optogenética: controlando el cerebro con luz
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Iris Mar(nez Rodero Pilar Natalia Rodilla Ramírez
OPTOGENÉTICA
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Controlando el cerebro con luz
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OBJETIVOS DE APRENDIZAJE !
• Ser capaces de definir Optogenética
• Entender cómo se desarrolló esta técnica
• Identificar los 3 pilares de la Optogenética
• Aprender mediante un ejemplo el diseño de estos
experimentos
• Conocer las perspectivas futuras de esta técnica
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La combinación de métodos ópticos y genéticos para controlar in vivo fenómenos en una célula
específica.
¿Qué es la Optogenética?
Ópticos Genéticos
Dirigir la luz a zonas de interés
Opsinas microbianas
Expresión heteróloga
INTRODUCCIÓN !
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CONTEXTUALIZACIÓN !
Francis Crick en 1979: La fotoestimulación para manipular tipos celulares específicos
[1]
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CONTEXTUALIZACIÓN !
Francis Crick en 1979: La fotoestimulación para manipular tipos celulares específicos
[1]
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CONTEXTUALIZACIÓN !
Francis Crick en 1979: La fotoestimulación para manipular tipos celulares específicos
[1]
su idea se materializó
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CONTEXTUALIZACIÓN !
Francis Crick en 1979: La fotoestimulación para manipular tipos celulares específicos
su idea se materializó
[1]
la Optogenética
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CONTEXTUALIZACIÓN !
Francis Crick en 1979: La fotoestimulación para manipular tipos celulares específicos
su idea se materializó
pero no aparece de la nada
[1]
la Optogenética
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CONTEXTUALIZACIÓN !
Francis Crick en 1979: La fotoestimulación para manipular tipos celulares específicos
su idea se materializó
pero no aparece de la nada
Ajeno a la neurociencia En Optogenética
opsinas conocidas desde la época de Crick hasta 2005 no se incorporaron a neuronas
se había expresado opsinas en células mamíferas
hasta 2005 no se expresaron en neuronas
óptica bien desarrollada para ensayos in vitro
interacción luz-célula in vivo supuso limitación
[1]
la Optogenética
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2005-2009 la optogenética se desarrolló: • Dificultades en su implementación • Pocas publicaciones y avances
Optogenética: “the three-body problem”
CONTEXTUALIZACIÓN !
Modelos animales:
-‐ C.elegans
-‐ Drosophila
-‐ Pez cebra
-‐ Ratón
-‐ Rata
-‐ Primates
[2]
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¿Cómo actúan los 3 pilares juntos?
LAS BASES DE LA OPTOGÉNETICA !
En Optogenética se necesita
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¿Cómo actúan los 3 pilares juntos?
LAS BASES DE LA OPTOGÉNETICA !
En Optogenética se necesita
Una proteína bacteriana
OPSINAS
[2]
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¿Cómo actúan los 3 pilares juntos?
LAS BASES DE LA OPTOGÉNETICA !
En Optogenética se necesita
Una proteína bacteriana
OPSINAS
[2]
[3]
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¿Cómo actúan los 3 pilares juntos?
LAS BASES DE LA OPTOGÉNETICA !
En Optogenética se necesita
Una proteína bacteriana
OPSINAS
Expresar la proteína en la membrana de la célula
de interés
EXPRESIÓN HETERÓLOGA
[2] [2]
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¿Cómo actúan los 3 pilares juntos?
LAS BASES DE LA OPTOGÉNETICA !
En Optogenética se necesita
Una proteína bacteriana
OPSINAS
Expresar la proteína en la membrana de la célula
de interés
EXPRESIÓN HETERÓLOGA
Activar la proteína con luz
LUZ DIRIGIDA CON
FIBRA ÓPTICA [2]
[2] [2]
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Los elementos, uno por uno
LAS BASES DE LA OPTOGENÉTICA !
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• Familia de genes • Codifican para las rodopsinas
Los elementos, uno por uno
1. OPSINAS
convierten los fotones a
corriente eléctrica
dirigen esa corriente a través de la membrana
LAS BASES DE LA OPTOGENÉTICA !
cuando se estimulan con la luz
[4]
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Los elementos, uno por uno 1. OPSINAS
LAS BASES DE LA OPTOGENÉTICA !
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Los 3 tipos más comunes en la Optogenética son:
Los elementos, uno por uno 1. OPSINAS
LAS BASES DE LA OPTOGENÉTICA !
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Los 3 tipos más comunes en la Optogenética son:
Los elementos, uno por uno 1. OPSINAS
Canalrodopsinas Permite el paso de
cationes por su poro
[2]
LAS BASES DE LA OPTOGENÉTICA !
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Los 3 tipos más comunes en la Optogenética son:
Los elementos, uno por uno 1. OPSINAS
Halorodopsinas Bombean Cl- al
medio extracelular
Canalrodopsinas Permite el paso de
cationes por su poro
[2] [2]
LAS BASES DE LA OPTOGENÉTICA !
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Los 3 tipos más comunes en la Optogenética son:
Los elementos, uno por uno 1. OPSINAS
Halorodopsinas Bombean Cl- al
medio extracelular
Bacteriorodopsinas Bombean H+ al
medio extracelular
Canalrodopsinas Permite el paso de
cationes por su poro
[2] [2] [2]
LAS BASES DE LA OPTOGENÉTICA !
![Page 23: Optogenética: controlando el cerebro con luz](https://reader031.vdocuments.mx/reader031/viewer/2022022001/588498c61a28ab26058b5d37/html5/thumbnails/23.jpg)
Los elementos, uno por uno 1. OPSINAS
LAS BASES DE LA OPTOGENÉTICA !
Excitatorias: depolarizan Inhibitorias: hiperpolarizan
[5]
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Los elementos, uno por uno 2. EXPRESIÓN DE OPSINAS
LAS BASES DE LA OPTOGENÉTICA !
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Los elementos, uno por uno 2. EXPRESIÓN DE OPSINAS
Consideraciones:
Fotocorrientes generadas por las opsinas son bajas
Se necesitan altos niveles de expresión génica
Se debe optimizar: neuronas muy sensibles y vulnerables
pueden dañarse por la sobreexpresión de proteínas de membrana
LAS BASES DE LA OPTOGENÉTICA !
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Los elementos, uno por uno 3. INTERFAZ CÉLULA-LUZ
• Se necesita alta intensidad de luz
• Se busca:
§ especificidad en el tipo cellular
§ minimizar la toxicidad celular
LAS BASES DE LA OPTOGENÉTICA !
[2] [6]
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Principalmente en neurobiología
APLICACIONES !
• Describir circuitos neuronales implicados en síntomas de estados
patológicos: epilepsia, Parkinson…
• Investigar a gran escala cepas mutantes de C. elegans con
defectos en proteínas sinápticas.
• Identificar neuronas y proyecciones moduladoras de
comportamientos: escape, sociales. En D. melanogaster, Danio
rerio y Mus musculus.
• Estudiar el aprendizaje y la memoria en Mus musculus.
• Regular el ritmo cardíaco.
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Principalmente en neurobiología
APLICACIONES !
• Estudiar el aprendizaje y la memoria en Mus musculus.
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Estudio del aprendizaje y la memoria
Un recuerdo está codificado por una población dispersa de neuronas
APLICACIONES !
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Estudio del aprendizaje y la memoria
Un recuerdo está codificado por una población dispersa de neuronas
Eliminación/inactivación
Pérdida del recuerdo
Activación Reexpresión
APLICACIONES !
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Estudio del aprendizaje y la memoria
Un recuerdo está codificado por una población dispersa de neuronas
Eliminación/inactivación
Pérdida del recuerdo
Activación Reexpresión
Objetivo
APLICACIONES !
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Estudio del aprendizaje y la memoria
Marcaje de las neuronas
c-fos tTA Sistema inducible Tet-off
Ratones transgénicos
c-fos-tTA
APLICACIONES !
[7]
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Estudio del aprendizaje y la memoria
Marcaje de las neuronas
c-fos tTA Sistema inducible Tet-off
Ratones transgénicos
c-fos-tTA
ITR ChannelRhodopsin-2-EYFP TRE Vector DNA: AAV-TRE-ChR2-EYFP
+
ITR
APLICACIONES !
[7]
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Estudio del aprendizaje y la memoria
Dos puntos de control para el marcaje:
• Activación neuronal • Ausencia de Doxiciclina
Si las neuronas se activan, quedarán marcadas sólo en
ausencia de doxiciclina.
APLICACIONES !
[8]
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Estudio del aprendizaje y la memoria • Habituación: caja A, doxiciclina. • Condicionamiento: caja B, choque eléctrico. Sin doxiciclina. • Test: caja A, doxiciclina. Épocas con y sin luz.
Esquema básico
APLICACIONES !
[8]
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Estudio del aprendizaje y la memoria • Habituación: caja A, doxiciclina. • Condicionamiento: caja B, choque eléctrico. Sin doxiciclina. • Test: caja A, doxiciclina. Épocas con y sin luz.
Esquema básico
APLICACIONES !
[8] [8]
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Estudio del aprendizaje y la memoria • Habituación: caja A, doxiciclina. • Condicionamiento: caja B, choque eléctrico. Sin doxiciclina. • Test: caja A, doxiciclina. Épocas con y sin luz.
Esquema básico
APLICACIONES !
[8]
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Estudio del aprendizaje y la memoria
Miden la inmovilización
• Habituación: caja A, doxiciclina. • Condicionamiento: caja B, choque eléctrico. Sin doxiciclina. • Test: caja A, doxiciclina. Épocas con y sin luz.
Esquema básico
APLICACIONES !
[8] [9]
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Estudio del aprendizaje y la memoriaResultados
No Shock No ChR2
CONTROLES
APLICACIONES !
[8]
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Estudio del aprendizaje y la memoria
Activar directamente una subpoblación de células implicada en la formación de un recuerdo es suficiente para inducir
la expresión del comportamiento asociado al mismo.
Resultados
No Shock No ChR2
CONTROLES Conclusión
APLICACIONES !
[8]
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Posibles direcciones futuras
CONCLUSIONES!
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Posibles direcciones futuras
CONCLUSIONES!
1. En Neurociencia
• Elucidación de las bases de su funcionamiento
• Control intrínseco y preciso en sistemas intactos in vivo
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Posibles direcciones futuras
CONCLUSIONES!
1. En Neurociencia
• Elucidación de las bases de su funcionamiento
• Control intrínseco y preciso en sistemas intactos in vivo
2. Expansión del toolkit
• Aplicación a otros tejidos: muscular, cardíaco,
embrionario…
• Ajustar las necesidades técnicas: velocidad, precisión…
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“La historia tras esta tecnología subraya el valor de la protección de nichos ecológicos
excepcionales y la importancia del apoyo a la ciencia puramente básica.
Nunca deberíamos olvidar que no sabemos dónde nos lleva la larga marcha de la ciencia o
qué necesitaremos para iluminar nuestro camino.”
Karl Deisseroth
CONCLUSIONES!
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BIBLIOGRAFÍA!v Imágenes:
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2. Deisseroth, K. (2015). Optogenetics: 10 years of microbial opsins in neuroscience. Nature neuroscience, 18(9), 1213-1225.
3. Delroisse, J., Ullrich-Lüter, E., Ortega-Martinez, O., Dupont, S., Arnone, M. I., Mallefet, J., & Flammang, P. (2014). High opsin diversity in a non-visual infaunal brittle star. BMC genomics, 15(1), 1035.
4. Membrana: Plasma membrane 3D. Trendyworks LLC. https://lh3.googleusercontent. com /xo5tKkxkXC1wc-qjVTpg03V9Rv2G0W4mtCSiTTbD5Qk5HrGEfNwBUQfflMj02TtY jp0=h900. Láser: Pixabay. https://pixabay.com/p-160991/?no_redirect. Consultado el 20/10/2015.
5. Pastrana, E. (2011). Optogenetics: controlling cell function with light. Nature Methods, 8(1), 24-25.
6. Streye: Top 5 Innovaciones Tecnológicas Médicas. (http://streye.com/blog/top-5-innovacion-tecnologica-medicas). Consultado el 20/10/2015
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8. Liu, X., Ramirez, S., Pang, P. T., Puryear, C. B., Govindarajan, A., Deisseroth, K., & Tonegawa, S. (2012). Optogenetic stimulation of a hippocampal engram activates fear memory recall. Nature, 484(7394), 381-385.
9. Imagui: http://www.imagui.com/a/dibujar-raton-c85aGadLb. Consultado el 20/10/2015.
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§ Deisseroth, K. (2011). Optogenetics. Nature methods, 8(1), 26-29. § Boyden, E. S. (2015). Optogenetics and the future of neuroscience. Nature
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manipulation of a hippocampal memory engram. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences, 369(1633), 20130142.
§ Deisseroth, K. (2010). Controlling the brain with light. Scientific American, 303(5), 48-55. § Fenno, L., Yizhar, O., & Deisseroth, K. (2011). The development and application of
optogenetics. Annual review of neuroscience, 34, 389-412. § Guru, A., Post, R. J., Ho, Y. Y., & Warden, M. R. (2015). Making sense of optogenetics.
International Journal of Neuropsychopharmacology, pyv079. § Nussinovitch, U., & Gepstein, L. (2015). Optogenetics for in vivo cardiac pacing and
resynchronization therapies. Nature biotechnology.