de ER0 en el tejido isquémico, uno de ellos es a través de la

liberación de elementos traza (reacción de Fenton) que en conjunto con la reacción de

Haber-Weiss darán origen al radical con mayor poder oxidante, el hidroxilo:

•O2- + Fe3+ - 02 + Fe2+

H2O2 + Fe2+ OH- + •OH + Fe3+

•02-; + H2O2 O2 + O H- + •OH

En adición, el endotelio afectado también participa en la producción de ER0 al sintetizar

NO•, vía el aminoácido L-arginina:

NOS

L-arginina + O2 + NADPH Ci t r u l in a + NO• + NA DP

N O • . + •02; ONOO• + H+ O N O O H

O N O O H •OH + NO2-

= forma reducida delDonde: NADP = dinucléotido de nicotinamina fosfatado; NADPH

NADP; NOS = óxido nítrico sintasa.

1 7

Hipoxantina + O2 XAO Xantina + •O2 + H2O2

ácido úrico + •O2- + H2O2XAO


24/90

Introducción

Finamente, estos radicales promueven la ruptura de la BHE, así como, la oxidación de

lípidos, proteínas y ácidos nucleicos presentes en el tejido isquémico. La peroxidación de los

lípidos membranales favorece aún más el incremento intracelular de calcio (Siesjö y cok.,

1995) y la liberación de metabolitos del ácido araquidónico; además, tiende a perpetuar las

reacciones redox con elementos traza (McCall y cok., 1987). Lo que a su vez provoca edema

citotóxico, lipólisis, fallo en la conducción axonal y degeneración neuronal, que culminará

finalmente con la muerte celular (Hall y Braugler, 1993). Asimismo se ha demostrado que

algunas ERO, particularmente el óxido nítrico, están involucradas en la activación de

microglia y, en consecuencia, con la promoción de la inflamación del tejido cerebral (Chan,

2001; Lachance y cok, 2001; Wong y cols., 2001).

Por último, se ha comprobado que la producción intracelular de ER0 puede generar la

activación de genes promotores de apoptosis a través del factor de trascripción nuclear NF-

K B (Ter Horst, 1997; Chan, 2001). Por tal motivo, se han tratado de diseñar estrategias

terapéuticas encaminadas a disminuir o inactivar las ER0 y procurar con ello, la reducción

del impacto del estrés oxidativo sobre el tejido nervioso.

VI. MECANISMOS DE DEFENSA CONTRA LAS ERO.

Antioxidantes.

El término antioxidante incluye a todas aquellas sustancias capaces de retardar o

detener los procesos de oxidación mediados por ERO. Los mecanismos de defensa

antioxidante incluyen: el “barrido” o depuración de las ERO, que previene su propagación;

la hidrólisis enzimática de los puentes éster, que remueve los ácidos grasos peroxidados

generados a partir de los lípidos; el secuestro de metales de transición (principalmente

hierro) y la reducción de peróxidos, mediada por catálisis enzimática (Thomas, 2000).

Los mecanismos celulares de defensa antioxidante se dividen básicamente en.

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Introducción

enzimáticos y no-enzimáticos (Ter Horst, 1997). Dependiendo si entre sus mecanismos de

inactivación se incluye la catálisis mediada por enzimas (dismutasa de superóxido -SOD-,

peroxidasa de glutation -GPX- y catalasa -CAT-):

e- S O D G P X CAT

O2 O2’ H2O2 OH- + O H • 2H2O

0 bien, si la inactivación de ER0 ocurre con sustancias antioxidantes (tocoferol o ácido

ascórbico) a través de reacciones espontáneas no enzimáticas:

ROO • + TOH ROOH+ TO.

Ascorbato + TO• Ascorbato•- + TOH

Donde: ROO• = radical peroxilo; TOH = tocoferol.

Aunque el producto final de la reacción con un antioxidante genera un nuevo radical

(Ascorbato•-), la reactividad de este nuevo radical es considerablemente inferior al de las

ER0 (Thomas, 2000).

Vitamina E (tocoferol).

La vitamina E (VE) es un componente esencial en la dieta de todos los mamíferos, se

encuentra presente de manera abundante en el germen de trigo y los aceites de girasol,cártamo, maíz y soya. Sin embargo, el cocimiento casero, la congelación profunda y el

procesamiento comercial de alimentos la destruyen rápidamente.

En estado natural existen 8 variedades de VE: tocoferoles y los tocotrienoles, ambos

designados como α, β y ó δ , de acuerdo al número y posición de los grupos metilo en su

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Introducción

anillo cromanol; todos ellos son isoprenoides sustituidos de ó-hidroxicromanos a tocoles.

No obstante, el a-tocoferol es la forma más abundante en la naturaleza, con mejor

absorción en el tracto gastrointestinal y mayor actividad biológica en los tejidos humanos

(figura 3). Es tal el significado biológico del a-tocoferol que diversos autores la denominan

genéricamente como vitamina E (Mayes, 1994; Thomas, 2000; Blatt y cols., 2001).

Figura 3. Fórmula estructural de la vitamina E en su forma oxidada (A) y reducida (B).

El cerebro parece ser el órgano con la mayor capacidad de retención y almacenamiento del

a-tocoferol (Blatt y cols 2001). A nivel intracelular, la VE se localiza principalmente en las

membranas mitocondriales, del retículo endoplásmico y plasmáticas de todas las células

(Thomas, 2000; Blatt y cok, 2001). Debido a que su actividad antioxidante es independiente

de enzimas, la VE constituye la primera línea de defensa contra la lipoperoxidación de los

ácidos grasos membranales y el daño al ADN (Murphy y cok, 1992) por lo que protege a las

diferentes estructuras celulares del ataque de las ERO.

Su propiedad antioxidante reside en la capacidad de transferir un H+ a un

radical peroxilo libre de un ácido graso poliinsaturado peroxidado; sin embargo, después de


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Introducción

realizar sus funciones debe ser reemplazada totalmente (Mayes, 1994). Un mecanismo alterno

de acción, aunque todavía no bien estudiado, son los incrementos de las concentraciones

intracelulares de las enzimas SOD y GPX, observados después de la aplicación VE; sin

embargo, la magnitud de este evento no es tan considerable cuando se le compara con la

observada con otros antioxidantes (Horáková y cols., 1991). Asimismo, la administración VE

malonaldehido y la actividad mitocondrial, considerados fuentes importantes de radicales

oxidantes (Sorrenti y cols, 1994; Villalobos y cos., 1994).

Ácido alfa-lipoico (lipoato, ácido tióctico).

El antioxidante metabólico ácido a-lipoico (AAL) es un derivado de bajo peso

molecular proveniente del ácido linoleico, presente en el germen de trigo, la levadura de

cerveza y las carnes rojas. El lipoato procedente de la dieta se absorbe en el intestino delgado,

cruza la BHE y en el interior de las células cerebrales es reducido a diidrolipoato, forma en la

cual es exportado al espacio extracelular. Su comportamiento antipático le hace igualmente

soluble en lípidos y agua, por ello se distribuye libremente en las células circundantes. Esta

propiedad hace que el AAL participe directamente en los mecanismos de defensa antioxidante,

tanto en la fase hidrófila como en la hidrófoba de la membrana (Kagan y cols., 1992; Packer y cols.,

1995; Packer y cols., 1997). Ambos, el ácido a-lipoico y dihidrolipoico son potentes

antioxidantes; el primero depura radicales •OH, HClO• NO•, •NO2, 102 y H2O2. Asimismo,

es capaz de quelar el hierro, cobre y otros metales de transición; por otra parte, el

dihidrolipoato, además de los radicales oxidantes mencionados, depura ROO• y •O2-, (Packer

y cok., 1997).

La capacidad antioxidante del AAL y sus derivados radica en un cromóforo tiol

presente en su molécula (figura 4), que actúa como un doble complejo redox (tiol-disulfuro)

21

reduce los niveles de lipoperoxidación (dienos), reduce las concentraciones de


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Introducción

al reaccionar directamente con las ERO.

Figura 4. Fórmula estructural del ácido a-lipoico, en sus formas oxidada (A) y reducida (B).

Asimismo, el lipoato participa en otros sistemas antioxidantes, lo cual potencia

importantemente su efecto; bloquea la producción de radicales libres oxidantes mediados

por la enzima SOD (Seaton y cols., 1996), regenera otros antioxidantes como las vitaminas C

y E (Kagan y cols., 1992), la coenzima Q10 y el glutatión (Murphy y cols., 1992; Roy y cols.,

1997). Por otra parte, el AAL, desempeña un papel importante en el metabolismo oxidativo

mitocondrial y celular; en forma de lipoamida se convierte en cofactor para los complejos de

la deshidrogenasa de a-cetoácidos, modula las proporciones de NADH/NAD+ y

NADHP/NADP+ mitocondriales e incrementa en 30-70% los niveles intracelulares de

glutatión (Packer y cols., 1995).

Dadas las características anteriormente mencionadas, el lipoato es un potente inhibidor

de la peroxidación de los fosfolípidos de membranas y bloquea la cadena oxidativa al

neutralizar las ER0 resultantes del metabolismo (Packer y cols., 1995). Esto lo hace un

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29/90

Introducción

compuesto sumamente eficaz en la protección de la integridad neurona1 frente a lesiones por

aminoácidos excitadores, disfunciones mitocondriales, la neuropatía diabética y algunos

errores innatos del metabolismo, entre otros (Packer y cols., 1995; Roy y cols., 1997).

VII. REMODELACIÓN CEREBRAL.

El término remodelación o plasticidad cerebral se refiere a una serie de procesos que

se llevan a cabo en el SNC, encaminados a modificar la citoarquitectura neurona1

principalmente a nivel sináptico. Las primeras evidencias de este fenómeno fueron

establecidas por Juraska y cols. (1980) quienes encontraron que el espesor de la corteza

cerebral varía en relación directa al nivel de estimulación medioambiental.

Aunque todavía en controversia, las evidencias crecientes sugieren que el fenómeno de

remodelación ocurre también bajo condiciones no fisiológicas; tal es el caso de la isquemia

cerebral (Stroemer y cols., 1992, 1993, 1998; Li y cols., 1998).

Las proteínas relacionadas con los procesos de remodelación neurona1 son:

sinaptofisina, proteína asociada al crecimiento 43 (growth-associated protein -GAP 43-),

ciclina D 1, proteína asociada a microtúbulos 2 (microtubule-associated protein -MAP 2-),

sinapsina y la espectina. Sin embargo, la sobre-expresión de las proteínas sinaptofisina y

GAP 43 ha sido relacionada con incrementos en el nivel de neurotransmisores

catecolaminérgicos (noradrenalina, dopamina y serotonina), involucrados a su vez en los

procesos de recuperación funcional poslesión (Stroemer y cols. 1998). Además, el aumento de

la inmunorreactividad de sinaptofisina y GAP 43 se considera un indicador adecuado del

incremento en el grado de expresión de ambas proteínas (Masliah y cols., 1989; Stroemer y

cok., 1992, 1993, 1998; Li y cols., 1998). Por ello, son dos de las proteínas más estudiadas

cuando se pretenden analizar los fenómenos de plasticidad cerebral.

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30/90

Sinaptofisina.

Es una proteína unidora de calcio (PM = 38,000 Da), presente en las vesículas

sinápticas de todas las terminales nerviosas. Parece ser que la concentración de sinaptotisinaen el parénquima nervioso permanece constante; sin embargo, es posible determinar la

presencia de aumentos o disminuciones en el número de sinapsis con base en métodos de

inmunomarcaje; por ello, se considera un indicador confiable del aumento en el número de

sinapsis presentes en la zona adyacente a la lesión (Masliah y cok., 1989). Asimismo, se han

observado incrementos de su inmunorreactividad (sobre-expresión) posiquemia (Stroemer y

cols., 1992). Por lo tanto, se le cataloga como un marcador de la remodelación nerviosa,

específicamente del proceso de sinaptogénesis (Masliah y cok., 1989; Stroemer y cok., 1992;

Stroemer y cok., 1998).

Proteína asociada al crecimiento 43 (GAP 43).

Los rebrotes axónicos son un componente importante de la plasticidad cerebral, éstos

pueden ser identificados por la elevada expresión de GAP 43. Esta fosfoproteína

intracelular, cuyo peso molecular es de 43,000 Da, es conocida también como B-50,

pp46, p57 ó neuromodulina.

Se le encuentra exclusivamente en el sistema nervioso, es un componente de los conos

axónicos en crecimiento; su función (a través de proteínas G) es facilitar la motilidad y

dirigir la axogénesis durante el proceso de desarrollo y regeneración neural (Benowitz y cols.,

1990). Estudios en ratones transgénicos, los cuales sobre-expresan de manera constante

GAP 43, muestran la presencia de rebrotes axónicos más allá de los límites considerados

como normales (Aigner y cols., 1995). Asimismo, se ha observado la sobre-expresión de GAP

43 en la zona de penumbra isquémica durante la fase de resolución del tejido nervioso en los

.eventos rsquemicos (Stroemer y cols.. 1993; Li y cok.. 1998): recientemente. este

Introducción


31/90

Introducción

funcionalsido relacionado, incluso, con un aceleramiento en la recuperación posiquemia

(Stroemer y cols., 1998).

Por todo lo anterior, la medición del grado de expresión de GAP 43 en el sitio de

lesión, se considera un indicador fiable para determinar la presencia de rebrotes axónicos, el

cols., 1993; Licual es un parámetro de plasticidad neurona1 (Benowitz y cok., 1990; Stroemer y cols., 1993; Li

y cols., 1998).

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33/90

\

antioxidante regenerador del tocoferol como es el ascorbato o el AAL, los cuales

indirectamente hubieran incrementado las concentraciones tisulares de esa vitamina. Por el

contrario, en modelos de isquemia focal por electrocoagulación de la ACM, se ha

demostrado que la deprivación alimenticia de VE se asocia con infartos cerebrales de mayor

tamaño (var der Worp y cok., 1998). Sin embargo, en este estudio, no se exploró la

posibilidad de dar suplementos suprafisiológios de VE con fines terapéuticos, ni se empleó

un modelo de isquemia con repulsión; mecanismo fundamental en la sobreproducción de

ERO. Por tal motivo, estos hallazgos no permiten definir con precisión la efectividad de la

administración aislada de VE en la reducción del daño oxidativo cerebral.

Respecto a la eficacia potencial del ácido a-lipoico en la disminución del daño

oxidativo, las evidencias son igualmente controvertidas. Diversos modelos de estrés

oxidativo sugieren un efecto neuroprotector del AAL contra el daño excitotóxico in vitro

(Müller y Krieglstein, 1995); incluso se postula que el AAL es capaz de facilitar la

regeneración de nervios periféricos en procesos mórbidos, tales como, las neuropatías (Roy y

cok., 1997).

Por otra parte, Cao y Phillis (199.5) encontraron que el ácido a-lipoico ejerce efectos

citoprotectores en Mongolina gerbils lesionados por isquemia-reperfusión cerebral global.

En adición, se ha encontrado que la administración subcutánea del AAL es capaz de reducir

el volumen del infarto producido por electrocoagulación de la ACM de ratón; no obstante,

los resultados obtenidos con la aplicación subcutánea o intracraneal (en cisterna magna) del

lipoato fueron diferentes. Esto sugiere que la biodisponibilidad y el catabolismo del fármaco

podrían influir en la concentración tisular del mismo (Wolz y Krieglstein,1996). Sin embargo,

en los últimos dos casos, los modelos de isquemia utilizados no son los más cercanos a la

fisiopatología de la EVC, además, tampoco se exploró la posibilidad del uso combinado del

Antecedentes

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34/90

lipoato con otros antioxidantes; por lo tanto, los efectos benéficos independientes del AAL,’

administrado en procesos isquémicos, no puede demostrarse de forma evidente.

Sinergismo del ácido alfa-lipoico y vitamina E.

La importancia de combinar el AAL con la VE ha sido reportada desde hace

aproximadamente una década. Se ha demostrado que el efecto antioxidante del AAL depende de

la concentración in situ de VE, lo cual sugiere la presencia de un efecto sinérgico entre ambos

antioxidantes.

Uno de los primero estudios que revelaron el sinergismo entre el AAL y la VE, se realizó

con fracciones microsomales enriquecidas con tocoferol, el análisis de quimioluminiscencia

demostró que en ausencia del a-tocoferol, el AAL es incapaz de inhibir la lipoperoxidación de los

microsomas (Scholich y cols., 1989). Posteriormente, Haramaki y cols. (1993) con un modelo de

isquemia-reperfulsión cardiaca in vitro, encontraron que, en aquellas preparaciones obtenidas deratas alimentadas con regímenes dietéticos normales, la perfusión por separado de AAL o VE no

mejoraba la recuperación posisquemia; sin embargo, cuando los corazones procedían de roedores

alimentados previamente con dietas enriquecidas con VE, la perfusión de AAL sí mejoraba la

recuperación cardiaca, así resultó evidente el efecto sinérgico in vivo de ambos antioxidantes.

Estos autores propusieron que el mecanismo de acción, por el cual ambos antioxidantes muestran

dicho efecto, parece radicar en su capacidad para modular los niveles tisulares de glutatión en el

tejido cardiaco hipóxico (Haramaki y cols., 1995). Estudios ulteriores, en los cuales se utilizó un

modelo de lesión por ER0 en homogeneizados de retina, confirmaron el sinergismo entre la VE

y el AAL, mediado por un intermediario, el ascorbato (figura 5) (Stoyanovsky y cols., 1995).

Posteriormente, Combes y cols. (200a) evaluaron el efecto de la combinación de AAL y

VE sobre los niveles de lipoperoxidación en un modelo de isquemia-reperfusión cardiaca ìrr vivo,

ellos encontraron que la mezcla de ambos antioxidantes reducía los niveles de malondialdehido e

Antecedentes


35/90

Antecedentes

hidroperóxidos (indicadores de lipoperoxidación). Estos mismos autores demostraron que la

combinación de lipoato y tocoferol mejora la fùncionalidad cardíaca, reduce la incidencia de

arritmias cardiacas posinfarto, preserva la contractilidad cardiaca y los niveles de lipoperóxidos

circulantes permanecen relativamente bajos (Coombes y cok., 2000 b).

Para explicar el sinergismo entre el AAL y, la VE se ha propuesto la capacidad regenerativa

del lipoato sobre el tocoferol (Stoyanovsky y cols., 1995). Sin embargo, este evento por si mismo

no es capaz de explicar la magnitud de los hallazgos encontrados, debido a que requiere de dos

intermediaros metabólicos, ubiquinol y ascorbato, para ser llevado a cabo (figura 5). Por lo tanto,

seguramente otros procesos están implicados y hacen posible en el potente sinergismo de esta

mezcla.

Figura 5. Vía de reciclaje de la vitamina E mediada por ácido a-lipoico.

Otros mecanismos de acción propuestos involucran al aumento de la actividad enzimática de la

GPX (Horáková y cok., 1991; Haramaki y cols., 1993; Coombes y cols.,2OOa) y la SOD,

específicamente de la isoforma acoplada a manganeso (MnSOD) (Coombes y cok., 2000 b). El

incremento en la actividad de la GPX parece deberse al incremento intracelular de selenio,

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Planteamiento del problema

III. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA.

Las especies reactivas derivadas del oxígeno parecen jugar un papel preponderante en los

mecanismos de iniciación y progresión del daño en la isquemia cerebral. Por ello, la

intervención farmacológica, mediante el uso de antioxidantes, pudiera ser una alternativa

atractiva para reducir el impacto de la lesión isquémica.

El ácido a-lipoico y la vitamina E son dos antioxidantes contenidos en la dieta habitual

de los mamíferos, entre ellos el ser humano. Ambos compuestos actúan de manera sinérgica,

esto ha sido demostrado en modelos de isquemia-reperfusión cardiacas y lipoperoxidación

retinianas, donde promueven la recuperación funcional, reducen la lipoperoxidación de

membrana y la extensión del daño. Sin embargo, actualmente se desconoce si esta mezcla

antioxidante representa una alternativa terapéutica útil para contrarrestar los efectos nocivosde los radicales oxidantes producidos durante la isquemia cerebral. Además, debido a las

importantes implicaciones clínicas que pudieran derivar del uso de esta mezcla antioxidante,

se consideró necesario establecer las consecuencias del tratamiento intensivo, después de

haberse producido un infarto embólico; así como, aquellas resultantes de la administración

profiláctica en animales posteriormente sometidos a isquemia.

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Hipótesis

IV. HIPÓTESIS.

La combinación de AAL y VE reduce la severidad de la lesión cerebral

por embolismo isquémico en ratas y favorece la recuperación funcional

de los animales después del tratamiento intensivo o profiláctico.


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Materiales y método

24 h

M o t o r

n=10 J

3 díasf

Cálculo de EdemaCerebral

n=5

EvaluaciónNeurológican=10

7 días

Volumen del Infarton=5

VII. MATERIALES Y MÉTODO.

DISEÑO EXPERIMENTAL

Índice Funcional

14 dias

Detección VesículasSinápticas

(Sinaptofisina)n=5

Detección de Conos Axónicos(GAP-43)

n=5


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Las dosis y esquemas de administración fueron seleccionados con base en estudios

previos, en los cuales ambos antioxidantes han demostrado ser eficaces en la disminución de

los niveles de lipoperoxidación (Cao y Phillis, 1995; Block y Schwarz, 1997; Stoffel y cols., 1997;

Blatt y cols., 2001). Ambos regímenes terapéuticos fueron administrados hasta el sacrificio de

cada animal.

Criterios de inclusión.

Animales que sobrevivieron al evento isquémico durante un lapso de al menos 24 h.

Aquellas ratas fallecidas después de ese período fueron incluidas para determinar la tasa de

mortalidad de cada grupo. Con el fin de preservar el tamaño muestra1 propuesto al inicio del

estudio, todos los individuos perdidos fueron repuestos.

Criterios de exclusión.

Animales que no presentaron signos clínicos (con la escala de déficit neurológico) de

lesión isquémica en las primeras 24 h posquirúrgicas. También fueron excluidos los animales

que no desarrollaron infartos cerebrales en la zona de dominio de la arteria cerebral media

(ACM)

Obtención del émbolo.

(1993). Para ello, los animales fueron anestesiados con pentobarbital sódico intraperitoneal (35

mg/kg) y previa asepsia y antisepsia de la región inguinal derecha del animal, se incidió y

disecó por planos hasta visualizar la arteria femoral. Ésta se sujetó con seda 000 y se introdujo

un catéter No. 24 conectado a un tubo de polietileno con diámetro interno de 0.86 mm. Se

extrajo sangre arterial, la cual se dejó coagular dentro del tubo durante 2 h a temperatura

ambiente y después durante 22 h a 4 “C.

36

Los émbolos Tfueron obtenidos de acuerdo al procedimiento descrito por Sereghy y


43/90


Transcurrido este tiempo, con el coágulo retraído, se procedió a su extracción; para ello,

se cortó una porción del tubo de 1.5 cm de longitud, ésta se colocó a la mitad de un sistema

hidráulico compuesto por 2 jeringas de 20 cm3 interconectadas entre si por un par de

mangueras de silicón de 30 cm de longitud, previamente llenadas con solución fisiológica

estéril (NaCl al 0.9% en agua bidestilada). Enseguida, el coágulo se extrajo mediante

compresión alterna de los émbolos de las jeringas. De esta manera, se obtuvo un coágulo rico

en fibrina y pobre en glóbulos rojos (Sereghy y cok., 1993). Los animales donadores de

émbolos no fueron incluidos en el protocolo experimental.

Isquemia focal por embolismo.

Para provocar la lesión por embolismo arterial, cada animal se anestesió con una

inyección intraperitoneal de pentobarbital (50 mg/kg), se colocó en posición decúbito dorsal, y

previa tricotomía, asepsia y antisepsia, se realizó una incisión longitudinal medial en la cara

anterior del cuello. Mediante disección por planos se expuso la arteria carótida común con sus

ramas derecha e izquierda. Con el fin de evitar sangrados, desviaciones del émbolo y facilitar

el abordaje hacia la arteria carótida externa, se electrocoagularon las arterias: pterigopalatina,

tiroidea superior y occipital. Después se realizó una arteriotomia transversal en la arteria

carótida externa y se canuló con un catéter No. 24. Se pinzó la carótida común e

inmediatamente después, el émbolo fùe inyectado hasta la carótida interna en un lapso de 30

segundos (figura 6). Durante todo el procedimiento, se tomó la precaución de no introducir

más de 100 n1 de solución fisiológica y se evitó que el pinzamiento de la carótida común

excediese más de 45 segundos (Sereghy y cols., 1993).

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Figura 6. Dibujo esquemático del método de embolización a través del árbol carotideo derecho. ACC:arteria carótida común, ACE: arteria carótida externa, ACI: arteria carótida interna, APP: arteria

pterigopalatina, ACP: arteria cerebral posterior, ACM: arteria cerebral media, ACA: arteria cerebral

Finalmente, se retiró el catéter, se electrocoaguló la arteria carótida externa y se efectuó cierre

por planos de la herida quirúrgica. Como consecuencia de lo anterior resultó un infarto

cerebral en el hemisferio cerebral derecho cuyas manifestaciones sensoriales y motoras se

expresan en el hemicuerpo izquierdo del animal.

Parámetros analizados.

Para el análisis de los ‘diferentes parámetros, se definieron 3 etapas principales. Se

tomó en cuenta que el tiempo transcurrido fuese el necesario para que las manifestaciones

esperadas por el daño embólico, descrito previamente (página 1 l), estuviesen plenamente

establecidas:

1. Evaluación del grado de recuperación motora mediante la escala de déficit

neurológico y el índice funcional motor (véase más adelante) (días 1ro, 3ro, 7° y 14°).

anterior.


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Materiales y rnetodo

2. Determinación de la extensión del daño con la evaluación del edema cerebral y el

análisis volumétrico del infarto (días 3ro y 7°).

3. Análisis del grado de remodelación del tejido lesionado, al 14° día poslesión,

mediante estudio inmunocitoquímico para revelar la sobre-expresión de

sinaptofisina (marcador de vesículas sinápticas) y GAP 43 (proteína de crecimiento

axónico).

1. Evaluación del grado de recuperación motora.

a) Escala de déficit neurológico (n = 10 por grupo).

Se aplicó a las primeras 24 h después de provocar el infarto embólico. Para ello, se

utiliió la escala de déficit neurológico descrita por Lekieffre y cols. (1997) consistente en el

analisis y calificación de tres parámetros: deambulación, evaluación del reflejo de flexión en

las cuatro extremidades y el reflejo de extensión de la extremidad anterior.

Deambulación. Los animales fueron colocados en una superficie plana de 1

permitiéndoles su libre desplazamiento durante un minuto. La deambulación normal y

espontánea se calificó con cero puntos; la circunscripción de círculos amplios al deambular

(eje de desplazamiento situado enla extremidad posterior del lado afectado) y, o

acompañado de claudicación se calificó con 1 punto; en tanto que, la incapacidad para

desplazarse y, o la circunscripción de círculos estrechos (eje desplazamiento situado sobre

la extremidad anterior del lado parético) se calificó con 2 puntos (figura 7).

Reflejo de flexión o retiro. Se analizó la respuesta motriz acontecida después del

pinzamiento del dedo medio de cada una de las extremidades. La flexión de la pata se

consideró como cero puntos, mientras que, la ausencia de ésta respuesta se calificó con 1

punto por cada extremidad.

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Figura 7. Posturas observadas con la evaluación de déficit neurológico durante la etapa dedeambulación (A-C) y reflejo de extensión de las extremidades anteriores (D-F). A. Representa’

la deambulación normal de una rata no lesionada. B. Circunscripción de círculos amplios; ocurre

so1o una pérdida moderada de fuerza que impide la deambulación en línea recta. C.

Circunscripción de círculos estrechos; se observa una severa pérdida de fuerza en las

extremidades izquierdas del animal que ocasiona un arqueo importante del tronco hacia el

hemicuerpo sano. D. Reflejo antigravitatorio normal de una rata al ser suspendida por la cola. E.

Extensión parcial de la pata correspondiente al hemicuerpo lesionado. F. Flexión o abolición

completa del reflejo antigravitatorio debido a lesión isquémica severa.

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fueron descartadas para el análisis.

Los parámetros analizados en las huellas fueron los siguientes (figura 8):

1 . Longitud de la huella (LH). Distancia comprendida desde el talón al dedo medio.

2 . Desplazamiento de dedos (DD). Distancia entre 1ro y el 5to dedo.

3. Desplazamiento del dedo intermedio (DDI). Distancia entre el 2do y el 4 t o dedo.

10 cm

L H D D DDI

Figura 8. Dibujo esquemático de la caja de deambulación utilizada para la determinación del IFM En

la parte inferior, se muestran las impresiones plantares de pata posterior derecha de una rata; las líneastrazadas muestran los 3 parámetros evaluados en cada huella (ver texto).

Durante cada sesión experimental, todos los ensayos se repitieron en tres ocasiones. Para finesde interpretación, se tomaron los valores medios de las huellas de la pata derecha (hemicuerpo

sano del animal) versus aquellos de la pierna izquierda (lado lesionado o parético). Este

control interno, realizado en cada animal, sirvió para descartar las variaciones individuales que

durante la deambulación presenta cada individuo Finalmente, las medias de los valores

obtenidos fueron sustituidas en la siguiente fórmula:

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DD = Desplazamiento de dedos

DD1 = Desplazamiento del dedo ìntermedio

L = Hemicuerpo lesionado (izquierdo)

C = Hemicuerpo sano (derecho)

Tres días antes de provocar el infarto, los animales de todos los grupos fueron

entrenados para caminar a lo largo de la cámara de prueba; no se realizaron mas

entrenamientos dado el fenómeno de habituación o “extinción”, el cual consiste en que los

animales tienden a permanecer inmóviles o a explorar la cámara de prueba, en lugar de

realizar la tarea para la cual han sido entrenados. Dichas sesiones se efectuaron los días 1, 3, 7

y 14 días posinfarto.

Al concluir el periodo de evaluación del grado de recuperación funcional, t o d o s los

animales fueron sacrificados por perfusión. intracardiaca; sus cerebros fueron extraidos e

incluidos en parafina, para efectuar cortes de 4 de espesor con un microtomo. Los cortesfueron teñidos con hematoxilina y eosina para determinar la ubicación del infarto. Si los

resultados obtenidos con la escala de déficit neurológico y el IFM no coincidían con infartos

cerebrales situados en regiones correspondientes al territorio irrigado por la ACM, estos

animales se excluían del estudio.

La califacación cero representa la función normal, en tanto que la máxima discapacidad

alcanza una calificación de -100 (Shen y Zhu, 1995).

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Donde:

AH20 = Incremento relativo del contenido de agua (edema)

CHAL = Contenido hemisférico de agua del hemisferio lesionado

CHAC = Contenido hemisférico de agua del hemisferio sano.

b) Cálculo del volumen del infarto (n = 5).

Perfusión intracardiaca.

El día 7 posisquemia, los animales fueron sacrificados mediante perfusión

intravascular. Brevemente, las ratas recibieron una dosis intraperitoneal de pentobarbital

sódico (60 mg/kg). Se les practicó toracotomía amplia para exponer el corazón; se pinzó la

aorta abdominal; se incidió el ventrículo izquierdo a nivel del ápex para canular,

transcardiacamente, la aorta ascendente. Enseguida, se instilaron 150 ml de solución

lavadora (NaCl al 0.9%, 10,000 UI de heparina /L y procaína al 1% en agua destilada)

durante 3 min. Posteriormente, se introdujeron 150 ml de solución fijadora

(paraformaldehido al 4% en tampón fosfatos 0.1 M). Inmediatamente después, se extrajo el

cerebro y se continuó la fijación por inmersión durante 24 h, en la misma solución fijadora.

Finalmente, el cerebro fue procesado e incluido en parafina mediante la técnica

convencional: deshidratación progresiva con concentraciones crecientes de etanol (70, 80,

95 y l00%), xilol-etanol 50:50 v/v, y xilol 100% (1 y II), impregnación en parafina caliente

(60 “C) 1 y parafina II; el tiempo de exposición en cada solución fuede una hora.

Determinación de las zonas de infarto mediante tinción con hematoxilina y eosina.

De los tejidos parafinados, se realizaron cortes coronales del cerebro completo con un

microtomo. Las rebanadas de cerebro fueron cortadas consecutivamente con espesores

alternos de 4 y 400 µm; durante este proceso se conservó la secuencia exacta entre los

cortes de 4 µm respecto a su predecesor de 400 µrn (figura 10). Los cortes de 4 µm se

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tiñeron con hematoxilina de Harris y eosina. Estas rebanadas tenidas fueron analizadas por

microscopía de luz para determinar la localización y el área del infarto cerebral.

Las zonas de infarto. (pannecrosis) se localizaron mediante la identificación deneuronas con datos de picnocitosis, cariorrexis, cariolisis, eosinofilia citoplasmática o

pérdida de la afinidad por la hematoxilina; otras alteraciones celulares, tales como neuronas

oscuras, festonadas y edematizadas fueron incluidas también en la cuantificación (García y

cok., 1995). Las principales características celulares obtenidas a los 7 días posinfarto se

muestran en la figura 9.

Cálculo volumétrico del infarto.

El estudio de las características celulares se realizó con una magnificación de x200;

mientras que el delineado y delimitación del área del infarto se efectuó bajo

magnificaciones de x40 y x100. La circunscripción del área de infarto se hizo mediante un

analizador de imágenes (Leica Q500l W). Una vez identificadas las zonas afectadas, las

imágenes se almacenaron en la computadora; con el cursor del ratón electrónico se efectuó

el trazado de los límites del infarto; el analizador de imágenes efectúa entonces, una

cuantificación automática de las zonas delimitadas, las adiciona y obtiene la superficie total

del infarto de cada rebanada de tejido. Todas las mediciones fueron efectuadas por

triplicado y el observador fue cegado respecto a los grupos estudiados. Finalmente, el

volumen total del infarto se obtuvo multiplicando el área de infarto de cada rebanada por la

distancia comprendida entre cada uno de ellas (figura 10) (Andersen y cols., 1999).


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Materiales y Métodos


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Figura 10. Dibujo esquemático del método para cuantificación del volumen del infarto. Una vezdelimitada y medida el área infartada en cada rebanada (sombreado), el volumen del infarto seobtiene de multiplicar cada una de éstas, por la distancia comprendida entre cada corte (Andersen ycols., 1999).

3. Correlación entre volumen del infarto VS. escala de déficit neurológieo.

Con la finalidad de obtener el grado de asociación entre la magnitud del’ daño

isquémico y el valor de las puntuaciones otorgadas con la escala neurológica, se efectuó un

análisis de regresión lineal entre el volumen del infarto determinado en cada animal y las

calificaciones (obtenidas en ellos mismos) con la escala de déficit neurológico, antes del

sacrificio de cada roedor.

Método estadístico.

Para detectar la presencia de diferencias estadísticamente significativas entre grupos

con las determinaciones de cálculo de edema y volumen del infarto se utilizó ANOVA de

una sola vía con post-hoc de Bonferroni/Dunn.Para el análisis de correlación de rangos se

utilizó la rho de Spearman. En ambos casos el valor elegido de P para considerar las

diferencias como estadísticamente significativas fue de 0.05.

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4. Análisis de remodelación del tejido nervioso lesionado

Inmunocitoquímica para microscopía de luz (n = 5 por grupo).

El día 14 posisquemia, los animales fueron sacrificados por perfusión intravascular,

sus cerebros fueron extraídos e incluidos en parafina, de acuerdo con los procedimientos

descritos previamente.

Una vez obtenidos los bloques parafinados, se realizaron cortes coronales con un

microtomo de la totalidad del cerebro. Se obtuvieron rebanadas de 40 µm de espesor,

simultáneamente se efectuaron cortes de 4 µm, conservando la correspondencia entre un

corte grueso y uno delgado. Los cortes de 4 µm fueron teñidos con hematoxilina y eosina;

éstos sirvieron para establecer las zonas del infarto. El núcleo isquémico fue determinado

mediante los criterios de necrosis celular descritos previamente (García y cok., 1995); en

tanto que, la penumbra del infarto se estableció desde los límites del núcleo isquémico

hasta 1 mm hacia el tejido cerebral adyacente (Kondo y cok., 1997).

Los cortes de 40 µm fueron destinados para los análisis de remodelación efectuados

exclusivamente en la zona de penumbra isquémica. En esa zona se evaluaron dos parámetrosdel grado de remodelación nerviosa: sinaptogénesis y rebrotes axónicos (sprouting). Para ello,

se detectaron, mediante técnicas de inmunocitoquímica, las proteínas sinaptofisina y GAP-43,

las cuales son componentes estructurales de las vesículas presinápticas y los conos axónicos

en crecimiento, respectivamente. Solamente se incluyeron en este estudio aquellos cerebros

donde el infarto se produjo en la zona cerebral irrigada por la ACM.

Inmuuocitoquímica para sinaptofisina.

Los tejidos designados para inmunomarcaje de sinaptofisina fueron desparafinados y

rehidratados con tampón salino de fosfatos (PBS 0.lM,pH 7.4). Subsiguientemente, los

cortes fueron lavados con PBS-Tritón-Albúmina (PBS 0.1 M, 0.1% de albúmina sérica

bovina y 0.05% de Tritón-X-l00, pH 7.4) durante 15 min en 2 ocasiones; este doble lavado

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inmunorreactivo en ambos hemisferios. Los niveles de fondo fueron obtenidos en el cuerpo

estriado o en la cápsula interna, dada la escasa presencia de procesos axónicos y relevos

sinápticos en ambas estructuras.

2) Niveles de GAP 43 o sinantofisina en el hemisferio no-lesionado (NHNoL). Estos

datos sirvieron para registrar el nivel basal de expresión de ambas proteínas, presente en el

cerebro en condiciones normales. Con la finalidad de obtener el valor de referencia en las

regiones cerebrales no lesionadas, estas mediciones fueron realizadas en ‘espejo” con

respecto a aquellas tomadas en el hemisferio lesionado,.

3) Niveles de GAP 43 o sinantofisina en el hemisferio lesionado (NHL,). Indican eI

nivel de expresión de ambas proteínas en la zona de lesión, cuya variación es directamente

1993).

Figura 11. Imagen de un corte coronal de cerebro de rata, adquirida en escala de grises. El tejido

de la rejilla con la cual se realizó cada una de las mediciones, pareadas de manera simétrica;

estriado (F).

proporcional a Ia cantidad de proteínas presentes en dicha zona (Stroemer y cols. 1992;

|muestra intemrna inmonorreactividad a GAP-43 (zonas obscuras). Los cuadros esquematizan el área

hemisferio isqueco (I) VS. Sano (S). En este caso, los niveles de fondo se obtuvieron del cuerpo

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Finalmente, el grado de sobre-expresión se obtuvo de la siguiente manera:

Sobre-expresión de sinaptofisina ó GAP-43 = NHL - NF

NHNOL-NF

El procedimiento de cuantificación densitométrica se efectuó bajo el régimen de

observador “cegado” respecto a la asignación de grupos. Se registraron un total de 300

determinaciones densitométricas pareadas por grupo. La densidad óptica normalizada final

fue obtenida a partir de la media ± error estándar de las mediciones individuales dentro de

cada grupo.

Análisis estadístico.

Para las comparaciones de los valores individuales de las medias ± error estándar entre grupos

se utilizó ANOVA de una sola vía, seguido de la prueba post-hoc de Bonferroni/Dunn; con un

nivel de significancia de P


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VIII. RESULTADOS.

Reproducibilidad del modelo.Ambos regímenes terapéuticos empleados en el presente estudio fueron bien tolerados

por los animales, puesto que no se presentó ninguna alteración atribuible a sobredosis o

toxicidad, tales como: hemorragias, esteatorrea o alteraciones ponderales, incluso en

aquellos animales pre-medicados durante 30 días antes de someterlos a isquemia.

Respecto a las zonas cerebrales afectadas, el modelo de isquemia focal por

embolismo carotídeo presentó una alta reproducibilidad. De un total de 124 animales

manipulados, 116 ratas (93.5%) presentaron infarto en las zonas correspondientes a la

irrigación de la ACM. Las áreas cerebrales lesionadas fueron: la corteza somato-sensorial

de extremidad anterior y posterior, parietal 1 y 2, frontal 1, perirrinal y piriforme; en tanto

que, las áreas subcorticales afectadas fueron los núcleos caudado y putamen (cuerpo

estriado). En contraparte, solamente 8 animales (6.5%) fueron retirados del estudio debido

a que mostraron infarto en el territorio de la arteria cerebral posterior.

Tasa de mortalidad.

En nuestro estudio, como se esperaba, la tasa de mortalidad fue considerablemente

elevada, debido al tipo y magnitud de las lesiones ocasionadas con este tipo de modelo

experimental. El número de animales fallecidos en cada grupo fue: control-isquémico =

ll/30 (3 5.5%), control-vehículo = 9/30 (3 1%), intensivo = 10/30 (33.3%), profiláctico =

6/30 (23%). Todos los individuos perdidos fueron repuestos para mantener el tamaño de la

muestra. A pesar de la elevada tasa de mortalidad presentada en cada grupo, la

premeditación con AAL ycon y VE, durante 30 días, redujo el índice de muerte de estos

animales en aproximadamente 10 puntos porcentuales (-3 1% en términos reales).

Resultados

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Resultados

El tipo de lesión producida con el presente modelo correspondió a un infarto cerebral

con un núcleo isquémico con cambios típicos de necrosis colicuativa, determinados por

pérdida importante de la afinidad a hematoxilina, detritus celulares abundantes, importante

infiltración leucocitaria y lesión microvascular generalizada (figura 12). Hacia la periferia,

se encontraron cambios necróticos característicos manifestados por la presencia de

vacuolación neuronal, picnosis, cariorrexis, cariólisis y desintegración del pericarion.

Figura 12. Infarto cerebral embólico (7 días) en corteza parietal de rata observado bajo diferentes

amplificaciones: A = x40, B = x100, C = x200, y D = x400. En las cuatro imágenes se muestran el

núcleo isquémico con necrosis colicuativa típica (*), la zona de penumbra (P) y, en algunos casos

(A Y W, se observan porciones de parénquima cortical sano (S). La zona de penumbra, delimitada

por las cabezas de flecha (C y D), muestra un patrón típico de necrosis neurona1 dispersa, algunas

neuronas “fantasma” (flecha), eosinofilia discreta y gliosis. Técnica hematoxilina & eosina;.

Análisis histpatológico.

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Resultados


a) Escala de déficit neurológico.

Los resultados de las calificaciones obtenidas con la escala de déficit neurológico se

muestran en la figura 13. Las menores calificaciones fueron obtenidas por los grupos

tratados con antioxidantes; sin embargo, el análisis estadístico únicamente reflejó

diferencias significativas con el grupo de animales sometidos al tratamiento profiláctico:

: control-vehículo = 3.1 ± 0.28, intensivo = 2.31 ± 0.33 vcontrol-isquémico = 3.94 ± 0.32

profiláctico = 1.39 ±0.23 (P = O.(

o-

Figura 13. Resultados obtenidos de la evaluación neurológicas de las 4 determinaciones (día 1, 3, 7

y 14) en los 5 grupos. La línea punteada señala el nivel basal normal (control-intacto); en tanto las

barras indican la media ± error estándar de los grupos isquémicos. Se observa que el tratamiento

antioxidante redujo las alteraciones motrices, principalmente en el grupo con manejo profiláctico.

(*) P = 0.001; Kruskall-Wallis-U de Mann-Whitney.

0-

1-

2-

3-

4-

5-

6-

C a l i f i c a c i ó n


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Resultados


a) Cálculo del edema cerebral.

La evaluación del grado de edema cerebral con base en la determinación del

incremento en el contenido de agua del hemisferio enfermo (isquémico) contra el

hemisferio sano (no isquémico), se expone en la figura 15. Los incrementos en el contenido

de agua están expresados en términos porcentuales: control-isquémico (1.62 ± 0.28 %),

control-vehículo (1.65 ±0.34 %), intensivo (1.55 ± 0.19 %) profiláctico (1.68 ±0.09 %).

El análisis estadístico no mostró diferencias numéricas significativas entre los grupos

controles (isquémico y vehículo) y los sometidos al tratamiento antioxidante (P = 0.986).

Incremento en el contenido de humedad

Figura 15. Grado de edema cerebral post-reperfusión evaluado al tercer día. El tratamiento conAAL y VE no reflejó efectos sobre el contenido de humedad en comparación con los controles (isquémico y vehículo). LOS valores expresan la media ± error estándar del incremento en el

contenido hídrico del hemisferio isquémico con respecto al hemisferio contralateral. El análisisestadístico no mostró diferencias sgnificativas entre ninguno de los grupos no reflejó (ANOVA-

Bonferroni; P = 0.986).

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Resultados

Análisis de correlación.

A partir de los datos obtenidos en los cuatro grupos isquemizados, se realizó un

análisis de correlación entre los valores calculados del volumen del infarto VS. lascalificaciones obtenidas con la escala de déficit neurológico. La gráfica de la regresión

calculada se muestra en la figura 17. Se encontró la presencia de asociación entre ambos

parámetros (coeficiente de correlación, r = 0.503). El valor predictivo de esta correlación

Vehículo

fue estadísticamente significativo (P = 0.006).

Volumen del infarto VS. Escala neurológicaeurológi

10 2 0 30 4 0 50

Volumen del infarto (mm3)

Figura 17.‘ El gráfico muestra las medias de los volúmenes del infarto, registrados en la totalidad de losanimales pertenecientes a los 4 grupos estudiados, y sus calificaciones del déficit neurológicocorrespondientes. El análisis de correlación reveló la presencia de una asociación moderada

estadísticarnente significativa entre ambos parámetros (r = 0.503; P = 0.006, Rho de Spearman).

C a l i f i c a c i ó n

Profiláctico


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Las figuras 18 y 19 muestra los patrones morfológicos y distribuciones tisulares de

Figura 18. Neuronas corticales de una rata del grupo profiláctico, presentes en la zona de penumbra

las cuales muestran vesículas sinápticas inmunomarcadas con anti-sinaptofisina, observadas bajo

diferentes amplificaciones: A = x400 y B = x1 000. Alrededor de los somas neuronales (S), la

Figura 19. Neuronas corticales de una rata del grupo profiláctico, presentes en la zona de penumbra

inmunomarcadas con anti-GAP 43, observadas bajo diferentes amplificaciones: A = x400 y B =

x1000. La distribución de la proteína sobre-expresada se circunscribe al soma (S) y el cono axónico

neurona1 en remodelación (flechas). Algunas neuronas en esta región no han expresado GAP 43

(puntas de flecha).

Remodelación neuronal

Resultados

las proteínas sinaptofísina v GAP 43, observados al día 14 posisquemia en la zona de

distribución la proteína muestra su patrón puntiforme característico (flechas).

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Los resultados del análisis densitométrico del grado de sobre-expresión de ambas proteínas

en el tejido lesionado (cuadro l), revelan que los regímenes de tratamiento antioxidante

(intensivo y profiláctico) incrementaron entre un 20 a 26 % la sobre-expresión de

sinaptofisina, y aproximadamente 40 a 45 % la de GAP 43, respecto a los controles (P <

Análisis de Remodelación Cerebral

Resultados

0.05).

Inmunomarcaje Control Vehículo Intensio Profiláción

Sinapofísina 139± 0.07± 1.8± 0.12 1.76±0.6 1.67±0.11

GAP 43 1.85±0.11 1.81±0.10 2.59±0.16 2.76±0.28

Cuadro 1. Densidades ópticas normalizadas de sinaptofisina y GAP 43 (14 dias posisquemia). Elcuadro muestra los resultados del grado de sobre-expresión de las proteinas sinaptofisina y GAP 43en la zona de penumbra. Ambos tratamientos antioxidantes incrementaron la expresión de ambosmarcadores de remodelación nerviosa. Los datos se expresan como la medida ± error estándar de lasdensidades ópticas normalizadas.

P < 0.05; ANOVA-Bonferroni.

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Discusión

IX. DISCUSIÓN.

El impacto biológico, psicológico, social y económico de la enfermedad vascular cerebral a

nivel mundial es de capital importancia. Esto ha motivado la búsqueda de diversos

tratamientos experimentales encaminados a tratar de prevenir o disminuir la magnitud del

daño cerebral. Sin embargo, pese a los constantes logros en el conocimiento de esta

patología, el impacto de tales avances en la terapéutica médica ha sido realmente muy

limitado, lo cual lamentablemente se refleja en la elevada mortalidad de la enfermedad

(-30%) y en el número tan importante de discapacitados que genera cada año.

Es tal la cantidad de tratamientos y sustancias experimentales estudiados que su

enumeración y clasificación resulta sumamente complicada. Algunas de las estrategi

oscar porfirio gonzalez perez

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