optimisation de la production de protéines recombinantes avec des

Click here to load reader

Post on 05-Jan-2017

221 views

Category:

Documents

5 download

Embed Size (px)

TRANSCRIPT

  • UNIVERSIT DE MONTRAL

    OPTIMISATION DE LA PRODUCTION DE PROTINES

    RECOMBINANTES AVEC DES CELLULES DE TABAC EN SUSPENSION

    RIC BOIVIN

    DPARTEMENT DE GNIE CHIMIQUE

    COLE POLYTECHNIQUE DE MONTRAL

    THSE PRSENTE EN VUE DE LOBTENTION

    DU DIPLME DE PHILISOPHIAE DOCTOR (Ph.D)

    (GNIE CHIMIQUE)

    MARS 2010

    ric Boivin, 2010.

  • UNIVERSIT DE MONTRAL

    COLE POLYTECHNIQUE DE MONTRAL

    Cette thse intitule:

    OPTIMISATION DE LA PRODUCTION DE PROTINES RECOMBINANTES

    AVEC DES CELLULES DE TABAC EN SUSPENSION

    prsente par : BOIVIN, ric

    en vue de lobtention du diplme de : Philosophiae Doctor

    a t dment accepte par le jury dexamen constitu de :

    M. PERRIER Michel, Ph.D., prsident

    M. JOLICOEUR Mario, Ph.D, membre et directeur de recherche

    M. DE CRESCENZO Grgory, Ph.D, membre et codirecteur de recherche

    M. MATTON Daniel-Philippe, Ph.D, membre et codirecteur de recherche

    M. HENRY Olivier, Ph.D., membre

    M. SAINSBURY Frank, Ph.D, membre

  • iii

    DDICACE

    ma mre, mon pre et Guillaume

  • iv

    REMERCIEMENTS

    Jaimerais remercier mes directeurs de recherche, les Pr. Mario Jolicoeur, Grgory De

    Crescenzo et Daniel P. Matton pour mavoir accueilli dans leurs laboratoires, pour leur

    encadrement, leurs judicieux conseils et leurs encouragements. Je tiens galement les remercier

    pour mavoir apport une nouvelle vision de la recherche, plus applique que celle que mes

    tudes antrieures mont donne.

    Je souhaite galement remercier tous mes collgues de travail pour leur aide, leurs

    conseils et pour la bonne ambiance quils ont fait rgner au laboratoire. Jaimerais

    particulirement remercier Steve pour mavoir transmis tout son savoir en ce qui concerne la

    culture de cellules de plantes, Mathieu pour les cultures en bioracteur et le Virgo, Zeina pour les

    analyses de Differential display, et Martin, Hugo et ric C. pour leur conseils concernant

    plusieurs mthodes de biologie molculaire.

    Jaimerais galement souligner le prcieux travail des techniciens, Martine, Gino, Lionel,

    Michelle, Carol, Jean, Robert qui mont aid lors de la ralisation de ce projet. De mme,

    jaimerais remercier le personnel du secrtariat du dpartement de gnie chimique, en particulier

    Louise, Lyne, Chantal F., Chantal B et Brigitte pour leur aide avec les problmes administratifs et

    les commandes.

    Enfin, un gros merci mes amis et collgues, en particulier Virginie, Marisha, Jingkui, Cyril,

    Aline, Antoine, Anne et Ines pour leurs oreilles attentives et leurs encouragements. Un gros merci

    galement Guillaume, pour le rconfort quil ma apport, la tranquillit de son condo et sa

    machine caf.

  • v

    RSUM

    La demande croissante pour des protines recombinantes faible cot stimule lindustrie

    dvelopper de nouvelles plateformes de production. Parmi celles-ci, la plateforme vgtale in

    vitro gagne en intrt. Permettant lutilisation dun milieu de culture entirement synthtique,

    exempt de protines et qui ne favorise pas le dveloppement de pathognes humains, les cellules

    de plantes peuvent effectuer des modifications post-traductionnelles et mener des molcules

    bioactives. Plusieurs protines produites en plantes sont dailleurs en phase d'essais cliniques.

    Toutefois, les faibles rendements en protines recombinantes obtenus avec les cellules de plantes

    limitent la comptitivit de cette plateforme novatrice.

    Les travaux de recherche regroups dans cette thse visent lamlioration des rendements

    en protines recombinantes produites par des cellules de tabac en suspension. L'objectif principal

    a consist en loptimisation de la production de protines recombinantes en cellules de tabac,

    dans le contexte d'un bioprocd en bioracteur. En objectifs spcifiques, la co-culture de cellules

    de plantes avec Agrobacterium permettant d'exprimer de faon transitoire un gne dintrt et un

    suppresseur viral, ainsi que lidentification et lisolation de promoteurs forts inductibles au froid

    ont t tudies.

    De manire prsenter une vue globale de la situation actuelle du march et de

    lindustrie, une revue dtaille a t ralise et soumise au journal Plant Biotechnology Journal

    (fvrier 2010). Dans la premire partie de cet article, l'ensemble des plateformes de production de

    protines recombinantes tablies de mme que celles en mergence sont dcrites en dtail et leurs

    niches spcifiques sont prsentes. Par la suite, les innovations rcentes rapportes dans la

    littrature pour la plateforme vgtale in vitro, telles que loptimisation des cassettes dexpression

  • vi

    et des paramtres de bioprocds et lutilisation de suppresseurs viraux de rpression gnique

    sont prsentes et discutes.

    Dans un deuxime temps, un chapitre prsente une tude dmontrant la faisabilit de

    produire des protines recombinantes de faon transitoire, dans des cellules de plantes en

    suspension, en les cocultivant avec des populations d'Agrobacterium comptentes transfrer des

    plasmides contenant divers gnes d'intrt. Il a ainsi t dmontr que lexpression transitoire

    dun suppresseur viral de rpression gnique tel que p19, simultanment l'expression galement

    transitoire d'un gne d'intrt, augmente de manire significative le rendement en protines

    recombinantes. Ces travaux ont t consigns dans un second article soumis au journal

    Biotechnology Progress (fvrier 2010). Plus prcisment, des cellules de Nicotiana benthamiana

    ont t cocultives avec deux souches dAgrobacterium diffrentes, lune ayant une construction

    pour lexpression dun gne dintrt, un anticorps IgG1 de souris, lautre codant pour le

    suppresseur viral p19. Ces travaux de coculture transitoire ont permis de dmontrer, pour la

    premire fois, que la co-transformation de cellules de plante en suspension avec deux vecteurs de

    transformation est possible, et que lutilisation dun suppresseur viral augmente significativement

    la production de protines recombinantes, de manire similaire ce qui est observ pour des

    feuilles de la mme plante agroinfiltres. Il a galement t dtermin que lutilisation dune

    approche transitoire pour lexpression du suppresseur viral pourrait tre prfrable

    ltablissement dune ligne exprimant constitutivement le suppresseur. Selon les rsultats

    prsents dans cette thse, la suppression du mcanisme de rpression gnique cause par p19 et

    qui est relie son niveau dexpression, pourrait tre plus leve dans le cas transitoire cause

    d'un phnomne de surexpression des transgnes (dont p19) en situation transitoire.

    Dans un troisime temps, lidentification et lisolation de promoteurs forts inductibles au

    froid dans N. tabacum ont t inities. Tel quexpliqu dans la revue de la littrature, des

  • vii

    systmes de production inductibles au froid sont prsentement en dveloppement dans des

    cellules microbiennes et de mammifres; le froid tant identifi comme un paramtre pouvant

    permettre daugmenter les rendements en protines actives et correctement replies, tout en

    diminuant les actions nfastes des protases. notre connaissance, il nexiste pas de systme

    similaire en plante avec une perspective de production de protines recombinantes. Les cellules

    de plantes sont normalement cultives entre 23 et 27C, et les effets dun stress 12C ou 18C

    pendant 6, 12, 24 et 48 heures sur la biomasse et la concentration en protines ainsi que le pH

    extracellulaire ont t caractriss. En utilisant une mthode dexpression diffrentielle

    (Differential Display), des fragments de la rgion 3-non-traduite (UTR) de quelques gnes

    potentiellement induits au froid ont t isols. La validation de ces candidats a t initie en

    utilisant des analyses Northern et Northern invers, mais na pas rsult, ce jour,

    l'identification claire de promoteurs candidats. Les bases de donnes existantes ont t cribles en

    utilisant une stratgie de BLAST; ce qui a permis de rduire le nombre de nos candidats

    potentiels. Une mthode damplification rapide du bout 5 de lADN complmentaire (5-RACE)

    a t ralise sur les candidats cibls afin daugmenter la longueur de la squence connue des

    gnes. Toutefois, aucun des fragments isols avec cette mthode ntaient relis aux candidats

    retenus. Les travaux effectus sont donc prsents afin de guider d'ventuels travaux sur ce sujet.

    Dans cette thse, la faisabilit dun systme dexpression transitoire, combinant des

    cellules de plantes avec plusieurs lignes dAgrobacterium a t dmontre de mme que

    limportance dexprimer de manire transitoire un suppresseur viral pour augmenter les

    rendements en protines recombinantes. Toutefois, beaucoup de travail demeure faire en ce qui

    concerne lidentification et lisolation de promoteurs inductibles au froid.

  • viii

    ABSTRACT

    The continuously increasing demand for bioactive recombinant proteins at low cost

    stimulates the industry to develop new production platforms. Among them, in vitro plant

    biotechnology is gaining interest. Allowing the use of a fully synthetic protein-free medium that

    do not promote the development of human pathogens, plant cells can perform post-translational

    modifications and lead to bioactive therapeutics. Various human proteins produced in plant cell

    cultures are currently under clinical trials. However, low recombinant protein yields obtained

    with plant cells limit the competitiveness of this new platform.

    The research in this thesis

View more