OpsonofagocitosisOpsonofagocitosisOpsonofagocitosis

Carlos Andrés Palma LlanosCarlos Andrés Palma LlanosAlumno de la Carrera de Tecnología Médica Mención

Bioanálisis Clínico, Hematología y Banco de Sangre

Opsonofagocitosis (OPA)• Qué es una Vacuna

• Fundamento de la técnica

C

CC

C

FcR

CR

Receptores FcFcR Afinidad por Igs Distribución Función

celular

Abbas. Inmunología Celular y Molecular. 2004

• Ratones sin la cadena γ del FcγR presentan una deficiencia en la defensa mediada por anticuerpos contra los microorganismos

Abbas. Inmunología Celular y Molecular. 2004

IFN- γ + FcγR

OPA

• Ensayo Clásico por Conteo (Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology)

• Citometría de Flujo (Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology)

• Fluorometría (Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology)

• Métodos microcópicos (sólo mencionado)

Bacterias (target)

• Streptococcus pneumoniae (16)

• Haemophilus influenzae b (2)

• Neisseria meningitidis (1)

• Enterococcus faecalis (2)

• Staphylococcus aureus (2)

OPA clásico(estandarización CDLI.4.4.415-422. 1997 )

Streptococcus pneumoniae (target)CDC

4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F

•Caldo Todd-Hewitt

•420 nm DO 0,5-

0,6

•-70ºC

•1000 UFC/20 ul

Muestras De Suero

• 37 (6 de prevacunación y 31 de post vacunación)

• Vacuna conjugada de polisacárido14-Valente <n=10> o 23-Valente <n=21>

• -70ºC (200ul)

• Sandoglobulina al 6%(referencia)

• Medición de IgG total por ELISA

CPS (10ug/ml)490 nmEstandar suero 89-SF

Células HL-60(efectoras)

• Promielocitos leucemoides

• Maduración

cultivo celular 6x10E5 células /mlANTIBIÓTICOSnitroblue tetrazolium

Opsonofagocitosis

• Efector/blanco (400:1)

• Preparación células efectorasObtención pellet4x10E5 / 40 ulResuspender en buffer de OPA

• 20 ul muestra por pocillo (para cada serotipo)

• 8 diluciones seriadas al doble (1:8 a 1:1024)

• DUPLICADO

• 20 ul de suspención bacteriana (1000 UFC)

• 37ºC 5%CO2, 15’

OPSONIZACIÓN

• 40ul de células HL-60 diferenciadas (4x10E5)

• 45 minutos a 37ºC con mezclado horizontal (220 rpm)

Fagocitosis

•10 ul suero conejo bebé (Complemento)

Happytreefriends.com

• 5 ul en agar Todd-Hewitt

• Toda la noche (60 UFC de base) T0

• Celda de Control complemento (s/Ac’s)

• Celda de control de la fuente de complemento (56ºC)

• Títulos de OPA (≥50% de muerte) son el recíproco de la dilución

Complemento T0

±20%

e.j. 1:8 8

• También se realizó con leucocitos de sangre periférica

• Análisis de Receptores por Citometría

CR1,CR3,FcγRI, FcγRII, FcγRIII,CD15

Algunos resultados…

Sin alteración en la OPA

OPA por FACSCDLI. 5.5.703-710.1998

• Streptococcus pneumoniae

• Suero de prevacunación contiene altos niveles de anticuerpo polisacárido C (C-PS)

• Bacterias con subcultivo 3 veces• Inactivación por calor, alcohol y formaldehído

• marcadas con una solución de fluoresceína isotiocianato (0,5 mg/ml)

• antisuero de conejo

• antisuero humano (56ºC)

• Complemento humano

• PMN de sangre periférica (efector)

OPA por FACS

OPA por FACS…

• Suero (56ºC) y Complemento [2%]

• S.pneumoniae 2.5x10E6 (fuente)

• 30 minutos de opsonización

• 2.5x10E6 PMN

• 30 minutos de fagocitosis

• Fijación con p-formaldehído en tubos FACS

• Análisis por FACScan

• FITC-positivo

• Corrección con FITC-positivo del pocillo s/anticuerpos

• Cálculos por regresión lineal en 25% de FITC-positivo

• Se acopla a la técnica clásica• Una centrifugación • Pellet celular y bacterias dejadas en suspensión• 20ul en placa hija con 40ul de “alamar blue”• Incubación 5-6h• Pocillo de control de complemento lea ≥20,000unidades de fluorescencia

• 530/590 nm para excitación/emisión• Bacteria cambia el indicador de azul a lavanda

OPA por FluorometríaCDLI.12.10.1238-1342.2005

• Los títulos de OPA se determinan como el recíproco de la dilución con ≤50% de la

fluorescencia media detectada en el control del complemento en ausencia de

anticuerpos del suero pero con otros reagentes.

Algunas publicaciones

• Neisseria meningitidis y diferencia bactericida y opsonofagocítica de las distintas subclases de IgG en ratones para un epítope . Scandinavian Journal of Immunology.59, 34-39, 2004

• Enterococcus faecalis usando probióticos como inductores de anticuerpos. Infection 33, 377-379. 2005

• Staphylococcus aureus por relación con infección nosocomial y multirresistencia. IAI 73.10. 6752-6762. 2005

• IgA como opsonina para el neumococo. J. Clin. Invest. 104: 1139-1147. 1999• Niños VIH positivo vacunados contra el neumococo generan niveles similares de anticuerpos IgG que niños sanos, pero la opsonofagocitosis muestra un decrecimiento estadísticamente significativo. CDLI.12.1.165-170.2005

Discusión y Conclusión

• Comparar los niveles de respuesta entre diferentes grupos

etarios, socioculturales, étnicos, etc. JID. 189. 2077-2084. 2004• Presenta variaciones dependientes de recursos

• Pero misma fundamento

• Destacado rol de S.pneumoniae

• Diferenciación entre nivel de Ac’s y funcionalidad

• Posible uso masivo en el futuro

• Comparación mundial Vacunas más específicas