1

ביולוגיה מולקולרית סמסטר חורף2017/2018

2

תוכן העניינים:

הרצאה שם המרצה עמוד

DNA 1ה מבנה אהרונהיים עמי 3

2 כפולש אהרונהיים עמי 13

3 בביולוגיה מולקולריתשיטות אהרונהיים עמי 23

DNA 4תיקון אהרונהיים עמי 26 5 שמר –כמודל מחקרי אורגניזמים חודר מרדכי 36 6 זבוב – מחקרי כמודל אורגניזמים אורין אמיר 38 7 שעתוק חודר מרדכי 41 8 תרגום שלגי רעות 65 9 פוסט תרגומייםשינויים אורין אמיר 81

דנה לינדר שחם

ביולוגיה מולקולרית

. , ד"ר רעות שלגי, פרופ' אמין אוריאן, ד"ר מוטי חודרייםהנרוהד"ר עמי א

DNA-מבנה ה

הוא לא ידע כיצד הוא נראה. קובע את התכונות של האורגניזם, אבל מנדל היה הראשון שהבין כי ישנו חומר גנטי, אשר

ם על התורשה. אחראי חלבונים אינםערך ניסוי שהראה כי פרדריק גריפית'

חיידקים מחוללי מחלה, -משני סוגים הוא עבד עם חיידקי סטרפטוקקוס

, וחיידקים שאינם (S-smooth) שלהם מבנה מעטפת של קפסולה חלקה

. הוא (R-rough) מחוללי מחלה, שלהם מבנה מעטפת של קפסולה מחוספסת

חלקה, הם מדביקים שם לב שאם הוא לוקח חיידקים חיים בעלי מעטפת

יים, העכברים אינם עכברים במחלה, ואם הוא לוקח חיידקים מחוספסים ח

, והעכברים Sמתים מסוג חיידקים נדבקים. לאחר מכן הוא החדיר לעכברים

מתים שעברו הרתחה )לצורך הרס Sי חיים עם חיידק Rוהחדיר להם חיידקי אבל כאשר הוא לקח עכברים לא נדבקו במחלה;

העכברים כן נדבקו. הוא הסיק מכך כי ישנו חומר שעובר מהחיידקים החלקים המתים אל החיידקים ים(, החלבונ

המחוספסים, וכי זה לא חלבון.

אצל הבקטריופאג'ים בחומר עבדו עם בקטריופאג'ים, שהם וירוסים שמדביקים חיידקים. הם סימנו הרשי וצ'ייס

)אלו חלבונים במעטפת גופרית יםהמכיל בחומר רדיואקטיבי אחר מבניםו (DNA-)זה ה פוספט מבנים המכיליםרדיואקטיבי

לאחר מעבר בצנטריפוגה, בתאי החיידק מצאו רק את הסימונים לפוספט ולא לגופרית. מכאן הסיקו כי .של הבקטריה(

. DNAזה שמכיל פוספט ולא גופרית. בהמשך התברר שזה החומר הנכנס לחיידק ומדביק אותו הוא

DNA-הבניין של היחידות

, סוכר, ובסיס חנקני.מרכיבים עיקריים: פוספט 3מורכב מנוקלאוטידים. כל נוקלאוטיד מכיל DNA-ה

יחידת הבסיס עם הסוכר נקרא נוקלאוסיד, ויחד עם הפוספט הוא

נקרא נוקלאוטיד.

. הוא מורכב או ריבוז נקרא פנטוז הסוכר

2ים פחמנים וחמצן. על פחמנ 5 משרשרת בעלת

(.OHהידרוקסיד )קבוצת קבוצת יש 3-ו

קשור אל קבוצת הפוספט הטעונה 5פחמן

שלילי. DNA-פיסיולוגי. לכן גם ה pH-שלילית ב

pHהוא חומצה, הוא יכול למסור פרוטון בסביבת DNA-מאחר וה

אוקסי ריבוז. -, הוא נקרא דה2 דהבעמ ימה. כאשר חסרה לו קבוצת הידרוקסילמתא

3

קשר אסטרי הוא . אסטרי-די-פוספוקשורים זה לזה בקשר ידיםנוקלאוטה

של הסוכר, 3פחמן חמצן: -בין פחמן לחמצן, לכן מדובר בשני קשרים פחמן

נקשר לחמצן של קבוצת הפוספט של מהנוקלאוטיד הבא, שהוא קשור לפחמן

נוקלאוטיד. סוכר מאותו של ה 5

של 5מחובר אל פחמן טיד אחדואשל נוקל 3יוצא זה שרשרת בה פחמן מה ש

הבסיסים לא מעורבים בקישור הנוקלאוטיד הבא דרך קבוצת פוספט.

השרשרת בתוך אותו הגדיל.

(A,G) פורינים. הם מתחלקים לשתי משפחות: DNA :A,G,C,T-ב חנקניים בסיסיםארבעה שנםי

ושתי , ולפורינים6 טבעת אחת של לפירמידינים -. לשתי המשפחות מבנה שונה(T,Cופירמידינים )

)צריך לזכור את המבנים האלו בע"פ(.. 6של ו 5של - מחוברות טבעות

. T-והוא מחליף את ה RNA-, אשר מצוי בUישנו בסיס נוסף הנקרא

4

בקרב זנים שונים. הוא שם לב כי בכל הזנים DNA-, ובחן את השכיחות של כל אחד מהבסיסים בDNAקראגף עסק בניקוי

שווה לכמות G-שבדק, היחס בין גואנין לציטוזין ובין אדנין לטימין הוא תמיד זהה, בכל הפרטים מאותו הזן. כלומר כמות ה

. CG-ו AT, ומה שמשתנה בין היצורים הוא היחס בין , בכל יצור חיT-שווה לכמות ה A-וכמות ה C-ה

DNAסינתזת

. ATPשתי מולקולות קישור של נוקלאוטיד אחד לשרשרת דורש השקעה של

פוספט )שזה -מונו-תחילה נוקלאוזיד

2סוכר+בסיס+פוספט אחד( קושרים עוד

-dNTPפוספטים ליצירת

deoxyribonucleotide triphosphate זה .

-)שהופכות ל ATPמולקולות 2דורש השקעת

ADPה .)-dNTP הוא תוצר ביניים גבוה מאוד

יקשר אל השרשרת באנרגיה. הוא

2תוך שהוא יאבד את וטידיתהפולינוקלא

הפוספטים שנוספו. בעצם הוא ישאר רק עם

(, שיקשר אל 5פוספט אלפא )שהכי קרוב לפחמן

מהשרשרת. 3הידרוקסיל של פחמן ה

אסטרי יוצאת מול' -די-ביצירת הקשר הפוספו

מים.

DNA-מבנה ה

כפול המסתובב פנימה. הבחינו כי מדובר בסליל .DNA-פיצחו את מבנה ה וילקיס,-, בעזרתם של פרנקלין וווסטון וקריק

, והחלק החיצוני הוא בפנים הסליל -נמצאים במרכזהחנקניים הבסיסים . 034.6לצורך הסיבוב, כל בסיס נמצא בזוית של

מימן קשרי 2יש T-וה A-בין ההבסיסים החנקניים קשורים בקשרי מימן אשר סוגרים את הסליל הכפול. . הסוכר והפוספט

, מרחק 2nm: רוחב בין סלילים . רוחב הקשרים האלו הוא זהה ולכן המבנה הוא מאוד סדורקשרי מימן 3יש G-ל C-ן הובי

.ננומטר 3.4בסיסים, ואורכו 10.4הוא 0360, כל סיבוב של 0.34nmבין נוקלאוטידים

5

כאמור, ת הקצה תלויה בקבוצה החופשית. זהו. '3-ל '5-הולכים מ ששניהםפרללים. המשמעות היא -הגדילים הם אנטי

יש פוספט לא '5 -בריבוז(. בקצה ה 3בריבוז( להידרוקסיד )של פחמן 5אסטרי הוא בין פוספט )של פחמן -הקשר הפוספו די

הוא: DNAבחלקו החיצוני, כל גדיל .יש הידרוקסיד לא קשור '3-קשור, ובקצה ה

(5') phosphate-sugar-phosphate-sugar……. -phosphate-sugar (3')

. '5-נקרא משמאל לימין. המוסכמה היא שצד שמאל הוא צד ה DNAבסכמות, רצף של

ישנו חלק עם שטח פנים . groove , שפונה לנוזל, יש שקעים הנקראיםהסלילבחלק החיצוני של

אזורים .minor groove, וחלק עם שטח פנים יותר קטן הנקרא major grooveיותר רחב הנקרא

DNA-ה החלבונים שעל גדילאלו יכולים ליצור אינטראקציות של קשרי מימן עם פקטורי שעתוק.

, והחלבונים שמייצרים אינטראקציה איתם בתהליכים תאיים cis regulatory factorsנקראים

. trans regulatory factorsשונים נקראים

ובקידוד לחלבונים, וזאת בגלל העובדה שהגדילים מדור לדור DNA-למבנה הסליל הכפול יש תפקיד בהורשה של ה

.DNA-. ווטסון וקריק כבר במאמרם הראשון שיערו כי הסליל נפתח, וכל גדיל משמש תבנית לשכפול של הקומפלמנטרים

RNA-מבנה ה

, פוספט ובסיס חנקני, אבל עם כמה שינויים:, הוא כולל סוכרDNA-דומה ל RNA-מבנה ה

. 2אוקסי ריבוז. לכן, יש קבוצת הידרוקסיל על עמדה -ריבוז ולא דה הסוכר הוא .1

אסטרי, -די-היא שורה של נוקלאוטידים הקשורים בקשר פוספו RNAגם מולקולת

.DNA-באותם המקומות כמו ב

(, שדומה מאוד לטימין, עם הבדל של Uל )בבסיסים החנקניים לא קיים טימין אלא אורצי .2

. קבוצת מתיל אחת

. כך למשל, בסביבה בסיסית DNA-הוא חד גדילי. לכן הוא פחות יציב בהשוואה ל RNA-ה .3

נותר יציב. DNA-בעוד שהמתפרק הוא יתפרק

RNA-תפקידיו של ה

מעביר את המידע הגנטי מהגרעין לציטופלסמה. .1

מסייע ביצירת חלבונים. .2

שחשובים לרגולציה. non coding RNA-( ו)שממנו נוצרים הריבוזומים mRNA ,tRNA ,rRNA-נמצא את ה RNAתחת משפחת

נוקלאוטיד נוקלאוטיד נוקלאוטיד

די אסטרי-קשר פוספו

6

סידור הגנים בגנום

יצור יש מספר שונה של כרומוזומים. הגנום האנושי מכיל לכל הגנים מסודרים על פני הכרומוזומים, אשר מאורגנים בזוגות.

שמר, יש הרבה פחות מתברר כי ליצורים פשוטים, כמו המהגנום מקודד לחלבונים. 1.5%-מיליארד נוקלאוטידים, ורק כ 3-כ

)גן לא 9000 -מספר הגנים הלא מקודדים הוא כאצל בני אדם, . , והרבה פחות חזרותאזורים לא מקודדים מאשר לבני אדם

מקודדיםאו אנזימתי(, ומספר הגנים ה אך לא מתורגם לחלבון. יש לו תפקיד רגולטורי RNA-מקודד הוא גן אשר משועתק ל

גנים. -פסואודו 20,000-ד כבנוסף, יש עו .20,000-הוא כ

. אין קשר בין גודל החלבון (bp)מעט וגם על אזורים קטנים( bp)דהיינו המון גנים יכולים להתפרש על אזור עצום בכרומוזום

שעליו יושב הגן התואם, וזאת בגלל האינטרונים. DNA-לבין גודל האזור ב

ישנם תאים שאין להם גרעין, כמו תאי דם אדומים )ולהם אין מעטפת כפולה.נמצא בגרעין התא, שהוא אברון בעל DNA-ה

מעוגן בגרעין ואינו יכול לצאת. DNA-הבאאוקריוטים, נמצא בציטופלסמה(. DNA-(, ותאים פרוקריוטים )שם הDNAגם

. RNA-גם חלבונים ו DNA-הכרומוזומים הם דחוסים מאוד, ומכילים בנוסף ל

שלושה מבניים עיקרים: כרומוזוםל

, אשר נמצא בקצה של הכרומוזום. אזור זה צריך להיות מוגן כדי שהתא לא יחשוב שהוא כרומוזום שנשברטלומרה .1

ויטפל בו בהתאם.

. הוא יודע להיקשר לסיבי הקישור במיטוזה. DNA-. אזור זה הוא בעל משמעות מיוחדת בשכפול הצנטרומרה .2

3. Origin of replication .של הכרומוזום. יש מספר אזורים כאלו על הכרומוזום אזור שאחראי על הרפליקציה

במידה והוא ארוך.

. הצביעה , ולחפש שינויים כרומוזומליםכדי לבחון אותו DNA-בקריוטיפ צובעים את ה

עושה שימוש באזורים שהם מיוחדים לכל כרומוזום )מבחינת רצף של בסיסים(. מסמנים

לגדילים להיפתח, ואז הבסיסים הצבועים בסיסים בצבעים פלורסנטים שונים, גורמים

גדיל חדש. -משלימים אותם ליצירת דו

צביעה זו חשובה לזהות טרנסלוקציות. בטרנסלוקציות יש שבירה ואיחוי של חלקים

שרת לזהות את זה, כי היא מראה בכרומוזום אחד אל כרומוזום אחר, וצביעה זו מאפ

אינם זהים. ההומולוגיםהכרומוזומים ש

, ואפילו קריוטיפים של חיות שונות מוצאים כי הגנום הוא מאוד שונה מבחינת מספר וסידור הכרומוזומיםאם מסתכלים על

ל אף השוני עמים לא מעידה על מורכבות היצור. וכמות הכרומוז. בין זנים שונים של אותה החיה ניתן למצוא הבדלים

דומים כי הם שמורים. , הרצפים המקודדים לחלבונים הם כן בכרומוזומים

7

DNA-אריזה של ה

במבנה הארוז מסודר DNA-ההיא מאוד צפופה וזאת על מנת שהוא יוכל להיכנס אל הגרעין הקטן. DNA-האריזה של ה

חלבונים אחרים שאינם היסטונים 1/3-, והיסטוניםחלבונים הנקראים DNA ,1/3 1/3-. הכרומטין הוא ככרומטיןשנקרא

מהגודל שלו. 10000מקטינה אותו בערך פי DNA-יזה. הדחיסה של האבל חשובים לאר

הארוז היא שרשרת עם DNA-הצורה של ה

מלופף DNA-חרוזים. החרוזים הם ההיסטונים, וה

נקרא DNAשל היסטון עם העליו. יחיד

בין הנוקלאוזומים נקרא DNA-ה. נוקלאוזום

linker DNA.

בסיסים המלופפים סביב היסטון אחד. 146מתברר כי יש באופן קבוע רצף של

תכונות של היסטונים:

. יחד הם יוצרים אוקטמר H2A, H2B, H3, H4היסטון מורכב מארבעה חלבונים שונים: -

חלבונים, כל חלבון מופיע פעמיים(. 8)מבנה של

H1 הוא נקשר במקביל ל. ןאינו חלק מההיסטון בכרומטי-DNA ולהיסטון, ומכתיב את

הדו גדילי מהנוקלאוזום. תפקידו לא ברור עד הסוף. DNA-אה של הכיוון היצי

טעון DNA-טעונים חיובית )לכן עשירים בארגינין ובליזין( כי הההיסטונים הם חלבונים -

שלילי.

ההיסטונים הם רצפים מאוד שמורים והם נמצאים בכמות מאוד גדולה בתא. -

טעון חיובית, והוא מאוד הכי. זה האזור DNA-, שעליו נקשר הhistone foldשנקרא אזור לכל תת חלבון של היסטון יש -

טרמינלי. הקצוות הללו פונים כלפי חוץ ויש להם N-שמור מבחינת הרצף. מה שמבדיל בין ההיסטונים הוא הקצה ה

כדי ליצור את האוקטמר, דחיסת הנוקלאוזום )דבר שמאוד ישפיע על מידת השעתוק(. יצוב הנוקלאוזום ובתפקיד

. 2A, 2B, אשר יתחברו לטטרמר. אליהם יתחברו שני דימרים של 3-4תחילה יווצרו שני דימרים של היסטונים

ובי באופן אלקטרוסטטי )קשירה בין מטען חי DNA-ההיסטונים קושרים את ה .נים יש תפקיד בבקרה על ביטוי גניםלהיסטו

הדחיסות .ATP, תוך ניצול chromatin remodeling proteinsע"י בזמן שעתוק הוא נפתח -לשלילי(, וקישור זה הוא הפיך

תשפיע באופן קריטי על ביטוי הגנים. ככל שהוא יותר דחוס )הזמן הכי דחוס זה במיטוזה(, לא יתבצע שעתוק. DNA-של ה

. כרומטין u נקרא. האזור הפחות דחוס אשר פנוי לשעתוק הטרוכרומטיןהאזור הדחוס נקרא

8

. למארז אין ספציפיות מבחינת הרצף, אלא DNA-זום על מנת לאפשר את הדחיסה של הוין נוקלאוזום לנוקלאקיים רווח ב

. בסיסים 80של -רק מרווחים קבועים

( H2A/B, H3, H4יכולים להחליף תת יחידות בהיסטון שבונה את הנוקלאוזום ) chromatin remodeling proteins-ה

ות שונות של היסטונים שלכל אחת תפקיד אחר. זה משתנה בין תא לתא, ואפילו בתוך אותו בהתאם לצרכי התא. יש תת יחיד

התא בזמנים שונים.

טרמינלי בהיסטון נתון לבקרה על ידי מודיפיקציות פוסט תרגומיות. יש מספר סוגים של מודיפיקציות: N-האזור ה

וכך טילציה חוסמת את המטען ונה חיובית. האצזין היא חומצה טעהוספת קבוצת אציטל לחומצת האמינו ליזין. לי .1

מאפשר שעתוק. השלילי. זה הופך את האזור לפחות דחוס, ו DNA-מחלישה את הקשר ל

פעמים על אותה חומצה אמינית, ולכל הוספה יש משמעות. 3. מתילציה יכולה לקרות עד הוספת קבוצת מתיל .2

ר מתילציה לא יעבור שות פעולות הפוכות. ליזין שעבעו -המתילציה והאצטילציה על הליזין מתחרות זו עם זו

טילציה. אצ

באופן כללי מתילציה תוביל להשפעות שונות כאשר היא תתרחש על חומצות אמינו שונות. מתילציה של חומצות

אמינו מסוימות תקדם שעתוק, ובמקומות אחרים תפחית.

הוספת קבוצת פוספט על חומצה אמינית סירין. .3

טין על פני ההיסטון עצמו. ויוהוספת יוביק .4

הבנה של משמעות המודיפיקציות תאפשר לנו להבין את הבקרה האפיגנטית. המגוון של המודיפיקציות מאפשרת קוד כמעט

שבו ניתן לראות מה המשמעות של כל מודיפיקציה על חומצות "קוד היסטונים" קיים אינסופי בגודלו מבחינת האפיגנטיקה.

9+אציטלציה על ליזין 4, בעוד שטרימתילציה על ליזין להשתקה של הגן גורמת 9טרימתילציה על ליזין -למשלאמינו שונות.

. תוביל לביטוי של גן

פוספורילציה -ם שעושים דהטילציה, ואנזימיאצ-יש אנזימים שיודעים לעשות דה כל המודיפיקציות האלו הן רברסביליות.

.מתילציה-ודה

עצמו. יש אנזימים שיודעים להוסיף מתיל על ציטוזין. זה DNA-של היסטונים ומתילציה של הצריך להבדיל בין מתילציה

ציה שלילית עם ביטוי גנים )ככל שיש יותר מתילציה יש פחות היא בקורל DNA-עצמו. מתילציה על ה DNA-עושה בקרה על ה

ביטוי(.

מוכנס לאזורים שיותר פעילים מבחינת 3.3היסטון

עתוק. ש

נמצא באזור הצנטרומר, ואחד מתפקידיו CENP-Aהיסטון

הוא למשוך את הכישור.

-רק כאשר צריך תיקון של ה DNA-מגויס ל H2AXהיסטון

DNA .

אחראי על שעתוק. H2AZהיסטון

אחראי על השתקה של שעתוק, כמו macroH2Aהיסטון

בבנות. Xבאינאקטיבציה של כרומוזום

9

שיודעים לזהות את המודיפיקציות readersישנם חלבונים הנקראים

טרמינלי של ההיסטון. הם יודעים לגייס אנזימים N-על פני הקצה ה

אשר יבצעו את התהליך שאמור להתבצע עקב ,וחלבונים אחרים בתא

המודיפיקציה.

)אלו writerעם חלבוני "פעולה "משתפים readers-חלבוני ה

מזהה readerחלבונים שעושים את המודיפיקציות(. כאשר חלבון

להגיע, ולעשות מודיפיקציה writerא מסמן לחלבון מודיפיקציה, הו

. יחד הם מעבירים את הסיגנל לאורך הכרומוזוםגם להיסטון הבא.

זה ימשך עד שיגיעו חלבונים רגולטורים שיעצרו את התהליך.

שבהם צריך DNA-החלבונים הרגולטורים יודעים לזהות רצפים ב

barrierה הם הרצפים שמסמנים עצירלפעול ולעצור את הסיגנל.

sequence החלבונים שמזהים אותם הם .barrier proteins . מדובר

נוצרים אזורים של בחלבונים מאוד מאוד שמורים. בתהליך הזה

כרומטין. uהטרוכרומטין ואזורים של

ף הזה, שמונע דחיסה באזור. אם ישנה מוטציה ברצ barrier sequenceגלובולין. זה -בגן לביתא HS4דוגמא היא הרצף

האזור הזה יהיה דחוס במקום משוחרר, ולכן הגן לא יתבטא. התוצאה היא אנמיה חמורה.

יכולים לעבוד בכמה מנגנונים: barrier-חלבוני ה

A. להיקשר אל הממברנה של הגרעין ולהפריע פיזית לקומפלקסreader-

writer .ליצור את ההטרוכרומטין

B. ליהם מפני התפשטות סיגנל להיקשר לנוקלאוזומים ספציפיים ולהגן ע

ההטרוכומטין.

C. שמאפיינות היסטוניות לגייס אנזימים שיבטלו מודיפיקציות

הטרוכרומטין.

כרומטין בגרעין: u-פיזור הטרוכרומטין ו

DNA זה .אדום()צבוע ב שנמצא בקצוות הגרעין הוא במבנה יותר דחוס ואינו מתבטא

-זה היו )צהוב וירוק( מתבטאכן דחיסות הקשה שנמצא בלופים מחוץ ל DNA ההטרוכרומטין.

והביטוי של הגנים שהוא מקודד. DNA-ציה בין המיקום של היש קורל. כרומטין

. הם רצפים לא מקודדים, שלא נמחקו Aluהצביעה הזו נעשתה על ידי צביעה של אלמנטי

-ל לא באזורי הטרוכרומטין וכמעט בכל-באבולוציה ומקורם בוירוסים. הם נמצאים הרבה באזורי יו

כרוטמין, -יו-שהם אזורי ה -הוירוסים נכנסו באזורים שכן עוברים שעתוק , וזאת משוםןכרומטי

ולכן ריכוזים גבוה שם.

10

משתכפל, ואז ההיסטונים צריכים להיקשר חזרה באופן רנדומלי בין שני DNA-ההיסטונים נפרדים, ה DNA-בעת שכפול ה

המקוריים )שעליהם יש מודיפיקציות( עם היסטונים חדשים )נטולי הול" של ההיסטוניםהגדילים החדשים. זה יוצר "מי

קציות על ההיסטונים . מכך יוצא שהמודיפיreader-writer. כדי להשלים את החסר יש פעולה של הקומפלקס מודיפיקציות(

דורית. -לא עובר בתורשה בין לתא בת, ולכן לתאים רבים בגוף שלנו יש את אותן המודיפיקציות. זה עוברות מתא אב

מאחר והוא מעגלי, אין לו טלומרים שצריך להגן עליהם. בגרעין. הוא מעגלי ואינו נמצא DNA-ה פרוקריוטיםאצל

)צורה של סליל(. supercoiledארוז בצורה הנקראת DNAאותו

גם לו יש חלבונים דמויי היסטונים שאורזים אותו.

אנזימי רסטריקציה

'5-. האנזים יודע לבצע את העיכול רק מהקצוות. יש כאלו שיודעים לעכל מDNAהם אנזימים שיודעים לעכל ונוקלאזותאקס

, ויש חד גדילי וכאלו אחרות לדו גדילי DNA. כמו כן, יש אקסונוקלאזות שיודעות לעכל '5-ל '3-וכאלו שיודעים לעכל מ '3-ל

. את שניהם כאלו שיודעות לעכל

במרכזה, ולא בקצוות. במקור הם הגיעו DNA-הם אנזימי רסטריקציה, שיודעים לחתוך את שרשרת ה תאנדונוקלאזו

3000-הויראלי. ידועים כ DNA-מחיידקים. חיידקים שהותקפו על ידי וירוסים, השתמשו באנדונוקלאזות כדי לעכל את ה

קולי. הוא הראשון שנגלה בחיידק זה ולכן -ע מאי, מגיEcoR1אנזימים כאלו. לכל אנזים יש שם שמעיד על המקור שלו )נניח

GAATTCמכיר את הרצף EcoR1-. למשל הבסיסים 4-8, לרוב של DNA(. כל אנזים מכיר רצף ספציפי וייחודי של 1הוא

ההכרהרצף יותר ארוכים ויותר קצרים, וככל שדו גדילי. אנזימים יכולים להכיר רצפים DNA-בלבד, ב '3-ל '5-הנקרא מ

יותר, האנזים הוא יותר נדיר. ארוך

יש אצל יוקריוטים זה על ציטוזין ואצל חיידקים על אדנוזין. . DNA -הזכרנו את המתילציה שיכולה להיות על בסיסי ה

הם אינם יכולים DNA-שהמתילציה מופיעה על רצף ה יש כאלו שברגע טריקציה שרגישים למודיפיקציה הזו.אנזימי רס

. ם יש מתילציהלים לעבוד רק א, ויש כאלו שיכולעבוד

11

. 'GAATTC 3 '5 -רצף פלינדרומי

3' CTTAAG 5 .

, יוצרת את הרצף ההפוך )אם נקרא את הרצף העליון הפוך, נקבל את הרצף התאמה בין הרצפים המשלימיםשניתן לשים לב

.את הרצף הפלינדרומיאנזימי רסטריקציה לרוב מכירים את הרצף ו המשלים(. זה רצף פלינדרומי.

G-ל Aבין בגדיל העליון ו A-ל Gמבצע את החיתוך בין EcoR1. למשל DNA-לכל אנדונוקלאזה יש דרך ייחודית לחתוך את ה

התחתון. הוא תמיד חותך בין הבסיסים הללו. אחרי החיתוך יוותר בגדיל

ים . אלו הם אותה בסיס)מסומן בירוק( sticky endsאזורים של DNA-על ה

זה נקרא הם חשופים, ללא גדיל משלים. '5-, שבקצה של התחתוןבגדיל ה

5' overhang.

גם בגדיל העליון וגם overhang '5ימני )תכלת( ושמאלי )סגול( ] [ יהיה -*כעקרון בגלל שיש שני תוצרי חיתוך

.בתחתון

. '3-גדיל המשלים הם בצד של הכאשר הבסיסים ללא ה, overhang '3גם יש באופן דומה

.overhang '3*גם פה בשני תוצרי החיתוך יוצא

blunt endsבמקרים בהם החיתוך הוא באותו מקום, יהיו

:sticky endsבמקום

יש למשל, מעבר לייחוד של הרצף שכל אנדונוקלאזה מזהה, גם אופן החיתוך הוא ייחודי.

, שחותכים את אותו הרצף בדיוק, אבל הראשון חותך (SmaI-ו XmaI) שני איזוסכיזומרים

. לכן האנזים הראשון G-להשלישי Cשני, והאנזים השני חותך בין C -הראשון ל C-בין ה

והשני יצור קצה חלק. overhang '5הראשון יצור קצה

תואמים. שהם יוצרים הדביקיםת תופעה נוספת היא שקיימים שני אנזימים שחותכים רצפים שונים, אבל יוצא כי הקצוו

בעלי אותו קצה דביק, במידה והם נעמדים זה מול זה. DNAאנזימים שנקראים ליגזים יודעים לחבר קצוות של

'GATCTA5 '3 ברצף הבא: G-ל Aלמשל יש אנזים שיודע לחתוך בין

5' ATCTAG3'

'GATCCG5 '3א: ברצף הב G-ל Gואנזים אחר שיודע לחתוך בין

5' GCCTAG3'

וב העליון יכול ואז הזנב הצה

להתחבר לזנב הירוק התחתון.

12

אנושי לזה של DNAאפילו בין -, במידה והקצוות הדביקים מתאימיםDNAהמשמעות היא, שניתן לחבר בין כל שני סוגי

.ATP-תירס. כל מה שצריך הוא ליגז ו

, ליגזים גם יוכלו לחבר ביניהם.blunt endsבמקרים בהם יש

סוכר הידרוקסיל של הלשל נוקלאוטיד אחד בין הפוספט -אסטרי די-בקשר הפוספו מי רסטריקציה חותכיםאנזי

. ודע לאחד בין קצה פוספט לקצה הידרוקסיליהליגז ימהנוקלאוטיד השני.

nicked DNA- פה בדוגמא יש לנו בקצה השמאלי פוספט ובקצה הימני 1מצב בו יש שבר רק בגדיל .OHהליגז יקח . ATP

. ויאחה בין הקצוות הללו

פלסימידים של חיידקים מכילים בדר"כ מספר אתרים לאנזימי רסטריקציה, כדי שיהיה אפשר להחדיר שם גנים חדשים.

לאחר שגן חדש חודר לפלסמיד, ליגזים מאחים אותו חזרה.

ועוד. DNAר לעיל, במיפוי לאנזימי רסטריקציה יש שימושים רבים בביולוגיה מולקולרית, כמו בשיבוט שהוזכ

DNAשכפול

)אצל חיידקים מדובר בממוצע יש אומנם מוטציות, אבל זה בשיעור נמוך צריכה להיות תהליך מאוד מדויק. DNA-הכפלת ה

מוטציות לא בהכרח משפיעות על תפקוד החלבון, בסיסים(. 810על 1בסיסים, ואצל בני אדם טעות 1010טעויות כל 3ל ש

ן חשובות ליצירת שונות. וכידוע ה

13

יש כמה עקרונות לתהליך ההכפלה:

קונסרבטיבית. -היא נעשית בצורה סמי .1

נִפתח, וכל גדיל משמש תבנית לבניית גדיל משלים. DNA-הכפלה סמי קונסרבטיבית היא כזו בה ה

באופן זה, כל תא בת יהיה עם גדיל אחד מתא האב וגדיל אחד חדש.

גנון השכפול, היו היפותזות שונות לגבי המנגנון. לפני שמצאו את מנ

בתא האב DNA-באופן זה ה -היפותזה אחת הייתה שהשכפול הוא קונסרבטיבי

האחד ישן והשני חדש. -שונה DNAמשתכפל בשלמותו, ואז בתא בשני תא הבת יש

הגדילים נחתכים באמצע, -היפותזה שנייה הייתה שהשכפול הוא דיספרסיבי

ן תאי הבת, ואז בכל תא בת הם מושלמים.ונחלקים בי

עובדת לשני הכיוונים. ההכפלה .2

ההכפלה מתחילה מנקודה מסוימת, ומתקדמת ימינה ושמאלה בו זמנית. היתרון של הכפלה

מערכות מתואמות שיעבדו יחד. 2כזו הוא שהיא מהירה יותר, אבל היא מצריכה

. הם עזרת חומר רדיואקטיביההכפלה בבועית אחריעקבו בניסוי שהראו את זה, החוקרים

פולימרז ובסיסים מסומנים בחומר רדיואקטיבי. DNAרגיל, ושמו במבחנה DNAלקחו

הבסיסים המסומנים הם אלו שמתווספים עם התקדמות השכפול, ולכן ניתן לעקוב אחרי

הבחינו הבועית הולכת וגדלה משני הכיוונים. מזלג ההכפלה. החוקרים

14

יש מקום בו היא מתחילה ומקום בו היא מסתיימת. .3

Origin of replication- שה רצף מיוחד-DNA .פולימרז יודע לזהות, ושם להתחיל את השכפול

. termination site, הנקרא יש גם אזור שמציין איפה להפסיק )מעגלי( סגור DNA-ב

על גבי הכרומוזום. origin of replicationהוא מאוד ארוך, יש מספר DNA-ביוקריוטים, שה

30,000-אחד לשני הוא כ originהשכפול נעשה במקביל, בצורה מסונכרנת. המרחק בין

בסיסים.

דקות. 40-שעות. בשמרים זה כ 8-קריוטי לוקח כ-תהליך ההכפלה בתא יו

גדיל וליצור את בועית ההכפלה. האנזים -את הדו, לפתוח origin of replication-כאשר מתחיל שכפול, צריך למצוא את ה

. הליקאזשעושה זאת נקרא

. אזורי fully methylatedמסומן על ידי מודיפיקציות של מתיל. ההליקאז מזהה אותו רק כשהוא origin of replication-ה

ים שמהווים את רצפי ההכרה , כי זה רצף שמסמן לאנזים שעושה מתילציה היכן לבוא. האזורGATCעשירים ברצף origin-ה

. trans regulatory factor. החלבונים המזהים את רצפי ההכרה נקראים cis regulatory elementsנקראים

, הגדיל החדש הוא origin-כאשר גדיל משוכפל באזור ה

עדיין ללא מתילציות, גדיל זה אינו יכול לעבור הכפלה.

ר עוד פעם רק כאשר הוא יהיה ממותל במלואו, יתאפש

סבב שכפול. המתילציות לא יופיעו במלואן עד אשר

בתא יש מספיק מאגרים מכל הנחוץ לעוד סבב של

)מספיק בסיסים, אנרגיה וכו'(. DNAשכפול

אחר. בשמרים המנגנון של ההכרה והשכפול הוא קצת

, ולא יתרחש סבב חדש עד אשר יעבור רגולטורי עובר פוספורילציה בתחילת סבב שכפול ציסה יש פוספורילציה ולא מתילציה.

פוספורילציה. -דה

15

יש רצפים שמסמנים לחלבוני העזר להליקאז ההליקאזות עובדים עם חלבוני עזר שמסייעים להם, ולכן בסמוך לרצפי ההכרה

היכן להיקשר.

ת )לעומיש שני קשרי מימן T-ו A. בין T-וב A-מיד אחרי רצפי ההכרה יש רצפים שעשירים ב

C-G ולכן קל יותר לשבור את הקשר הזה ולפרום את הקשרי מימן( 3ששם יש-DNA .

. ATPהפתיחה של הגדילים היא תהליך שמצריך

. '3-ל '5-היא תמיד נעשית מ .4

ות )זה העליון(, וגדיל אחר צריך להי '3-ל '5-ז מנתשצריך להיות מסו אחד גדיללכאורה נפתח ונוצר מזלג ההכפלה, DNA-כשה

צריך להביא בסיסים עם קצה באחד , כי'5 -ל '3-שונה מהותית מ '3-ל '5רכה בכיוון . הא)זה התחתון( '5-ל '3-מסונתז מ

פוספט ובשני צריך להביא בסיסים עם קצה הידרוקסיל. צריך גם שני אנזימים שונים לכל אחת

ל פכמש , והואימרזפול DNA-ה -ה את השכפולידוע שיש רק אנזים אחד שעושמהפעולות הללו.

פועל הוא שהגדיל העליון )לכן מביא בסיסים רק עם קצה פוספט(. מה שקורה ב '3-ל '5-רק מ

מתארך באופן רגיל, עם הפתיחה של המזלג. הגדיל התחתון מתארך בחלקים, כל פעם מתארך

ואז ליגזות מחברות בין המקטעים האלו. המקטעים נקראים '3-ל '5-מקטע מסוים קצר מ

. okazakiי מקטע

, leading strandהגדיל המתארך ישר נקרא

. יש מנגנונים שדואגים לסנכרן את lagging strandוהגדיל השני נקרא

הקצב של שני התהליכים.

בסיסים. זה מתואם עם 200-הוא כביוקריוטים אורכם של מקטעי אוזאקי

זום. והאורך של הנוקלא

16

בכל כיוון: lagging-וה leading-וונית, וסימון של הכי-כאן יש דוגמא לבועית הכפלה דו

. laggingיהיה leadingחשוב לשים לב שזה הולך הפוך מימין ומשמאל של המזלג. תמיד מול

זה קשור ? '5'3-ולא מ '3'5-למה דווקא הכיוון הנבחר הוא מ מ

לפעולת ההגהה בעת השכפול, שעליה נרחיב בהמשך. אבל בקצרה,

קשר נוקלאוטיד לא נכון, מסירים אותו כדי להוסיף את במידה ונ

, בעת יצירת הקשר '5'3-אילו ההוספה הייתה מהנוקלאוטיד הנכון.

שהוא p-pלא היה נשבר הקשר לנוקלאוטיד המתוקן, דיאסטרי -הפוספו

את האנרגיה הדרושה לא הייתה פולימרז DNA-קשר עתיר אנרגיה, ול

המשיך את הפילמור.ל

הארכה ובשמאל ו '3'5-ר סכמטי בו מתוארת בימין הארכה מזה תיאו

. בשלב לפני האחרון רואים שבעת הוספה של '5'3-היפותטית מ

פוספט, שנחוצה -אין צורך בשבירה של הקשר הטרי 5'3-נוקלאוטיד מ

כדי לקבל אנרגיה.

17

דיאסטרי -את הקשר הפוספויודע לעשות . אנזים זה DNA polymerase1ארתור קורנברג בודד בצורה ביוכימית את האנזים

DNA-. האנרגיה שנוצרת בעקבות שחרור שתי מולקולות הפוספט משחררת את ההידרוקסיל של הסוכרל בין הפוספט

צריך לדעת לבחור את הבסיס הנכון. 1פולימרז DNA-פולימרז ומאפשרת לו להתקדם עוד צעד קדימה. ה

דיל הכפול בחלל שלו, בחלק הנקרא אצבעות. לאנזים צורה של כף יד, הוא תופס את הג

דיאסטרי, רק אל מול הבסיס -המבנה של הפולימרז הוא כזה שמאפשר יצירת קשר פוספו

הנכון. כאשר הבסיס הוא לא נכון, תהיה הפרעה סטארית וההתקפה הנוקלאופילית

לא תוכל להתרחש. דיאסטרי -שנחוצה ליצירת קשר פוספו

הוא דיאסטרים -מעבר לכך שהוא יוצר קשרים פוספומאוד נמוך אבל הוא עובד כמעט ללא טעויות, כי מרז הקצב של הפולי

החסרה של . הההארכהפעולה זו נעשית באתר שונה על גבי הפולימרז מזו של . , מעין הגהה לשכפולעושה תיקון טעויות

(. '3-ל '5-גם לפעולה של אקסונוקלאזה מ לפולימרז יש אפשרות)אם כי ידוע ש. '5-ל '3-דווקא מ נעשיתבסיסים,

בתהליך ההגהה, הפולימרז מזהה שנוקלאוטיד לא נכון הוסף, כי יש הפרעה סטארית שלא מאפשרת את ההארכה של

, ומותירה את מוציאה את הנוקלאוטיד השגוינצמדת לפולימרז ו '5-ל '3-אקסונוקלאזה החותכת מהשרשרת. במקרה זה,

. שוףח '3השרשרת עם קצה

אז הפולימרז מוסיף את הנוקלאוטיד הנכון.

18

אנזימים וחלבונים הנחוצים להכפלה:

בנוסף אליהם יש עוד מספר אנזימים וחלבונים.הזכרנו את הפולימרז ואת ההליקאז.

1. NAPs ו-CAFs

נים קטומר של ההיסטובסיסים בכל פעם. האו 600-גבר על הנוקלאוזומים וההיסטונים. הוא חושף כתמזלג ההכפלה צריך לה

של המון היסטונים בתא )זה השלב היחיד בחיי התא בו יים וזה הנבנה. בשלב הזה יש יצירהמתפרק, ומתפצל בין הגדיל הק

יש תרגום של היסטונים( כדי להשלים את האוקטומורים מחדש. ההרכבה של האוקטומרים מחדש לאחר השכפול נעשית על

Nucleosome assembly factors (NAPs.)-ו chromatin assembly factors (CAFs)ידי חלבונים הנקראים

2. Topoisomerases

הוא כאמור בצורה של סליל, ושני הגדילים DNA-ה

מלופפים אחד סביב השני. כדי שתתרחש הכפלה,

הליפוף צריך להשתחרר.

במידה ופתיחת הליפוף לא הצליחה, נוצר פלונטר

פותח את topoisomerase1אנזים בשם ונבנה מתח.

הפלונטר הזה. זה אנזים שבאתר הפעיל שלו יש

טירוזין, שזו חומצה אמינית עם הידרוקסיל.

פוספט הקשר לגדיל אחד באזור של ההידרוקסיל נ

(. זה מאפשר DNA-ויוצר ניק )חיתוך בגדיל אחד של ה

אסטרי והמתח -להסתובב סביב הקשר הדי DNA-ל

האנזים לפוספט של הקשר בין הטירוזין של משתחרר.

אסטרי -די-הקשר הפוספודיאסטרי שנפתח, ובזכות זה הריאקציה היא הפיכה ו-הגדיל אוגר את האנרגיה של הקשר הפוספו

מחדש באופן ספונטני. יכול להיווצר

גדילים 2פותח סלילים יותר בעייתים, כאשר יש פלונטר בין Topoisomerase2אנזים

גדיליםת הפלונטר ונקשר באופן קוולנטי והפיך אל אחד המזהה א . הוא)האדום והכתום(

נוצר פתח )מעין שער חלבוני( שמאפשר מעבר של הגדיל השני )הכתום( וחותך אותו.

. שחתך DNA-סוגר חזרה את הושחרור של הפלונטר. אז האנזים )האדום(

. ATPמולקולות 2זה תהליך שמצריך

19

3. SSB- single strand DNA binding proteins

נפתח DNA-מיד כשהלכן, את תנועת הפולימרז. ולהאטשניוניים חד גדילי שיכול ליצור מבנים DNAבמזלג ההכפלה יש

פוספטי -נקשרים לשלד הסוכרי SSB-ה. DNA-, ובצורה קואפרטיבית נקשרים אחד לשני ומיישרים את הSSB-קופצים עליו ה

.DNA-החיצוני של ה

, כי lagging-ל הבגדי SSBנמצא יותר

לוקח יותר זמן לשכפל.

4. Primases

10-20של יוצרים פריימר -אנזימים שמניחים את הבסיסים הראשונים בשכפולפרימזות הם

הפולימרז חייב התחלה קיימת של שרשרת כדי לעבוד. . שהפולימרז יכול להמשיך אותובסיסים,

חד גדילי, DNAמזות מתיישבים על הוא יודע להאריך שרשרת אבל לא להתחיל אחת. הפרי

OH (3' )-הם יוצרים את קצה הויודעים לחבר נוקלאוטידים ללא הימצאות של נוקלאוטיד אחר.

, אשר בסופו של DNAולא RNAנוקלאוטידים של ותמניח הפרימזות. להאריך שהפולימרז יודע

לה של הגדיל כדי אבל הם יוצרים את ההתח ומוחלפים בנוקלאוטידים הנכונים. דבר מוסרים

בתכלת. RNA)איור תחתון משמאל: פריימר שפולימרז יוכל לחבר אליהם את הבסיסים שיביא

. באדום שמחליפים אותם אחרי ההשלמה של הגדיל( DNAבסיסי

כי שם כל הזמן צריך להתחיל מקטעים משלימים חדשים. lagging strand-נמצא יותר פרימזות על ה

RNA-היבריד, ואוכל את ה DNA-RNA. הוא מכיר RNAseהיא על ידי RNA-ההסרה של נוקלאוטיד ה

-של ה template-. את הבסיסים החסרים משלים הפולימרז על ידי הDNA-ק ב, ונוצר ני '3-ל '5-מ

DNA שיש לו, כאשר ה-DNA יכול לשמש כפריימר. בסוף הליגז מחבר את הניק. החתוך

היא שהפרימזות הם אנזימים לא מדויקים )עושים טעויות DNAולא של RNAאחת הסיבות לכך שהפריימר הוא של

, אפשר לתקן את הטעויות הללו. DNA-ב RNAבהארכה(. מאחר וצריך להחליף את הפריימר

5. Polymerase 1, 2, 3

אמור לקחת . לפי הקצב המקסימלי שלו, בסיסים בשנייה 80-הוא עושה פחות מ -הוא מאוד איטי 1פולימרז DNA-הקצב של ה

שלם אחד. DNAלו ימים לשכפל

20

היא הרבה יותר 3. הם יותר נדירים בתא. פעולתו של הפולימרז 3ופולימרז 2פולימרז -נמצאו שני אנזימים אחרים אחריו

לא יודע להאריך את השרשראות של 3. אבל הפולימרז בסיסים בשנייה 1000-עושה כהוא -1מזה של הפולימרז מהירה

מחליף אותו. 3הוא זה שמתחיל את ההארכה, ואז הפולימרז 1לכן הפולימרז הפריימר.

.DNA-יעשה תיקוני חירום בהגהה של ה 2פולימרז

השוואה בין הפולימרזים:

Processivity- מספר הבסיסים

שהאנזים יאריך לפני שישתחרר

.DNA-מה

יש 3ניתן לראות כי לפולימרז

פרוססיביות מאוד גבוהה.

שתי תת לו אותה הןמה שמקנה

יחידות שיש לו מעבר ליחידות

שעושות את ההארכה ,הליבה

והתיקון. יחידות אלו נקראות

בהתאמה. loading clamp-ו sliding clampביתא וגמא, או

, וכךDNA-ומקל עליו את התנועה על פני ה 3תופס את הפולימרז sliding-. והDNA-להיתפס על ה sliding-גורם ל loading-ה

כאשר הוא ירגיש שיש עיכוב בפעולה שלו. זה מעיד על כך 3ישחרר את הפולימרז sliding clamp-ה .הוא ממשיך לסנתז

. okazakiשהפולימרז סיים להשלים מקטע

21

פולימרזים באאוקריוטים:

אצל הפרוקריוטים. 1-3באאוקריוטים יש יותר סוגים של פולימרזים מאשר -

.lagging strand-ול leading strand-יש פולימרז שונה ללאאוקריוטים -

הפולימרז היחיד שיודע להמשיך את הפריימר הוא פולימרז אלפא. -

האלונגציה באאוקריוטים היא איטית יותר מאשר בפרוקריוטים בגלל ההיסטונים )?(. -

'3'5-שמפרקות מ . אין אקסונוקלאזות'5'3-פעילות ההגהה היא רק על ידי אקסונוקלאזות שמפרקות מ -

(. לא ברור עדיין איך הפריימר הזה מוסר. RNA)בפרוקריוטים ראינו אותם כשהיה צריך לפרק את הפריימר

אנזימים שמפסיקים הכפלה .6

אחד מכל כיוון. -אזורי טרמינציה 2מעגלי, וצריך DNA-בבקטריות, ה

אחד עוצר ה. TerB-ו TerAשמסמנים סיום של שכפול נקראים DNA-מקטעי ה

הכפלה עם כיוון השעון והשני עוצר הכפלה נגד כיוון השעון. הרצפים האלו הם

חד כיוונים, כך שרק פולימרז שבא מכיוון מסוים יזהה אותם. פולימרז שעובד

ולהיפך. כך יווצר אזור TerB-אלא רק ב TerA-עם כיוון השעון לא יעצר ב

. overlap zone החפיפה

הם אלו Tus-איפה להיקשר. חלבוני ה Tusרגולטורי והם מסמנים לחלבוני טרנס רגולטורי, הנקראים הם ציס Ter-מקטעי ה

שמונעים פיסית את השכפול בפני הפולימרז, אבל רק בכיוון הרלוונטי.

-הטלומר שנמצא בקצה הכרומוזום מהווה בעייה. בגדיל של הליניארי, אצל אאוקריוטים, DNA-ב

lagging לכן בגדיל זה, בחלק האחרון למזלג ההכפלה הזמן בפריימר והארכה בכיוון ההפוךיש צורך כל .

כי כדי להאריך אותו צריך -יך אותושיוסר בהמשך, ולא תהיה אפשרות להאר RNAביותר, יוצב פריימר

. '5-ל '3-לעבוד מ

. הפתרון הוא על בגדיל אחד של הטלומר בסיסים 20-חסר של כ אמור להיותעם כל חלוקה עקרונית, לכן,

רצף של ידי אנזים בשם טלומרז שעליו יש

RNA.

על RNA-אופייני. ה DNAיש רצף על הכרומוזום, באזור הטלומר,

הטלומרז הוא כזה שתואם ומשלים את הרצף האופייני של גבי

(, leadingשל הגדיל התקין )שהיה '3-. הוא נקשר לקצה ההטלומר

)זה החלק RNA-של ה template-ואז הגדיל הזה מתארך לפי ה

הוא ארוך יותר, leading-של ההורוד בתמונה(. כעת שהקצה

DNAעל ידי lagging-מתאפשרת סינתזה של החלק החסר בגדיל ה

פולימרז )זה החלק הירוק בתמונה(.

22

שיטות בביולוגיה מולקולרית

PCR-polymerase chain reaction. שיטה המאפשרת לנו להגביר קטעים שלDNA ו-RNA אם הופכים אותו ל(-cDNA .)

(, ורק עבור הגן שמעניין cyclesבסבבים ) -במבחנה, רק שהיא נעשית המון המון פעמים DNA-מחקה את שכפול ה PCR-ה

, שמים DNAאותנו, ולא כל הגנום. לשם כך לוקחים

פולימרז ונוקלאוטידים DNAאותו במבחנה עם

שרו הגברה של חופשיים, ופריימרים ספציפיים שיאפ

-מחממים את ה cycleרק הגן שמעניין אותנו. בכל

DNA גדיל, אז מאפשרים -כדי לפתוח את הדו

לפריימרים להידבק ולפולימרז להאריך את הגן, וכך

מכפילים את כמותו. התהליך חוזר על עצמו כמה

. לצורך 2גדלה פי DNA-כמות ה cycleפעמים, בכל

. reverse-ו forwardההגברה צריך שני פריימרים:

הראשון יקשר לגדיל עליו נמצא הגן )נניח העליון(,

והשני יקשר לגדיל המשלים )נניח התחתון(. שני

של הקטע שצריך '3-הפריימרים יקשרו לקצה ה

)רואים 3'5-וכך תתאפשר הארכה מלהגביר,

בציור(.

מורכב שלושה שלבים: PCR-של ה cycleכל

מעלות כדי שהגדילים יפרדו. 90-ל DNA-מחממים את ה -דנטורציה -שלב ראשון

יוסבר -מעלות )תלוי בפריימר 50-65-של כל גדיל. זה נעשה ב '3-הדבקה של הפריימרים אל הקצה ה-annealing-שלב שני

בהמשך(.

מעלות. 72-. נעשה בtemplate-הארכה של הגדיל על סמך הפריימר וה-אלונגציה/פולימריזציה-שלב שלישי

בסיסים. עליו להיות מספיק ארוך כדי שיתן רצף ספציפי ייחודי לגן )שסטטיסטית אין 20-ריימר צריך להיות באורך של כפ

. הטמפ' annealing-סיכוי סביר שיופיע בלוקוסים אחרים(, אבל לא ארוך מדי, כי אז נצטרך טמפ' גבוהה מדי כדי לבצע את ה

C-G. היא מבוססת על הטמפ' הנחוצה לשבור קשרי annealing temperatureבה מתבצעת ההדבקה של הפריימר נקראת

הצפויים להיווצר בין הפריימר למקטע, עבור כל קשר G-C-וה T-A-. כדי לקבוע אותה נספור את מספר קשרי הT-A 2)0(-ו 4)0(

A-T מעלות ועבור כל קשר שצריך להיווצר בין 2שצריך להיווצר נוסיףC ל-G משל, אם המקטע הוא מעלות. ל 4נוסיף

ATTACGGGCT קשרי 5, אז צפויים להיותA-T קשרי 5-וC-G 30 = 2*5 + 4*5. הטמפ' תהיה.

זו הטמפ' המקסימלית בה אפשר לבצע את ההדבקה של הפריימר למקטע, אם נעבור אותה, ההדבקה לא תתרחש, כי

מקטע. אם הטמפ' תהיה נמוכה מדי, הפריימר במערכת תהיה מספיק אנרגיה )חום( לשבור את כל הקשרים בין הפריימר ל

אם ניקח את המקטע -הוא יוכל להיקשר גם למקטעים אחרים דומים. למשל -יקשר אבל הוא לא יהיה מספיק ספציפי

תמנע מהפריימר 30-. ולכן עריכת הריאקציה ב28, אז הטמפ' הקריטית עבורו היא A-אחד ב Cמהדוגמא למעלה, ונחליף

המקטע הדומה הזה. לסיכום, הספציפיות של הפריימר היא גם ברצף וגם בטמפ' בה נבצע את הריאקציה. שלנו להיקשר אל

מעלות. 56-השאיפה היא לתכנן פריימר שיזדקק לטמפ' הדבקה של כ

23

אפשר להחדיר לפריימר "זנב" שיהווה רצף הכרה לאנזימי רסטריקציה. הוא לא יתאים לרצף שרוצים להגביר, אבל אחרי

ה הוא יאפשר לנו להכניס את הרצף לתוך פלסמידים. ההגבר

כמו טיפה אחת של דם. היא משמשת לזיהוי -גם ברקמה מאוד מאוד קטנה DNAמאפשרת לנו לזהות מקטעי PCRשיטת

ואז לבצע את ההגברה( ועוד. cDNA-הויראלי ל RNA-בדם )צריך להפוך את ה HIV -פלילי, למחקר, לבדיקה נוכחות נגיף ה

שהוגבר בג'ל אגרוז בשדה חשמלי, שמפריד בין מקטעים לפי אורך DNA-י האמפליפיקציה מריצים את האחר

הוא שלילי, ובג'ל הוא רץ אל עבר הקתודה. הפרגמנטים הקטנים ירוצו יותר קדימה DNA-)מספר בסיסים(. ה

אות את ההפרדה ואז אפשר לר DNA-( שנדבק לEtBrמהפרגמנטים הארוכים. משתמשים בצבען שפלורסנטי )

ליניארי. אם יש בו ניק הוא רץ DNA-דחוס רץ מהר מ DNAסגור מעגלי רץ יחסית מהר. DNAבין הבנדים.

הגדילים הוא ירוץ יותר מהר מהניק. 2-מאוד לאט כי הוא מאוד מסורבל. אם הוא חתוך ב

-בשיטת סנגר DNAריצוף

תנאים 3ובסיס לא נכון לא נקשר. צריך שיתקיימו ,כון שמגיע נקשרפולימרז עובד בצורה די מדויקת, כך שבסיס נ DNA-ה

של השרשרת תהיה קבוצת הידרוקסיד, ושלישית '3-תחילה שהבסיס יהיה נכון, שנית שעל הקצה ה -כדי שיתרחש הקשר

קבוצות פוספט. 3שעל הנוקלאוטיד הבודד שנכנס יהיה

ם נכניס סנגר ניצל את העובדה הזו כדי לרצף. הוא ידע כי א

נוקלאוטידים חופשיים בלי קבוצת ההידרוקסיד על הריבוז

(di-deoxynucleotide .הפלמור של השרשרת יעצר ,)

שרוצים לרצף DNA -בשיטת הריצוף על שם סנגר, לוקחים את ה

-ושמים אותו עם פריימר )חייבים לדעת את הרצף של הפריימר( ו

DNA אוקסי(. -דה-אוקסי( ונוקלאוטידים "פגומים" )די-נוקלאוטידים רגילים )דה -פולימרז, ושני סוגים של נוקלאוטידים

מריצים ארבע ריאקציות שונות, בכולם יש את כל ארבעת הנוקלאוטידים התקינים, ובנוסף, בכל אחת מהן יש גם את אחד

תקים של הגן אותו ומהנוקלאוטידים ה"פגומים" )באחוז נמוך יחסית( שעוצרים את הריאקציה. בכל מבחנה יש המון ע

יש עותקים בהם הוא נעצר -הסתברותית, בכל עותק הפלמור נעצר במקום אחר ,כאשר מתחיל הפלמורמעוניינים לרצף.

מוקדם, ויש עותקים בהם הוא נעצר מאוחר. לכן, בכל מבחנה מתקבלות שרשראות שונות באורכן. לאחר מכן מריצים את

ניתן לדעת את רצף הגן שנקבע על פי כמות הבסיסים בשרשרת. -צרים לפי האורךהתוצרים מארבעת המבחנות בג'ל, והם עו

)צריך לזכור להפוך את הבנדים לרצף המשלים(.. TTAG-לפי הסדר של הבנדים. למשל בדוגמא של הג'ל שפה, הגן מתחיל ב

24

Second generation sequencing-.נקרא גם הסנגר האוטומטי

, החלו לבצע את הריאקציה עם נוקלאוטידים שמסומנים בצבעים פלורסנטים. כל אחד עם המצאת הבסיסים הפלורנסטים

אוקסי סומן בצבע פלורסנטי אחר, מה שאפשר לעשות רק -דה-מארבעת הנוקלאוטידים הדי

ריאקציה אחת במקום ארבע, וכך חסך את העבודה עם החומרים הרדיואקטיבים )בהם

הפגומים(. השתמשו קודם כדי לסמן את הנוקלאוטידים

-ספריות גנים

כאשר רוצים לרצף גנום או כרומוזום חייבים לשבור אותו לחלקים. שוברים אותו על ידי אנזימי

רסטריקציה, ואז משבטים אותם לתוך פלסמיד שהרצף שלו ידוע, ומחדירים אותם לחיידק כדי

חלק קטן בהרבה עותקים. מפיקים את החיידקים, שכל אחד מהם מכיל DNA-שישכפל את ה

צריכה להיות באופן כזה שיאפשר DNA-מהגנום ההומני ומרצפים אותם. השבירה של ה

כפילויות וחפיפות כדי שנוכל לחבר אותם לכדי רצף ארוך.

בספרייה, כל הגנום של היצור נמצא בתוך פלסימידים.

בעזרת השיטה הזו ניתן לתכנן פריימרים לריצוף של גנים אנושיים.

שנה להשלים את 15האנושי עסקו בריצוף של גנום שלם של אדם. לקח בפרויקט הגנום

הפרויקט. אזורים של טלומרים ואזורי הטרוכרומטין )אזורים מאוד דחוסים( לא רוצפו כי קשה

לפתוח אותם.

Next generation sequencing (NGS)-

בסיסים(. את אותם המקטעים מקבעים 400 למקטעים קצרים )סביב DNA-שוברים את ה next generation sequencing-ב

על משטח ומגבירים אותם. בעת ההגברה, כל בסיס שהוסף נקרא בשיטות של פלורסנציה. הטכניקה היא כזו שמיד לאחר

ההוספה של בסיס יש השהייה קצרה, בה המכונה קוראת את הפלורסנציה של הבסיס שהוסף ומזהה אותו. בעזרת תוכנות

קטעים לכדי גנום. מחשב מחברים את המ

Ilumina- סוג שלNGSחותכים את ה .-DNA למקטעים קצרים. למקטעים

באיור( 1, )'3-וה '5-ה -פים אדפטורים, רצפים בשתי הקצוותהאלו מוסי

שמאפשרים להם התאמה למשטח )צ'יפ( שעליו יש מקטע קצר משלים.

יל מתקפל , ואז הגד'5-הקישור תחילה הוא רק לאדפטור אחד, בקצה ה

הפוך( שקשור Uונוצר גדיל בצורת גשר ) '3-ונקשר לאדפטור השני בצד ה

DNA-באיור(. על אותו גדיל עושים שכפול באמצעות פריימר ו 2לצ'יפ )

באיור(. אז עבור כל אחד מהגדילים, 3-4גדילי )-פולימרז, כך שנוצר גשר דו

איור(, שיכול ב 5אדפטור אחד יתנתק כך שנקבל מקטע אנכי וחד גדילי )

לעשות את אותו הסבב מחדש, וכך נעשית ההגברה של המקטע. לאחר מכן

25

המון -אחיד DNA, וכך נוצרים איים של forwardמסלקים את כל העותקים של הגדיל המשלים, כדי שישאר רק הגדיל

אי אפשר לרצף מולקולה באיור(. לאחר ההגברה אפשר לרצף את המקטע ) 6עותקים של אותו המקטע, ללא הגדיל המשלים )

, כדי לא לקבל ריצוף של המקטע ההפוך ועושים ריצוף עם '3-בודדת, חייבים שתהיה הגברה(. חוסמים את הקצה ה

נוקלאוטידים פלורסנטים. זה נעשה על כל העותקים במקביל. לאחר מכן בתוכנת מחשב צריך לחבר את המקטעים כדי לבנות

את הרצף המלא.

א עצומה ומאפשרת לבחון מיליונים של מקטעים בבת אחת. לפריימרים ניתן להוסיף כל מיני רצפים, היכולת של הצ'יפ הי

למשל רצפים שיעזרו לנו לזהות מאיפה הגיעה הדגימה )קובעים שדגימות מסוימות יקבלו פריימר עם תוספת אחת, ודגימות

אחרות יקבלו פריימר עם תוספת אחרת. זה מקל אח"כ על האנליזה(.

הסרטני. DNA-ם בטיפול לסרטן מנסים להכווין טיפול שיהיה יעודי לתאים הסרטניים על ידי ריצוף של ההיו

Exome sequencing- רק אחוז אחד מהגנום הוא מקודד לחלבונים, ויש גישות בהם מרצפים רק את האזורים האלו-

רים אליהם ידועים. לוקחים את הגנום ומגבירים אקסונים, והפריימ 180000מרצפים רק אקסונים. ידוע כי בגנום אנושי יש

את האקסון בלבד בעזרת הפריימרים, ואז מבודדים את המקטעים שעברו הגברה ואותם מרצפים. אלטרנטיבה אחרת היא

להוציא את מקטעי האקסונים מתוך הספריות הגנומיות הקיימות כבר. מסנתזים פרובים שמתאימים לחלקים של אקסונים

למשוך אותם בעזרת מגנט. אפשר דים קטנים וכך אפשר ים לעבור איתם היברידיזציה. אל הפרובים מחברים ביבלבד, ויכול

גם למשוך גן ספציפי מתוך הספרייה שמעניין אותנו לחקור ע"י תכנון פרוב שמותאם אליו.

פים. זה ישמש אותנו כאשר שאותו מרצ cDNA-ל reverse transcriptionע"י mRNAאפשר לרצף גם -ברקוד מולטיפלקסינג

הוא מבטא מכל גן, פחות כדי לדעת את הרצפים עצמם )רלוונטי לזיהוי תא RNAכמה -נרצה לדעת על הפעילות של התא

כי מספיק כמה בסיסים בודדים לקבל זיהוי מתוך השוואה -mRNAסרטני נניח(. לכן מספיק לרצף מקטע מאוד קצר של

ן(.לספרייה )זה בעצם הברקוד של הג

DNAתיקון

פולימרז יודע לחוש כשיש בסיס לא נכון, ועל ידי פעולת אקסונולאזה להחליף בסיס. אבל גם היכולת הזו של ההגהה DNA-ה

היא מוגבלת, וצריך מנגנונים משלימים בשכפול ובשעתוק שיעשו תיקונים. מנגנונים אלו חשובים גם למקרים בהם יש

הליכי הזדקנות. מוטציות עקב פגעים סביבתיים או ת

יכול לנבוע מרעלנים )כמו סיגריות, קרינה( או משינויים פנימיים )כמו טעויות של הפולימרז(. חשוב להבחין בין DNA-נזק ל

נזק לתאים מתחלקים ולתאים שאינם מתחלקים. אם הנזק הוא בתאים מתחלקים, המוטציות שיכולות לגרור מחלה יעברו

ת של המחלה )זה הליך סרטני(. אם הנזק הוא בתאים לא מתחלקים, המוטציות ישפיעו על לתאים הבאים, ויגרמו להתפשטו

שעתוק הגנים בו. אותו תא יפעל פחות טוב, ובסוף הוא ימות. זה חלק מתהליך ההזדקנות.

מתי יתרחשו יותר טעויות בשכפול? ברגעי עקה, הפעילות של הפולימרז היא פחות טובה ויש יותר סיכוי למוטציות.

(. הם יותר חשופים לטעויות של RNAאו DNAואצל וירוסים, המשמרים את המידע הגנטי שלהם במולקולות חד גדיליות )או

מוטציות, כי אין להם את האפשרות לבקר את הטעות אל מול הגדיל המשלים, התקין.

26

מנגנונים לתיקון טעויות שנעשו השכפול

MisMatch repair (MMR)-ה יכול לגרור לכך שהגדילים לא יקשרו, ותהיה בליטה אם ישנה טעות ז

(, MutS, MutL, MutH)חלבוני DNA-. בפרוקריוטים, יש חלבונים שתפקידם הוא לסרוק את הDNA-ב

וכאשר הם מבחינים בבליטה כזו עקב זוג לא מתאים, הם יובילו לפתיחה של הגדילים. הבסיס הלא

ו, ותהיה השלמה חדשה של הגדיל ע"י פולימרז, בתקווה נכון יוסר יחד עם כמה בסיסים לפניו ואחרי

שהפעם יוכנס הגדיל הנכון. חיידקים יודעים להבחין מי הגדיל היותר חדש כי עליו עוד אין מתילציות

הוא החלבון שעושה את הניק, והוא יכול לחתוך רק MutH-)בחיידקים יש מתילציות על אדנוזין(. ה

DNA .לא ממותל

MMR יש חלבונים דומים לאלו שעושים -יםבאאוקריוטMMR בפרוקריוטים. לאאוקריוטים אין מתילציות על אדנוזין. לא

-ברור מה בדיוק המנגנון לפיו הם מזהים את הגדיל החדש, עם הטעות. מניחים שהם רגישים לאזורים של ניק, שיהיו על ה

lagging strand שהוא מתקן את הגדיל הלא נכון. 50%הסתברות של . יתכן גם שהוא עושה את התיקון אקראית, ולכן יש

למוטציות ספונטיות )לא מהשכפול( תיקון

חמצון, חום, קרינה, טעויות מטבוליות. בין השינויים יכולה להיות -יש מוטציות ספונטניות, שנגרמות עקב תהליכים בסביבה

ה של כל הבסיס )זה ישאיר נוקלאוטיד בלי הוספה של קבוצות מתיליות לבסיסים, התקפות של הידרוליזה שתוביל להסר

תהליך דה פוריניציה או דה פירמידינציה(, הוצאה של קבוצת אמין ועוד. -בסיס

פעמים ביום. הוצאה של 18000שכיחות המוטציות האלו היא די גדולה. למשל הוצאה של פורין בהידרוליזה מתרחשת בתא

קיע המון אנרגיה לתקן את הטעויות האלו. פעמים ביום. התא מש 600פירמידין מתרחשת בתא

:mispairing-מספר סוגי מוטציות שגורמות ל

-מוטציה של הוצאה קבוצת אמין מהבסיסים. מים מתקיפים את ה -דה אמינציה

DNA וזה מוביל לשחרור קבוצת האמין, ולשינוי של הבסיס. אדנוזין למשל יהפוך

, וכך נקבל T-במקום ל C-תחברת ללהיפוקנסטין. אדנוזין ללא קבוצת אמינית מ

מוטציה.

אמינציה הופך לקסנטין.-גואונין שעובר דה

. Gולא A. לכן בעת שכפול ישימו מולו U-אמינציה ל-ציטוזין הופך אחרי דה

אמינציה. -טימין לא עובר דה

בעצם אם אין תיקון לאותם טעויות, בחצי מתאי הבת תהיה מוטציה נקודתית.

עובר מתילציה וזה משתיק C-, בהם הCpG islandsום שנקראים יש אזורים בגנ

. T-ל Cהדה אמינציה הופכת -CpGאמינציה של ציטוזין באיי -את הגן. אם יש דה

, והן C-Tיוזכרו בהמשך(, יש כאלו מיוחדות שמזהות קשר -אמינציה )גליקוזילזות-בין האנזימים המתקנים מוטציות של דה

באבולוציה. CpGנים האלו לא מספיק יעילים ולכן יש הפחתה של איי . המנגנוT-מורידות את ה

27

כאמור הידרוליזה של מים יכולה לגרום להסרה של הבסיס. גם -דה פירמינציה/פורינציה-דה

ומתוך כך deletionבמוטציה כזו, בחצי מתאי הבת לא יהיה שינוי, אבל בחצי מתאי הבת יהיה

frameshiftר בסיס ופשוט ידלג עליו, ובתא הבת האלו נקבל בסיס אחד . הפולימרז יראה שחס

פחות.

Base oxidation- חמצון של קשרים כפולים שמוביל לשינוי של הבסיס )יש לו קשר בודד במקום כפול( או יצירה של

ר לבסיס לא בהם יש שינוי במיקום של הקשר הכפול. זה יוביל למוטציות ברצף, כי אז הבסיס המחומצן יקש -טאוטומרים

. A-במקום ל C-יקשר ל Tנכון בשכפול. למשל טאוטומר של

יתכן כי עקב שינויים סביבתיים, אנלוגים של בסיסים, שהם חומצות גרעין

שדומות לאחד מארבעת הבסיסים אבל עם שינוי של קבוצה פונקציונלית

ברומואורציל דומה לטימין, -5אחת, יכנסו במקום הבסיס התקין. למשל

. Aבשכפול במקום Gבל הוא יקשור אליו א

זו מערכת חלבונים -Base excision repairמנגנון התיקון הקיים למוטציות אלו נקרא

ומחפשת שינויים שהובילו לבסיסים אבנורמלים. חלבונים אלו נקראים DNA-שעוברת על ה

למשל הבסיס הפגום ). ברגע שהם מזהים בסיס לא תקין, הם נעצרים ומסירים את גליקוזילזות

אמינציה(. ברגע זה יש "שן חסרה" בגדיל. עדין יש את הסוכר והפוספט אבל אין -שעבר דהכזה

-דיאסטרים חסרי בסיס. הן חותכות את ה-בסיס. יש אנדונוקלאזות שמזהות קשרים פוספו

DNA ויוצרות ניק היכן שיש בסיס חסר, ואז מגיע פולימרז ומכניס נוקלאוטיד חדש במקומו ,

וליגז שסוגר את הניק.

או שיצרו DNA-( הם אלקטרופילים, והם יובילו לאובדן של הalkylating agentsחומרים שעושים מתילציה )נקראים

mispairing למשל .G עם מתיל יתחבר ל-T ואז בתא הבת הבא נקבל ,A במקוםG ;T עם מתיל יתחבר ל-G במקום ל-A .

סיגריות, מוצרים קוסמטים מסוימים ומזון שעבר טיפול בניטריט )יתכן בדגים וגבינה(. יש חומרים אלקילים בעשן

28

בתאים הסרטניים. DNA-, מתוך ניסיון לערער את הDNA-חומרים רבים שנמצאים בשימוש בכימותרפיה עושים מתילציה ל

אים בריאים. יותר חלשות, והתקווה היא שהם יפגעו יותר מת DNAלתאים סרטניים יש מערכות תיקון

. החומרים המסרטנים קשורים DNA-חומרים שנמצאים בעשן )מהגריל ומסיגריות( יכולים לגרום למודיפיקציות מזיקות ב

( והם מונעים שעתוק DNA adductsבאופן קוולנטי לבסיס )

ומקדמים מודיפיקציות מזיקות.

DNA-. הן עוברות על גבי המתיל טרנספרזותמנגנון התיקון:

הן מזהות קבוצת מתיל על בסיס לא נכון, הן נקשרות וכאשר

באופן קוולנטי למתיל )דרך קבוצת צד ציסטאינית( ומנקות

. מהמתיל DNA-את ה

שכפולתיקון תוך כדי

. Sהמנגנונים שהוזכרו עד כה פעילים במהלך חיי התא. המנגנון הבא הוא בעת שלב

ע"י המנגנונים הקודמים )נניח פגוע, שלא תוקן DNA-כאשר מזלג ההכפלה נתקל ב

כל אלו גורמים לכך -עקב מתילציה לא נכונה, טאוטומר, בסיס ללא קשר כפול

שהמבנה הוא לא מדויק(, הפולימרז נעצר ומגייס פולימרזות מיוחדות

(translesion polymerase שמאפשרות מעבר על גבי המכשול. אותן פולימרזות הן )

מסוג אחר. יהיו פולימרזות שיחליפו באופן מדויק כל אחת מזהה מכשול -ספציפיות

הן לא ידעו מה הבסיס הנכון שצריך -)ישימו את הבסיס הנכון(, ויהיו כאלו שינחשו

להיכנס ויכניסו אקראית איזשהוא בסיס. אומנם זה הכנסה של מוטציה, אבל

לפחות זה מאפשר את ההמשך של השכפול. יתכן כמובן שזו מוטציה שתתן יתרון.

ברוב המקרים אבל לא.

. DNA-הפולימרזות האלו תחת בקרה מאוד חזקה, הן יגוייסו רק כאשר יש תקלה ב

אם הן לא מבוקרות נכון, הן יעשו מוטציות בעצמן.

*לא צריך לזכור את שמות הפולימרזות.

, שמגייס אנזימים SOSפגוע, נכנס לפעולה מנגנון DNAאצל חיידקים, ברגע שיש

משמש כרפרסור לגנים LexA. באופן רגיל, ללא עקה, פקטור שעתוק בשם DNAשמתקנים

פגום, מולקולה DNA. פקטור זה עובד כדימר. כאשר יש קריאה של התא שיש SOS-של ה

מה שהופך -משועתקת, והיא חותכת את הרפרסור הדימר לשני מונומרים RecAבשם

ועתקים. מש SOS-אותם למאקטבי שעתוק. כתוצאה מכך הגנים של ה

29

תיקונים תוך כדי שעתוק

הפגום DNA-פולימרז נשאר על ה RNA-פגוע, היא גם תפעל לתקן אותו. באאוקריוטים, ה DNAכאשר מערכת השעתוק מזהה

-פגוע, הוא יתנתק מה DNAפולימרז יזהה RNA-מערכת התיקון מזהה זאת ובאה לתקן. בחיידקים, כאשר הולא מתקדם.

DNA פעלו מנגנוני תיקון הוא ישוב לשעתק.ורק אחרי שיו

הפגום, ולא מצליח לאותת למנגנוני DNA -נתקע במקום של הפולימרז RNA-ה ( בהםcokayne syndromeיש כמה מחלות )

פיגור גדילתי, פיגור שכלי, אבנורמליות של השלד.יכול להוביל להתיקון להגיע. לכן הוא אינו מתקדם ואין שעתוק.

Ames test- יכולים לשנות -יטה ישנה לבחון האם חומרים הם מוטגניםשDNA לוקחים חיידקים בהם המסלול .

הביוסינתטי לאחת מהחומצות אמינו פגוע. למשל גורמים לו לאבד את היכולת לסנתז היסטדין, ואז הוא חייב היסטדין

ותו מסלול שתאפשר לו לייצר היסטדין במצע. אם החומר שבודקים הוא מוטגן, היא יכולה באופן אקראי לעשות מוטציה בא

משמע החומר הוא מוטגן. כמובן שיתכן שהיו מוטציות רבות שלא נזהה -ואז נראה שגדלות מושבות במצע בלי היסטדין

בשיטה הזו, היא לא מושלמת.

של התאים. בהתחלקות הלמומים מולדים, כי פגע ילות בוקר לנשים בהיריון. גרמההטלידומיד. היא ניתנה כתרופה לבח

הוא מוטגן שעבר את מבחן איימס. הוא לא נבחן על בע"ח לפני שניתן לשימוש. היום משתמשים בו לטיפול בסרטן. טלידומיד

. DNA-כאמור לתאי סרטן יש מנגנוני תיקון פחות טובים, ולכן הם יותר פגיעים לחומרים שפוגעים ב

פגיעות מקרינה

גדיליות, ניקים -דימרים של פירמידנים, שבירות דו -DNA-ה סוגים של פגיעות ב( יכולה ליצור כמUVקרינה )רנטגן או

שידרדרו לשבר דו גדילי.

, שני פירמידנים עוקבים נקשרים זה לזה. בסיסים בצורה של דימר לא מוכרים בדימרים של פירמידינים

על ידי הפולימרז.

טנים בעשן סיגריות ופליטת דיזל. *דימרים של פירמידין יכולים גם להיווצר ע"י חומרים מסר

(, והם יודעים לתקן photolyaseלק מהחיידקים יש אנזימים שמאוקטבים על ידי אור )בצמחים ואצל ח

, שמטפלת nucleotides excision repairאצל אאוקריוטים יש מערכת שנקראת את הדימרים הללו.

ני צידי הדימר. הליקאס פורם את באותם דימרים. האנזימים מזהים את הדימר ויוצרים ניק מש

בסיסים בבני אדם(, ואז פולימרז מוסיף את 30המקטע עם הדימר החוצה )לרוב מדובר על מקטע של

גדיל -, המערכת מזהה שיש הפרעה נפחית בדוmismatch-הבסיסים החסרים. המנגנון דומה לזה שב

ושם היא מתקנת.

. יש 30בסיסים ולא 11של היא אותו מנגנון כמו באאוקריוטים, רק שההסרה . פחות או יותר E.coli :Urv system-המערכת ב

, 1פולימרז DNA. ההשלמה היא על ידי UrvA, B, Cוהם DNA-חלבונים שמעורבים בזיהוי ובפתיחה של ה 3קומפלקס של

. UrvDוההליקס נקרא

:DNA-תיקונים לשבירה של ה

(, חלבוני סנסור חשים בה, והם מזעיקים double strandזה ניק או שבירה )בין אם DNA-כאשר יש זיהוי של שבירה של ה

יתוקן והתא ממשיך בפעולתו. DNA-למקום השבר מנגנוני תיקון. במידה והמנגנונים יעבדו טוב, ה

30

, תהליך החלוקה נעצר. תא הבתשבירה שעלולה לסכן את מידה והתא חש שזואם זה קורה במהלך חלוקת התא, ב

ן לא צלח, התא יעבור אפופטוזיס.אם התיקו

להיכנס מהתא ישנם מעצורים מיוחדים על מנת למנוע קריטיות במהלך מעגל חיי התא. נבחן במספר נקודות DNA-מצב ה

. DNA-. זה שלב בו התא מחליט אם לשכפל את הG1-Sלא תקין. מעצור אחד הוא בין שלבי DNAלמחזור התא במידה ויש

. זה אחרי השכפול ולפני המיטוזה. G2-M-יה שכפול. המעצור השני הוא בשלב הפגוע לא יה DNA-אם ה

. חלבון DNA-הוא חלבון שמזהה שבירות דו גדיליות ב ATMחלבון

מזהה שבירות חד גדיליות. הם יכולים להביא לעצירת ATR -הומולוגי אליו

, דרך p53, הם מפעילים חלבון DNA-מעגל התא. אם הם מזהים שבר ב

, וגורמות לייצובו )מה p53, שמזרחנות את chk1+2ת קינזות בשם הפעל

גורם לו לפעול p53שמונע ממנו לעבור דגרגציה בפרוטואוזום(. הייצוב של

כגורם שעתוק. הוא נקשר לרצפי בקרה בפרומוטורים של כל מיני גנים

עובר שעתוק p21(. בעקבות כך, חלבון trans regulatory element)הוא

הם אנזימי מפתח CDKs-. הCDK1+2, והוא יוצא לדכא את חלבוני ותרגום

. החלטה זו M-ל G2-, ומS-ל G1-במעגל התא, שאחראים על המעבר מ

אינו תקין, DNA-תלויה בגורמים פנימיים וגורמי סביבה. למשל אם אין אוכל מספק בסביבה, לא תהיה חלוקה. ואם מצב ה

לא יהיה שכפול/חלוקה.

שבירה חד גדילית בעת שכפול: התמודדות עם

ניק, כשמזלג ההכפלה פוגש ב. leading-באיור רואים שהגדיל העליון נשבר. זה גדיל ה

. כך השכפול לא יהיה מלא. בעקבות כך template-הפולימרז נופל, כי הוא חושב שסיים את ה

leading-המוזעק מנגנון תיקון. המנגנון תיקון מגייס אקסונוקלאזות, שמעכלות את הגדיל

בולט בגדיל התחתון המשלים אותו. קצה זה יכול לעבור צימוד '3השבור, על מנת ליצור קצה

. זה ההוספה במקצת (, על מנת להתארךlagging strand-הדו גדילי מהצד השני )של ה DNA-ל

של החלק הירוק. החלק הירוק יכול להוות פריימר כדי לתקן את החלק החסר בגדיל העליון

הגדילים חוזרים לסידורם המקורי, והפולימרז משלים את החלק לאחר ההארכה, . שנשבר

החסר בגדיל העליון, וממשיך את הסינתזה רגיל במזלג ההכפלה.

האקסונוקלאזות שמשתתפות במהלך התיקון הזה מבוקרות באופן חזק ומבוטאות רק בשלבי

S ו-G2על מנת שלא ייצרו ניקים ב ,-DNA .

31

לא בעת שכפול: DNA-ב תיקון ניק

. PARPבזה נקרא ברשמעויש מערכת תיקון שמזהה את השבירה ומנסה לתקן אותו. החלבון

הוא מזהה את האתר השבור ונקשר אליו. אז הוא עושה פוליריבוזילציה על עצמו )מוסיף לעצמו

ווה (. זה מהPAR. אותן שרשראות נקראות +NADפקטור -ע"י שימוש בקו שרשראות פוליריבוז

פולימרז ביתא. הם DNA-ליגז ו DNAסימון לחלבונים נוספים שמגויסים לאזור. אלו הם

מוריד את היחידות הסוכריות ומשחרר PARG אח"כ אנזים .יםהחסר יםמשלימים את הבסיס

את הקומפלקס.

יודע גם לטפל בשברים דו גדילים. PARP-מנגנון ה

דחוס מאוד. לשם כך יש גיוס של היסטונים לא יהיה DNA-מנגנוני התיקון דורשים שה

(. הם מחליפים את ההיסטונים הרגילים H2AXמיוחדים, שמסמנים את האזור כשבור )היסטון

פחות דחוס, מה שמקל על התיקון. DNAכדי ליצור

ת, כי מקטע שלם גדילי-גדילית היא חמורה יותר משבירה חד-גדילית. שבירה דו-שבירה חד גדילית יכולה להוביל לשבירה דו

היא יכולה להוביל לכך שכל הכרומוזום יתפרק. של כרומוזום יכול ללכת לאיבוד, ולא יהיה תבנית להשלים לפיה.

גדילי:-תיקון שבר דו

ם להיגרם מקרינה, טעויות בשכפול או חומרים מחמצנים.ים יכולישברים דו גדיל

Non-homologous end joining- חלבוניKu מיישרים אותם -הם מטפלים בקצוות ., ומתיישבים עליהשבירהמזהים את ה

. מנגנון זה הוא מהיר אבל "מלוכלך" כי הוא יוצר DNA-לקצה חלק וקצת מעכלים אותם ומדביקים את שתי קצוות ה

.frameshiftמוטציות מקומיות או

הלחמות של 2000-, לאדם יש כ70סטטיסטית, בגיל

DNA-קריטי כי רוב ה כרומוזומים. זה הרבה פעמים לא

אינו מקודד לחלבון.

קצוות של 2המנגנון מאוד לא ספציפי ויכול לאחות

כרומוזומים שונים.

Homologous recombination- מנגנון שמאפשר

כרומטידות אחיות/שחלוף בין כרומוזומים הומולוגים

אזות נוקלתחילה . לצורך השלמת המקטע החסר

ויוצרות קצוות בולטים מעכלות את הקצוות השבורים,

. אותם הקצוות יכולים להשתרבב לכרומוזום '3של

, שם הם יתארכו על ידי גדילים משלימים, ואז יחזרו לכרומוזומים המקורי שלהם לצורך כרומטידה אחות/ההומולוגי

השלמת המקטע החסר.

וזום ההומולוגי והשלמת המקטעים *אין צורך לדעת בדיוק את האופן של השחלוף, רק את העקרון של שחלוף עם הכרומ

32

על גן שאדם היה ו ,בין כרומוזומים הומולוגיםשלו. כתוצאה מהמנגנון הזה, אם התיקון היה template-החסרים על פי ה

הטרוזיגוט עבורו, זה יהפוך אותו להומוזיגוט.

. S-רק לקראת שלב ה במנגנון זה, שני ההומולוגים צריכים להיות קרובים אחד לשני. לכן זה יכול להתרחש

וצריכים לעבור אקטיבציה ע"י סיגנלים הם נוצרים בתא במצב לא פעיל החלבונים המתקנים הם מאוד מבוקרים.

. אם תהיה פעילות יתר או חסר שלהם, יתפתחו גידולים סרטניים. DNA-שמאותתים כי יש נזק ל

Rad51 -בבקטריה ו RecA הם ההומולוגים ועושים את השחלוף בין החלבונים שמזהים את הרצף שצריך תיקון

RecA-שלב השחלוף הוא האיטי ביותר במנגנון התיקון. ה .באאוקריוטים

(. אז הקומפלקס ATPהחד גדילי ומותח אותו )תוך ניצול DNA-פף סביב המתל

הדו גדילי בכרומוזום DNA-החד גדילי מתחברים אל ה DNA-וה RecA-של ה

גדיל בכרומוזום ההומולוג, והחד גדיל נדחף -הדו פותח את Rec-ההומולוגי. ה

, כך שנוצר הטרודופלקס )דו גדיל, המורכב מגדיל אחד של הכרומוזום ביניהם

. במידה ויש התאמה השבור וגדיל משלים מהכרומוזום ההומולוגי שלו(

הומולוגית בבסיסים )כלומר אכן מדובר במקטעים הומולוגים בין

חד גדיל יושלם על הו (,ATP)ע"י הידרוליזה של קיתנת RecA-הכרומוזומים(, ה

של הכרומוזום ההומולוגי. במידה ואין התאמה בין הבסיסים, template-פי ה

יחפש אזור אחר בכרומוזום להיקשר אליו. Rec-ה

BRAC1+2-. ההנחוץ לרקומבינציה הומולוגית Rad51מגייסים את הם חלק מקומפלקס חלבונים ש BRCA חלבוניבבני אדם,

והתא ,נפגעשל רקומבינציה הומולוגית אלו נחשבים סופרסורים לגידול. אם יש בהם מוטציה והם לא פעילים, מנגנון התיקון

מסרטני השד. 3-8%-מוטציות בגנים אלו מופיעות ב נהיה סרטני.

לאזור הנזק, ומשחרר Rad51-, הוא מוביל את הDNA-ושומר אותו לא פעיל. כאשר יש נזק ל Rad51-תופס את ה BRCA2-ה

כנראה קשור בעיכול הקצוות הראשוני שחשוב לרקומבינציה הומולוגית. אם הוא לא BRCA1אותו כך שהוא נהפך לפעיל.

פועל כמו שצריך, יתרחש מנגנון התיקון הלא הומולוגי, שמעלה את הסבירות למוטציות.

. PARP-על ידי מנגנון ה לא מצליחים להשרות תיקון הומולוגי, יש תיקון BRCA-כאשר ה

גם . במידה ומסלול אחד פגוע יש סכנה מוגברת להתפתחות של סרטן. אבל DNAמסלולים בהם מתוקן כמה כפי שראינו, יש

, אחרת הוא לא היה יכול להמשיך להתחלק. למעשה, התא הסרטני ממש יםשעובד מנגנוני תיקוןעדיין נותרו סרטני לתא

את הבינו שיש אופציה לחסום -בסרטןחדש . מכאן בא רעיון לטיפול לצורך התרבותו רונותתלוי במערכות התיקון האח

, וכך להרוג את התא הסרטני. התקין שנותר טיפולהמנגנון

בתאים רגילים, אם חוסמים מערכת תיקון אחת זה לא אידיאלי, אבל הם כן ימשיכו

ת היחידה שעוד נותרה . אבל בתא סרטני, אם חוסמים את המערכשברים לתפקד ולתקן

הומוזיגוטים תאים סרטניים שהם ל תרלוונטי תרופה זוהתאים ימותו. ( PARP-)הפעילה

ים למוטציה, שכן בתאים ההטרוזיגוטים להטרוזיגוט א לתאיםול BRCA-למוטציה ב

המנגנון ההומולוגי עוד יפעל במידת מה.

33

במחקר DNAשימוש במערכות תיקון

. בה לוקחים פנוטיפ כלשהו )בדר"כ מחלה( forward geneticsגישות מחקריות. גישה אחת היא צריך להבדיל בין כמה

טגנזה אקראית . עושים מוscreening ומנסים לגלות מה הגן שאחראי לפנוטיפ הזה. דרך אחת לגלות זאת היא באמצעות

, שיעשה שכפול PCRלעשות באמצעות (. את המוטגנזה הזו אפשרscreen-)זה ה בתאים, ובודקים מה הפנוטיפ של המוטציה

רנטיבית היא לחשוף את התא למוטגנים, שיעשו מוטציות דרך אלטפולימרז גרוע, שיש לו הרבה טעויות. עם, אבל DNA-של ה

באופן אקראי, ואז נחקור את הפנוטיפ.

וידועות, ובוחנים מה ההשפעה פה בוחרים גן מסוים, פוגעים בו ע"י מוטציות מכוונות .reverse genetics גישה אחרת היא

זים את הגדילים. מסנת PCRובעזרת ,מתכננים פריימר שיש לו מוטציה מכוונת כדי לעשות את המוטציות האלו על הפנוטיפ.

יש אפשרות לזהות את הגדיל החדש על פני הישן בזכות המתילציה )רק בישן יש מתילציה(.

. אבל במקרים רבים רוצים לעשות את השינוי ברמה in vitroפעילויות האלו ככה עושים שינויים ברמה של הגן. חוקרים את ה

ליצור צמח טרנסגי או חיה טרנסגנית. התקווה היא שבעתיד יהיה ניתן לעשות את זה באדם כטיפול למחלות. -של כל הגנום

את וצים להחליף, היו שמיםשאותו ר DNAיה הומולוגית. אם יש מקטע של הכלים שעמדנו לרשותו בעבר היו רקומבינצ

, ונותנים למערכת של הרקומבינציה להחליף ביניהם. זו לא )מקטע שהונדס גנטית( על פני וקטורהמקטע שרוצים להכניס

שיטה יעילה אבל היא עובדת.

לוקחים תאים עובריים, שנלקחו מבלסטוציט -בקצרה על התהליך

נלקחים מעכבר )ביצית מוקפאת שעברה מספר קטן של חלוקות(. הם

שיש לו תכונה מובחנת )נגיד פרווה שחורה(. עושים מניפולציה

)לא יעיל אבל עובד(. תאי הבלסטוציט שגורמת לוקטור לחדור אל

ם שעברו את בעזרת אנטיביוטיקה אפשר לעשות סלקציה רק לתאי

עכבר אחר, עם תאים עובריים שנקצרו מל השינוי, ואותם להחדיר

העוברים ההיברידים גיד פרווה לבנה(. תכונה מובחנת אחרת )נ

תהיה להם פרווה להם -כימרים לאם, ונולדים צאצאים יםמוחדר

-לבנה עם אחוז מסוים של הפרווה השחורה והמוטציה של הנוק

של אותם אזור של הגמטות, הצאצאים המוטציה חדרה לאם אאוט.

כבר יהיו הומוזיגוטים למוטציה. בגמטות יםעכברים כימר

ך מאוד ארוך והוא לוקח כשנה. זה תהלי

. את השבירה צריך לעשות DNA-של הדו גדילית בטכניקות החדשות, עובדים על לעשות מוטציה נקודתית על ידי שבירה

-בדיוק בנוקלאוטיד שאנחנו רוצים שיוחלף. אחת ממערכת התיקון שהזכרנו היא המערכת הלא -באופן מדויק מאוד

. אאוט של גן-והשגנו נוק מוטציות. אם יהיה לנו מזל היא תעשה את המוטציה כמו שרצינו , שעושה(NHEJ) הומולוגית

מכניסיםלאחר השבירה (. במקרה זה, HDR-mediated repairלהשתמש במערכת התיקון ההומולוגית )אופציה אחרת היא

אין. -הגנום. בדרך זו עושים נוקמערכת התיקון תזהה אותו ותכניס אותו לתוך בעודף את המקטע שנרצה שיוחלף. לתאים

אפשר לעשות את זה לגן שלם או )ואז צריך להחדיר מקטע דו גדילי( או למוטציה נקודתית של נוקלאוטיד אחד )ואז צריך

34

כדי לכוון למערכת תיקון אחת ולא אחרת, צריך להוסיף חלבונים שיעכבו להחדיר מקטע חד גדילי עם השינוי בנוקלאוטיד(.

שנייה.את המערכת ה

.במקום הנחוץ DNA-לחתוך את ה בנוקלאזות ספציפיות, שיודעותבשביל השיטות האלו משתמשים

הספציפיות .מתוך כל הגנוםבסיסים( 12-40)של נוקלאז מאוד ספציפי, שיכול לזהות רק רצף מסוים הוא נוקלאז-מגה

. זה לא פשוט לעשות את פי של בסיסיםיצמכיר רצף מאוד ספ, שבזכותן הוא כל מיני מודיפיקציות לנוקלאזמושגת על ידי

אליהם. רצפים שניתן לתכנן נוקלאז מיוחד רק מספר מוגבל של ות האלו על הנוקלאז, ולכן ישקצייהמודיפ

לוקחים נוקלאז כללי בשם . zinc-finger nuclease -ב שיטה אחרת היא שימוש

Foxשנקשר ל ,-DNA ים על יאבץ מזהה רצפים ספציפ על ידי 'אצבע אבץ'. האצבע

עובד , ולכן אפשר לכוון את הנוקלאז להיקשר לרצף המבוקש. הנוקלאז DNA-ה

ון, והחיתוך יתבצע איפה ששניעליו להיקשר לגדיל העליון והתחת-כדימר

המונומרים נפגשים. גם עם שיטה זו יש בעיות, קשה לפתח אצבעות ספציפיות.

DNA-זה די דומה לנוקלאז עם אצבעות אבץ, רק שהפעם החלק שנקשר ל .TALENsות בשם היום בשיטות עובדים עם נוקלאז

כזה רצף חומצות אמינוניתן היום לבחור הוא רצף חומצות אמינו, שהינדסו אותו להיות רצף בתחילת חלבון הנוקלאזה.

(.Foxנוקלאזה שמתאים רק לאזור אחר בגנום. גם הנוקלאזות האלו עובדות כדימר )החלק החותך הוא גם

אנזים זה נלקח מבקטריות. הוא אנדונוקלאז שמשמש את . Cas9שעובדת עם אנזים קריספר,שיטה אחרת היא שיטת

של DNA-הבקטריה להגנה מפני בקטריופאג'ים. האנזים שובר את ה

ההפעלה של האנזים היא .PAMלאחר רצף קצר ומסוים שנקרא הבקטריופאג'

DNA-הוהוא נקשר אל ,יידקים, הם מייצרים אותו. בחRNAעל ידי מקטע של

. PAM-מיד אחרי ה-שיחתוך באותו האזור Cas9-השל הפאג', ומגייס את

כאשר רוצים לשבור את הגנום בנקודה מאוד ספציפית, מסנתזים מולקולת

RNAשתדע להיקשר למקום ב ,-DNA אותו רוצים לשבור, ומחדירים אותו לתא

)אבל זה דבר שהוא PAMאיפה שיש רצפי רק בודזה מן הסתם יע .Cas9עם

יחסית שכיח בגנום(. לאחר השבירה, ניתן לעשות מוטציה עם רקומבינציה

הומולוגית ולא הומולוגית.

35

אורגניזמים שהם מודלים גנטיים

מערכת השמר כמודל מחקרי

מהר וניתן לעשות להם מניפולציות הם גדלים מאוד הם מודל מחקרי מאוד נוח כי שמרים הם אאוקריוטים חד תאיים.

. יש לו המון מרקרים שניתן להשתמש 90-גנטיות יחסית בפשטות. הגנום שלהם מאוד קטן ועבר ריצוף מלא עוד בשנות ה

. , אנטיביוטיקות, בסיסיםבהם. אלו מרקרים ביוסינטטים של חומצות אמינו

כמעט חסר אינטרונים. זמן DNA-. הגנים 650-יסים ובס 14000כרומוזומים, ויש לו רק 16-של השמר מורכב מ DNA-ה

החלוקה הוא מאוד קצר.

. השמר הוא האפלואידי, ויש לו , כי בתהליך המיטוזה יש הנצה של התא החדש מהתא הישןשמר האפייה נקרא גם שמר הנצה

שיהיו )במיוזה( ם האפלאידיםשמרי 2-הומולוג לשמר זכרי ונקבי. אפשר בעזרת מניפולציה ליצור שמר דיפלואידי, שיתחלק ל

.)כמו תאי זרע( בצורה של נבגים

לשמרים שימוש נרחב בתעשייה הפרמצוטית. הם משמשים ליצור אלכוהול, אפייה, מקור ויטמינים, מקור פרוביוטי. הוא

נחשב בטוח לאורגניזמים בניגוד לחיידקים.

-ומים לשאר התאים האאוקריוטים. ניתן לעשות רהרלוונטי כי המסלולים המטבולים שלו דהוא השימוש בשמר כמודל

במצע screeningלקחת מסלול מטבולי בשמר שהוא מוכר, ולעשות לו מוטציה שתהרוס אותו, תוך כדי -טוציהיקונסט

בנוסף אפשר להחדיר לשמר גן מיונק ולחקור את הפעילות שלו בתא שמכיל את החומר שהשמר הפגוע לא יודע לסנתז.

השמרי.

ונות עם העבודה בשמר היא שלא ניתן לחקור מנגנונים של התפתחות. החסר

פלסמידים שמתחלקים יחד עם גם יתבטאו בכמויות גדולות. יש יוכפלו בתוך השמר ויס פלסמידים לשמרים, שניתן להכנ

, כי יש הרבה . ניתן להכניס מסלול ביוסינטטי שלם לתוך שמר בפלסמיד(centromeric sequence)להם יש הגנום של השמר

וניתן לעשות מניפולציות גנטיות בשמר על ידי הפלסמידים. מרקרים ידועים.

חלבון הם חשובים מאוד בכל המסלולים הביולוגים. כל החלבונים -חלבון. קשרי חלבון-השמר מסייע לנו לחקור קשרי חלבון

-א להבין את הקשרים החלבוניים האלובתא עוברים אינטראקציה עם חלבונים אחרים במהלך החיים, ואחת המטרות הי

האם חלבון אחד הוא מעכב/זרז לאחר, אינטראקציה בין ליגנד לרצפטור וכן הלאה. יש אינטראקציות חלבוניות שהן יציבות,

קציות אחרי תרגום יכמו בנוגדנים, פולימרזות. ויש אינטראקציות זמניות, שהן מבוקרות, כמו בחלבונים אלוסטרים, מודיפ

ועוד.

. Y2H (yeast 2 hybridsystem)נקראת חלבון. היא -לחקור אינטראקציות חלבוןמערכת מיוחדת שפותחה בשמרים נה יש

(, והשני שמאפשר DNA binding domain-BD)נקרא DNA-האחד שמאפשר את הקשירה ל -לגורמי שעתוק יש שני אזורים

ללא קשירה -בין הדומיינים האלו יש אינטראקציה(. transcription activation domain-ADפולימרז ) RNA-את הקשירה ל

גילו את שני הדומיינים האלו )בניסוי שנדבר עליו יותר בהרחבה Gal4לא יתרחש שעתוק. כאשר חקרו את הפקטור שעתוק

בחלק של מוטי(.

36

: כאשר יש חלבון שמעניין אותנו לחקור, מחברים two hybrid-שיטת ה

נקרא נחקרההחלבון גן מדווח.שעתוק ל פקטורשל BD-אותו אל ה

מאפשר לנו לעקוב אחרי הביטוי של הגן )נגיד כי מדווח גן חלבון פיתיון.

הוא משנה את הצבע של התרבית או שהוא מאפשר גדילה על מצע

-חלבון פיתיון קומפלקסהסלקטיבי בלי נויטריינט כלשהו, או שניהם(.

BD קטב את השעתוק. בנוסף ידע היכן להיקשר, אבל הוא לא ידע לא

cDNAומאחים אותו עם AD-לוקחים את ה -עושים עוד היבריד

יה עם ן שאנחנו חושדים שהוא עובר אינטראקצחלבו -לחלבון טרף

החלבון השני שלנו )הפיתיון(. הקומפלקס הזה יודע לשעתק אבל הוא

הטרף תהיה אינטראקציה בין חלבוניהציפייה היא ש .לא יודע היכן

-וה AD-תוביל ליצירה של פקטור שעתוק )יהיה חיבור בין הש, וןפיתיוה

BD .אפשר (, ואז נראה ביטוי של הגנים המדווחים. אם אלו חלבונים שלא עוברים אינטראקציה, לא נראה את הגן המדווח

ון.טרף עם הרבה חלבונים שונים, ולבחון את האינטראקציה שלהם עם חלבון הפיתי-AD-לעשות את ההיבדריד של ה

-. לשם כך עושים שימוש בבאותה רקמהשמתבטא DNA-. זו ספרייה של מכלול כל הexpression libraryהרעיון הוא ליצור

RNAבקצה ה .-RNA יש זנב של פולי-A לכן עושים פריימר של פולי .T שמתחבר אליו, ואז בעזרתreverse transcriptase

ד. המטרה היא לאסוף את כל הגנים שמתבטאים באורגניזם, ולהכניס כל שאותו אפשר להכניס לתוך פלסמי cDNAמסנתזים

, ואז נוכל בקלות לבדוק את האינטראקציה שלהם עם חלבונים Gal4 AD-גן לתוך פלסמיד אחר, כאשר כל גן מחובר ל

.אחרים, תהיה ספריה שונה לכל רקמה )ספרית כבד, ספרית לב וכו'( . מאחר וכל רקמה מבטאת גניםאחרים

. לכן frameshiftברס טרנסקריפטאז עוצר באופן אקראי, אם הוא יעצור באמצע של קודון )שלשת נוקלאוטידים(, יהיה הר

-כן, חייבים לשמור על ספרייה בה ל כמויכנסו במסגרת קריאה לא נכונה. 2/3מהספרייה יבטאו חלבונים אמיתיים, 1/3רק

RNA 5יש כיווניות נכונה של'3 צריך לדעת איך שומרים על אלו(. דבר נוסף לא)טאו חלבונים אמיתיים. יב 1/6, אחרת רק

ם יפורציונליורשנקבל יהיו פ cDNA-שיראה, ועל כן, ה mRNAשלוקחים בחשבון הוא שהפריימר יתפס באופן לא ספציפי לכל

וס אותם, ונצטרך נדיר יותר(, יהיה יותר קשה לתפ mRNA-לגנים שמתבטאים ברקמה. אם יש גנים שמתבטאים פחות )שה

גנים, צריך ספרייה של 20,000נגזר כמה עלינו לסרוק כדי ליצור ספרייה טובה. עבור יותר פלסמידים. מכל השיקולים האלו

כמיליון פלסמידים.

אחד הניסויים שנעשו בשמר היה למפות את כל האינטראקציות הקיימות בין חלבונים של השמר. ביטאו את כל הגנים

. ואז היה ניתן לבדוק את BD-ופעם אחת שהם קשורים ל AD-פעם אחד שהם קשורים ל -לסמידיםהמתבטאים בפ

.Y2Hהאינטראקציות בין כולם בשיטת

-צריכות להיות בגרעין. זה לא יכול להיות על חלבונים ממברנלים או מה Y2H-האינטראקציות החלבוניות במגבלות השיטה:

ERתוקית בעצמם, כי הם יובילו לביטוי של הגן המדווח בכל מקרה. עלהם פעילות שי . השיטה לא מתאימה לחלבוני טרף שיש

. , היא אינה מאוד מדויקתfalse positive-ו false negativeלשיטה יהיו הרבה

הדרוזופילה זבובמודל

שנה. לכך כמה סיבות: 100-דרוזופילה נבחרה כמודל מחקר לפני כ

ד איתה.זו חייה קטנה ופשוטה, שזול לעבו .1

37

אין צורך באישור אתיקה לעבוד איתם. .2

חודשים. אבל הזבוב הבוגר מופיע אחרי 3זמן מחצית החיים של זבוב הוא קצר. זבובים יכולים להאריך ימים עד .3

שבוע.

של -כל פרט מעמיד המון צאצאים. בשילוב עם מחזור חיים קצר, זה מאפשר לגדל אוכלוסיות מאוד גדולות .4

עלינו לזהות מוטציות גנטיות נדירות. ניתן לסקור כמויות עצומות של אורגניזמים בזמן קצר.מיליונים. זה מקל

ם, לפי רצוננו.יקל מאוד להחדיר שינויים גנטי .5

.in vivoקל לנתח את המערכות. קל לעבוד .6

ת. מצעיר עד בוגר. יש להם דיפרנציאציה של רקמו-והשמר, יש להם אורך חיים שלם C.elegance-בהשוואה ל .7

מאפשר לחקור תהליכי התפתחות.

מהגנים שמעורבים במחלות בבני אדם שמורים ברמה מקסימלית לזבוב. מבנה הגנום שמור מאוד לגנום 85%-כ .8

שעתוק -יש להם רק ארבעה כרומוזומים. אבל עם זאת, כל התהליכים הבסיסיים זהים -האנושי, אבל הוא מצומצם

וכן הלאה.

התנהגויות מורכבות. מערכת העצבים שלו יודעת לעשות אינטגרציה של הקלטים זבובים מסוגלים למגוון של .9

מהסביבה ולהבין כי הוא בסכנה, והיא תורה לו לשנות את כיוון התעופה שלו. יש להם התנהגויות חיזור, מושפעים

מאלכוהול, יכולים להתמכר לסמים ועוד.

מעגל החיים של הדרוזופילה:

בוקעת רימה )זו התולעת(, שנקראת לארבה. 24הם מזדווגים ואחרי יש זבוב זכרי ונקבי.

הולכת דם, אויר. הלארבה עוברת שלושה שלבים של -לתולעת כבר יש את כל המערכות

התפתחות והופכת לגולם. לגולם יש שני שלבים התפתחותיים ואז הוא הופך לזבוב. כל

התהליך הזה לוקח כעשרה ימים בממוצע.

סנים בבקבוקים, וכל מסלול ההתפתחות מתקיים באותו בקבוק. במעבדה הם מאוח

כן אפשר(. C. eleganceבתוכו יש את המזון שהם צורכים. לא ניתן להקפיא זבובים )

זה חומר שמרדים אותם, ואז ניתן לעבוד -אפשר להזרים להם פד"ח לתקופה מוגבלת

להפריד אותם, לנתח אותם. -איתם

, ולקשר פנוטיפים שונים על פני הדרוזופילה, להבין איך נראים הומוזיגוטים והטרוזיגוטים ן ויזואליבאופ יש לנו יכולת לזהות

זה מאוד מקל על הניתוח המולקולרי. .אותם למיקומים על כרומוזומים

העין. יש אלפי תת יחידות שמרכיבות את העין. יש מחקר נרחב על ההתפתחות של -למשל בעין של הזבוב. העין היא מורכבת

( ומוטנט אחר עם עיניים W-היא אדומה משום שיש לזבוב פיגמנט ההופך אותה לאדומה. יש מוטנט עם עיניים לבנות )נקרא

בדומה לכך, יש המון מוטציות שנראות כעדשה/בוטן. ויש עוד מוטציות שקשורות עם כל מיני פנוטיפים שונים של העין.

שנותנות ביטוי פנוטיפי בכנפיים.

אזור בגנום שכאשר יש בו מוטציה, הזכרים גילהשנה, מורגן חיפש מוטציות בזבובים שנחשפו למוטגנים. הוא 100-כלפני

שהוא חלק ,הוא רצפטור notch-. בהמשך מתברר כי הnotchמתים, והנקבות הן בעלות כנפיים אכולות. הוא קרא לגן הזה

, יש אירועי חיתוך, שבעקבותיהם פקטורי שעתוק נכנסים לגרעין ממנגנון תקשורת בין תאית. כאשר הוא פוגש רצפטור אחר

תוכניות גנים שחשובות להתמיינות של תאים. יש מספר רב של מחלות שקשורות במוטציות שונות באותו יםומפעיל

ביניהם סוגים שונים של סרטן. אלו מוטציות שקשורות בהפעלת יתר של הרצפטור, ולא בחוסר ביטוי שלו. -הרצפטור

38

מה ניתן ללמוד מזבובים?

תאיים, מולקולרים, ביוכימיים. היום משתמשים -בכל האספקטים -ניתן ללמוד מזבובים בעיקר על גנטיקה התפתחותית

בזבובים כמערכת להבנה של פיסיולוגיה ומחלות. למשל, הגנים הראשונים שנתגלו באוטיזם נתגלו בזבובים.

קצת על ההתפתחות:

ת פוקע כלארבה. כעבור כמה ימים יש את היצור הבוגר. כבר ברמת העובר שעו 24העובר כעבור

. , שכל אחד מהם יתפתח לאזור אחר של הפרט הבוגרמוצאים אזורים מובחנים זה מזה מבחינה תאית

בדרוזופילה, האזורים המובחנים מתחילים כבר בביצית. ניתן לעקוב אחר ההתפתחות העוברית על

בסמן פלורסנטי, שמאפשר לעקוב אחרי הגרעינים. כך ניתן לעקוב אחרי ידי סימון אחד ההיסטונים

נדידה של תאים לאורך ההתפתחות.

בזבוב אבל לא ניתן לעשות ביונקים, שם ההיריון הוא רחמי. אלו פרוצדורות שניתן בקלות לעשות

ת מודל ובעשורים האחרונים הבינו כיצד מביצית מופרית נוצרת כל תבנית הגוף של הבוגר, בזכ

יש קסקדת אירועים של פקטורי שעתוק, שפועלים בצורה גמנטציה.הדרוזופילה. שם ראו את הס

, והם יתמיינו לאיברים היררכית ורוחבית, כדי לייצר אזורים ששונים זה מזה מבחינת זהות התאים

יכוז ומערכות שונות, כתלות במיקום הפיסי שלהם על פני העובר )המיקום הפיסי מכתיב את סוג ור

.הפקטורי שעתוק אליהם יחשפו(

פה רואים את הלארבה. בצבעים השונים סימנו פקטורי שעתוק שונים, שכל אחד משרה התמיינות

למשל -את מגוון אופציות ההתמיינות שמגדילות לסוג אחר של תאים. יש ביניהם אינטראקציות

ם. אדופקטור עם ששולב פקטור כחול ישרה תוכנית שונה מפקטור כחול

תהליכים התפתחותיים בדרוזופילה מופיעים גם ביצורים יותר מתקדמים

אחוריים יםשקשורים בהתמיינות של אזורהם גנים Hox genesאבולציונית.

נמצאים גם בעכברים, ובבני אדם. מעניין שגם והם ,בדרוזופילה וקדמיים

תבהתמיינו הפולריות של הגנים נשמרת בין היצורים. למשל גנים שקשורים

פילה קשורים גם להתפתחות של אזורים מוחיים ולאזורים קדמיים של הדרוז

בעכבר ובאדם.

4-)נוק אאוט של הגן( הוא בעל בית חזה כפול, ו hox genes-זבוב עם מוטציה ב

. ביטוי יתר של אותם גנים יגרום להתפתחות של זבוב ללא 2זוגות כנפיים במקום

ם כלל. בית חזה שלם, ובלי כנפיי

צלעות. נוק אאוט של הגנים האלו מובילים לצלעות נוספות.גורר אובדן של hox genes-בעכברים, ביטוי יתר של ה

. ביטוי יתר קשור בלוקמיה. םוהפני קשורות במלפורמציות שונות של הגפיים hox-בבני אדם, מוטציות של חסר ב

39

בבני אדם יש אנלוג .. בזבובים פגיעה בו מובילה לבקיעה של זבובים בלי כנפייםחשוב גם לסגמנטציה של הזבוב winglessהגן

שחשוב מאוד בתהליך סרטני. מוטציה בו תוביל לסרטן השד. pathway-הוא מקודד לליגנד שהוא חלק מ. wittשלו שנקרא

מרמה שהסתכלנו על גן בודד, אפשר להסתכל באופן מערכתי על פקטורי השעתוק.

ניתן לבחון את הזיקה של פקטורי השעתוק גנום של הדרוזופילה הוא קטן,מאחר וה

םיהם הופכי B-ו Aהפקטורים -יםילמשל שני פקטורים ספציפלאזורים שונים בגנום.

B-לא נקשרים טוב ל A-. אזורים בגנום שנקשרים טוב לבזיקה שלהם לאזורים בגנום

אזורים שונים -hox genes זה תואם את התיאוריה של הסגמנטציה לפיולהיפך.

הם יתמיינו ציאלי לאותם פקטורים, וכךיבטאו גנים שונים כי הם יקשרו באופן דיפרנ

לאיברים שונים.

מהגנום של 24%. רק 70-80%-המשותף בין הגנום של זבובים ובעלי חוליות הוא כ

האלו. בעלי חוליות הוא ייחודי להם. לכן יש חשיבות רבה להבנת הגנום של היצורים

מה ניתן ללמוד מזבובים על ביולוגיה של התא?

myc לא חיים. נמצא כי myc-. עכברים עם נוק אאוט לטנותלא מתפתחות מספיק ונותרות ק mycלארבות עם מוטציות בגן

ט כל , והוא גם אחד האונקוגנים החשובים ביותר, הוא מעורב בכמע)בכל היצורים( הוא אחד האקטיבטורים של גדילת תאים

., וכאשר הוא יוצא משליטה יהיה גידולזה גן שקשור בגדילהסוגי הסרטן.

אחראיות על משק הסוכר והאינסולין PI3קינזות הגדילה של רקמות קשורה במסלול העברת אותות של אינסולין. בזבוב,

רקמה ) מת שומן של הזבובברק רק עשו ביטוי יתר של אותן קינזותכש הן מעורבות בהעברת אותות של אינסולין. בתאים.

שמקבילה לכבד של האדם(, הרקמה גדלה בהרבה ממה שהיא אמורה להיות.

ברמת האורגניזם, זבובים עם מוטציה ברצפטור לאינסולין נולדים קטנים יותר, וזבובים עם פעילות יתר של המסלול נולדים

גדולים יותר.

-אחד הרצפטורים ב) IGF-1-בגודל של כלב נקבע לפי הרצפטור לביונקים, מסלול האינסולין גם קשור בגדילה. ההבדל

pathway גם רלוונטים סלולי אינסוליןמתינוקות לאימהות סכרתיות נולדים גדולים יותר. בבני אדם, (. של אינסולין

התפתחות סרטן.

טים ללא מערכת קצרים יותר. מוטנ םהמחיר שאנו משלמים על הפעלת מסלול האינסולין הוא שהחיים של היצור ה

בעכברים. גם בזבובים ו גם מאריכים חיים יותר. זה נראהולין הם יותר קטנים בגודל, אבל האינס

כשהכנף מתפתחת ברימה, היא מתפתחת מקבוצת תאים . hypo pathwayמסלול בשם המנגנונים ששולטים על גודל איבר:

ורים של המסלול, גודל הדיסק היה מאוד גדול, והסיקו, אחד הרצפטFATעשו מוטציות ברצפטור כקטנה שנקראת דיסק.

הגן הזה חשוב לשמירה על גודל נכון של האיבר. בעכברים, עיכוב של המסלול הזה גורר הגדלה רצינית של הכבד.ש

תחום מחקר אחר שמאוד התפתח מהדרוזופילה הוא התפתחות מערכת העצבים. ניתן להבין על מחלות שונות של מערכת

ממחלות נוירודגנרטיביות, התמכרויות ומחלות נוירופסיכיאטריות. בדרוזופילה גילו גנים שונים -זכות הדרוזופילההעצבים ב

.שקשורים באוטיזם

40

ופוסט שעתוק שעתוק

, אשר זמין לצאת החוצה RNA-, הוא משועתק אל הDNA-מדברת על כך שהמידע הגנטי נמצא ב הדוגמה המרכזית בביולוגיה

בתא הוא לאכסן את המידע הדרוש ליצירת DNA-בוזום אל חלבון. הפונקציה היחידה של היעובר תרגום ברמהגרעין. הוא

חלבון.

DNA-מקודד לחלבון. בעבר חשבו כי כל ה DNA-מה 1%למשל, רק ת עם הדוגמה המרכזית. לא מעט תצפיות לא מסתדרו

אינו RNA-זורים הללו תפקודים. כמו כן, מרבית ההלא מקודד הוא "זבל" שלא נעלם באבולוציה. היום ברור כי יש לא

. בנוסף, ישנם וירוסים שהגנום שלהם אנזימתייםתפקידים רבים, ביניהם תפקידים RNAיש למולקולות מתורגם לחלבון.

. RNA-ב רק , אלא המידע הגנטי היהDNAכלל לא הכילו ניחים כי התאים הפרימורדלים . היום מDNAולא RNAהוא

על חלבונים כעל גולת הכותרת בדוגמה המרכזית התרסקה עקב ראיות אלו. ההסתכלות

דוגמה נוספת שקורסת היום היא זו שטוענת כי בכל תאי גופנו יש בדיוק את אותו הגנום. כאשר החלו ללמוד מערכות

די ליצור את אימונולוגיות, מצאו כי בתאים מסוימים של מערכת החיסון, חלקים בגנום שלהם עוברים רקומבינציה כ

הנוגדנים. לכן כל תא של מערכת החיסון לא זהה לתא הראשוני של הזיגוטה בגוף. היום יש שיטות לריצוף גנום של תאים

. ככל ועוד , טרנסלוקציותdeletionבודדים, וכך יודעים כי לא כל התאים שלנו זהים, ויש שינויים שנוצרים עקב מוטציות,

חשובה לתפקוד של הרקמות. על אף כל זאת, אם ניקח כל תא בגופנו ונרצף אותו, יםראה אותה הטרוגניות בין התאהנ

במאקרו נקבל את אותו הגנום.

למרות שהגנום הוא בגדול אותו הגנום בין התאים, לכל תא בגופנו יש פונקציה אחרת, צורה אחרת ותכונות אחרות. ההסבר

RNAאת האינפורמציה, לא אומרת כי הוא יבטא אותה. כל תא מבטא לכך הוא בקרה על הביטוי הגנטי. העובדה כי לתא יש

שונה וחלבונים אחרים.

ר לברור אילו גנים יבוטאו. אתגר ראשון הוא מתי לבטא ומים שעומדים בפני אותו המנגנון שאאפשר לשאול מהם האתגר

, יבטא גנים של E-coliט כמו חיידק גנים מסוימים. השאלה של 'מתי' לא מתייחסת לזמן אלא לסיטואציה. למשל יצור פשו

ינים שיש בסביבה. לא כדאי לו לבטא את כל הרצפטורים כל הזמן, כי יש לזה ירצפטורים לנויטריינטים בהתאם לסוג הנויטר

עלות אנרגטית גבוהה. הוא צריך לווסת את הביטוי בהתאם לסביבה.

עבור התמיינות לסוגים שונים של רקמות. ההתמיינות נעשית בדוגמא יותר מורכבת של יונק, בזמן ההיריון, תאים צריכים ל

על ידי סיגנלים מהסביבה, וסיגנלים אלו מופרשים על ידי תאים אחרים, שעברו התמיינות. לכן, ההתמיינות מדומה למשחק

אירוע התמיינות אחד קורה עקב אירוע התמיינות אחר בסביבה. -פונג-פינג

לא יקרה", שלא תעלה על המקורות האנרגטים שיש לגוף להשקיע. במקרים רבים, על מערכת זו להית מערכת יחסית "

רבות שלא משועתקות, אלא עוברות מיד דגרגציה. לכאורה זו בזבוז של אנרגיה, אבל בחינה יותר מעמיקה RNA נוצרות מול'

באנרגיה. לכן בסך הכללי יש חסכוןיש תפקיד בבקרה, ו RNAכי לאותו ,מגלה שלא

41

בקרה על -היא לגבי בקרת הביטוי הגנטי. היא גורסת שיש שלבים שונים של בקרה על תהליך הביטוינוספת שנשברה דוגמה

(, בקרה splicing)זה שעבר עיבוד, כמו mRNA -(, בקרה על הDNA-של ה template-)זה שמיוצר בגרעין מה primary RNA-ה

שעבר את התרגום. הבקרה על כל אחד RNA-ה על הפירוק של ההבשל מהגרעין לציטופלסמה, בקר RNA-על היציאה של ה

מהשלבים הללו היא קריטית.

בדוגמה הזו יש שני דברים

לא נכונים. תחילה,

-הדוגמה היא ליניארית

מתחילה בנקודה מסוימת

ומסתיימת בנקודה

מסוימת. עבודות חדשות

הראו כי יש פקטורי בקרה

שמשתתפים בשלבים

-שונים של התהליך

ובעצם יש מולקולות

RNAשעושות פירוק של

וגם את ההרכבה שלו בגרעין. בעצם ההסתכלות החדשה על התהליך היא הסתכלות מעגלית, ולא כזו ליניארית עם התחלה

וסוף. שנית, החלוקה לשלבים היא מלאכותית. בפועל הכל הוא מנגנון אחד רציף, כי פקטורים שמשתתפים בשלבים

בשלבים אחרונים, ויש גם פקטורים שמשתתפים בבקרה בכל שלבי התהליך. מוקדמים משתתפים גם

Machinery- ריות בתא שמבצעות "עבודה". מכונות מולקולRNA polymerase הואmachinery זום. וכזה, וגם הפרוטא

הזה או לא. אוטומטים. אין להם את היכולת הערכית להבין אם צריך לעבוד על התהליך machineryברוב המקרים אלו

machinery-, גם אם התא לא צריך אותו כרגע. מי שמווסת את הRNAהוא יסנתז DNAפולימרז, אם יראה RNA-למשל ה

ומורה לו איפה והיכן לעבוד הם הפקטורי שעתוק והפקטורי תרגום.

Transcription factor- הם הפקטורים שמכוונים את השעתוק. מורים ל-RNA ב פולימרז איזה חלק-DNA .לשעתק

Translation factor- פועלים על הריבוזום, קובעים לו איזה מולקולותRNA .הוא יזהה ויתרגם

Decay factors - קובעים אילו מולקולות יפורקו. -פקטורי פירוק

על יש פקטורים שמשמשים גם כפקטורי שעתוק, גם כפקטורי תרגום וגם כפקטורי פירוק. הקונטקסט הוא זה שמשפיע

כאשר פקטור רכש עוד תפקיד והיה לזה יתרון, התפקיד נשמר. -ההסבר הוא אבולציוני התפקוד של הפקטור.

גנטיביטוי

יש חשיבות רבה להכרת התהליכים הללו אצל אנחנו נלמד את תהליך השעתוק כפי שהוא מתבצע בחיידקים פרוקריוטים.

וגם כי המערכות שם יותר פשוטות כדי להתחיל ולחקור אותם, והן חיידקים, כי הם מהווים חלק אינטגרלי בגוף האדם,

הבסיס למערכות המורכבות יותר ביונקים.

משולה למכונית, שדורשת נהג )פקטורים( כדי שיכווין אותה. RNA polymerase -פולימרז. ה RNAהשעתוק נעשה על ידי

42

כמה מוסכמויות:

RNA-כלומר הרצף שלו יהיה כמעט זהה לחלוטין לרצף ה -א המקודדהגדיל העליון הו, double stranded DNA-ב .1

שנוצר ממנו )לפחות בתהליך השעתוק הראשוני(.

, וכל upstream, נחשב (והפרומוטור '5-. מה הולך שמאלה ממנו, )לכיוון ה+1נקרא בסיס RNA-הבסיס הראשון ב .2

.downstream(, נחשב '3-מה שהולך ימינה ממנו, )לכיוון ה

. 100%-לא ב ן ברוב המקרים, אבל. הוא מקודד למתיונין. עם ההתקדמות בריצוף, גילו שזה נכוstart codonהוא ATGהרצף

אם זו טעות שלא תוקנה או שזה מכווון, כחלק מתהליך אבולציוני? ככל הנראה זה דבר שמקנה יתרון, כשם ההשאלה נשאלת

שכל וריאביליות מקנה יתרון.

והוא מרצף לפי התבנית שלו. template-מזהה גדיל אחד, שהוא הגדיל ה RNA polymerase-ה

לאחר הגיבוש ימרז נכנס ומשעתק את אחד מהם. אבלבעבר חשבו ששני הגדילים נפתחים, והפול

, התברר כי התמונה היא שונה: הגדיל המלופף נפתח באזור DNA-פולימרז עם ה RNA-של ה

כת, והיא מהווה את האתר הפעיל לפעילות האנזימטית. הגדיל של מסוים. באזור הפתוח יש מת

נבנה היכן שהמתכת נמצאת. ברגע שהגדיל מתחיל להתארך, השייר שלו שנוצר זז RNA-ה

אל אזור המתכת DNA-החוצה, והפולימרז והמתכת נשארים במקום. הפולימרז מביא את ה

אוטיד שהגיע הוא נכון מבחינת ליש נוקלאוטידים בודדים. אם הנוקהפעיל, ובסביבה הזו

ההתאמה, המתכת תבצע פעולה קטליטית ויווצר קשר קוולנטי בין הבסיס הנ"ל לבסיס שלפניו.

פולימרז אחד. זאת להבדיל מיצורים RNA( יש רק E.coli-ביצורים פרוקריוטים )כגון ה

פולימרז. RNAאאוקטריוטים שיש להם שלושה סוגים של

פולימרז בתא עסוקות בשעתוק. היתר לא מחוברות כדי שיוכלו להחליף פולימרז שמתנתק. RNA-ממולקולות ה 50%

תת יחידות. באופן מפתיע אין 12תת יחידות. בשמרים )שהם אאוקריוטים( יש לאנזים 5-בפרוקריוטים, האנזים בנוי מ

(. אבל המבנה המרחבי שלהם הוא דימיון רב בין תתי היחידות של האנזים בין הפרוקריוטי והאאוקריוטי )מבחינת הרצף

דווקא כן דומה.

43

פולימרז: RNA-פה ניתן לראות את מבנה ה

נזיום. גהאתר הפעיל הוא באזור המ

תת יחידות, אחת מהן היא יחידה סיגמא. עם סיום השעתוק, 5כאמור יש לו

-ר, יחידת הסיגמא מתנתקת מהאנזים. יש לה תפקיד חשוב במשתחר RNA-כשה

initiation כי זו התת יחידה שיוצרת את המגע הפיסי עם ה-DNA .

בפרוקריוטים (כפי שהוא היום)המודל לשעתוק

( היא קריטית כי היא קובעת מה initiation of transcriptionהתחלת שעתוק )

, RNA-. זה קובע את מסגרת הקריאה, ואת גורל הRNA-של ה '5-יהיה קצה ה

כלומר מה שמוצג במודל קורה ברוב המקרים אבל לא בכולם. -רוע סטטיסטישייוצר. זה אי RNA-ובכלל מה ה

פולימרז בעל יחידת הסיגמא עם RNA-האירוע הראשוני הוא אינטראקציה של ה

בכתום(. המפגש הזה יקבע איפה הפולימרז יתחיל לעבוד. )בציור הסיגמא DNA-ה

של החלבון )הוא בעל לסיגמא יש כמה דומיינים. כל דומיין הוא אזור פונקציונלי

צורה מרחבית מסוימת, מופרדת משאר הדומיניים(.

, ואינו סגור DNA-בו ה Closed promotor complexמחוץ לאזורי הסיגמא יש

.קשור באופן חזק לפולימרז

אינו כל הזמן במצב דו גדילי, יש מידי פעם פתיחה של הגדילים )של DNA-ה

זה נקרא נשימה. אירועים אלו הם סטוכסטים. הקשרים המימניים המחברים אותם(, ו

. אלו A-T-דומיין אחד שמזהה אזורים עשירים בלה תת יחידה הסיגמא מחליטה איפה הקומפלקס החלבוני יקשר. יש

הם אזורים שנושמים יותר בקלות, ולכן יש להם A-T. אזורים של C-Gאזורים בהם יש פחות קשרי מימן מאשר אזורים של

single. לסיגמא יש את היכולת לזהות אזורים של single strandedשם הוא DNA-ה רגעים בהם

strandedעם הקשירה שלו ל .-DNA החד גדילי, הוא מונע מה-DNA לחזור למצב שלdouble

stranded .לא אקראי. זאת ו ילי בנשימה הוא סטטיסטיהזיהוי של הסיגמא את האזור החד גד

)שזה בעצם אזור התחלת השעתוק( double stranded-צף מסוים במפני שלסיגמא יש העדפה לר

בסיסים אחרי אזור תחילת השעתוק. אלו שני האזורים 35ויש לה העדפה לרצף נוסף שנמצא

, אז יש גם יותר A-Tשנתפסים מצידי אזור הסיגמא. מאחר וסטטיסטית יש באזור הזה יותר קשרי

לפולימרז. DNA-ש האירוע של האינטראקציה בין הואז יתרח single strandסיכוי שיהיה שם

44

החד גדילי DNA-לאחר שהסיגמא נקשר אליהם, ה אזורים חד גדיליים הם הרבה יותר גמישים.

לעבר תעלה בתוך הפולימרז שמרוצפת בחומצות אמינו חיובית. הם עוברות אינטראקציה נע

הגיע לאתר הפעיל, היכן )שהוא שלילי(, והוא נתקע בתעלה, ויכול ל DNA-חזקה עם ה

שהמגנזיום.

לאחר מכן, מתחילה הסינתזה. יש בסביבה תעלה נוספת המוליכה נוקלאוטידים חופשיים

המסתובבים באזור. מניחים כי הם נכנסים באופן אקראי, ואם הם מוצאים "שידוך הולם" הם

אירוע נשארים שם מספיק זמן ומתרחשת איניציאציה, אחרת הם יוצאים. מאחר וזה

בסיסים 50בסיס אחרי בסיס. הקצב הוא בערך של -סטטיסטי, יתכנו טעויות. וזה חוזר חלילה

בשנייה.

יש מנגנונים שנועדו לנטר את הטעויות הללו ולתקן אותן. הרעיון של מנגנון מייצר ומנגנון מבקר

שמייצר והשני אחד -שני מנגנוניםיה. ככל הנראה לתא יותר יעיל ליצר הוא נפוץ מאוד בביולוג

מתקן, מאשר לייצר מנגנון אחד שאין בו טעויות.

הגדיל שמתארך נתקע בתוך לשונית בחלל )מסומן בצהוב בציור(, והוא ., נוצר קונפליקטבשרשרת 9-סביב הנוקלאוטיד ה

RNA-הסיגמא מהזה גורם לשרשרת פעילויות ושינויי קונפורמציה, שגורמת לשחרור יחידת דוחף את הלשונית ויוצא החוצה.

בסיסים הראשונים. הפולימרז ממשיך 20-25-פולימרז. בעצם היחידה הזו נמצאת רק בתחילת השעתוק, בעת שעתוק ה

לשעתק בסיס אחרי בסיס, עד אירוע טרמינציה.

לא נשארים אבל דברים כי שניהם תופסים את אותו המקום. RNA-מפריעה לבהתחלה תפקיד הלשונית היה תמוה. היא הרי

הוא "כשר". כאשר RNA-, היא עוזרת לוודא שהRNA-תפקיד בבקרה על איכות ההתברר כי יש לה אכן סתם באבולוציה, ו

תקוע בחלל לזמן מה )כי לא יתרחש יישאר RNA-מתווסף בסיס לא נכון, הוא לא יתקע בלשונית, והוא לא ידחוף אותה. כך ה

(. RNAי ויצא החוצה לפירוק )אירוע זה נקרא "הפלה" של נתק באופן ספונטיתנ , ואז הואפורמציה וכו'(נשינוי הקו

שמשועתקים RNAשל '5-, ניסו לקבוע את הקצה הE.coli-המחקרים הראשונים בהם ניסו להבין את בקרת השעתוק ב

ולם. בעיקר . החוקרים השוו את הגנים שרוצפו וחיפשו אזורים משותפים לכטורובעצם לזהות פרומ-מהרבה מאוד גנים

לאזור השעתוק. upstreamי הבקרה מתרחשים רק ירועלשעתוק, כי הניחו שא upstreamאזורים

45

10א צהחיפושים הללו לא הניבו פרי, לא היה נוקלאוטיד שהופיע יותר בצורה סטטיסטית מאחרים. אבל כן מצאו אזור, שנמ

בסיסים אחורה 25עוד . זה למעשה רצף שמור. טא בוקס()נקרא טא TATTATלשעתוק, שמכיל את הרצף upstreamבסיסים

(upstreamהיה עוד רצף שמור ). ,יכולות להיות סקירה של הרבה מאוד גנים הראתה כי למרות שהאזורים הללו שמורים

מספר מוטציות בטאטא בוקס והוא עדיין יהיה פונקציונלי.

10- עמדות היום מבינים כי

הן העמדות בגן 35- -ו

דת הסיגמא נקשרת שיחי

ביניהם יש את אליהם.

. A-T-האזורים שעשירים ב

בין שבניסויים בהם החליפו את הבסיסים בעמדות הללו, היו שינויים רבים בביטוי של הגנים, אבל אם החליפו את הבסיסים

, לא היו הרבה שינויים בביטוי. לכן הם נכנסים להגדרה של פרומוטור. 35--ו 10-עמדות

, יש אחת שנועדה לזהות את רוב E. coli. אצל , כל אחת מעדיפה רצף אחדהיום שיש כמה סוגים של יחידות סיגמאמצאו

28סיגמא מיוחדים, כמו בל יש יחידות סיגמא אחרות, שמזהות גנים, אשמזהה את הטאטא בוקס( 70)זו סיגמא הגנים

שמבוטאים גנים ו ה גנים שמבוטאים מצבים של אי תנועהשמזה 38סיגמא כימוטוקסינים, אוגנים לגנים לתנועה ו שמזהה

. אבל זה יםהבסיסאם יהיו שינויים בודדים ברצף חשוב להדגיש כי הסיגמא תזהה את אזור הפרומוטור גם. במצבי סטרס

של בביטוי יותר שליטההיה שתהיא , אינו מושלםלזיהוי הסיגמא סיבה לכך שלעיתים הרצף היוריד את הסיכוי שזה יקרה.

הגנים. אם תמיד הרצף היה מושלם, לא ניתן היה להגביל את התהליך. אבל ברגע שההתאמה היא לא מושלמת, צריך שיהיו

עוד פקטורים שיאפשרו את הקשירה, ואת הפקטורים הללו אפשר לבקר בסיגנלים שונים.

פולימרז יכול RNAת. מטפורית, הרכב פולימרז לפעול בסיטואציות שונו RNAהגיוון ביחידות הסיגמא מאפשר תחילה לאותו

את כל הגנים, אלא את הגנים שהסיגמא )הנהג הנוכחי( תכתיב default-כ שעתקלנהוג בכבישים שונים, תלוי בנהג. הוא לא י

, והיא מזהה יותר טוב גנים שקשורים בעקה סביבתית, וכך הפולימרז ישתעק גנים Sלו. למשל, במצבי רעב, פועלת סיגמא

להתמודד עם הרעב, ולא כל גן.שנועדו

לו( היא פולימרז )העובדה כי הספצפיות שלו משתנה בהתאם לתנאי הסביבה והפרטנרים שמוצמדים RNA-המודולריות של ה

ת ביולוגית. כי מאותם "חלקי בניין" ניתן לייצר קומפלקס שיהיו לו מגוון של תפקודים. חסכון אדיר מבחינת מערכ

רכת היא יותר מתוכחמת, כי יש יותר פקטורים שמבקרים את אותו מנגנון, אבל ברמות הבסיסיות, בתאים אאוקריוטים המע

הפרטים הם דומים.

סוגי סיגמא. לא יתכן כי זה מספיק כדי לבקר את הביטוי, כי יש הרבה יותר מצבי 6-7-גנים, ו 3000הוא יצור עם E.coli-ה

. שעתוק , ופה נכנסים הפקטוריות עוד מנגנון לבקרה על ביטויסביבה להתמודד איתם. ולכן ברור כי צריך להי

46

פקטורי שעתוק

פולימרז לאן להגיע, מתי ובאיזו כמות. RNA-ה תמכוונים א

הציעו את המערכת הפשוטה ביותר שנתנה לנו את ההבנה הראשונית כיצד ג'קו ומונו, הראשונים שעבדו על פקטורי שעתוק,

גנים: 3-מורכב מ lac operon-. הlac operon-ם עבדו בתאים פרוקריוטים וחקרו את מנגנון השעתוק. ה מבקריםפקטורים

lacZ, lacY, lacA מסגרות הקריאה האלו מוכרות על ידי פרוטור משותף )הצהוב( והם שרלוונטים לניצול לקטוז מהסביבה .

אחד המכיל את שלושת transcript-מיוצרים כ

מסגרות הקריאה.

operon א מסגרת קריאה בה מאוגדות יחד הו

אחד. אם שלושת הגנים הללו משתתפים באותו RNA-כמה מסגרות קריאה, המבוטאות על ידי פרומוטור אחד ומשועתקות ל

לא זקוק להם בסביבה ענייה E.coli-שכן ה -טא אותם יחד, מנקודת מבט של בקרהמנגנון או קומפלקס חלבוני, יש יתרון לב

מאפיין תאים אחד operonשל כמה מסגרות קריאה תחת ארגון זהשלושתם בסביבה שמכילה לקטוז. בלקטוז וכן זקוק ל

פרוקריוטים.

עניין אותם להבין מה האזור על . lac operon-הם חקרו את הפקטורים שמבקרים את השעתוק של הבניסוי של ג'קו ומונו,

lac-של ה DNA -ה מקטעיאת הם לקחו נקשרים. בשלב הראשון, אליהם הפקטורים והפולימרז lac operon-פני הרצף של ה

operon והגיבו אותם עם ,RNA פולימרז יחד עם הסיגמא. אח"כ הם הוסיפוDNAase1 אנזים שמעכל ,DNA ובחנו מה נשאר

שהיו DNA-. האזורים של האחרי שסילקו אותו

א לא עוכלו מגפולימרז עם הסי RNA-מחוברים ל

האזור שנותר הם היו מוגנים. , DNAase-על ידי ה

זה האזור - RNA polymerase footprintהוא

עד 35-טור )והפרומאליו, והוא שהפולימרז נקשר

-10 .)

פולימרז, RNA-וראו כי הוא מגן על אזור דומה לזה של ה ,repressorעם פקטור שעתוק DNA-הם הגיבו את ה בשלב השני

, ראו כי הוא מגן על אזור מעט יותר cAMP-CAP -ישלישי עשו זאת עם הפקטור השנור. בשלב הטובתחילת הגן וסוף הפרומ

upstream מזה של ה-RNA .פולימרז

RNA-מכך לומדים שיש התנגשות בין הקישור של ה

פולימרז לרפרסור. זה לא מקרי, התברר כי תפקידו של

פולימרז. כאשר הוא RNA-הרפרסור הוא לעצור את ה

מעכב את ו lac operonעל הרצף יושבהוא מבוטא,

פעילות הפולימרז כי הוא לא נותן לו להמשיך להתקדם

בשעתוק.

תוצר פירוק של יהיה כאשר DNA-הרפרסור יתנתק מה

לקטוז בסביבה, וכך בעצם הביטוי של הגנים הללו יתבצע רק הם נחוצים )שיש לקטוז בסביבה(.

47

ר אליו, מתברר כי יש לו רצף מסוים שמיד אחריו מופיע הרצף המשלים כשמסתכלים על הרצף של המקטע שהרפרסור נקש

יכול לקשור את הרפרסור, מה שאומר כי הוא את המחשבה שיתכן כי כל אחד מהגדיליםלו. זה רצף פלינדרומי. זה העלה

יש יתרון אבולציוני. אחד. אפשר לראות כי הפלינדרום לא מושלם, וגם לזה גדילכל חלבון של רפרסור נקשר אל עובד כדימר.

אתרי 2-דימר נקשר יותר טוב ל

קשירה ממונומר לאתר קשירה

אינטראקציות: בין 3אחד, כי יש

, המונומר DNA-מונומר אחד ל

ובין המונומרים DNA-השני ל

עצמם.

היה פקטור . ואילופקטורים שנקשרים כמונומר 2-ה יותר מטובכדימר שני פקטורים אחיזה של -עקרון 'טובים השניים'

היה יותר יציב. מתוך כך יוצא שהבקרה של הרפרסור העובד בדימר היא חזקה יותר מאשר אם היה רפרסור שלישי, זה אפילו

שעובד כמונומר.

טור בנוסף לשני והוא כזה שנקשר לפרומ( cAMP-CAP) אופרטורה

יכול לעבור אינטראקציה עם CAP-נמצא כי ה הפקטורים האחרים.

הוא CAP-לאור עקרון 'טובים השניים' מבינים כי תפקידו של ה הפולימרז.

, וכנ"ל DNA-יש נקודת עיגון ל CAP-לעשות אקטיבציה לפולימרז. ל

לפולימרז. כל אחד מהם מייצב את השני, ולכן הקשירה שלהם גוררת

טור. זה עושה את והגדלה של הזמן שהפולימרז שוהה על הפרומ

מגביר את הסיכוי לשעתוק. האקטיבציה, כי סטטיסטית, זה

זו מולקולת שליח בתוך התא. היא רגישה מאוד .cAMPהוא תלוי CAP-ה

עולה, cAMP-לרמת הגלוקוז בתא. כשרמת הגלוקוז נמוכה, כמות ה

יהיה גבוה במקרים בהם ריכוז הגלוקוז הוא נמוך, ואז יש צורך בניצול של לקטוז. CAPולהפך. לפיכך, הפקטור

דל:סיכום המו

יעדיף גלוקוז על לקטוז אם יש לו אפשרות. E.coli-כעקרון ה

CAP-ולכן ה נמוך cAMP-אם יש גלוקוז בסביבה )ללא לקטוז(, ריכוז ה

lac-אין ביטוי של המעוכב, ובנוסף הרפרסור קשור. כתוצאה מכך

operator .

עדיין cAMP-כאשר יש לקטוז וגלוקוז בסביבה, הרפרסור יעוף, אבל ה

של יהיה מעט מאוד ביטוילכן . lac-, וימנע המון ביטוי של הנמוך יהיה

. lac-ה

CAP-וכך ה cAMP הרבהכאשר הלקטוז נוכח והגלוקוז לא, יהיה

.lac-, וגם הרפרסור לא יהיה, ויהיה הרבה ביטוי של היאוקטב

הוא מידת הלקטוז והגלוקוז. -אפס ועד הרבה( כתלות בסביבה)מ lac operator-מודל מראה שיש סקאלה רחבה לביטוי הה

מסביר תגובה של התא לאינסוף מצבים.

48

אירועי הבקרה הללו הם רק על האיניציאציה. כמובן שיש גם אירועי בקרה על טרמינציה ואלונגציה, ולכן המנגנון הוא הרבה

יותר מסובך.

. זה רפרסור לדיפטריה טוקסין )רעל DtxR-נקשר לפרומוטור כפונקציה של תנאי הסביבה היא הש דוגמא נוספת לפקטור תאי

שמפריש החיידק והורג את המאכסן(, והוא נקשר לפרומוטור רק בנוכחות ברזל. דהיינו, הגן ייוצר רק כשאין ברזל. יש עוד

כמובן הרבה דוגמאות כאלו.

. הקישור הוא DNA-עקרון טובים השניים מאפשר לשני פקטורים להיקשר יחד ל

, שנמצאים הרחק DNA-ב cis elements-יש אפשרות לסמוך פיסית. אבל

להשפיע על פעילות הפולימרז. ומוטור, לשמש כתבנית לפקטורים וכךמהפר

. בגישות גנטיות, glnAברמות נמוכות של חנקן משועתק גן שנקרא -דוגמא

, לפרומוטור upstreamבסיסים 140חוקרים זיהו אלמנטים שנמצאים

חלבונים )טרנס אלמנט( 2ים לאותם אלמנטים נקשר. ושמשפיעים על השעתוק

כטטרמר, והם משפיעים על הפולימרז גם דרך עקרון טובים השניים )כלומר מגע

כעל DNA. אנחנו רגילים לחשוב על פיסי שיוצר אינטראקציה עם הפולימרז(

מולקולה ליניארית, אבל בפועל היא מולקולה גמישה שנמצאת במצב מקופל

ש אזורים שרחוקים מבחינת רצף הבסיסים, שיכולים למצוא את ומסובב. לכן י

.DNA-, בזכות לופ בעצמם קרובים מבחינה מרחבית

חלבוני הטרנס אלמנט מייצרים קשר עם הפולימרז וגורמים לו לשהות יותר זמן

מקדמים שעתוק. הקשירה של החלבונים אל הפולימרז , וכך הםDNA-על פני ה

וסטטיסטית, לא DNA-מוצאים כי לולא הפקטורי שעתוק, הפולימרז לא ישהה מספיק זמן על ה .ATPדורשת הידרוליזה של

יהיה שעתוק.

ון שמונע את הלופ . כך למשל אם יגיע חלבglnA, אפשר לעשות עוד בקרה על ביטוי הגן DNA-על ידי רגולציה של הקיפול של ה

ה רפרסור. יה של האינהנסור עם הפולימרז, הוא יהווצקשנחוץ לאינטרא

עצמו גם משחק תפקיד ביצירה של הלופ, כי רק רצף נכון יאפשר יצירה של לופ. DNA-רצף ה

בתאים פרוקריוטים: קלסיפיקציה של פקטורי שעתוק

אקטיבציה ועיכוב. שתי הזרועות הללו מתפקדות בו זמנית ברוב המקרים. לכאורה זה מוזר, -לבקרה יש לפחות שתי זרועות

רצה בו זמנית גם עיכוב וגם אקטיבציה. אבל זה מקנה בקרה יותר מפוכחת, כי על ידי שינוי קטן בקישור של כל שפרומוטור י

לא מעט מדי ולא יותר מדי, בהתאם לתנאי הסביבה שמשתנים כל הזמן. -אחד מהם, ניתן לקבל את מידת השעתוק הרצויה

הרבה קומפלקסים מכילים גם אקטיבטורים וגם רפרסורים מחוברים פיסית.

49

ציינו קודם שלאחר התחלת השעתוק יש אירועי בקרה על אלונגציה וטרמינציה. כאשר הפולימרז מגיע לסוף מסגרת הקריאה

ת דומים לזו של יש אירוע טרמינציה. הבקרה על טרמינציה מורכבת לא פחות מזו שעל האיניציאציה, וחולקת עקרונו

האיניציאציה.

, A-בהרבה גנים, הטרמינציה מתרחשת באזורים מוגדרים שעשירים ב

יודע לעשות ברגע שהוא משועתק . רצף זה, G-ו C-עשיר בשלפניהם יש רצף

אינו יציב, U-ל A-. הקישור בין הU-ל Aלופ. תחילת הלופ הוא בקשר בין

. transcript-וזה גורם לשחרור של ה

על תרי טרמינציה מצויים גם באזורים שלא היינו מצפים למצוא אותםא

היא שכך ניתן לבקר טוב אמצע האופרון ובתחילתו. הסיבהב -פני האופרון

פקטורים ישיותר את השעתוק, ולהפסיק באמצע שעתוק שאינו רצוי.

רצוי, הם יעצרו אירוע כן , ובמידה והשעתוק הוא שמונעים טרמינציה

. transcript-אמצע הטרמינציה ב

סיכום בקרת שעתוק בפרוקריוטים:

פולימרז אחד. תת יחידות הסיגמא קובעות את מיקום התחלת השעתוק, ויש להן ספציפיות לגנים שונים. פקטורי RNAישנו

שעתוק משמשים כאקטיבטורים ורפרסורים. במקרים רבים אקטיבטורים יכולים להפוך לרפרסורים, ולהיפך.

נקשר לריבוזום עוד במהלך השעתוק. transcript-תוק מצומד לתרגום, והרבה פעמים ההשע

בקרת שעתוק בתאים אאוקריוטים

השעתוק באאוקריוטים הוא מורכב יותר מהשעתוק בפרוקריוטים, אבל השפה היא אותה השפה.

מבנה סכמטי של פרומוטור

אאוקריוטי:

פולימרז. הוא RNA-בצהוב יש את ה

יותר מהפולימרז מורכב

תת יחידות. 12הפרוקריוטי. יש לו

יש רצף שמסמן את תחילת

בוקס, רק TATAהפרומוטור, כמו

שהרצף הוא מורכב יותר וכולל גם

50

הוא מחליף את הסיגמא ולפולימרז. TATA box-שנקשר ל TAFs2D -יש קומפלקס חלבוני)בתכלת(. DPEורצף Inrרצף

)מסומן בכחול כהה(.

. TAF2D-למטה יש פקטור שעתוק שעושה אקטיבציה. הוא נקשר לאלמנט ציס. הוא יכול לעבור אינטראקציה עם הבאדום

הוא משפיע על שעתוק על פי עקרון טובים השניים. אפשר לראות כי יש עוד אקטיבטור שנמצא רחוק מהפרומוטור )אדום

-coחלבון מתווך )החלבון הכחול הכהה שנקרא למעלה(, והוא עושה את אותה העבודה של אקטיבציה, אבל באמצעות

regulator complex .)כמו שצוין קודם, הפקטורי שעתוק מאריכים את הזמן של הפולימרז על ה-DNA ולכן מגדילים את

DNA-י, ולכן הארכת הזמן של הפולימרז על היסטהסיכוי שיתרחש שעתוק. שעתוק הוא אירוע סטטיסטי ולא דטרמינ

RNA-, לDNA-י שהשעתוק יצא לפועל. בנוסף, הפקטורי שעתוק עושים פעולות נוספות כמו מודיפיקציות למגדילה את הסיכו

וגם לפולימרז.

כרוך סביב -האאוקריוטי נמצא במבנה של כרומטין DNA-יש גם אלמנטים של נוקלאוזום וכרומטין )ירוק וכתום למעלה(. ה

נרחיב על זה בהמשך. היסטונים, ולכן צריך להתמודד איתם בעת השעתוק.

טיבים )שמרים ופטריות(. ישל יונקים ושל יצורים יותר פרימ -פה רואים פרומוטורים אאוקריוטים קלאסים

upstream)בצהוב(. כלומר הוא יכול להיות הרבה יותר TATAיש רצף -90מיקום בשמר הפרומוטור הוא יחסית פשוט. ב

בהשוואה לחיידק.

upstreamאלמנטים שעושים הגברה לשעתוק )אינהנסורים( )זה בכתום(. האלמנטים יכולים להיות גם אצל יונקים, מוצאים

( והוא עדיין '5'3-לפרומוטור, ואפילו בתוך הגן עצמו. מצאו כי ניתן גם לקרוא את האלמנט הפוך )מ downstreamוגם

, DNA-האינהנסור, הפכו אותו, וסגרו שוב את ה יעבוד, אם כי פחות ביעילות )לקחו אקסונוקלאזות שיחתכו את הרצף של

ועדיין הם עשו הגברה לשעתוק(.

, מצאו כי תחילת השעתוק היא גם אירוע סטטיסטי. הרעיון deep sequencingכשעשו אנליזה לכל הגנום בשיטות של

טור. ואזור של הפרומ ששעתוק תמיד מתחיל בפרומוטור הגיע מכך שבניסויים רבים שעשו מצאו כי השעתוק מתחיל באותו

לאזור שאנו מכנים פרומוטור, אבל זה downstream-ו upstreamאבל בפועל זה אירוע סטטיסטי, ושעתוק יכול להתחיל גם

קורה בשכיחות הרבה יותר נמוכה )אפסית כמעט אל מול השכיחות בה השעתוק מתחיל בפרומוטור(.

51

מעגל השעתוק:

-pre-initiation complexההתחלה היא בהרכבה של החלוקה לשלבים היא מלאכותית.

DNA-זה הפולימרז עם הקומפלקס המקביל לסיגמא והפקטורים הרלוונטים. בזמן זה, ה

-. השלב הבא הוא הפתיחה של הclosed promotor complexעוד סגור, ולכן הוא נקרא

DNAשלב זה מאפשר את החדירה של ה .-template ולימרז. אל תוך האתר הפעיל בפ

מהווה את שלב האיניציאציה. עם ההתווספות RNA-כניסת הנוקלאוטיד הראשון של ה

downל הפולימרז מהפרומוטור, והוא ילךבסיסים נוספים, יהיה פינוי ש 15-30של

stream .ל לאחר מכן יש אלונגציה עד לשלב הטבעי שהפקטורים שהיו אחראים על ייצוב הפולימרז נשארים מאחור. אל הגן

שנוצר יהיה תקין. אם הוא לא RNA-. זאת כדי לוודא שהמהאיניציאציהשלב זה הוא מבוקר מאוד, אפילו יותר . RNA-ה

)לא RNA-של ה '3-השלב הבא הוא קביעת קצה ה. נופל( RNA-מהמקרים ה 90%-)משערים כי ב תקין הוא יעבור דגרגציה

-במקום מוגדר ומוסיפים קטעים של פולי RNA-ורים שחותכים את ה. זה לא נעשה על ידי הפולימרז אלא על ידי פקטבסכמה(

Aמעגל מתחיל מחדש. . לבסוף יש טרמינציה וה

בדומה לניסויים שראינו בפרוקריוטים, גם פה ניסו עשו ניסוים רבים בהם ריצפו את אזור הפרומוטור של הרבה מאוד גנים,

שונים . כשבחנו את השכיחות של ארבעת הבסיסים במיקומים אכדי לחפש רצף שיכול להוות רצף הכרה ליחידות הסיגמ

. TATAAAרצף השכיח הוא בפרומוטור, מצאו שפה ה

חוקרים ניסו להבין מה החלק בפרומוטור שהוא הקריטי

זה גן -לבקרה על הביטוי. הם חיברו את הפרומוטור לגן מדווח

יו )כמו צבע(, ולכן לדעת מתי שמוציא תוצר שניתן לעקוב אחר

מתבטא. אז הם עשו מוטציות קטנות באזורים שונים על הגן

פני הפרומוטור, ומצאו כי מוטציות באזורים מסוימים השפיעו

הרבה על הביטוי, בעוד שמוטציות אחרות לא )איפה שיש +++

ללא התערבות. איפה שיש פחות + -הביטוי היה כמו בקונטרול

אזורים 3 הייתה השפעה(. בסוף הגיעו למסקנה כי יש –או

ים על הפרומוטור שמשפיעים על השעתוק, ואלו אזורים יקריט

שקושרים את הפקטורי שעתוק.

DNaseהיה שילוב של כמה שיטות. שיטה אחת היא כיצד גילו את פקטורי השעתוק?

protection assay- ט של תאים והוציאו את כל החלבונים. הם קחוקרים לקחו אקסטר

יה בה יש צקהפר בשיטות שונות של כרומוטוגרפיה, וחיפשו אתהפרידו את החלבונים

לזמן מאוד קצר כדי DNaseם ערום ועיכלו אותו ע DNA לקחואת הפקטור שעתוק.

השבור לפרקציות, ושוב הוסיפו DNA-הם הוסיפו את ה לשבור אותו לרצפים קצרים.

DNAase . ג'ל של הריצו את הפרקציות בג'להם(DNA )וחיפשו היכן יש ולא של חלבון ,

52

-לא יוכל לחתוך את ה DNase-, מתוך מחשבה שכאשר פקטור שעתוק יהיה נוכח, הDNase-מקטעים שלא נשברו על ידי ה

DNA .באותה הנקודה, כי הפקטור מגן עליו

ם שבור באורכי DNAשלא נשבר, והבנדים שרצו הם מקטעים של DNAבכל הפרקציות, הבנד העבה בהתחלה של הג'ל מייצג

, שם יש בנדים חסרים. 9-12. הפקטורי שעתוק היו בפרקציות , עד כמה נוקלאוטידים בודדיםהולכים ויורדים

ומוסיפים לו את הפקטור שעתוק, ואז מריצים אותו בג'ל. השבור והערום, DNA את . לוקחיםgel shiftטכניקה אחרת היא

DNA ר שעתוק הוא ירוץ לאט יותר, וזה הללא כלום ירוץ ללא בעיה, אבל כאשר הוא קשור לפקטו-gel shift זה מוכיח כי יש .

ולא חלבון אחר DNA-. כדי לוודא שהאכן הפקטור שעתוק הוא החלבון הקשור לDNA-קשירה בין הפקטור שעתוק ל

super-למה שיוביל -את נוגדן מוסיפים לג'ל, והוא יקשר אל החלבון ויאט עוד יותר את הריצה של הבנדמשתמשים בנוגדן.

shift.

של מוטציה מספר מוטציות בודדות בגן. הפקטור נקשר. לשם כך עושים DNA-זור ביתרה מכך, ניתן לדעת בדיוק לאיזה א

יעלם. gel shift-וה DNA-לבטל את הקישור בין הפקטור שעתוק ל בסיס אחד באתר הקושר, צפויה

General transcription factors – לא חשוב השמות כל כך, יש רשימה של כמה פקטורי שעתוק כלליםוטים, באאוקרי(

(, שהם מדמים את הסיגמא בפרוקריוטים. בקריסטלוגרפיה אפשר לראות שהם נקשרים אל הפולימרז ויוצרים TF2Dלמעט

יה. לשם כך יש אותם פקטורים כללים לא מספיקים כדי לייצב את הפולימרז במקומו ולייצר איניציאצ. DNA-קומפלקס על ה

. transcription activatorsפקטורים ספציפיים שנקראים

. )שהוא פקטור שעתוק( Gal4עבדו עם החלבון בו בניסוי שבשמרים כמה עקרונות חשובים של פעילות פקטורי שעתוק התגלו

לגן Upstreamים. או דברים אחר RNA-מבלי לבחון את ה מידת השעתוק( שמאפשר לעקוב אחרי LacZלקחו גן מדווח )

Gal4 -הרצף בסיסים ש ,TATA box-המדווח שמו פרומוטור, שמכיל מעבר ל

. (GALUAS)נקשר אליהם כדי להפעיל את השעתוק

53

Gal4החוקרים רצו לבדוק מהם הדומיינים בחלבון

שאחראים על שעתוק.

2 , ובדקוGal-הם עשו מוטציות באזורים שונים על פני הגן ל

, וגם את הקישור השעתוק של הגן המדווחדת מיאת -דברים

הם ראו שמוטציות באזורים .על הפרומוטור UASלרצף

ם מנעה את הקישור, ואז גם לא נצפה שעתוק. יספציפי

מוטציות באזורים אחרים אפשרה את הקישור, אבל עדיין

מנעה את השעתוק.

הוא חיוני לאקטיבציה, אבל DNA-המסקנה היא שהקישור ל

bindingצריך אזור באמצעותו יקשר ) Gal-ה -יקאינו מספ

site( ואזור אחר באמצעותו יאקטב )activating site.)

עוברים על הפרדה בין שני הדומיינים האלו. חייב להיות ביניהם מגע פיסי כדי שהפקטור יפעל. two-hybrid-ב

גם יש שותפת להרבה פקטורי שעתוק.הרעיון של חלוקה לשני הדומיינים האלו מ

יות למשל דומיין אחד מכל יכולים לה -ר אחד לשנישונות בכמות הדומיינים מפקטו

. על פני הרצף של הגן יכול להשתנות, והסדר ביניהם AD 2-ואחד BD אחד, או

איך יוצרים מגוון גדול באפשרויות הרגולציה על השעתוק, שיאפשר הגבה להמון מצבי סביבה?

2, רואים את הפולימרזTTRכשבוחנים את אזור הפרומוטור לגן וד של פקטורי שעתוק על אותו גן. מגוון גדול מא -גישה אחת

אתרים קושרי פקטורי שעתוק שנמצאים בסמיכות 6טור המסוים הזה יש וקשור עם הרבה מאוד פקטורי שעתוק. בפרומ

DNA-מאחר וה. האיניציאציהמאזור בסיסים 2000-אזורים קושרים פקטורי שעתוק במרחק של כ 4לתחילת השעתוק, ועוד

AD-ו BDאזורים יכולים להיות פיסית קרובים לאזור הקשירה של הפולימרז )כל אחד עם 4הוא גמיש ויכול להתקפל, אותם

ון של כל כך הרבה כל החלבונים האלו יוצרים קומפלקס יציב מאוד, שמאפשר לפולימרז להתחיל שעתוק. היתראחד(.

(, וזה מאפשר לתאים להגיב 5-10%שזה מאפשר לכייל את מידת השעתוק ברזולוציה די גבוהה )עד א פקטורי שעתוק הו

את הסיכוי 5%-להרבה מצבי סביבה משתנים. למשל אם פקטור אחד יעוכב כרגע בגלל תנאי סביבה, סטטיסטית זה יקטין ב

לייצר DNA-של הפולימרז לשהות מספיק זמן על ה

, 5%-מופחת ב שעתוק. ובממוצע נקבל שעתוק

ולעיתים זה יכול להיות משמעותי בתגובה.

מודיפיקציות שיכולות למנוע את הקישור של

פקטור שעתוק לפרומוטור הן למשל פוספורילציה

של הפקטור )זה הופך אותו לשלילי ואז הוא נדחה

.DNA-( או פוספורילציה של הDNA-על ידי ה

54

שר להגיע למגוון רחב יותר של רגולציות עם מספר מועט של פקטורי שעתוק אפה של פקטורים. קנטורייבקומ -גישה נוספת

הצהוב, כחול וירוק. כל אחד נקשר לרצף מוגדר -כמו בדוגמא לעיל(. בדוגמא הבאה יש שלושה פקטורי שעתוק 10)לא

טורים יכול לייצר , והקשירה היא בצורה של דימרים )בגלל עקרון טובים השניים(. כל אחד מהפקDNA-וספציפי על פני ה

הומודימר )קשירה של שני מונומרים זהים( והטרודימר

)קשירה של שני מונומרים שונים(, וזה מאפשר יצירה

דימרים שונים. יש דימרים שמועדפים מבחינת 6של

יציבות על פני האחרים, ולכן כל קומבינצית דימר תתן

מידת שעתוק מעט שונה. אם מוסיפים על זה את

ת על הפקטורים )כדימר עשות מודיפיקציוהאפשרות ל

( זה מרחיב עוד יותר את מידת הגיוון. וככל או מונומר

קטורים, ניתן לייצר עוד ועוד שעולים במספר הפ

נציות. יבקומ

ישנו את הפקטור האדום, שיכול -(b-דוגמא נוספת )ב

וא פקטור אדום הלהיקשר לפקטור הצהוב בלבד )ה

. לכן הפקטור האדום DNA-ן(. כאשר האדום נקשר לצהוב, הוא מונע ממנו להיקשר אל האלא לחלבו DNA-שלא נקשר ל

הומודימר ירוק וכחול, -דימרים של אקטיבציה 3כי הוא לא ישפיע על fine tuning-ישמש כמעכב, אבל העיכוב יהיה ב

ירוק.-והטרודימר כחול

כמה סוגים של עיכוב:

, BDהאדום הוא רפרסור. לשניהם יש עיכוב תחרותי: הירוק הוא אקטיבטור, -

. אפשר DNA-הרצף באותו . שניהם מתחרים על הקישור אל ADורק לירוק יש

כמו ADסור לאקטיבטור, אם מוסיפים לו פרבצורה מלאכותית להפוך את הר

שיש באקטיבטור הירוק.

עיכוב ע"י אינטראקציה בין הפקטורים: ברגע שהאדום נקשר אל הירוק הוא -

ל שעתוק. עפומונע ממנו לש AD-החוסם לו

אינטראקציה עם פקטורי שעתוק כללים: הרפרסור עובד בדומה לאקטיבטור. -

)שהוא פקטור שעתוק כללי( ומפעיל אותו. אם TF2Dאקטיבטור לרוב נקשר אל

, הוא מונע ממנו לתפקד. TF2D -הרפרסור נקשר אל ה

ן בזמן. אם התא צריך מה היתרון של הצימוד בין מעכב לאקטיבטור? זה חסכו

עכשיו לייצר אקטיבטור בהינתן סינגל, זה יקח לו הרבה יותר זמן מאשר להסיר

את המעכב על ידי מודיפיקציה פשוטה.

עטוף היסטונים DNAהשעתוק על פני

עטוף בהיסטונים בצורה של כרומטין. היחידה הבסיסית היא DNA-ערום. אבל בתא, ב DNAעד כה עסקנו בשעתוק

מתלפפת סביב קומפלקס היסטון אחד, במרווחים יחסית קבועים. אחת התכונות DNAקלאוזום, בה כמות קבועה של הנו

הייחודיות של ההיסטונים היא שהם מאוד חיוביים )יש להם אחוזים גבוהים של ליזין וארגינין( והם מאוד מאוד שמורים.

55

תר קשיחה, ואזורי זנב תת יחידות. יש להיסטון ליבה יו 8-ההיסטונים בנויים מ

אמיני שהם אלו שבאינטראקציה עם הסביבה החיצונית.

30nmהנוקלאוזומים מתארגנים בצורה מאוד ספציפית, גם מלופפת שנקראת

כרומטין. על זה יש שני ליפופים נוספים ליצור את הכרומוזום.

בעת שעתוק בתא, צריך לפרום את הנוקלאוזומים. התא מנצל את הקושי של

הפולימרז להתגבר על המחסומים האלו לצורכי בקרה.

כרומטין(. -הכרומטין מאורגן בצורה דחוסה יותר )הטרוכרומטין( או פחות )יו

RNA אזורים של ה נים האחרים כלל לא יכולים לגשת אלפולימרז והחלבו

הטרוכרומטין. אחד התפקידים המרכזיים של פקטור שעתוק הוא לקחת

גישה לפולימרז ושאר החלבונים. אותו כדי לאפשרכרומטין דחוס ולפתוח

יודעים לסלק לגמרי הם. chromatin remodelersנקראים פקטורים אלו

assembly-בוקס, וכל אזור ה TATAנוקלאוזומים מאזורי בקרה עיקריים, כמו

ים ערום. יש גנ DNA-עתוק, ולהותיר את הפולימרז בתחילת הש RNA-של ה

, אלא הוא באופן רגיל לא מצוי בנוקולאוזום עתוקבהם אזור תחילת הש

. במרווחים בין נוקלאוזומים

ברגע שהפולימרז ממשיך את האלונגציה, הוא יתקל בנוקלאוזומים והוא

יצטרך להסיר אותם או לשנות אותם.

של גנים משתנה בין ים הראשונים שהצביעו על כך שהכרומטין יאחד הניסו

החוקרים לקחו תאים בהם אים את הגנים האלו:אם הם מבטתאים, כתלות ב

יש גן כלשהו שמתבטא ותאים אחרים בהם אותו הגן מושתק. הם הוסיפו

מעדיף לחתוך DNase-לפרקי זמן משתנים. ה DNaseלגרעינים של התאים

DNA כלומר ללא חלבונים(DNA )לאחר סילוק הלא דחוס .-DNase הוציאו

הערום, אותו חתכו עם DNA-את האת כל החלבונים מהתמיסה ולקחו

. בסוג הריצו בג'ל. אותו התקבל פרגמנט באורך ידועש יה כךאנזימי רסטריקצ

מייצג DNaseהראשון של התאים, בו הגן כן מתבטא, הזמן של האפס דקות

בסיסים. ואז ככל 4000-את הביקורת, בה הפרגמנט היה שלם ורץ לכל אורך ה

נט הזה התקצר. בסוג השני של התאים, היה יותר זמן, הפרגמ DNase-שה

לא קיצר את הפרגמנט, וזאת כי הוא היה DNase-בהם הגן לא מתבטא, ה

דחוס בכרומטין.

56

חר של . סוג א(DPN) סוג אחד הוא כזה שאין בו נוקלאוזום באופן קבוע -יש שני סוגים של פרומוטורים שאקטיבים בשעתוק

. מצאו (OPN) נוקלאוזומים )המיקום של הנוקלאוזום אינו קבוע בפרומוטור אלא אקראי(הם כאלו שכן יש בהם פרומוטורים

טא באופן קבוע. ולעומת זאת, ן קבוע הם כאלו ששייכים לגנים שהתא מבערומים מנוקלאוזומים באופ יםרומוטורכי פ

הביטוי שלהם מותנה בכך ואז טורים שכן עטופים בנוקלאוזומים הם כאלו שמתבטאים בתנאי סביבה מסוימים. הפרומו

שסיגנל חיצוני יוביל לפתיחת הנוקלאוזום )ע"י פקטורי שעתוק(.

הסילוק של הנוקלאוזומים:

מנגנון הוא לקשור שני חלבונים יש כמה מנגנונים שמעורבים בסילוק של נוקלאוזומים.

145בסיסים(. כדי ליצור נוקלאוזום צריך 130-, במרחק קצר יחסית )כDNA-אל ה

סים, ולכן באזור זה לא יוכל להיווצר נוקלאוזום. בסי

בין שני נוקלאוזומים כשיש נוקלאוזום, עדיין יכול סטטיסטית יכול להתרחש שעתוק.

יכול לנוע באופן דיפוזי ימינה , שזה אזור יחסית חשוף. הנוקלאוזוםlinkerנמצא

ום אתר קשירה בתוך הנוקלאוזום הוא קריטימיק שהיו מוסתרים בתוך הנוקלאוזום. BDושמאלה, וכך לחשוף מקטעי

. אם האתר קשירה נמצא בקצה הנוקלאוזום, תזוזה קטנה שלו תחשוף את האתר, אבל אם להסתברות שהשעתוק יתרחש

ביר.הוא במרכז הנוקלאוזום, יהיה צורך בתזוזה רצינית של הנוקלאוזום, וזה כבר הסתברותית פחות ס

ייד באופן חופשי ללא צורך באנרגיה, יש גם אנזימים שיכולים באופן אקטיבי לשנות את אוזום יכול להתנמעבר לכך שהנוקל

יש אנזימים שיכולים לקחת את כל )זה בהשקעת אנרגיה(. DNA-מיקום הנוקלאוזום והמבנה שלו, והקשר של ההיסטונים ל

. histone chaperonsאחד לאחד. הם נקראים DNA-ההיסטונים של הנוקלאוזום ולהעביר אותם מ

chromatinמנגנון שלישי מטפל במקרים בהם האתר קשירה נמצא באמצע הנוקלאוזום, מאוד לא חשוף. יש אנזימים )

remodelers) שמתערבים בקשר בין ה-DNA כך היסטונים. קשר זה הוא לרוב הדוק ולה-DNA נו גלוי לחלבונים שנמצאים אי

כך שהאתר קשירה לא ממש צמוד אל ההיסטון, ואז הוא חשוף אל מחלישים את הקשר הזה, אותם חלבונים בסביבה.

תזוזה של הנוקלאוזום )בניגוד למנגנונים האחרים(.קטורים בסביבה. זה מנגנון בו אין פ

( הם chromatin remodelers-לפקטורי שעתוק יש פעולת שרשרת, ולכן אם הם הצליחו להשתחל לאזור דחוס )עקב פעולת ה

זורים בסביבתם לצורך השעתוק. יוכלו לפתוח את הא

חוצה. זנבות ההיסטונים יכולים לעבור נמצא בחלק הפנימי, והזנב שפונה הכאמור, להיסטונים יש את החלק הליבתי ש

אינטראקציה בינם לבין עצמם וכך להשפיע על הארגון המרחבי של ההיסטונים. הם יכולים ליצור כרומטין דחוס או לא

להשפיע על זנבות ההיסטונים )באמצעות מודיפיקציות(, כך היא DNA-השפיע על הפתיחה של הדרך נוספת לדחוס. לכן,

אלטרנטיבה אחרת ממודיפיקציות היא שימוש בחלבונים שיהוו תחרות לקשר בין הזנבות. .יחלשו ניהםשהאינטראקציות בי

עם זנב אחר.אם יהיה חלבון שיקשר אל אחד הזנבות, הוא ימנע מאותו זנב ליצור אינטראקציה

57

בין המודיפיקציות שעל זנבות ההיסטונים

טילציות, ילציות, אצנמצא מת

. גם החלק הליבתי טינציה )ועוד(ייוביקוו

של ההיסטון יכול לעבור מודיפיקציות,

אבל זה פחות שכיח. מאמינים כי גם

ההשפעה של מודיפיקציה בחלק הליבתי

היא פחות משמעותית מההשפעה של

בזנב. שתי המודיפיקציות מודיפיקציה

ן שכדאי לזכור הם מתילציה על ליזי

טילציה על ליזין ואצטילציה על ליזין. אצ

מנטרלת את המטען החיובי שלו, וכך הזנב

)לכן לאחר DNA-נקשר פחות חזק אל ה

יותר חשוף לפקטורי DNA-אצטילציה ה

טילציה )הוא לא יזהה היסטון שעבר ציה של אצות היסטון שעבר מודיפיקשעתוק(. חלבון בשם ברומודומיין יודע לזה

.DNA-לציה הוא יסייע עוד בפתיחה של היטלבון זה נקשר אל ההיסטון לאחר אצאם ח מתילציה(.

ר שעבין יודע לזהות היסטון ימתילציה על ליזין גם מנטרלת את המטען אבל באופן פחות חזק. חלבון בשם כרומודומ

לחלבונים . מוטציות בגנים DNA-, ולהגביר את פתיחת הלציה על היסטון(יטזהה אצקציה של מתילציה )אבל לא ימודיפי

שמזהים את המודיפיקציות האלו יכולות לגרום לסרטן.

קציות על ההיסטונים וביטוי גנים. יחוקרים ניסו למצוא קשר בין סוגי המודיפ

אין אזורי כרומטין בהם ב, מצאו כי H3כאשר בחנו באופן ספציפי את הזנב של

מודיפיקציות על אותו הזנב, הגנים מושתקים ולא מתבטאים כלל. לעומת זאת

, הובילה לביטוי נרחב של 14כרומטין עם מודיפיקציה של אצטילציה בעמדה

הובילה לתזוזה של 9לציה בעמדה יטגן. לעומת זאת, מודיפיקציה של אצה

עשה על פני כל היסטון. ועבור כל מודיפיקציה נמצאה תגובה שונה. דבר זה נ

ההיסטונים, והתגלה כי ישנו קוד של היסטונים, שהוא קוד נוסף על פני הקוד

הגנטי וקודים אחרים בתא, והוא חשוב לביטוי גנים.

הנוקלאוזום הראשון, וזנבות ההיסטונים בו, חשובים לבקרה של תחילת השעתוק.

TF2D- ציאת אתר תחילת השעתוק ללוגי לסיגמא באאוקריוטים, שאחראי על מהקומפלקס האנ-RNA פולימרז. הוא מורכב

, הוא TATA-מזהה את ה TF2D-. לאחר שהTATA-שנקשר אל ה TATA binding proteinמכמה חלבונים, אחד מהם הוא

לאזור תחילת downstreamפולימרז, ואז עושה מודיפיקציה על היסטון שנמצא נוקלאוזום אחד RNA-קושר את ה

עובד בשיטה של טובים TF2Dיודע לזהות. הקומפלקס TF2D-ות ההיסטונים שלו מכיל קומפוננטות שההשעתוק. אחד מזנב

השניים, וקושר אליו כמה חלבונים נוספים, מה שמייצב את הקומפלקס במקום ליותר זמן. מתברר כי פגיעה בזנב של

השעתוק פחות זמן )ולכן גם הפולימרז ישהה באתר התחלת TF2Dההיסטון בנוקלאוזום הראשון, תוביל לכך שהקומפלקס

אוזום הראשון משמש ית. למעשה הזנב של ההיסטון בנוקלישהה שם פחות זמן(, והשעתוק יהיה פחות סביר סטטיסט

כפקטור שעתוק.

58

הכרומטין מעורב בהרבה בקרות נוספות מלבד שעתוק.

ם האלונגציה. הארגון הבסיסי של הכרומוזום פולימרז צריך לעבור דרך נוקלאוזומים לש RNA-לאחר תחילת השעתוק, ה

פולימרז, והוא צריך להתגבר עליו. אפשר לשאול למה נוצר המכשול הזה ומדוע לא סולק RNA-מהווה מכשול בפני ה

-מתברר ש .שם יש את שאר המנגנונים שציינו( -)לא על התחלת שעתוק ציה? התשובה היא בקרה על קצב האלונגציהובאבול

פולימרז פשוט נופל ולא ממשיך את RNA-בוגר. באותם מקרים ה transcript-איניציאציה לא מסתיימים ב מאירועי 90%

השעתוק. בקרה זו חשובה לא פחות מבקרה על איניציאציה, והיא קשובה לסיגנלים של התא. העקרונות של בקרת

האלונגציה דומים לעקרונות של בקרת האיניציאציה.

. הם יודעים להקשר לחלק FACTפולימרז דרך נוקלאוזומים נקרא RNA-רים את מעבר האחד הקומפלקסים שמאפש

את רומשאי H2A, H2Bנמצא מעט לפני הפולימרז ומסלק את יחידות ההיסטון FACT-. הH2A, H2Bבעיקר -מההיסטונים

H3, H4שני אלו הם היסטונים שיכולים להיקשר ל .-RNA ר על פניהם ללא בעייה פולימרז בקשר חלש, והוא יכול לעבו

למקום. הוא יחזיר ספציפית את H2A, H2B-מחזיר את ה FACT-פולימרז עבר, ה RNA-ולשעתק, מבלי לפגוע בהן. לאחר שה

FACTשימצא בסביבה, בגלל שהמודיפיקציות עליהן מאוד ספציפיות. עיכוב של H2A, H2Bהיחידות שהוציא, ולא סתם

ר שבו הוא אמור לעבור. זה לא אומר שלא תתרחש כלל אלונגציה, אבל הסבירות שלה תרד יוביל לכך שהפולימרז יתקע באזו

כי הפולימרז יתקע שם ליותר זמן, וגם את תתרחש, הקצב שלה יהיה איטי יותר.

splicing -שחבור

המקודד אליו, וזאת בגלל DNA-הסופי לא בהכרח מייצג את הרצף של ה RNA-ה

. החלקים שהוצאו הם splicing-צאים בתהליך המו RNA-שרצפים רבים של ה

)זה splicingיכול לעבור כמה אירועים שונים של transcriptהאינטרונים. כל

יכולים DNA-(, ולכן מתוך מסגרת קריאה אחת בalternative splicingנקרא

הוא להגדיל את splicingשונים. למעשה אחד התפקידים של mRNAלצאת כמה

מאפשר ורסטיליות לאורך splicing-. כמו כן, הDNA-ורמציה שיש בכמות האינפ

נים, מבלי להשפיע על החלבון.ורי אפשר להכניס מוטציות באינטציה, כוהאבול

למשל -alternative splicingאפשר גם שרקמות שונות יבטאו גן באופן שונה ע"י

חר. שאותו גן יתבטא בפיברובלסט באופן מסוים, ובתא כבד באופן א

ן הוא אזור פונקציונלי מסוים של החלבון. לרוב כל אקסון מקודד ליחידהיכל חלבון מורכב ממספר דומיינים, כאשר דומי

ככל הנראה, יש מספר יחסית נמוך בטבע של דומיינים, יקודד משני אקסונים.שיש דומיין פונקציונלית אחת, אבל לעיתים

ציה אומרת כי רוב ומאפשרת מגוון עצום בחלבונים. ההיפותזה על האבול splicingאבל האפשרויות הרבות לחבר אותם ע"י

ציה הוקדש ליצירה של הדומיינים הבסיסים, ושאר האבולוציה התפתחה באופן מאוד מהיר על ידי "משחק" עם והזמן באבול

. splicing-אותם דומיינים ב

59

בה יותר ביב נוקלאוזום(. האינטרונים הם הרלכמות הבסיסים סבסיסים )מספר דומה 150אקסון ממוצע באאוקריוטים הוא

:בהם צריכים להיות ארבעה אלמנטיםבסיסים בלבד, ש 20-50בסיסים. ספלייסינג דורש 3000-כ -ארוכים

אליו שהם שמורים downstream-ו upstream. יש רצפים splice site '5-א' לתחילת האינטרון. זה האקסון האזור בין סוף

מאזורי החיתוך, ויש כאלו שמופיעים בשכיחות גבוהה. 100%-מופיעים ב -נוקלאוטידים מסוימים שממש ממש שמורים )יש

יותר שמורים(. downstreamאזורים

מה שיש אח"כ באינטרון הוא לא משנה. אפשר שיהיה כל רצף וזה לא קריטי לספלייסינג. כמו כן מוטציות באזורים האלו לא

קריטיות.

-ו upstream. שוב יש רצפים שמורים splice site '3 -ר השני החשוב הוא האזור בין סוף האינטרון לתחילת אקסון ב'האזו

downstream שפה זה( אליו, וגם פה, הם יותר שמורים בצד של האינטרוןupstream .)

15-)כ עשיר בפירמידניםך להיות רצף צרי splice site '3-בסוף האינטרון יחסית. לפני ה שני אזורים נוספים שחשובים הם

.branch pointלחיתוך יהיה אדנוזין. אזור זה נקרא upstreamבסיסים 20-25-וכ, בסיסים(

.בור )מבחינה כימית( לא צריך לדעתאת התהליך של השחטרנספריקציה ראשונה ושנייה. -מתבצע בשני חיתוכים splicing-ה

אינטרון. -של האקסון junction-יש רצף שיודע לזהות את ה RNA-על פני הולא חלבון. RNAהספלייסינג יכול להתבצע על ידי

שיזהה את הרצף אחר RNA-אחד שיזהה את הרצף של תחילת הספלייסנג )זאת אומרת המעבר מאקסון לאינטרון( ו RNAיש

-בסיסים עם הבסיסים של ההם עושים צימוד . U1/2 snRNAטרון לאקסון(. אלו הם פלייסינג )מעבר מאינשל סוף הס

junction .באזור ה-branch ,ה- A נגיש לחיתוך של השרשרת. יהיה כךבסיסים, ושל המחוץ לצימוד ישאר

יש יתרון מסוים על פני חלבון והוא שהוא RNA-פועל בשיטות של אינטראקציות )טובים השניים וכו'(, כמו חלבון. ל RNAגם

באופן יותר מדויק מאשר חלבון. לכן הוא יותר מדויק ביכולת שלו לבקר תהליכים RNA-וב DNA-יודע לזהות רצפים ב

מסוימים.

60

ירד במידה splicing-. ראו שהmRNA-, שמנעה ממנו ליצור צימוד עם ה snRNA-בניסוי עשו מוטציה באחד הבסיסים שעל ה

, או שהיא גם חשובה לתהליך של mRNA-עם ה snRNA-ניכרת. רצו לדעת האם המוטציה פגעה רק בצימוד של בסיסי ה

( וראו שאחוז transcript-החיתוך. לכן עשו מוטציה אחרת שלא פוגעת בצימוד )כלומר מוטציה לבסיס שעדיין יודע להיקשר ל

חזר למה שהיה. splicing-ה

.snRNA-פעילות ה הם מבקרים את .splicing (ESE, ESS)של רפרסוראינהנסור או יש אזורים על פני האקסון שמהווים

, שנקשרים אליהם ומבקרים את פעילות SR proteins (serine argenine proteins)הרצפים האלו מזוהים על ידי

של עצמו בזכות אותם רצפים. splicing-הספלייסוזום. לאקסון יש את היכולת לבקר את ה

אי ההוצאה של האינטרון. הוא מכיל את כל ספלייסוזום הוא מבנה גדול שמכסה את האזור של האינטרון, והוא אחר

המרכיבים שנחוצים לספלייסינג. לכל אינטרון יש את הספלייסוזום שלו.

(. זה מאפשר את השידוך של אקסון אחד לשני לאחר co-transcriptional splicingהספלייסינג מתרחש תוך כדי השעתוק )

היה סכנה שאקסונים לא נכונים יתחברו זה לזה, ושאקסונים ק החיתוך. אילו החיתוך היה מתבצע אחרי השלמת השעתו

מסוימים ילכו לאיבוד. הזמן שניתן לקומפלקס הספלייסינג להיווצר תלוי לא רק ביעילות של אותו הקומפלקס, אלא גם

זמן בקצב של השעתוק. אם יהיו שני פולימרזים, כל אחד משעתק בקצב אחר, בשעתוק האיטי יהיה לספלייסוזום יותר

-אבל אם השעתוק יהיה מהיר מאוד, יש סכנה שהספלייסוזום לא יעמוד בקצב ויעשה טעויות בזיהוי הלזהות את האקסון.

junctions .הנכונים

מהם המנגנונים שמאפשרים זיהוי טוב של אתרי הספלייסינג?

. junctionsעוזר לזיהוי של אותם הספלייסינג מתרחש בזמן השעתוק כך שהאקסונים והאינטרונים נחשפים ברצף מסוים, ש

בזיהוי שמשתתפים snRNAאזורי האנהנסור על פני האקסון מושכים את הספלייסוזום לאזור החיתוך. יש לפחות שני

רצפים. זה מוריד את הסיכוי לטעויות.

Splicing לא חייב להתרחש בין שני אקסונים של אותוRNAו את התופעה . אפשר שיכנס אקסון בכלל מגן אחר. תעד

יהיה שונה לחלוטין מרצף RNA-במקרה זה, ה .trans-splicingבחיידקים, אבל כנראה זה קיים ביצורים נוספים. זה נקרא

. זה מעלה את אפשרויות הקומבינציה ליצירת חלבונים לכמעט מספר אינסופי. DNA-ה

61

:RNAדרכים אלטרנטיביות לספלייסינג של

. מתוך הסכמה זה נראה DNA-. הוא מכיל את האקסונים והאינטרונים, כמו הDNA-למנטרי להראשוני הוא קומפ RNA-ה

בשל שנוצר מאותו RNA-ייסינג הוא לאחר השעתוק, אבל כפי שציינו זה תוך כדי. ניתן לראות פה כמה דוגמאות ללשהספ

transcript ם. האופציה השנייה היא איבוד של בו כל האקסונים נותרו כפי שה -ראשוני. השמאלי הוא כביכול הנורמלי

פולימרז מאוד מהיר, שלא מאפשר לספלייסוזום להדביק את הקצב, RNA-אקסון אחד. זה יכול להיווצר על ידי שימוש ב

הוא נחתך. לכן שהיו אמורים לזהות את האקסון השני עברו עיכוב, ו snRNA-ומאבדים אקסון אחד. אופציה אחרת היא שה

. intron retained-יתכן גם שכל האינטרון ישארבה יש הוספה של חלק מהאינטרון. exon extendedאפשרות נוספת היא

בוגרות RNAכמובן שיתכן שכאשר הייתה החסרה של אקסון, כל פעם תהיה החסרה של אקסון אחר, ולכן יווצרו מולקולות

נצפו בתאים אמיתיים. ראשוני. כל האופציות האלו אכן RNAהשונות זו מזו למרות שנוצרו מאותו

( שלו יש רפרטואר אדיר של אקסונים וספלייסינג אלטרנטיבי. החוקרים חישבו שמספר DSCAMבדרוזופילה נמצא גן )

. זה כמובן לא אומר שכולם אכן נוצרים. אם לוקחים בחשבון 38,000-מאותו הגן הוא כ RNAהקומבינציות האפשריות ליצור

האפשרית היא אינסופית. RNA-רטית כמות האז תיאו trans-splicing-את ה

מוטציות מהמחלות שנגרמות ממוטציה בנוקלאוטיד בודד נובעות ממוטציות שמשפיעות על הספלייסינג. יש 15%-כ

לאינהנסורים, ויש מוטציות שיוצרות אתרי ספלייסינג חדשים. SR-שמשפיעות על הקישור של חלבוני ה

האזורים בהם מתבצע הספלייסינג. הם סימנו את החלבונים שמשתתפים בתהליך חוקרים רצו למפות בתוך התא את

במרקרים פלורסנטים. הם ציפו כי זה יתרחש בכל הגרעין, כי בכל מקום מתרחש שעתוק, אבל מצאו שיש מוקדים מסוימים

המשועתק מגיע לשם לעבור חיתוך. RNA-בהם זה מתרחש. אותם אזורים הם בתי חרושת לשעתוק, וה

RNA-של ה '3-יצירת קצה ה -פוליאדנילציה

לאחר RNA-אלא הם מוספים ל DNA-בסיסי אדנין. אלו בסיסים שלא מקודדים על ידי ה 150-250יש בקצה זנב של RNAלכל

.פוליאדנילציההשעתוק בתהליך

62

ב האדנין )שיוצרת את ( וההוספה של זנtemplate-צריך לא לבלבל בין הטרמינציה של השעתוק )הירידה של הפולימרז מה

יוטים, אירוע הטרמינציה מתרחש הרבה אחרי שהפולימרז עובר את האזור בו יהיה בתאים אאוקר (.RNA-של ה '3-הקצה ה

. RNA-של ה '3-את הקצה ה תקובע , וכאמורRNA-במקום מאוד מוגדר ב תנילציה מתרחשד. פוליאRNA-של ה '3-הקצה ה

RNA-התכונות של הגרת הקריאה, ווצר אחרי מסה יעצור את הגן. אם היא תיואם היא תתרחש באמצע אזור הקריאה ז

באיזה קלות יצא מהגרעין(. תכונות כמו נוצר ) למסגרת הקריאה זנב האדנין downstreamיקבעו על פי כמה

סורים שיבקרו ננהאליהם יהיו גם אזורי רפרסורים ואי. סמוך A-יש אזורים שמורים שאומרים איפה צריך להתווסף זנב פולי

ין. חלק מאותם פקטורים ישארו על מקום הנכון ויוסיפו את זנב האדנאת התהליך. הם יקשרו פקטורים שיעשו את החיתוך ב

יים התהליך וימשיכו איתו לתרגום. תסכשיגם RNA-ה

ם אירועים של לציה מתרחשת תוך כדי השעתוק. אירוע זה נתון לבקרות נרחבות. יש גינבדומה לספלייסינג, הפוליאד

alternative polyadenylation .

מהגרעין לציטופלסמה RNAmיציאת

תרגום. בקרת שלב זה מכריע את גורל הביטוי הגנטי כמו בקרת שעתוק ו

יםהמבקר הן אלוהמנגנונים החשובים לתקשורת זו ה היא קריטית לקיומו של התא. התקשורת בין הגרעין לציטופלסמ

. ממברנת הגרעין מורכבת משכבה ליפידית מהציטופלסמה עין לציטופלסמה וכניסת מולקולות לגרעיןיציאת מולקולות מהגר

תת יחידות סימטריות. בצד הפונה לגרעין המבנים דומים בצורתם לסל, ולכן 8שבתוכה משובצים מעין אברונים בעלי

, nuclear pore complex (NPC)-. מחקרים רבים הראו כי מדובר בbasketנקראים

מהגרעין לציטופלסמה ולהיפך. השער הוא דו כיווני. פה ניתן RNAדרכם עוברים חלבונים,

. NPC-לראות חתך בדופן הגרעין, ואת ה

, כך שקומפלקס אחד נושק לשני. בתוך על פני הממברנה מסודרות בצפיפות גדולה NPC-ה

nuclearים החלל של הפורות יש הרבה סיבים חלבוניים ארוכים. אותם סיבים נקרא

porinsהם מאופיינים ברצפים חוזרים של פניל .-( אלנין וגליציןFG repeats הרצפים .)

החוזרים הללו יכולים לעבור אינטראקציות בינם לבין עצמם. משום כך, החלל של הפורות

דמוי ספגטי. -סבוך הוא

28-יכולות לעבור כ NCP-שאר השערים. דרך האינו השער היחיד בו עוברות מול' בין שני המדורים, לא נרחיב על NPC-ה

מולקולות בשנייה, זה קצב מאוד מהיר. כשלוקחים בחשבון את כמות הפורות בממברנה, מדובר על תנועה מאוד מסיבית של

. nucleoporinesנקראים NPC-מריבוזום(. חלבוני ה 30מיליון דלתון )פי 125-הוא כ NPC-גודל המולקולות בין המדורים.

. יש דימיון בין החלבונים השמריים והאנושיים. 60-חלבונים כאלו, וליונק כ 30-מר יש כלש

דלתון עוברים בחופשיות בפורות. מולקולות יותר גדולות נלכדות ברשת הספגטי -קילו 60עד חוק האצבע אומר כי חלבונים

. ך בחלבונים מוטורים, וללא צורללא צורך באנרגיה -ולא יכולות לחצות. המעבר בפורות הוא פסיבי

63

טרנספורטרים צריכות)חומצות גרעין או מולקולות גדולות( מולקולות שלא עוברות בפורות בזכות עצמן

. למשל תת יחידה של הריבוזום נכנסת בדרך זו. הקריופרין עובר כדי לחצות karyopherinsבשם

לא נקשרים בינם לבין עצמן, FG repeats-. משום כך, הFG repeats-אינטראקציות לא חזקות עם ה

מסוים(. FGהסובבים על הקישור לרצף FG-והמעבר מתאפשר דרך סבך הספגטי )הקריופרין מתחרה עם ה

בא )הוא נקשר לרצף אחד, אחד ל FGבגלל שהאינטראקציות לא חזקות, הקריופרין יכול לדלג בין רצף

קציה הייתה חזקה, הקריופרין היה נתקע אילו האינטראהקשר מתנתק, ואז נוצר קשר עם הרצף הבא(.

הקריופרין משיג את האנרגיה לנוע בתוך הסבך ממולקולות מים שנמצאות באזור ופולטות בתחילת הסבך.

אנרגית חום.

, וזאת FG-חזקה יותר מהאינטראקציה בין הקריופרין ל( cargo)האינטראקציה בין הקריופרין למטען שלו

ן באמצע הסבך.כדי שהוא לא ישחרר את המטע

חזור אחורה? זה אירוע אקראי, קדימה בתוך הסבך ולא יינוע הקריופרין ומה לגבי הכיווניות של התנועה בתוך הסבך? מדוע ש

בזכות שני דברים: אז איך בכל זאת חלבונים מגיעים לצד שהם צריכים להיות בו?. לעיתים הוא ישוב ולעיתים יתקדם

, בכיוון אחד במקביל זים תומך בתנועה לכיוון אחד, אז גם אם שני התהליכים יתרחשו)א( מפל ריכוזים. אם מפל הריכו

.התא ם שלבתנאית הקצב יהיה יותר מהיר. אבל בקרה זו היא די מינורית, כי קשה לשלוט בריכוזים במהירו

של הממברנה, הוא יהיה . בצד אחדשלו cargo-, וכן בין הקריופרין לFG repeats-)ב( אפיניות משתנה בין הקריופרין וה

הוא יהיה באפיניות יותר גבוהה של הממברנה ההתחלה(, ובצד אחר ולמטען )זה במדור FG-היקשר לבאפיניות יותר גבוהה ל

היעד(. כך מולקולה שהוא העביר לא תוכל לחזור )הוא לא יקשור אותה בצד של במדור)זה ומהמטען FG-מה השתחררל

היעד(.

איך קריופרין מזהה את . ידי קריופרין מסוים. יתכן קריופרין שמזהה יותר מסובסטרט אחדסובסטרט נישא על כל

הסובסטרט שלו?

הוא סינתז אותם בכמויות גבוהות על ידי שימוש בוירוס, ואז בחן את . קר עכב אחרי חלבוני הציטופלסמה בתא מסויםחו

לגרעין מהציטופלסמה והבחין שלכל החלבונים שנכנסים הוא בחן מיהם החלבונים שנכנסים מיקומם בתוך תא אאוקריוטי.

nuclear localization sequenceיש רצף שמור של כניסה. מדובר ברצף חיובי ששובר אלפא הליקס. רצפים אלו נקראים

(NLS)אל . אם לוקחים חלבון שבאופן טבעי לא אמור להימצא בגרעין, ומכניסים לו את הרצף הזה בהנדסה גנטית, הוא יכנס

הגרעין. מצד שני, אם עושים מוטציה ומשבשים את הרצף הזה, חלבון שאמור להיות בגרעין לא יכנס.

על חלבונים אחרים שיש להם רצף כניסה. לא לכל החלבונים הגרעיניים יש רצף כניסה לגרעין. יש חלבונים שתופסים טרמפ

את מהגרעין. יש חלבונים בעלי שני הרצפים, לכן הם יכנסו , כדי לצnuclear export sequence (NES)באופן דומה יש גם

, וביניהם רבים הם ללא שני shuttling עושים(. אחוז גבוה מחלבוני הגרעין shuttlingויצאו )תנועה דו כיוונית זו נקראת

הרצפים )הם תופסי טרמפים(.

-בשימוש יופרין עושההקר כדי לקשור את המטען במדור אחד ולשחרר אותו במדור אחר,

GTPase בשםran.

אימפורטין קשור מחוץ לגרעין האת זה עושים קריופרנים מסוג אימפורטין. :הכניסה לגרעין

האימפורטין+המטען+ ור את המטען.שלק . רק במצב זה הוא יודעran-GDP -ל

המטען לא והמטען משתחרר. GTP-ב GDP-משחלף את ה GEFפנימה, ואז יםנכנס ran-GDP-ה

. GDP -קושר אותו רק כשהוא קשור ל , כי הקריופריןלחזוריכול

64

.ran-GTP-קריופרנים בשם אקספורטין עושים את זה. הם קושרים את המטען בתוך הגרעין, בסיוע של ה :יציאה מהגרעיןה

. ואז המטען משתחרר בחוץ, ולא יכול להיקשר מחדש GDP-עושה הידרוליזה ל GAPאל הציטופלסמה, יםיוצא םכאשר ה

הם לא ממשפחת .GTPase-, שלא תלויים בRNA-ייעודים ל טרנספורטריםיחצו את הפורות, יש RNAכדי שמולקולות

מבוקרת על ידי חלבונים RNA-הכיווניות של תנועת ה הקריופרנים אבל הם מאוד דומים להם, ומתפקדים אותו הדבר.

נשאר תקוע בציטופלסמה ולא RNA-יטופלסמטי. כך ה, אבל נמצאים רק בצד הצRNA-שיודעים לנתק את הקריופרין מה

אם לתנאי הסביבה. כך למשל בעת הגרעין היא מאוד רצינית, והיא תותמ RNA-חוזר. הבקרה על היציאה של מולקולות ה

. ואילו בתנאים של סטרס, תתאפשר יציאה לחלוקת תא רלוונטיות RNAצורך לחלוקת תא, תתאפשר יציאה של מולקולות

להתמודדות עם סטרס. רלוונטיים RNAsשל

תרגום

כל שלשת -הקוד הגנטיהערוך יוצא מהגרעין ומטרתו היא לעבור תרגום. התרגום לחלבון הוא באמצעות mRNA-ה

חומצות 20-נוקלאוטידים מקודדת לחומצה אמינית אחת. בזכותו מועבר מידע המקודד בארבע אותיות למידע המקודד ב

חומצות אמינו שמקודדות על ידי יותר מקודון אחד, ויש כאלו שמקודדות רק מקודון אחר. יש אמינו + סטופ קודון. יש

שלושה סטופ קודונים.

3אופנים ) 3-הוא מולקולה ליניארית לרוב. מולקולה ליניארית יכולה להיות מחולקת לשלשות ב mRNA-: המסגרת הקריאה

ם שונים לחלוטין אחד מהשני. בדוגמא הבאה, המסגרת הראשונה מסגרות(. שלושת המסגרות האלו יכולות ליצור חלבוני

המקודדת למתיונין )כל חלבון מתחיל במתיונין(. במסגרת השנייה, המסגרת מתחילה בסה"כ נוקלאוטיד AUG-מתחילה ב

2ל מתחיל מחלוקה שבדוגמא האחרונה, עבור אותו הרצף . הרבה סטופ קודון הוא עם שנוצר transcript-אחד אח"כ, וה

סטופ קודון. ידים קדימה, לא יהיו שוםנוקלאוט

RNAt

הן עושות את החיבור בין שלשה של נוקלאוטידים .tRNA-מלאכת הקידוד נעשית על ידי ה

זרועות וקצה, שיוצר מעין תלתן. יש לה 3הוא בצורה של tRNA-לחומצה אמינית. המבנה של ה

שלה קשורה החומצה אמינית. היא קשורה '3-מבנה שניוני ושלישוני מאוד מיוחד. בקצה ה

באופן קוולנטי. בקצה הלולאה שמול החומצה אמינית, יש את האנטיקודון. CCAלרצף של

לקודון אותו היא אמורה לתרגם. הוא שלשה של בסיסים שקומפלמנטרים האנטיקודון

Wobble-ה מת. העמדקודון, במיקום השלישי יש אפשרות לגמישות מסויבשלישית האנטי

והיא לא חייבת להתאים ת יש גמישותלקודון, אבל בשלישי 100%-תואמת ב קודון חייבת להיותהראשונה והשנייה באנטי

65

61יש הסטופ קודון קודונים )בלי 61 -חומצות אמינו ו 20מגשר על הפער בין . הוובל בעמדה הזותמיד לנוקלאוטיד בקודון

(.קודונים

-)ולפעמים גם חלקים מהאמצע של ה '3-וה '5-. לאחר השעתוק נחתכים הקצה ה3-זפולימר RNAתק על ידי עמשו tRNA-ה

transcript)ואז מוספת קבוצת ה ,-CCA . ,על פני הבנוסף-tRNA נות. נעשות מודיפיקציות שובגרעין

גרעין, . זה יכול להיות ב'3-שזה ההוספה של החומצה האמינית בקצה ה -יהצלאצי-אמינוהמולקולה תעבור לאחר מכן,

. הצימוד ATPבתהליך שמצריך סינטתזות tRNAאצילציה מתבצעת ע"י -בציטופלסמה או במיטוכונדריה. תהליך האמינו

, כי אגורה שם הרבה אנרגיה. אותה אנרגיה שאצורה בו תשמש ליצירת הקשר הפפטידי בעת high energy bondהזה נקרא

יצירת החלבון.

הוא לא יכול לדעת -חד עבור כל חומצה אמינית. הריבוזום עיוור לחומצה האמינית שהגיעהסינטתזות, א tRNAאנזימי 20יש

קודון. -מעניין אותו רק אם יש צימוד נכון בין הקודון לאנטישהגיע נושא את החומצה האמינית הנכונה או לא. tRNA-אם ה

( של הסינתטזות מאוד מאוד חשובה. fidelityלכן האמינות )

רמות: 2-לציה: האמינות מתבצעת בשל האמינואצי הדיוק מנגנוני

. הכרות זו היא עם כמה מנגנוני בקרת איכות. היא נעשית בשני ע"י האנזים בהכרה של חומצת האמינו הספציפית .1

שלבים: תחילה החומצה אמינית צריכה להתאים לאתר הפעיל של האנזים, שהוא בצורה של כיס מרחבי. הכיס של

אים אך ורק לחומצה אמינית אחת. בגלל שיש חומצות אמינו שמאוד דומות, לעיתים תדחף האתר הפעיל אמור להת

, שם מתבצעת בדיקה נוספת שהחומצה editing site -חומצה אמינית לא מתאימה לכיס, ולכן יש כיס נוסף

א תוסר. צה האמינית לא תתאים לכיס השני היהאמינית אכן מתאימה לסינתטז הזה. אם החומ

-יש הרבה נקודות מגע בין ה שונה מעט במבנה המרחבי שלו. tRNAכל .עבור האנזים הספציפי tRNA-של הבהכרה .2

tRNA לסינתטז, וצריכה להיות התאמה גבוהה ביניהם כדי שיקשרו .

הקשר הפפטידי

החומצה פטידי. לחומצה האמינית שלו אוגר בתוכו המון אנרגיה, והיא זו שמשמשת ליצירה של הקשר הפ tRNA-הקשר בין ה

ידי, נעשה חיבור בין הצד האמיני החשוף שלהביצירת הקשר הפפטדרך הצד הקרבוקסילי, ו tRNA-האמינית קשורה אל ה

-peptidyl)שקרוי tRNA-. הפפטיד עדיין קשור בחומצה האמינית האחרונה שלו להמתגבש טרמינלי של פפטיד C-לקצה ה

tRNA והבגלל שהוא קשור לפפטיד ,)-tRNA שנקראחדש ה( שמגיע aminoacyl tRNA ) ידחוף אותו החוצה, ויהפך בעצמו

)אנרגיה הושקעה כבר . יצירת הקשר הפפטידי היא תהליך ספונטני, לא מושקעת בו אנרגיה חיצוניתtRNA-להיות הפפטידיל

. (tRNAאציל -ביצירת האמינו

66

ולכאורה הריבוזום מיותר. מתברר ,tRNA-ת אמינו הוא החומצוהאז למה צריך את הריבוזום? מי שעושה את הקישור בין

היו נפגשים אקראית, לחלבון לא הייתה tRNA-שהתפקיד של הריבוזום הוא לשמור על מסגרת הקריאה. לולא הריבוזום, ה

ת, בקונפורמציה מאוד מסוימאחד בסמוך לשני, tRNA-סוף. בנוסף, הריבוזום מעמיד את שני הלא כיווניות, לא התחלה ו

ומאפשר את היצירה של הקשר הפפטידי.

הריבוזום

מיליון ריבוזומים בתא הומני. 3.5-חומצות אמינו. יש כ 10000-ל 1הריבוזום הוא מאוד יעיל, הוא עושה טעות

חומצות אמינו לשנייה באאוקריוטי. 2-ח. אמינו לשנייה בחיידק, ו 20 -ציה הוא יחסית מהירקצב האלונג

RNA-הכוונה היא שהריבוזום בנוי בחלקו מ. ribozyme בעצםהריבוזום הוא

RNA. יש לו תת יחידה גדולה וקטנה, ובשניהם, החלק האפור הוא ובחלקו מחלבונים

1/3-( וrRNAרנ"א )הוא נקרא 2/3והחלקים הצבעוניים הם חלבונים. למעשה הוא

חלבונים.

. rRNAשל הריבוזום הם active site-כל ה

ם:מבנה הריבוזו

ריאלי פה מופיעים הריבוזום הבקט

הם ריוטי. שניקווהריבוזום האא

. מורכבים מתת יחידה גדולה וקטנה

-. ה70Sהריבוזום הבקטריאלי נקרא

S פות יפמסמנת שיקוע, וזה קשור לצ

. התת יחידה לא למשקל של המול'

.50Sוהגדולה היא 30Sהקטנה היא

, 80Sהריבוזום האאוקריוטי הוא

40Sטנה שלו הוא התת יחידה הק

.60Sוהגדולה היא

67

יםמפורט RNA-ומחלבונים. הגודל של התת יחידות, מספר החלבונים בהן ושרשראות ה rRNA-כל תת יחידה כאמור בנויה מ

3בפרוקריוטים, 2) בתת יחידה הגדולה RNA-יוט לאאוקריוט הוא במספר שרשראות הרבין הפרוקהעיקרי באיור. ההבדל

.באאוקריוטים(

גם בפרוקריוטים וגם -)שרשרת אחת של התת יחידה הגדולה 5S-, חוץ מה1פולימרז DNAמשועתקים על ידי rRNA-ה

עותקים 400-. יש כRDNAמשועתקים מאותו הלוקוס בגנום, הקרוי rRNA-. כל ה3( שמשועתק על ידי פולימרז אוקריוטיםבא

RNA-מתרחשות כל מיני מודיפיקציות על השם גם נוקלאולוס. מתבצע ב rRNA-העיבוד של ההשעתוק ושל הרצף הזה בגנום.

. לאחר מכן הוא . תהליך זה מערב הרבה חלבוניםליצירה של הריבוזום השלם עם כל מיני חלבונים assembly-וקיפולים, ו

נשלח לציטופלסמה.

תהליך התרגום

השלבים הם .הסריקהשלב , והוא אאוקריוטיםל חלק ייחודייש פרוקריוטים. טים וורייש כמה שלבים, חלק משותפים לאאוק

בסיום התרגום הריבוזום עובר מחזור.טרמינציה. -ונגציהאל-איניציאציה

עיקריים: active siteי בריבוזום יש שנ

, שם נעשה הצימוד בין הקודון לאנטי קודון. הוא נמצא בחיבור בין תת היחידה הגדולה decoding center-ה אחד הוא

exit, שם נוצר הקשר הפפטידי. הפפטיד הנוצר עובר במנהרה שנקראת PTC-peptidyl transfer centerני הוא הש והקטנה.

tunnel .

tRNAת מרחבית להחזיק עמדות. כל אחת מהן מותאמ 3-סנטר מחולק ל decoding -ה

היה , יאיניציאציה. בכל רגע נתון למעט בכל רגע( tRNA 3)ולכן הריבוזום יכול לאכלס

-שם יושב אציל ,decoding-היא העמדה בה מתבצע ה A -. העמדה הראשונהtRNAבהן

tRNA העמדה השנייה .P- שם עומד ה-tRNA מהשלב הקודם שמחזיק את השרשרת

tRNA-, ממנה יוצא הexit-, זו עמדת הE -(. העמדה השלישיתtRNA-הפפטידית )פפטידיל

החופשי שהשתחרר.

68

וד שמור בין בקטריות שלב מא שלב האלונגציה:

ואאוקריוטים. כדי להתקדם שלשה, הריבוזום

. mRNA-הוא שנע ולא ה

. צריך שזה Aאציל יקשר לעמדה tRNA-תחילה ה

נים שמוודאים הנכון, ויש מנגנו tRNA-יהיה ה

אז נוצר הקשר הפפטידי.הנכון. tRNA-שזה ה

יתנתק Pשהיה בעמדת tRNA-בשלב זה, ה

ר(.באיו 2)שלב מהפפטיד

כל הריבוזום יעשה טרנסלוקציה של -3שלב

קודם תנוע תת היחידה הגדולה, שלושה בסיסים.

ותת היחידה הקטנה תבוא בעקבותיה. כתוצאה

שהיה tRNA, אותו מתנועת התת יחידה הגדולה

. יפול Eבעמדה tRNA-ה של היחידה הקטנה, עם התנועה .חדש tRNA-תתפנה ל A, ועמדה Eיעבור לעמדה P-ב

מאוישות בו זמנית. יש פערי זמן קצרים. decoding center-*בפועל לא כל שלושת העמדות של ה

לתהליך זה מסייעים פקטורי אלונגציה. הם מבקרים את האמינות והדיוק. אכיפת הדיוק הוא תהליך שצורך אנרגיה.

. יש לו Aלעמדה tRNA-אי להביא את ה. הוא אחרeEF1והאנלוג האאוקריוטי EF-Tu-פקטור ראשון: פקטור בקטריאלי

לשם כך הוא עושה הידרוליזה קודון.-ה הכרה נכונה בין הקודון והאנטיית. הוא מסוגל לוודא שהיproofreadingפונקציה של

. GTPשל

. הוא לא מאפשר לה להיות חשופה שעליה ממסך את החומצה האמיניתבאופן ש tRNA-ל , והוא נקשרGTP-קשור ל EF-Tu-ה

יעבור GTP-מלא, ה codon-anti-codon recognition. רק כאשר יהיה לפני שיעשה את ההגהה היווצרות הקשר הפפטידיל

, וכך Pבעמדה tRNA-הוא בקונפורמציה מושלמת עם ה Aשבעמדה tRNA-. הtRNA-הידרוליזה, ואז הפקטור ישתחרר מה

נוצר הקשר הפפטידי.

לשימוש כדי למחזר את הפקטור GTP-חזרה ל GDP-יוטים( עושה שחלוף של הבאאוקר eEF1Bבבקטריות ) EF-Tsפקטור

נוסף.

. הוא מאפשר את הטרנסלוקציה של הריבוזום בדיוק בשלושה (eEF-2אנלוג באאוקריוטים )בבקטריות. EF-Gפקטור שני:

. GTPבסיסים. גם תהליך זה תלוי אנרגיה. הטרנסלוקציה מתרחשת תוך הידרוליזה של

-בחומצה האמינית, וה tRNA-הוא לטעינה של ה ATP-. )הGTP אחד ושניATP חיבור של חומצה אמינית אחת דורש אם כך,

GTP .)הם לפעילות הפקטורים

69

. אאוקריוטים ופרוקריוטיםתהליך האלונגציה זהה בין

? זה על ידי ההכרה בין הקודון והאנטיקודון, והתת יחידה proofreading-כיצד מתבצע ה

צא בפוזיציה נמ tRNA-קודון, ה-אם יש צימוד נכון בין קודון לאנטירק של הריבוזום. הקטנה

rRNA (16s-ליצור קשרים עם התת יחידה הקטנה של ה הוא יכול חבית מסוימת שבהמר

rRNA16-(. הS יעשה קשרי מימן עם ה-tRNA וה-mRNAהתת יחידה של . הצימוד בין

על פני GTP-מאפשרת את ההידרוליזה של ההיא ש RNA-לשתי מולקולות ההריבוזום

לא יוכל להיכנס לאתר שאליו הוא צריך להגיע EF-Tu-הפקטור שעתוק. אם אין צימוד נכון, ה

יצא החוצה. tRNA-ולא יוכל לעשות הידרוליזה, וה

ר הריבוזום מאפש בתרגום: המבנה המרחבי של הכיווניות, הוא שנותן את peptidyl transfer centerהאתר הפעיל השני,

יכולה להתבצע רק בכיוון Pלעמדה Aמעמדה tRNA-. התזוזה של הmRNA-של ה '3-לכיוון ה -טרנסלוקציה רק בכיוון אחד

.3'5-, ולכן הריבוזום אוכף כיווניות מואינה יכולה לחזור אחורה אחד

חומצות אמינו. 30-כ בו זמנית לים להיותהוא תעלה בריבוזום בה עובר הפפטיד. זו מנהרה צרה, שבה יכו exit tunnel-ה

יצירת התעלה )הם יושבים בקצה בשמשתתפים ,(L4, L22שני חלבונים ריבוזומלים )( ו23S) rRNA-התעלה בנויה ברובה מ

שלה ומצביעים עליה(. הדעה הרווחת היא שהתעלה מונעת קיפול של החלבון.

האיניציאציה:

. שונים הפרוקריוטי והאאוקריוטי מאוד mRNA-ה

כלומר הוא מקודד ליותר מחלבון אחד. יהיו לו -טרונייסהוא פוליצ mRNA-ה בחיידקים

יש לו לרוב אין אינטרונים. קודון. stopקודון וכמה startכמה -כמה מסגרות קריאה

קודון, ואליו יודע להיקשר start-ל upstreamבסיסים 5מוטיב מסוים ברצף שנמצא

. shine-delgrano-sequenceאו RBS (ribosome binding site) הריבוזום. הוא נקרא

של RBS-)בין התת יחידה הקטנה וה בזכות צימוד בסיסים mRNA-הריבוזום נצמד אל ה

. (mRNA-ה

. start codon-נעשה ישירות על ה recognition-אין את הרצף שמסמן לריבוזום איפה להיקשר. ה באאוקריוטים

)זה קיים רק Aיש את זנב הפולי '3-בצד היקודד לחלבון אחד לרוב(. mRNAיסטרוני )לפחות בגדול. הוא לא פוליצ mRNA-ה

)כל מיני capיש אזור של '5-בצד הטים(. באאוקריו

-, ובינו לבין ה(mRNA-מודיפיקציות שיש על הקצה של ה

start codon שלא יעבור תרגום יש אזור

(5' UTR-untranslated region)בין '3-יים גם באזור ה. זה ק ,

. mRNA (3' UTR)-לחלק מסוים על ה A-הפולי

*UTR .קיימים גם בפרוקריוטים

70

של Pמתיונין )מתיונין עם מודיפיקציה(. הוא נכנס ישירות לעמדה -הראשון מקודד לפורמיל tRNA-בפרוקריוטים ה

שעוד לא mRNA, לכןצומדים ויתרחשו במקביל. תהליך השעתוק ותהליך התרגום הם מ. לפרוקריוטים אין גרעיןהריבוזום.

, זנב cap-)הוספת ה mRNA-סיים את השעתוק שלו כבר יתחיל תרגום. באאוקריוטים, לאחר השעתוק יש עיבוד נרחב של ה

, ספלייסינג( ואז הוא יוצא לציטופלסמה לתרגום. Aהפולי

האיניציאצור )של tRNA-דורשת בנוסף ל איניציאציה בפרוקריוטים

. IF1, IF2, IF3רמיל מתיונין( שלושה פקטורים: פו

-מייצב את התת יחידה הקטנה של הריבוזום על ה RBS-בשלב הראשון, ה

mRNA בעזרת ה-IF3פורמיל -. המתיוניןtRNA מגיע ביחד עם ה-IF1, 2

tRNA-הוא להביא את ה IF2-תפקיד ה. Pונכנס ישירות לעמדה

ברגע , וGTP-. הוא מגיע עם הfidelity-האיניציאצור, והוא גם אחראי על ה

, ושלושת GTP -ה קודון יש הידרוליזה של-שיש הכרה בין הקודון לאנטי

הפקטורים משתחררים. זה מאפשר לתת היחידה הגדולה להצטרף לתת

. אלונגציההיחידה הקטנה ולהתחיל את ה

כי יש בו את כל pre-initiation complexכל הקומפלקס הזה נקרא

הדרושים לאיניציאציה. המרכיבים

פקטורי איניציאציה, נזכיר את החשובים ביניהם. 27, הסיפור יותר מורכב. יש באאוקריוטים

. זה מבנה קריטי בשביל האיניציאציה של התרגום Cap '5-האיניציאציה מתחילה ב

-איניציאציה, למעט יוצאי דופן שנזכיר בהמשך, מתחילים בה יבציטופלסמה. כל שלב

cap binding complexשנקשר אל ה ,-Cap. ה-mRNA ,לא מסתובבים ערומים בתא

בעת התרגום, החלבונים מפני דגרגציה. עליהם הם קשורים לכל מיני חלבונים, שמגינים

-)ב Aלא יעבור דגרגציה הוא מתקפל, כך שהקצה הפולי mRNA-האלו מוסרים. כדי שה

לקולה היא מעגלית ומוגנת , ואז המוcap binding complex-( גם נקשר אל ה'3

, eiFיש כל מיני חלבונים. אחת המשפחות היא cap binding complex-במדגרגציה.

: ויש לה כמה חלבונים

4E -הוא קושר את ה-cap.

4G -הוא חלבון פיגום.

4A -הליקז שמאפשר את ה-scanning- .ההליקאז יכול תהליך ייחודי לאאוקריוטים

ם. ינים שניוניכדי לפתוח מב ATPלפרק

במטרה למצוא את mRNA-בתהליך זה נעשית סריקה על פני ה. scanning complex-מגייס את ה cap binding complex-ה

הראשון )עם המתיונין(, tRNA-המורכב מ( pre-initiation complex)קרוי גם scanning complex-. הstart codon-ה

, עד אשר mRNA-ינוע על פני ה scanning complex-ה. eiF2aאיניציאציה, בהם גם ( וכל מיני פקטורי 40Sהיחידה הקטנה )

71

start codon-ה ימצאהקומפלקס . כשATPשתורם לו 4A-. מי שנותן לו את הכוח לנוח הוא הstart codon-ימצא את ה

-את ה יעזובהוא , eiF2-המ GTPרוליזה של , תהיה היד(mRNA-)כלומר יהיה צימוד בסיסים בין התת יחידה הקטנה וה

mRNA תגיע התת יחידה הגדולה, ויתחיל תרגום. במקומו ו

לרוב שלושה בסיסים לפני נמצאים באיזשהיא סביבה בה יש קונטקסט מועדף. AUGקודוני . AUGהוא קבוע start codon-ה

אליו יש בסיסים downstream. גם C, בסבירות גבוהה יהיה 1. בעמדה מינוס G, בסבירות יותר נמוכה יהיה Aיש AUG-ה

. kosak sequenceמועדפים. רצף הקונטקסט נקרא

מאוד ואלפי בסיסים. יש להם תפקיד חשוב בבקרה של -יכולים להיות מאוד ארוכים '3-וגם בצד ה '5-, גם בצד הUTR-ה

יתורגם. mRNA-התרגום. הם יכולים להכיל מידע ספציפי על שלבי בקרה פוסט תרגומיים, ועל מתי וכמה ה

הטרמינציה:

.UUA, UAG, UGAיש שלושה קודוני טרמינציה:

. טרמינציה ומחזור-מורכבת משני שלבים טרמינציה בפרוקריוטים

)כל אחד מכיר סטופ RF2או RF1 (release factor)יפול הפוליפפטיד מהריבוזום. הוא מצריך פקטור בשלב הטרמינציה,

אז מתבצעת (. tRNAשל הריבוזום )אף על פי שהם לא Aיודעים להיכנס לעמדה חלבונים ש ם אחרים(. הפקטורים הםקודוני

הידרוליזה של הקשר האסתרי בין הפפטיד לפפטידיל

tRNA הפפטיד משתחרר ומקבלים ,tRNA בעמדה ריקP .

לאחר שהפפטיד שוחרר, תת היחידות של הריבוזום עוד

לשימוש tRNA-ואת הקשורות זה לזו, וצריך למחזר אותן

משחרר את . הוא RF3 זה שלב המחזור. לשם כך מגיע נוסף.

אז . GTP)תלוי מי היה שם(, תוך הידרוליזה של RF1/2-ה

)עוד פקטור( EF-G, הוא מביא את RRFיכנס פקטור נוסף

ושניהם יחד מאפשרים את הדיסוציאציה של תת היחידה

וסף, אז מגיע פקטור נ. GTP, גם תוך הידרוליזה של הגדולה

IF3שמשחרר את ה ,-tRNA תת החופשי. כך נותרת ה

-. מאחר והmRNA-קשורה לעדיין בלבד,היחידה הקטנה

mRNA משיך הוא פוליציסטרוני, הריבוזום צריך לה

. , ולכן התת יחידה הקטנה נשארתלמסגרת הקריאה הבאה

(.ובשחרור התת יחידה הגדולה של הריבוזום IF1/2בשחרור – GTP ו שנינוצל )סה"כ,

72

חרור של תת היחידה הקטנה. התהליך מורכב משלושה שלבים.תכלול גם את הש באאוקריוטים, הטרמינציה

, מכירים את tRNA-. הם גם דומים לeRF3-ו eRF1בפקטור בו משתחרר הפפטיד. שלב שנעזר, termination-שלב ה)א(

דם . זה מקGTP-, ועם ההכרה של הסטופ קודון יש הידרוליזה של הGTP-קשור ל eRF3-. הAהסטופ קודון, ונכנסים לעמדה

דית יטאת שחרור השרשרת הפוליפפ

. הקומפלקס שנותר tRNAמהפפטידיל

הריק, הריבוזום tRNA-כולל את ה

. eRF3-וה

, שיסייע במחזור תת היחידה ABCE1, ויגיע פקטור נוסף בשם eRF3-תחילה יעזוב ה)ב( שלב המחזור של התת יחידה הגדולה.

mRNA-נותרנו עם התת יחידה הקטנה, הקשורה ל שני הפקטורים יעזבו. . אזATPהגדולה. לשם כך הוא יעשה הידרוליזה של

הריק )כמו בפרוקריוטים(. tRNA-וה

Re-initiation )ג( שלב מחזור התת יחידה הקטנה. אירוע של

לרוב יהיה באאוקריוטים יכול להתרחש, אבל הוא נדיר.

מחזור של התת יחידה הקטנה. יש שני מנגנונים בהם זה

זרת פקטורים או בעזרת חלבון ליאגטין. לא פורט עב –קורה

. יותר מזה

mRNA ארוך יכול להיות מתורגם על ידי הרבה ריבוזומים בו זמנית. מבנה זה נקרא

start codon-. מאחר והריבוזום מתקדם לאורך השרשרת, לאחר ההכרה עם הפוליזום

אציה. כל ריבוזום יהיה בשלב הוא יתקדם, ויוכל להגיע ריבוזום נוסף, ולהתחיל איניצי

אחר של התרגום )השרשרת המוקדמות יהיו קצרות, והשרשראות המאוחרות יהיו

אחד. transcript mRNAארוכות(. בסוף יווצרו המון עותקים של החלבון מאותו

יש שיטות לראות את זה בתנאי מעבדה.

mRNA-תוכה את כל הומוסיפים ל ( במבחנה,50%עד 10%-בונים גרדיאנט של סוכרוז )מ

זים את התמיסה במהירויות מאוד גבוהות. זה מאפשר כרבצנטריפוגה מסהקיימים בתא.

גרדיאנט, כפונקציה של המשקל שלהם והצפיפות שלהם. השונים לשקוע ב mRNA-ל

73

mRNA שמתורגם על ידי הרבה ריבוזומים שוקע יותר, ו-mRNA שלא מתורגם לא שוקע. כך ניתן להפריד בין כל ה-mRNA

בתא על פי כמות הריבוזומים שמתרגמים אותם.

RNAאומר כמה UV-. כל פעם עוברת דרך הקורא טיפה אחת של הנוזל. הUVאת התמיסה בקורא לאחר השיקוע מעבירים

עברו RNAכמה . הפלט שיוצא מתאר , וכאמור כל טיפה מייצגת תרגום על ידי מספר שונה של ריבוזומיםיש באותה הטיפה

.וכן הלאה 2, כמה על ידי 1ום על ידי ריבוזום תרג

דוגמא לפלט של ניסוי.

heatקבוצות ניסוי באדום וירוק שעברו סטרס של 2-קונטרול ו -היו שלוש קבוצות

shock .

שלא עברו תרגום )אלו הכי פחות שקעו בסוכרוז(. mRNAהפיק הכי משאלי מייצג

דומה. הפיק השני הוא ורגמהולא ת נוצרהש mRNA-בשלושת הקבוצות, כמות ה

mRNA שמתורגמים על ידי ריבוזום אחד. ניתן לראות שבקבוצות הסטרס הכמות

גמים על ידי ריבוזום אחד עלתה משמעותית בהשוואה לקונטרול. שמתור mRNAשל

רגמים על ידי הרבה ריבוזומים קטנה מאוד )הפיקים ותשמ mRNA-אבל כמות ה

וגע בתרגום.הימניים(. המסקנה היא שהחום פ

הריבוזום הפרוקריוטי והאאוקריוטיההבדלים המבנים בין

-מאחר ויש הבדלים בין השניהם מבצעים את אותה הפונקציה, וראינו מעט הבדלים בשלבי האיניציאציה והטרמינציה.

mRNA לו ליצור ושימושניתן לנצל את ההבדלים האהפרוקריוטי והאאוקריוטי, יש הבדלים מבניים בין הריבוזומים הללו, ו

אנטיביוטיקה. אנטיביוטיקות רבות היום יודעות לתקוף את הריבוזום הפרוקריוטי ולא את האאוקריוטי. ב

ולא A-אריתרומיצין וטטרהציקלין הן אנטיביוטיקות ייחודיות לריבוזום הפרוקריוטי. הטטרהציקלין חוסמת את העמדה ה

ממנה יוצא הפוליפפטיד. exit tunnel-ה להיכנס. אריתרומיצין חוסמת את tRNA-מאפשרת ל

וחוסמת את הטרנסלוקציה. PBC-יש אנטיביוטיקה אחרת שנכנסת לאתר ה

בתת יחידה הגדולה, אורך השרשראות, ומספר וסוג החלבונים rRNA -ציה של הריבוזום, השתנה מספר מולקולות הובאבול

כאשר משווים שמרכיבים כל תת יחידה.

מר וריבוזוםבין ריבוזום של ש

פרוקריוטי מוצאים שיש הרבה משותף

(common core וההבדל העיקרי הוא ,)

וחלבונים. rRNAשנוספה עוד שרשרת

כאשר משווים את הריבוזום השמרי

העיקרי הוא , השוניריבוזום ההומניל

השרשראות התארכו. rRNA-כמות ה

כמות החלבונים לא משמעותית.

של הריבוזוםהשתנתה כמעט מהשמר.

השמר דומה יותר לריבוזום החיידקי

מאשר ההומני.

74

בקרת תרגום

לבקרה של התרגום. הוא עובר צימוד עם התת יחידה הקטנה, ומסמן לה שעוד shine delgarno-מנצלים את ה םיוטיפרוקר

כמה בסיסים מתחיל תרגום.

תר, והתרגום נמנע, ובתנאים אחרים הוא חשוף יש שוני במידת החשיפה של הרצף בתנאים שונים. בתנאים מסוימים הוא מוס

והתרגום יתבצע.

יש כמה מנגנונים מוכרים לכך:

עם התת יחידה , ומתחריםRBS-יש פקטורים רפרסורים )חלבונים( שיודעים להיקשר אל ה .1

. קשירתם תמנע את התרגום. הקטנה על אתר הקשירה

, פ'יכול להיות בכמה מבנים שניוניים, כתלות בטמ RBS-ה .2

. זו תהיה בקרה נפוצה שחלקם יהיו אופטימלים לצימוד עם התת יחידה הקטנה וחלקם לא

.(heat shock proteins) בחלבונים שמסייעים לחיידק להתמודד עם סביבות חמות

כמו חומצות אמינו. -לקולות קטנותמו, אבל בעזרת RBS-של ה שינוי במבנה השניוני .3

. זו את התרגום ימנעש המבנה השניוני באופן קשירת המולקולה הקטנה תשנה את

אחד מתוצרי . בדר"כ בקרה שנפוצה בגנים שקשורים בתהליכי ביוסינתזה מסוימים

גנים לייצור חומצת אמינו ליזין. כאשר ליזין -דוגמא השרשרת הוא שמונע את התרגום.

. נמצאת בסביבה, החיידק לא צריך לייצר אותה ולכן היא מעכבות את הביטוי

*זו דוגמא בה המול' הקטנה מנעה תרגום. זה יכול להיות גם להפך.

לא מקודדות, בהן מולקולות קטנות RNA. יש מולקולות small RNAבקרה על ידי .4

מהתת יחידה הקטנה להיקשר ומהתרגום ולמנוע RBS-שיודעות לעשות צימוד אל ה

ירים אם כעת צריך או שמגד לתנאי סביבה, יתבטא בהתאםרגולטורי ה RNA -ה. להתחיל

הרגולטורי. RNA-לא צריך לתרגם את הגן שאותו מבקר ה

75

, הסיפור הרבה יותר מורכב.באאוקריוטים

סטרס של רעב, סטרס -נתחיל בדוגמא של בקרה תחת תנאי סטרס. תא חשוף לסוגים שונים של סטרס

א לעצור את כל התהליכים הלא יהתגובה הראשונה של התא אל סטרס האוקסיטטיבי, טמפ' קיצוניות ועוד.

גדילה, תרגום חלבונים ייעודיים של התא. מטרת התא היא להפעיל מנגנוני הצלה ואדפטציה שיאפשרו לו -נחוצים

להתמודד עם לתנאי הסביבה החדשים.

, והגברה סלקטיבית של תת זת חלבוניםלובלית של סינתלסטרס היא רפרסיה גשל התגובה התאית hallmark-ה

ראו את התופעה הזו במגוון אורגניזמים. 60-. עוד בשנות השרלוונטים להתמודדות עם הסטרס mRNAה של קבוצ

למשל בדוגמא הבאה רואים שעם העלייה בטמפ', הזבוב מבטא פחות ופחות חלבונים. במקביל, מטמפ' מסוימת

(. זה חזר על עצמו בעכבר, heat shock proteinsהייתה עלייה בביטוי של חלבונים ספציפיים )בהמשך גילו שאלו

תרנגול ואדם.

mRNA-תהליך עצירת התרגום הוא מהיר יותר מתהליך עצירת השעתוק, וגם יותר מהיר מדגרגציה של ה

. זה יתרחש במקביל להגברה של , ולכן נראה עצירה של התרגוםהקיימים. בתגובה לסטרס התא צריך להגיב באופן מיידי

mRNA להתגבר עם הסטרס הנוכחי. ספציפיים שמיועדים

בקרות על שלב האיניציאציה:

הבקרה צריכה להתלבש על מנגנונים עיקריים. pathwaysשלב איניציאציה יכול להיות מבוקר בצורה גלובלית דרך שני

. mRNA-המשותפים לכל ה

-Pathway אחד קשור ל-eIF2alpha הוא תת יחידה של( .eIF2 ,

scanning-הראשוני ל tRNA-זה הפקטור שמביא את ה

complex מסלול זה מבוקר על ידי פוספורילציה. הבקרה היא .)

. scanning complexesעל ידי עיכוב המחזור של

. רק לאחר GTPתלויה בהידרוליזה של eIF2aplhaהפעילות של

. לאחר שהוא scanning-הוא יכול להתחיל את ה GTP-קישורו ל

כדי להיות זמין GDP-ת הצריך למחזר אסיים את פעילותו

הוא הפקטור שעושה לו את המחזור )עושה eIF2Bלמסלול נוסף.

יכול לעבור פוספורילציה באתר eIF2alhpa-(. הGTP-שחלוף ל

-שנמצאים קשורים ל eIF2alhpa -של ה poll-סטרס, מהר מאוד יגמר ה ילמחזר אותו. במצב eIF2B-מסוים, וזה ימנע מה

GTPיתכן גם עיכוב על הות להתחיל איניציאציה. , ואז לא תהיה אפשר-eIF2B .כדי למנוע מחזור

eIF2alhpa כל אחת משופעלת על ידי גורם סטרס אחר. קינזות עובר פוספורילציה על ידי אחד מארבע ,PERK למשל מופעלת

.HRI, PKR, GCN2האחרים הם . ER-על ידי היפוקסיה וסטרס הקשור ל

76

ולהגביר תרגום? כזו מלט" מההשתקה י"לה מסוימים מצליחים mRNAאיך

. uORF (upstream open reading frame). המנגנון נקרא UTR '5-זה מתווך על ידי אלמנטי ציס שנמצאים על ה

uORF יש להם( הם מסגרות קריאה קצרות המקודדות לפפטידים קצריםstart ונמצאות ב ,)5-וסטופ קודונים'UTR .של גנים

הם בעלי רצפים מקודדים, אבל קיומם של החלבונים uORF-ברמה של מספר חומצות אמינו בודדות. ה לעיתים הם קצרים

שהם מייצרים מוטל בספק. ככל הנראה כן מסונתז מהם פפטיד קצר, אבל לא ברור אם יש לו פונקציה ואם אורך החיים שלו

ושהם מצלחים לגייס ריבוזומים שעושים תרגום. מספיק ארוך כדי לתפקד בתא. היום רק יודעים שהפפטידים האלו קיימים,

בשמר. זה גן שמתבטא רק GCN4הגילוי של המנגנון החל מגן

4בתנאים של מחסור בחומצות אמינו בסביבה. לגן הזה יש

initiation-בתנאים רגילים, ה. UTR'5-ברצף ה uORFמקטעי

complex נעצר על ארבעת ה-start codons של ה-uORF

ם ומתרגם את אותם לפפטידים קצרים, וזה בזכות הראשוני

-איניציאציה. אולם כאשר הוא מגיע ל-היכולת לעשות רה

start codon של הגןGCN4 כבר אין מספיק פקטור ,

כדי להתחיל שם ,פנוי GTP-קשור לש eIF2alphaאיניציאציה

גם איניציאציה. זאת כי מנגנון המחזור של הקומפלקס

מהיר כדי לאפשר את זה. איניציאציה לא מספיק

פעיל לעשות זאת(, והתת eIF2הראשון )יש מספיק uORF -מתחילה איניציאציה על הבתנאים של מחסור בחומצות אמינו,

הפעיל מאוד נמוכים, בגלל שהוא עבר eIF2alpha-איניציאציה. אבל אחוזי ה-יחידה של הריבוזום ממשיכה לרה

הבאים. עם ההתקדמות של קומפלקס uORFs -איניציאציה של ה-תגייס כדי להגיע לרהפוספורילציה, ולכן הוא לא מספיק לה

-ולהתחיל רה CNG4מספיק לעבור מחזור בדיוק בזמן להגיע לתחילת מסגרת קריאה של הגן eIF2alpha-האיניציאציה, ה

, כך שיאפשר את התזמון הראשון הוא מאוד מדויק start codon-הראשון וה uORF-איניציאציה בגן. בעצם המרחק בין ה

המדויק הזה של הפעלת מנגנון המחזור.

חילת תהוא מאוד קצר ונמצא ב . אחדUTR'5-ב uORFלגן הזה יש שני. המנגנון פה הוא די דומה .ATF4 גן אנלוגי ביונקים הוא

השני, זה uORF-על פני הכאשר יתחיל תרגום קודון של החלבון. start-. השני הוא קצת יותר ארוך והוא חופף את הUTR'5-ה

יתרגם ו הראשון uORF -, הוא יתחיל באקטיבי וזמין eIF2alpha יש מספיקים, כשיבתנאים נורמל .לתרגום של הגןיפריע

-לרה תמשיך . התת יחידה הקטנה של הריבוזוםממנו פפטיד קצר מאוד

זה לא .השני uORF -, באזור החדש eIF2alphaותקשור איניציאציה

, והוא לא יתורגם. בעצם בגלל ATF4האיניציאציה של הגן יאפשר את

אציה כל כך יעיל, התרגום של הגן לא מתרחש. צישמנגנון האיני

עובר eIF2alpha , מתרחש דבר דומה למה שראינו בשמר.בסטרס

פעיל כדי להתחיל eIF2alphaיש מספיק . בתנאים אלו, פוספורילציה

-איניציאציה של ה-לרהמספיק אבל לא , הראשוןuORF -איניציאציה ב

uORF ה השני. אבל המרחק בין-uORF מסגרת קריאה של הגן הראשון ו

ATF4 של מנגנון המחזורל כדי לאפשר מספיק גדול כןeIF2alpha .לפעול

77

מצאו שזה מאוד נפוץ. הגילוי שלהם הוא יחסית חדש, והתאפשר על ידי UTR'5-בתוך ה uORFכשחיפשו היכן בגנום יש

. לפני מספר שנים יצאה שיטה חדשה המאפשרת RNA, שמאפשר לרצף גם next generation sequencing-טות של ההשי

ואיפה יושב ריבוזום ומתרגם בכל רגע נתון. באאוקריוטים יש המון בקרת תרגום. העובדה ,מתורגמים בתא RNAלדעת איזה

mRNA-אפשר לנו לדעת ברזולוציה יותר גבוהה מי מהמסתובב בתא לא אומרת כי הוא יתורגם. אותה השיטה ת mRNA-ש

יתורגם, ולעזור לנו לגלות כל מיני בקרות על התרגום.

. ribosome footprint profilingהשיטה נקראת

על כך שכאשר ריבוזום , וNGS-היא נסמכת על ה

ל אזור הקריאה מכל הפרעה מתרגם, הוא מגן ע

RNAase .RNAase-טיפול ב למשל כמו חיצונית,

חופשי שיש בתא, שאינו מוגן על ידי RNAכל מעכל

בסיסים, שבמרכז 30-חלבונים. הריבוזום מגן על כ

לכן הוספה של שלהם נמצא הקודון שכעת מתורגם.

RNAase לתוך תמצית של תא, תשאיר רק את

שעברו תרגום באותה נקודת זמן. RNA-האזורים ב

גלות מהי מִפתחי השיטה ניצלו את העובדה הזו כדי ל

steady stateבמצב של שכעת מוגן על ידי הריבוזום, וכך לדעת מה התא מתרגם כרגע, באותו סוג תא, footprintאותו

האלו, ולדעת כמה ריבוזומים footprints-ובעקבות חשיפה לכל מיני גורמים סביבתיים שונים. ניתן ליצור ספרייה על ה

-( ומיקום התרגום על פני הmRNAכמות התרגום )מספר ממוצע של ריבוזום על כל תרגמו כל קודון בחלבון. יש פה מידע על

mRNA .

מתורגמים על ידי uORF-בזכות הטכנולוגיות האלו אפשר לשאול שאלות חדשות על בקרות של תרגום, ולדעת אם ה

הרבה ריבוזומים שמתרגמים את . ראו כי יש ATF4ריבוזומים. לקחו תאי גזע של עכברים והסתכלו על הריבוזום באזור של

. ATF4-השני, וכמעט שום ריבוזומים המתרגמים את ה uORF -הראשון ואחוז נמוך של ריבוזומים המתרגמים את ה uORF-ה

שמתורגמים, ומצאו שיש המון מהם. עוד לא ברור לגמרי מה הבקרה שהם עושים כפוליפפטידים. uORF-סיווגו את ה

-Pathway שני נקראMTOR. הוא שולט על ה-cap binding complex וישירות ,

eIF4Eישיר של רגולטורהמנגנון הזה נסמך על עצמו. cap-שנקשר אל ה 4E-על ה

-את ה ר, הוא מונע ממנו לקשו4E-. כאשר אותו חלבון נקשר אל ה4E-BPשנקרא

cap 4-ואין איניציאציה. אם הE-BP 4-יעבור פוספורילציה הוא לא יקשר אל הE

גבר האיניציאציה. ותו

יהיה לא 4E-BP-חוסר בגלוקוז או חוסר חומצות אמינו, ה -במצבים של עקה

מזורחן, ותהיה רמה נמוכה של איניציאציה.

.. הוא יושתק במצבי סטרסMTORהוא קינז E4-BP-מי שעושה את הפוספורילציה של ה

78

למסלול הזה: מנגנון עוקף

IRES-internal ribosome entry site מדובר במבניים שניוניים מורכבים, שנמצאים .upstream ל-start כולים, ויקודון

. הם cap binding complex-מבלי צורך ב ,קומפלקס scanning-להביא לגיוס של הכי הם יודעים MTOR-לעקוף את ה

את הקומפלקס סריקה. סוייג, שיITAFבאופן ישיר, או לגייס פקטורים אחרים scanning complex-יכולים לגייס את ה

RNA-. לRNAהתגלו לראשונה בוירוסים. לוירוס יש מטרה לחדור לתא המאכסן ולהתרבות. המידע הגנטי שלו הוא IRES-ה

, ועם זאת הוא מסוגל להיות מתורגם בתא המאכסן. זאת כי cap binding complex-והוא לא מסוגל לגייס את ה capאין

בהמשך ראו את המנגנונים האלו גם בגנים אנדוגנים באאוקריוטים. די לעבור איניציאציה. כ IRES-הוא מצליח לגייס את ה

הויראלי, אבל כן מצאו שהם מסוגלים לעבור RNA-של אותם המנגנונים האנדוגנים לא מגיעה לזו של ה והתחכוםהיעילות

.cap-בהם יש רפרסיה לתרגום שזקוק לאיניציאציה בתנאים

בקרה על אלונגציה:

. קינז שמזרחן אותו גורם לו eEF2אחד הנקודות בהם יכולה להיות בקרה היא על ידי פוספורילציה של פקטור האלונגציה

הקינז עובר אקטיבציה ורפרסיה על ידי מגוון רחב של מצבים פיסיולוגים. eEF2-להיקשר ביעילות פחותה לריבוזום. ה

בסביבה )ואז רוצים הרבה אלונגציה( ובנוכחות של נוטריינטיםק עובר דיכוי כאשר יש מספימאוקטב במצבים של סטרס, ו

פקטורי גדילה.

לקודונים tRNAשינוי הזמינות של היא בקרה נוספת ברמת האלונגציה

מסוימים )הכחולים(, tRNAמסוימים. כאשר יש חלבון שמקודד רק על ידי

כחולים. לעומת זאת, tRNAבתאים שבהם יש הרבה קצב גבוההוא יתורגם ב

אדומים, יתורגם בקצב איטי באותו התא. tRNAחלבון שמקודד רק על ידי

הזמינים מסוג מסוים יכולה להאט אלונגציה של tRNA-כך בקרה על כמות ה

גנים.

כך למשל בתנאים שהתא ירצה פרוליפרציה, הוא ידאג לזמינות גבוהה של

tRNA נמוכה של ומצד שני זמינות, רציהגנים של פרוליפשנחוצים לתרגום

tRNA הנחוצים לתרגום גנים של דיפרנציאציה. ולהפך בתנאים בהם התא

ירצה דיפרנציאציה ולא פרוליפרציה.

mRNA, למעט heatshockעקב mRNAראינו את הניסוי שהראה כי יש רפרסיה של

-שעולים ומיהם ה mRNA-ספציפיים שעוזרים להתמודד עם המצב. כדי לדעת מיהם ה

mRNA השתמשו ב ,םשיורדי-ribosome footprint profiling . עשו בפלטalignment לפי

-, ובדקו את ריכוז הריבוזומים לאורך השכן תורגמו mRNA-לכל הקודון start-ה

transcript בתנאי קונטרול יש יותר ריבוזומים בהתחלה, ואז יש התפלגות שווה של .

ראו הצטברות של ריבוזומים חמור heat shock. בעקבות mRNA-הריבוזום על פני ה

זה מעיד על עצירה של יש ירידה ומיעוט יחסי של ריבוזומים. חומצות אמינו 60-רי כבתחילת מסגרת הקריאה, ואח

ריבוזום ומחזיק את הפפטיד שיוצא הבדר"כ יש צ'פרון שנמצא על ח.אמינו? 60האלונגציה. מדוע האלונגציה נעצרת אחרי

79

הצ'פרון לא קיים ולכן הריבוזום נתקע. כנראה זה מנגנון בקרה רחב בזמן ,heat shockתנאים של . בexit tunnel-מה החוצה

סטרס, כי הוא קיים בתגובה לעוד סוגים של סטרס.

:UTR '3-מנגנוני בקרה ב

microRNA הם מולקולותRNA יש להם רגולטורי. תפקיד מאוד קטנות, בעלות

מקודדים על ידי גנים עצמאיים RNAתפקיד מרכזי בהשתקת גנים. המיקרו

מצא י)יש כמה מאות או אלפים של גנים כאלו בגנום הומני(, שיכולים לה

גנים או באינטרונים של גנים אחרים. המולקולה משועתקת רבאזורים אינט

(, אבל אז היא עוברת pri-miRNA) בסיסים 70-של כ תחילה כמולקולה ארוכה

באורך של stem loopניוני מיוחד של בגרעין. העיבוד יוצר מבני ש עיבוד

עיבוד של machinery. יש , שמחובר עדיין למולק' ארוכהבסיסים 20-22-כ

-pre-ל pri-miRNA-מזהה את אותו מבנה שניוני וגוזר את הש ,droshaשנקרא

miRNAכולל רק את המבנה של ה, שstem loop כלומר הוציאו את שאר ,

הוא יוצא אל מבנה הוא עדיין דו גדילי.אותו .הרצפים שלא שייכים ללופ

ויוצר את , מפריד את הגדיליםגוזר את הלופ DICERIהציטופלסמה. שם אנזים

., שהוא חד גדיליmature miRNA-ה

היא בציטופלסמה בסיסים. 20-22הוא שעושה את ההשתקה של הגנים. זו מולקולה חד גדילית, באורך mature miRNA-ה

תחפשמ RNA המיקרוככל הנראה, קומפלקס, כדי שלא תעוכל. RISC (RNA induced silencing complex)קשורה על ידי

mRNA ומי שעושה את ההשתקה זה השאיתם תוכל לעשות צימוד בסיסים ,-RISC ביונקים, מצאו כי שקשור אליה .

-ל RNAבסיסים בין המיקרו , והצימוד גורם להשתקה של הגן. צימוד הUTR'3-נוטה להיקשר לבסיסים ב RNAהמיקרו

mRNA יכול להיות מלא או חלקי. אם הצימוד הוא חלקי, התרגום יעצר. אם ההתאמה היא מלאה, תהיה דגרגציה של ה-

mRNA .על ידי חיתוך שלו. ההתאמה המלאה קיימת רק בצמחים ולא ביונקים

שכנראה נעשים השתקה מצאו כמה מנגנוניבהתאמה חלקית,

:RISCוהקומפלקס RNAעל ידי מיקרו

.mRNA-שחותך את ה AGOגיוס של הפקטור .1

-וכך ה A-, שמורידות את זנב הפוליאדנילזות-דהגיוס של .2

mRNA יותר נגיש לפירוק .

יכול להתקפל, RNA-העובדה שה-אציהציעיכוב איני .3

להיות קרובים פיסית לאזורים '3-מאפשרת לאזורים מה

אציה. ציאינימונעים RNAהמיקרו אציה, וצישל האיני

. mRNA-של ה pre-mature terminationיצירה של .4

. mRNA-ריבוזום לגשת לה, שמונע מP-bodiesגיוס של .5

רי שמשחק תפקיד בהשתקה של לא ידוע מיהו המנגנון העיק

תרגום.

80

שינויים פוסט תרגומיים

זה מגדיל את splicing-נגנון הם לוקחים בחשבון את מגנים שמקודדים לחלבונים. א 20000-40000הגנום האנושי מכיל בין

שונות. ברמת mRNAמולקולות 100,000מגוון החלבונים הקיימים מאותם גנים. ניתן להגיע בעזרת ספלייסינג עד

הפרוטאום, יש גם שינויים לאחר התרגום, שמגדיל עוד יותר את מגוון החלבונים. דוגמא נפוצה היא פוספורילציה של חלבון,

שלו, או את מיקומו בתוך התא. מבחינה מספרית, מדובר על יותר ממיליון חלבונים שונים בתא. שמשנה את הפונקציה

טרמינלי. בשיטות המסתמכות על סימונים של חלבון באופן N-כל החלבונים מתחילים בחומצה אמינית מתיונין, בקצה ה

בון. רדיואקטיבי, נהוג לבחור במתיונין, כי יודעים בוודאות שהיא תופיע בכל חל

טרמינלי של החלבון, הם אתרי המטרה למודיפיקציות C-הקצה טרמינלי ו N-הקצה הקבוצות הצד של חומצות האמינו,

פוסט תרגום.

נציה, פוספורילציה, הוספת סוכר, הוספת ליפיד, ידוגמאות למודיפיקציות פוסט תרגומיות: אצטילציה, מתילציה, יוביקוויט

ביקוע פרוטאוליטי.

לכל אברון יהיו אנזימים שיהיו , בגולג'י, במרווח הבין תאי. ER-במיטוכונדריה, ב -אלו מתרחשות בכל מקום מודיפיקציות

וונטים למודיפיקציות שצריכות להתרחש בו. רל

וון המודיפיקציות, שיכול להשיג תגובה כל חלבון יכול לעבור הרבה מאוד מודיפיקציות שונות. קיים קוד קומבינטורי של מג

. בסוף ההשפעה העיקרית של מודיפיקציות היא שינוי מטען החלבון, וזה משפיע על האינטראקציות פציפית ומורכבתמאוד ס

שלו עם מולקולות אחרות. שינוי האינטראקציה של חלבון עם מולקולות אחרות, יכולה לגרור שינויים במיקום חלבון,

פעילות שלו, בזיהוי שלו על ידי מערכות דגרגציה. בקשירה של חלבון לחלבון אחר )שינוי האפיניות ביניהם(, ב

ם, שמשפיעים על התפקוד שלו בתוך התא. הוא שעובר המון שינויים פוסט תרגומי . הוא חלבוןp53דוגמא היא חלבון

רגולטור של שעתוק.

פוספורילציה

עשית על חלבון יכול להתקיים במצב פעיל ולא פעיל בתא. בהרבה מקרים, ההפעלה של החלבון נ

, ואת הפוספט הזה הוא מעמיס על ADP-ל ATPידי פוספורילציה בעזרת קינזה. קינז מפרק

-החלבון. זרחון לרוב לא מתרחש באופן ספונטני, צריך שיהיה סיגנל תאי כדי שהוא יתרחש. דה

היא תתרחש כאשר הסיגנל שהורה על פוספורילציה לעומת זאת, לא דורשת אנרגיה.

. פוספורילציה יעלם

, יש שלוש קבוצות פוספוריל. ATPריל טעונה שלילית באופן חזק. במולקולות קבוצת הפוספ

ריל גבוה באנרגיה. קינזה שוברת את הקשר עם הפוספריל הכי הקשר בין כל קבוצת פוספ

ריל, והיא היא עם שתי קבוצות פוספ ADP -פוספט גמא, ומדביקה אותו על החלבון שעובר זרחון. המולקולה שנותרה -קיצוני

.AMP-יכולה לתרום אחד מהם ולהפוך ל

אקטיבציה שלו. -זרחון יכול לגרום לאקטיבציה של חלבון או לדה

מהחלבונים עוברים מודיפיקציה של פוספורילציה. 30%-כ

חלבונים שפועלים כקינזות. 518בגנום יש לפחות

קרוב למחצית מהם קשורים במחלות אנושיות.

גנים. מהן אונקו 100לפחות

81

התגלה מנגנון הפוספורילציה. ברנט וקנדי זיהו שאם לוקחים תאים סרטניים ושמים אותם במצע עשיר פוספט, 50-בשנות ה

ולהדביק ATPהוא נכנס ויוצא במהירות מהתאים. הם זיהו שיש אנזים קינז שיודע לקחת -מהיר של הפוספט turnoverיש

את הפוספט על מולקולה אחרת.

שונה בה התגלה תפקיד הזרחון היא הגליקוגן בכבד. אנזים בשם המערכת הרא

במולקולת גליקוגן ומשחרר גלוקוז מתוך 1-4גליקוגן פוספורילז מקטלז קשר

הגליקוגן. קרבס ופישר גילו שכאשר אותו אנזים מזורחן, הוא פעיל, וכאשר הוא

זרחון שלו מתבצע בקסקדה של-מזורחן הוא לא פעיל. הזרחון והדהלא

לין, הוא מעלה בתא את רמות נרתחת תנאים של סטרס מופרש אדתהליכים.

cAMP-dependentבשם . הוא נקשר ליחידה רגולטורית של קינזcAMP-ה

protein kinaseידוע גם כ( ,-PKA ומפעיל אותו. הוא מזרחן קינז אחר בשם )

היא פוספורילז קינז, אשר מזרחן בתורו את הגליקוגן פוספורילז. והתוצאה

עלייה ברמת הגלוקוז.

ידועים קרוב למיליון אתרים על חלבונים שמסוגלים לעבור זרחון. בפועל זרחון

50%-, כחלבונים. מתוך כל הפוספורילציות שנצפו בפועל 170,000-נצפה על כ

על טירוזין. 20%-על טריאונין, וכ 23%-על סרין, כ היו

מאשר 4עושים אקטיבציה )בערך פי מבין מודיפיקציות הזרחון שחקרו, הרוב

אקטיבציה(.-דה

מה שמיוחד בפוספורילציה על פני מודיפיקציות אחרות הוא שזו המודיפיקציה היחידה שדורשת אנרגיה. ברמה ההוליסטית,

התא צריך שזה ישתלם לו לבצע את המודיפיקציה הזו, ולכן זה יקרה בתהליכים שהתא מאוד זקוק להם. זה גם עוד סיבה

כדי שאנרגיה לא תבזבז סתם. -מדוע פוספורילציה היא תהליך כל כך מבוקר

סוגים של קינזות:

חלוקה אחת היא על פי חומצת האמינו שעוברת

זרחון.

. מרביתם הם אנזימים טריאונין קינזות-סרין-

הם קולטנים, שבחלק התוך שנמצאים בתא. מיעוט

. PCK, Rhoפעילות של קינז. דוגמאות: תאי יש להם

, שמרביתם הם רצפטורים. נקראים טירוזין קינזות-

. RTKגם

. במבנה שלהם הם נראים כקינזות, קינזות-פסואודו*

אבל הם לא פעילים כקינזות. הפונקציה שלהם עוד לא

ידועה.

ת ניתן לחלק אותם לקבוצות ציוניומבחינה אבול

נוספות, כפי שנראה באיור.

82

עושה את הפעילות הקטליטית. דומיינים אחרים משתנים בין קינזות, אפילו לכל הקינזות, ללא יוצא מן הכלל, יש דומיין ש

בתוך אותה משפחה.

כיצד מתבצע זרחון?

רלוונטית כמעט לכל הקינזות.קינז(. היא MAP)קרוי גם ERKמהקינז זו דוגמה

מעוגן סובסטרטכאשר חלבון ה .docking domain-ה -תר הקושר את הסובסטרטוא ATP-לקינז יש אתר שקושר את ה

שצריך לעבור זרחון בסובסטרט. , נוצר שינוי קונפורמציה בקינז, וכעת האתר הקטליטי מאוד מותאם לאזורבאתר הקשירה

-מה שישחרר את הסובסטרט וה -, והקינז שוב ישנה את הקונפורמציה שלוATP-הזרחון יתבצע על ידי ההידרוליזה של ה

ADP .

הם מחוברים על . ATP-בין שתי היחידות האלו יושב ה. C-lobe-ו N-lobeהקינז יש שני חלקים: מבחינה מולקולרית: על פני

activation-ה נמצא C lobe-יכולה לשנות את המפתח בין שני החלקים של הקינז. על פני ה p loop-. הצורה של הp-loopידי

segmentמצאות של סיגנל(. יל ידי קינזות אחרות )כתוצאה מה. זה אזור רגולטורי של הקינז, שיכול לעבור פוספורילציה ע

גם יקשר סובסטרט, -רחשו שני דבריםת. אם יsubstrate binding domain -כמו כן יש אזור שיודע לקשור את הסובסטרט

-Nשנמצאת על ה αC helixיעבור שינוי קונפורמציה: שרשרת הליקס בשם וגם הקינז יהיה מזורחן באתר הרגולטורי, הקינז

lobe ,התזוז-p loop ,ה תתי היחידות יתקרבו זו לזוושתי יתקפל(-N וה-C) זה יצור אתר קטליטי שיכול לעשות בצורה .

יש שינוי קונפורמציה של לאחר ההידרוליזה,ולהדביק את הפוספט על הסובסטרט. ATP-מיטבית את ההידרוליזה של ה

. משתחררים, והקינז שוב פתוח ADP-הקינז, הסובסטרט וה

שזז עם שינוי הקונפורמציה של הקינז קשור קו פקטור מגנזיום. הוא נחוץ לפעילות הקטליטית, ובעת Cα helix-אל ה

התנועה של ההליקס הוא מתקרב בדיוק למקום שהוא צריך להיות באתר הקטליטי.

83

חומצות אמיניות -קונצנזוסוטיב . הפפטידים שהוא יזרחן הם כאלו שנושאים מלכל קינז יש העדפה לפפטידים מסוימים

רק יזרחן ERKקינז כך למשל, סטרט אחד, בתנאי שיש לו את המוטיב קונצנזוס. בוהקינז יוכל לזרחן יותר מס ברצף מסוים.

סירין או טריאונין ששתי חומצות אמינו לפניהם יש פרולין, וגם מיד אחריהם יש פרולין. זה יהיה רצף שיתאים באופן הטוב

הקטליטי. ביותר לאתר

על ידי יותר מקינזה אחת. ,יש קינזות שונות שיש להם העדפה לאותו סובסטרט. כלומר אותו חלבון יזורחן יותר מפעם אחת

בעזרת התכונות האלו אפשר להשיג בקרה על קינזות.

הם בנפרד . כאשר בוחנים את כמות הפוספורילציה שלו על כל אחד מB-ו A -יש לקינז הזה שני סובסטרטיםדוגמא:

רטים יחד, הם טסתה קינזה. כאשר שמים את שני הסובהוא הסובסטרט המועדף על פני או A-)במבחנות נפרדות(, רואים ש

מתחרים זה בזה, ואז הפער ביניהם גדל עוד יותר.

.אותו הסובסטרט מזורחן על ידי שני קינזות, אבל הזרחון השני תלוי בכך שיתרחש הזרחון הראשון -דוגמא נוספת

קינז שעובר פוספורילציה על ידי קינז אחר )וזה שפעל אותו(, מזרז זרחון של עוד קינזות מסוגו. -משוב חיובי -דוגמא נוספת

שיטות לזיהוי פוספורילציה:

י מפריד על פהיותר כבד )משקל מולקולרי משתנה(, ולכן בהרצה בג'ל חלבון שעובר פוספורילציה לרובשיטות ביוכימיות: -

משקל, הוא ירוץ קצת פחות.

כדי לזהות בדיוק מיהי החומצה האמינית שעברה זרחון, אפשר לעשות מוטציה נקודתית ולהחליף את החומצה האמינית -

הפוספורילציה של החלבון ,שיכולה לעבור זרחון בחומצה אמינית שלא יכולה לעבור חמצון, ולראות אם עקב המוטציה

ה שעוברת זרחון. אם לא, אז זו חומצה אחרת, וצריך להמשיך לסקור עם עוד מוטציות. בוטלה. אם כן, אז זו החומצ

ה את הפוספורילציה )הוספת מטען שלילי(.שתחקגם לעשות מוטציה נקודתית אפשר-

84

שיטות אימונולוגיות: אפשר להשתמש בשיטות של נוגדנים, שיהיו ספציפיים רק לחלבונים שעברו זרחון. -

זה נוגדן שמכיר רק טירוזין שעבר זרחון, .anti-phosphotyrosine antibodies -שתמשה בה שפותחההשיטה הראשונה

ז נוגדנים שיהיו יותר והוא יהיה רלוונטי להרבה חלבונים )כל חלבון בו יש טירוזין שעובר זרחון(. בהמשך ניסו לסנת

ר זרחון על טירוזין. היום יש נוגדנים שיודעים לעשות ידעו לזהות זרחון על חלבון ספציפי, ולא כל חלבון שעובש -ספציפיים

. זה מרקר מאוד חשוב.שעבר זרחון 15דה הכינו נוגדן שמזהה רק סירין בעמ p53את זה, למשל עבור החלבון

איך מייצרים את הנוגדן הזה? מכינים את חלבון הסובסטרט במעבדה

מערכת החיסון באופן מזורחן, ומחדירים אותו לתוך עכבר בעזרת וירוס.

של העכבר תייצר נוגדנים עבור אותו הפפטיד המזורחן, וניתן למצות

אותם מהסרום. כאשר מוציאים את הסרום, הוא מכיל כל מיני נוגדנים

שהעכבר ייצר, ולכן צריך לנקות אותו ולהישאר רק עם הנוגדן שמעניין

אותנו. לשם כך משתמשים בקולונה שעליה נמצא הפפטיד המזורחן.

מעבירים את הסרום בקולונה, ורק הנוגדן שאנחנו מעוניינים בו יקשר

לקולונה, כל השאר ישטפו. בהמשך נפריד את הפפטיד מהנוגדן. את

הטכניקה הזו אפשר לעשות לכל חלבון שעולה על דעתנו.

אפשר לשים על פני סלייד המון נוגדנים בבת אחת, שכל אחת מזהה antibody array-ב

או בחלבונים שונים(. אפשר להדגיר את התמצית על אותו ,)או באותו החלבון זרחון אחר

שתי נתונות הסלייד, וכך לבדוק בבת אחת המון חלבונים והמון פוספורילציות. פה

דוגמאות, האחת עברה טיפול והשנייה לא. יש להם דפוס פוספורילציה שונה.

תאפשר הפרדה טובה בין כל חומצות שהרצת ג'ל דו מימדי, בהפרדה על פי גודל ומטען, -

היו חומצות אמינו שעברו זרחון. ואז שימוש בנוגדנים ספציפיים שיגידו איפההאמינו,

-mass spectrometry- זרחון של חומצה אמינית אחת משנה את המשקל המולקולרי של

מאוד רגיש לשינויים האלו. MS-החלבון, וה

3, הפיק השלישי הוא 1רחון, הפיק השני הוא זרחון בפלט הבא, הפיק הראשון הוא ללא ז

אפשר לבדוק בבת אחת המון חלבונים ולקבל מפות שנותנות תמונה כללית MS-זרחונים. ב

של כלל הזרחונים בתא.

85

מסלולים חשובים בהם מעורבות קינזות:

-העברת אותות

לתא יש קולטנים על פני הממברנה שקולטים את למשל בנדידה של תא: ישנו גירוי בסביבה שמסמן שכדאי שהתא ינדוד.

יהיה שינוי בפעילות של חלבונים שבסופם קולטן, יש שרשרת של תהליכים הסיגנל הזה, ועקב הקשירה של הליגנד אל ה

. השליחים השניוניים מתרגמים את הסיגנל ביטוי גנים שנחוץ לנדידהושינוי ב, (תנועה של המיקרוטובוליןקיימים )נניח

רבים מהשליחים השניוניים עובדים על פוספורילציה.י לפעילות בתא. החיצונ

נתאר סכמה אחת כללית )יש גם סכמות אחרות(: הרצפטור עומד בתא

במצב חופשי, בלי חלבונים שקשורים עליו. עם הקשירה של הליגנד,

הרצפטור עובר זרחון )לרוב על ידי רצפטור חבר בשם טירוזין קינז או על

אוטופוספורילציה(. לאחר הזרחון הוא מזוהה על ידי כל מיני ידי עצמו ב

(. docking proteinsחלבונים שניוניים שמזהים אותו רק במצב המזורחן )

על פני אותם חלבונים נקשרים כל מיני חלבונים אחרים: חלבוני פיגום,

)חלבון שנחוץ כדי להחזיק חלבונים אחרים(. הרבה adaptorsחלבוני

גם -חלבונים אלו מתאפשר על ידי פוספורילציותהין מהקישורים ב

-נקשר לממברנה בעזרת פוספטידיל SOSפוספורילציות של חלבונים וגם פוספורילציות של שומנים )נניח החלבון הירוק

(. PI3-אינוזיטול מזורחן

:RTK -טירוזין קינז רצפטור

תאי די דומה )אך לא זהה(, וההבדלים הם בעיקר הם משפחה מאוד גדולה של רצפטורים, שבכולם החלק התוך RTK -ה

, שעושה את tyrosine kinase domainבחלק האקסטראצלולרי, כי כל אחד מזהה ליגנד אחר. לכולם יש באזור התוך תאי

הפוספורילציה. זו יכולה להיות פוספורילציה על פני רצפטור אחר סמוך או אוטופוספורילציה.

)ציין שצריך לדעת את הפרטים של הטבלה(: הטורים מהמשפחדוגמאות לרצפ

86

דוגמא לגבי האינסולין רצפטור:

הוא עובר כדימר. במידה והליגנד מפעיל את שני הקולטנים, הם עוברים דימריזציה, ואז עושים פוספורילציה זה על זה ואחד

רו אליהם אדפטורים, שמזהים אותם כתוצאה מהפוספורילציה, הרצפטורים יקש. trans-auto-phosphorylation –על השני

יקציות שונות. למשל ם מודיפמזהיה ,ההכרה על ידי אדפטורים מתאפשרת על ידי דומיינים שיש להםרק במצבם המזורחן.

רו יידע להיקשר לכל חלבון בו יש טירוזין מזורחן. אותם אדפטורים יעב SH2מזהה פוספוטירוזין. אדפטור עם SH2 דומיין

בתא. את הסיגנל הלאה

:EGF (epidermal growth factor)דוגמא לגבי

רציה של תאים. הקולטן אליו הורמון מאוד חשוב לפרוליפ

גם הוא עובר הוא בעל חלק אקסטרצלולרי מקופל.

זה מוביל רה של הליגנד לרצפטור. עם הקשי דימריזציה

אחדוכתוצאה מהם -לשינוי בחלק הפנימי של הקולטנים

, ושניהם (receiver-)ה את השני ףדוח )האקטיבטור(

טרמינלי ויכולים לקשור חלבוני C-מזורחנים בקצה ב

. אדפטור

דוגמא לגבי הורמון גדילה:

גם אקטיבציה בצורה של דימר. עם הקשירה של הליגנד

בעל GRBברצפטור, הרצפטור יעבור זרחון ויוכל לקשור אדפטור

SH2 אדפטור הוא יקשור .דומייןSOS שיקשורRASה .-RAS הוא

3שבה יופעלו קטן. ההפעלה שלו תתחיל שרשרת GTPaseחלבון

-קינזות, האחרון תזרחן את השנייה

(raf-1-->MEK-->ERK והקינזה האחרונה גם תשנה פעילות של ,)

חלבונים רלוונטים לסיגנל, וגם תזרחן אתרים בגרעין ותוביל

. map kinase cascadeלשינוי בביטוי גנים. קסקדה זו נקראת

קינז. והקינזה שמזרחנת -קינז-map, תקרא MEKקינז. הקינזה שמזרחנת אותה, -map, נקראת גם ERKהקינזה האחרונה,

קינז. כל שם מציין מה הקינזה הולכת לזרחן, ולכן ככל שהולכים אחורה מוסיפים עוד -קינז-קינז-map, תקרא raf1אותה,

קינז לשם.

87

באופן ישיר, שפעל חלבוןפוספורילציה יכולה ל

-A-והיא יכולה לעשות זאת בדרכים עקיפות. ב

גורר ניתוק מה ש מזורחן המעכב של החלבון,

גנים <--שלו מהפקטור אותו הוא מעכב

משועתקים.

, יש קסקדה של פוספורילציות. מזרחנים B-ב

מעכב ובכך מבטלים את העיכוב, והחלבון

פעיל/גנים משועתקים.

בגרעין יכול לשמש כזיכרון מולקולרי לאחר סיגנל. למשל כאשר הופעל סיגנל שגרם לתאים התמיינות, לא זרחון חלבונים

ן, נרצה שהם יחזרו אחורה. לשם כך, אחד מהתהליכים שיקרו בשרשרת העברת האותות הוא זרחון של חלבונים בגרעי

לאחר שהוא הסתלק מהמערכת. שישמרו את ההשפעה של הסיגנל גם

מפעיל הם גנים שקשורים בהתמיינות. בתחילת ההתפתחות הם EGF-גני המטרה שה ובר של הדרוזופילה:דוגמא מהע

, מופעל הטירוזין קינז. כתוצאה מכך יש הפעלה EGF. כאשר מתחילה ההפרשה של grouchoמושתקים על ידי פקטור בשם

, מה שהופך אותו ללא פעיל, grouchoמזרחן את . אנזים זה נכנס לגרעין וERKבסופה מופעל אנזים קינז, map-של מערכת ה

יתפנה מסביבת התא, וכך זה משמש EGF-נמשך זמן רב לאחר שה groucho-הגנים האלו יכולים להתבטא. הזרחון על ה זוא

זכרון מולקולרי.

RTK להיות מעורבים יכולים גם ים של טירוזין קינז שט. יש קבוצת אנזימים ציטופלסמותטירוזין קינז הם רק סוג אחד של

. דרך אותם הדומיינים הם עוברים אקטיבציה. SH3-ו SH2בהעברת אותות. גם הם יכולים להכיל דומיין של

נניח בדוגמא הזו, הטירוזין קינז הוא הכתום. הוא מזורחן בזנב שלו, ולכן מעוכב על ידי התת יחידה הכחולה )לה יש דומיין

SH2מזורחן(. הוא גם מעוכב על ידי היחידה הירוקה )שלה יש דומיין , וכך היא קשורה לטירוזין קינז הSH3 ולכן היא קשורה

פוספורילציה, המעכב הכחול יתנתק, ויחפש מישהו -לקינז במקום אחר, אבל מעכבת אותו גם(. כאשר הטירוזין קינז יעבור דה

)הירקרק הבהיר(, הוא יקשור את התת activating ligand-. אם יבוא הSH2-אחר עם פוספורילציה להיקשר אליו דרך ה

יחידה הכחולה והירוקה, והעיכוב מהטירוזין קינז יוסר, ואז הוא יזרחן את עמו ויהפוך להיות פעיל.

88

בקרה על קינזות:

קינזות:שונות של בקרהדרכי 4נזכיר

-PKA- רט כאשר הם עובר כדימר. יש לו שתי יחידות רגולטוריות שמונעות את הקישור שלו לסובסט

יכולה להיקשר לתת יחידה הרגולטורית וכך להסיר אותה ולשפעל את cAMPנמצאות. מולקולה של

, הקינז הזה יעוכב. cAMP-. אם תמנע יצירת הPKA-ה

-PKC- גליצרול )מהממברנה( וקלציום יסירו את התת יחידה -אצילצריך שדי ,כדי שהוא יופעל

וקלציום מופיעים בתא DAG. וי מבני שיהפוך אותו לפעיל, ואז הוא יעבור שינהרגולטורית שלו

עקב סיגנל של העברת אותות.

-map ( קינזERK2)- כדי צריך לעבור פוספורילציה על האזור הקליטי

שמאפשרת את יצירת האתר הקטליטי ,הפוספורילציה גורמת לשינוי קונפורמציה יהיה פעיל.ש

של הקינז.

-cdc2- תאים מ קינז קריטי להעביר-G1 ל-S הוא יהפוך לפעיל רק לאחר שתצטרף אליו תת יחידה .

לעיתים זה דורש פוספורילציות נוספות להפעלה. השוני בדוגמא הזו משאר .Aשל ציקלין בקרתית

הוא בכך שפה היה צריך תוספת של יחידה רגולטורית ולא הסרה שלה. ,הדוגמאות

.החלבון ולא רק על הפעלתו על מיקוםבקרה יכולה להשפיע גם הזכרנו ש

ERK-את הרחן מז MEKחלבון נמצא בציטופלסמה. כאשר ERKחלבון למשל,

, שתקע אותו בתוך לו להתנתק מחלבון מעכבוזה מאפשר במספר אתרים,

)חלבון IMP7-יתחבר ל ERK-. אם תהיה פוספורילציה נוספת, ההציטופלסמה

. ידי פוספורילציות בגרעין על שעתוק, שם יקדם ויכנס לגרעיןאימפורטין(

בעצם הבקרה של הקינז לא רק הפעילה אותו אלא גם שינתה את מיקומו

התוך תאי.

בקרת קינז כטיפול ללוקמיה:

זו רק דוגמא אחת לתהליך מולקולרי בו קינזות משפיעות על תהליכים פתולוגים, יש עוד דוגמאות רבות.

Chronic myelogenic leukemia- כמה אונות בגרעין. הציטופלסמה היא נוקלארים, כי יש להם-בנים הם פוליתאי הדם הל

, סוג הלוקמיה הזהמאוד מצומצמת בתאים האלו. בהיסטולוגיה של מח העצם, רוב התאים שנראה הם תאי דם אדומים. ב

מיאולוציטים, על יש הבשלה לא תקינה של חלק מתאי הגזע של תאי הדם הלבנים, ובהיסטולוגיה נמצא עלייה בתאים מסוג

חשבון תאי הדם האדומים.

-מהחולים הם א 50%. 55. זו אחת מהלוקמיות הנפוצות. היא פורצת לרוב סביב גיל 1:100,000-יחותה היא ככזו מחלה שש

הוא קרינה מייננת. CML-סימפטומטים בעת הדיאגנוזה, ועם הזמן יש החמרה. גורם הסיכון הגדול ביותר ל

89

9. על כרומוזום 22-ו 9חלה הוא טרנסלוקציה בין כרומוזום הבסיס הגנטי למ

. עקב טרנסלוקציה, הגנים האלו bcrגן בשם 22ועל כרומוזום ablיש גן בשם

כרומוזום הכרומוזום המאוחה נקרא .22כרומוזום מתחברים על פני

. האיחוי של הגנים האלו מייצר קינזה שהיא bcr-abl פיוז'ןפילדלפיה, והגן

ביתר. פעילה

היא קינזה שקשורה לממברנה ומופעלת על ידי טירוזין קינז רצפטור. abl-ה

מאוד פעילה רה על הקינזה הזו מתבטלת, והיאעקב הטרנסלוקציה, הבק

הם מתחילים להתחלק ללא קשר לשום כתוצאה מכך, בתאים המיאלואידים.

לים חסינות מפני אפופטוזיס. אם כך יש פה בעייה מלבד הפרוליפרציה הבלתי נשלטת, התאים האלו מקב סיגנל חיצוני.

ולעכב אותו. bcr-abl-ל targetingולא מתים. לכן קו הטיפול היה לנסות ולעשות ,הם מתחלקים ללא שליטה -כפולה

, ואתר שקושר את הסובסטרט ועושה לו זרחון. מצאו מעכב שמונע את הקשירה ATP-לקינזה יש אתר שעושה הידרוליזה ל

לקינזה. התרופה נקראת גליבק. לפני הגליבק, הטיפול בלוקמיה הזו היה בעייתי. האופציה הייתה השתלת מח ATP-של ה

מהחולים היו מגיבים אליה. 50%-תמותה. אופציה אחרת הייתה כימותרפיה, ורק כ 25%עצם. זו פרוצדורה מסוכנת עם

וב השיפור הסימפטומטי(. אפשר גם לעק ולוגי תוך שנה )זהמהחולים שטופלו בגליבק הגיעו לריפוי המט 96%-לעומת זאת, כ

מהחולים היה 83%הכימרי מתבטא שם(, ומצאו שאצל mRNA-אחרי הרמסיה המולקולרית של התאים )לראות כמה ה

המסקנה היא שהשרידות של התאים האלו, ולא רק רמסיה ציטוגנטית גם כן. זה מלמד כי התאים הסרטניים מתו.

יש היום כמה דורות נוספים של הגליבק, כי חלק מהחולים פיתחו עמידות. , תלויה בקינזה. ההתחלקות שלהם

)טבלה לאותן הקינזות targetingיש עוד מחלות רבות שקשורות בקינזות שיצאו משליטה, ויש המון תרופות חדשות שעושות

. לא צריך לזכור את השמות. במצגת(

עות מעכב אחד, יש סיכוי שהתא יעשה מוטציה שתאפשר לו לעקוף את העיכוב הזה. אם עושים עיכוב של הקינזות רק באמצ

שפוגעות בכמה קינזות של אותו המסלול )שהרי ,תרופותקוקטיל שמורכב מכמה הרעיון הוא לבוא עם ,פותובפיתוח תר ,לכן

ים, וכך לתת "מכת מוות" לתא. ביתר, כנראה גם השאר יפעלו ביתר(, ובכמה קינזות במסלולים שונ תאם אחת במסלול פועל

טינציהיוויוביק

לה קטנה אלא על חלבון שלם. מודיפיקציה פוסט תרגומית מאוד מיוחדת, היא לא מבוססת על מולקו

של חלבון טרמינלי N-ח. אמינו, שנקשר לשיירי ליזין או לקצה ה 78טין הוא חלבון של ויויוביק

טין נקשר ימעלות לשרשרת החלבון. היוביקוו 90ת של קשר איזופפטידי. הוא בזוויזה נחשב . המטרה

. , שבו יש גליציןטרמינלי שלו C-מהקצה ה

גם ניתן ציה נפוצה על היסטונים. נטיייוביקוו-טינציות על חלבון היא מגוונת. מונויכמות היוביקוו

. זה חשוב ן על חלבון אחדטיילהדביק הרבה יוביקוו

. של המולקולה( targeting-)מבקר את ה לאנדוציטוזה

על פני החלבוןהדבקה יכולה להיות באתרים שונים ה

, או אחת על השנייה בשרשרתטינציה(ייוביקוו-)מולטי

, על פני אותו האתר. כל סימון טינציה(ייוביקוו-)פולי

, תיקון פירוק של חלבון למשלגורר תגובה אחרת,

DNA .

90

, כי הליזוזום מפרק אברונים וחלבונים שנכנסו פנימה באנדוציטוזה פירוק תוך תאי של חלבונים מתבצע בעיקר בליזוזום.

מוטציות . נלים, ולא ממש חלבונים חוץ תאייםמדובר על חלבונים ממבר .יוביקוויטינציה-הייתה להם מודיפיקציה של מולטי

קראות אגירה או זקס. קבוצת מחלות אלו נ-במערכות שקשורות בליזוזום מובילות למחלות שונות וקשות, ביניהן הטיי

ות. זאגלוקוזיד

פירוק חלבונים שונה ממודיפיקציות אחרות. פוספורילציה, אציטלציה וכו' ניתן להסיר, טין שגוררת ימודיפיקציה של יוביקוו

ציה, ולאחר פירוק החלבון לא ניתן גנציה שולחת חלבון לדגריטיויוביקו והחלבון יחזור להיות מה שהיה לפני המודיפיקציה.

אותו. צריך רק לסנתז אותו מחדש. לאחות

נציה עצמה היא מודיפיקציה כן הפיכה, אבל התוצאה שלה לא. יט*היוביקווי

מערכת היוביקוויטינציה לא קיימת בחיידקים.

גולדברג חקר פירוק של חלבונים ומצא שזמן מחצית החיים של חלבונים בתא מאוד מגוון. יש חלבונים עם זמן מחצית חיים

דקות, וכאלו שזמן מחצית החיים שלהם מגיע לשעות, וכאלו שהם מאוד יציבים, ולא מתפרקים במהלך חייו של של מספר

לקח טין. הואיסיס לגילוי מערכת היוביקוונשאלה השאלה מה גורם להבדל האלו. בריאן פול ערך ניסוי שהיווה את הבהתא.

אים סומנו במימן רדיואקטיבי, ולכן כל החלבונים הפנימיים מהת צימאקרופאג'ים, תאים בולעניים עשירים בליזוזומים. ח

התאים סומנו בחנקן רדיואקטיבי. את התאים שסומנו בחנקן החצי השני של . גם במימן רדיואקטיבי שלהם היו מסומנים

, הוא כתש לתמצית. את התמצית הוא הוסיף לתרבית התאים המסומנים במימן. הוא מדד את קצב התחלופה של החלבונים

, ואילו הפירוק של החלבונים שסומנו בחנקן 4%של -וראה כי הקבוצה של החלבונים שסומנו במימן היו בעלי פירוק נמוך

. אז הוא הוסיף חומר שמעכב את הכניסה לליזוזום. זה כמעט ולא שינה את 37%-)דהיינו חלבונים חיצוניים לתא( היה גבוה

אבל זה שינה דרמטית את קצב הפירוק של החלבונים האקסוגנים )הוריד אותו לליזוזום, יםאנדוגנקצב הכניסה של חלבונים

זה הפרוטאוזום שמפרק אותם. משמעותית(. היום יודעים שזה משום שהליזוזום לא מפרק חלבונים אנדוגנים.

ה, ואז טין בשיטת הסלמי. זו שיטה בה מפרקים מערכת לכל המרכיבים שליהרשקו וצחנוב'ר גילו את מערכת היוביקוו

גזע תרבית תאי הם לקחומחברים אותם מחדש, ובוחנים כל חלק בנפרד, כדי לראות אם הוא זה שעושה את הפונקציה.

שמפרקת חלבון שסומן יש מערכת הם ידעו שבתאים האלו . שאמורים להתמיין לתאי דם אדומים, ופירקו אותה לפרקציות

ATPלב כי אם הפרקציות מופרדות, אין פעילות של פירוק, בין אם יש שמוהם . ATPפירוק הזה הוא תלוי ה, ושיוביקוויטיןב

. אבל כשחיברו את שתי הפרקציות, כן היה פירוק של החלבונים. ATPובין אם אין

מהשמר עד האדם יש -טין יציב בחום, הוא לא מתפרק. יש לו מבנה גלובולרי מוגדר. הוא מאוד שמור באבולוציהיויקוהיוב

טין מעורב בהרבה תהליכים. יווקי. היוב96%דימיון של

7יוביקוויטין יש העל פני חלבון טינציה לחלבון היא כאמור דרך שיירי ליזין של חלבון המטרה. ימודיפיקציה של יוביקוו

, כתלות במיקום הליזין . צורת השרשרת יכולה להשתנותטינציהייוביקוו-ודרכם אפשר לבצע פולי חומצות אמינו של ליזין,

( או בשילוב של כל מיני homotypic polyubiquitinationכל החיבורים יכולים להעשות באותו אופן ). יו נעשה החיבורשעל

אם הקישור של (. אופן הקישור של השרשרת יכתיב את גורל החלבון. למשל, mixed linkage polyubiquitinationקשרים )

.DNA, החלבון ילך לתיקון 63. אם החיבור הוא דרך ליזין וטאוזוםבפר , החלבון ילך לפירוק48השרשרת הוא דרך ליזין

91

, שהן יכולות להשתלב בשרשראות יוביקווטין או להיות מודיפיקציות SUMO-יש מולקולות דמויות יוביקוויטינציה, כמו ה

בפני עצמן.

טין שהתווספו בזכות הרצה בג'ל על סמך משקל. יאפשר לדעת את כמות היוביקוו

-ל ATPעושה הידרוליזה של E1לה שצריכה לעבור שפעול. אנזים וקוביקוויטין? יוביקוויטין היא מולוצרת שרשרת יאיך נ

AMP ,זה השפעול(.יונקשר אל היוביקוו( הוא בא במגע עם חלבון טיןE2 ,)ובהשקעת של עוד אנרגיה )לא מופיעה באיור ,

משתחרר. E1-ה, וE2-קוויטין המשופעל נקשר ליהיוב

. זה אנזים פיגום, שעליו מתלבש חלבון המטרה שעובר את )נקרא גם יוביקוויטין ליגז( E3-יטין יעבור לאנזים שלישיהיוביקוו

יזהה E3-כדי ההקרבה ביניהם תאפשר את יצירת הקשר האיזופטטידי. טין. יושמכיל את היוביקו E2-נציה, והיהיוביקוויט

מזורחן. את הסובסטרט, הרבה פעמים הוא צריך להיות

92

תקבע על איזה ליזין תהיה , שהזהות שלהם E2סוגים של כמהטין. יש יאם התהליך הזה יקרה כמה פעמים, יבנה עץ יוביקוו

נציה. י, שהזהות שלהם תקבע את הסובסטרט שעובר יוביקוויטE3יטינציה. יש אפילו יותר סוגים של ווהיוביק

טינציה:ייוביקוו-דה

. מוטציות באנזימים DUB/USP (ubiquitin-specific protease)י נעשות על ידי אנזימ

האלו גורמות לסרטן.

ן יכול להיות ספציפי לקשר הפנימי בשרשרת. כלומר יטיהאנזים שמסיר את היוביקוו

..48, ואחרים לקישור בליזין 63ם לקישור בליזין יספציפי DUBיהיו

יש כאלו שיודעים ו רון שהוסף,יטין האחשיודעים לחתוך רק את היוביקוו DUBש י

באמצע. יש כאלו שיודעים לקצוץ זה טין האחרון, אלא ילחתוך רק כשזה לא היוביקוו

טינציה(. ייוביקוו-דה-טין הראשון )מונוירק את היוביקוו

שספציפיים לסובסטרטים מסוימים. DUBיש

לעכב אותם. , וחומרים פרמקולוגים שיודעיםDUBs-יש אנזימים שיודעים לעכב את ה

הפרוטאוזום:

טין נעשה על ידי יהפירוק של חלבון שסומן ביוביקוו

הפרוטאוזום. זה קומפלקס חלבוני ענק. הוא נקשר לחלבון

טין. בנוסף יש לו חלק שעושה יהמטרה דרך שרשרת היוביקוו

unfolding .לחלבון, ואז מפרק אותו

(.20S-זה ה) core-הפרוטאוזום בנוי מארבע טבעות מרכזיות, ה

שרשראות ביתא. 7שרשראות אלפא ומעליהן 7חלק זה מכיל

ארבע הטבעות האלו ליטי. א החלק הקטבמרכז הטבעות נמצ

מוקפות באזור רגולטורי, שנקשר אל חלבון המטרה ושרשרת

.unfolding-טין ועושה את היהיוביקוו

93

, וכך ADP-ל ATPכבים ספציפיים שמונעים פירוק של . אפשר למצוא מעADP-ל ATP פירוק של דורשת unfolding-פעולת ה

.AMP-ל ATP-של ה שעושים הידרוליזה לעכב את הפרוטאוזום מבלי לעכב חלבונים אחרים

הפרוטאוזום. אפשר לאדם שסבל משבר ונמצא בגבס, או לאדם שסובל ממחלה כרונית, יש פירוק של השריר, שנעשה על ידי

את הפירוק של השריר. אוזום כדי למנועלעכב את הפרוט

. pH=7-בניגוד לליזוזום, הפרוטאוזום עובד במכל חלבוני התא. 1%-כהם מהווים -יש הרבה פרוטאוזומים בכל תא

כיצד מזהים פירוק חלבונים?

יש כמה שיטות. אחת היא בריצה בג'ל לפי משקל. אפשר להריץ את

יך המניפולציה אהרקמה תחת תנאים שונים, ובזמנים שונים, ולראות את

. למשל לוקחים רקמה סרטנית ובודקים את השפיעה על פירוק החלבונים

)מצפים ATPבתמצית, ואז בנוכחות ATP, ללא נוכחות של mycהריצה של

(., כי אז הפרוטאוזום יכול לעבודATPכשיש כי המיק יתפרק

דוגמא נוספת היא לקחת תרופה שמעכבת את הפרוטאוזום, ולראות

. כשמטפלים בה חלבון מסוים נותרת קבועה שהרמה של

מודיפיקציות של יוביקוויטינציה קיימות בשרשרת של העברת אותות.

שבאופן רגיל לא יכולים להיכנס לגרעין כדי (NK-kB-ו p65) , יש פקטורי שעתוקNKבתאים של מערכת החיסון מסוג -דוגמא

נחשפים לציטוקינים שונים, זה NK. כאשר תאים מסוג (Ikb-α) ןקבבי-לקדם תגובה חיסונית, כי הם חסומים על ידי אי

ם ספציפיים, מה שמאפשר את היוביקוויטינציה שלהם בין בשני אתריקב-עבורם סיגנל לעשות זרחון של אימהווה

אפשר מ בין מפורקים על ידי הפרוטאוזום. זהקב-כתוצאה מכך האי. בין המזורחן בלבד(קב-ן ליגז מזהה את האי)היוביקוויטי

לפקטורי השעתוק להיכנס אל הגרעין ולהתחיל שעתוק של גנים שקשורים בתגובה חיסונית.

, שמעכבת את הפרוטאוזום velcadeד בפרוטאוזום. יש תרופה בשם ים בבקרת חלבונים באופן הדוק, במיוחיתאי סרטן תלו

פה הזו. לפני מציאת התרופה הזו זה היה סרטן מטופל בתרו ונועלת אותו. גידול המטולוגי )של מערכת הדם( בשם מיאלומה

על ידי שרשראות של קטלני, שאי אפשר היה לרפא ממנו. בסרטן הזה, יש השתלטות של הסרטן על מח העצם,

לינים שמפרישים תאי הסרטן. התרופה מעכבת את הפרוטואוזום, מה שגורם לכך שהתא הסרטני מפסיק לייצר ואימונוגלוב

ששיווי המשקל בין הפירוק של השרשרת ליצירתה הוא קריטי(. לאחר טיפול במעכב הפרוטואוזום, את השרשראות )כנראה

יש ירידה משמעותית ברמות האימונוגלובלינים ובגודל של הסרטן.

94