obtenção de proteínas para análise proteômica universidade federal de pelotas centro de...
TRANSCRIPT
![Page 1: Obtenção de Proteínas Para Análise Proteômica UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS Centro de Desenvolvimento Tecnológico – CDTec Curso de Pós-Graduação em Biotecnologia](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081604/5706384e1a28abb8238f718b/html5/thumbnails/1.jpg)
Obtenção de Proteínas Para Análise Proteômica
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTASCentro de Desenvolvimento Tecnológico
– CDTecCurso de Pós-Graduação em
Biotecnologia
Prof. Luciano Pinto
![Page 2: Obtenção de Proteínas Para Análise Proteômica UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS Centro de Desenvolvimento Tecnológico – CDTec Curso de Pós-Graduação em Biotecnologia](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081604/5706384e1a28abb8238f718b/html5/thumbnails/2.jpg)
Característica das Proteínas
Caroline Rizzi/Luciano
![Page 3: Obtenção de Proteínas Para Análise Proteômica UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS Centro de Desenvolvimento Tecnológico – CDTec Curso de Pós-Graduação em Biotecnologia](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081604/5706384e1a28abb8238f718b/html5/thumbnails/3.jpg)
Caroline Rizzi/Luciano
![Page 4: Obtenção de Proteínas Para Análise Proteômica UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS Centro de Desenvolvimento Tecnológico – CDTec Curso de Pós-Graduação em Biotecnologia](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081604/5706384e1a28abb8238f718b/html5/thumbnails/4.jpg)
Ponto Isoelétrico
É no ponto isoelétrico que a proteína apresenta-se com menor solubilidade!!!!
Caroline Rizzi/Luciano
![Page 5: Obtenção de Proteínas Para Análise Proteômica UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS Centro de Desenvolvimento Tecnológico – CDTec Curso de Pós-Graduação em Biotecnologia](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081604/5706384e1a28abb8238f718b/html5/thumbnails/5.jpg)
Importância do cálculo do pI
1.Vector NTI2.Expasy
• Focalização isoelétrica• Solubilidade• Purificação:• Proteínas ácidas:
pH>pI: troca iônica• Proteínas básicas:
pH<pI: troca catiônica
Caroline Rizzi/Luciano
![Page 6: Obtenção de Proteínas Para Análise Proteômica UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS Centro de Desenvolvimento Tecnológico – CDTec Curso de Pós-Graduação em Biotecnologia](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081604/5706384e1a28abb8238f718b/html5/thumbnails/6.jpg)
Caroline Rizzi/Luciano
![Page 7: Obtenção de Proteínas Para Análise Proteômica UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS Centro de Desenvolvimento Tecnológico – CDTec Curso de Pós-Graduação em Biotecnologia](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081604/5706384e1a28abb8238f718b/html5/thumbnails/7.jpg)
Caroline Rizzi/Luciano
![Page 8: Obtenção de Proteínas Para Análise Proteômica UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS Centro de Desenvolvimento Tecnológico – CDTec Curso de Pós-Graduação em Biotecnologia](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081604/5706384e1a28abb8238f718b/html5/thumbnails/8.jpg)
![Page 9: Obtenção de Proteínas Para Análise Proteômica UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS Centro de Desenvolvimento Tecnológico – CDTec Curso de Pós-Graduação em Biotecnologia](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081604/5706384e1a28abb8238f718b/html5/thumbnails/9.jpg)
Caroline Rizzi/Luciano
![Page 10: Obtenção de Proteínas Para Análise Proteômica UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS Centro de Desenvolvimento Tecnológico – CDTec Curso de Pós-Graduação em Biotecnologia](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081604/5706384e1a28abb8238f718b/html5/thumbnails/10.jpg)
Caroline Rizzi/Luciano
![Page 11: Obtenção de Proteínas Para Análise Proteômica UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS Centro de Desenvolvimento Tecnológico – CDTec Curso de Pós-Graduação em Biotecnologia](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081604/5706384e1a28abb8238f718b/html5/thumbnails/11.jpg)
Caroline Rizzi/Luciano
![Page 12: Obtenção de Proteínas Para Análise Proteômica UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS Centro de Desenvolvimento Tecnológico – CDTec Curso de Pós-Graduação em Biotecnologia](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081604/5706384e1a28abb8238f718b/html5/thumbnails/12.jpg)
Caroline Rizzi/Luciano
![Page 13: Obtenção de Proteínas Para Análise Proteômica UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS Centro de Desenvolvimento Tecnológico – CDTec Curso de Pós-Graduação em Biotecnologia](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081604/5706384e1a28abb8238f718b/html5/thumbnails/13.jpg)
Caroline Rizzi/Luciano
![Page 14: Obtenção de Proteínas Para Análise Proteômica UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS Centro de Desenvolvimento Tecnológico – CDTec Curso de Pós-Graduação em Biotecnologia](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081604/5706384e1a28abb8238f718b/html5/thumbnails/14.jpg)
Caroline Rizzi/Luciano
![Page 15: Obtenção de Proteínas Para Análise Proteômica UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS Centro de Desenvolvimento Tecnológico – CDTec Curso de Pós-Graduação em Biotecnologia](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081604/5706384e1a28abb8238f718b/html5/thumbnails/15.jpg)
Preparação do extrato bruto para purificação
Questões?
Qual é a fonte de proteínas?
Tecido, bactérias, intra ou extracelular?
Quais são os equipamentos disponíveis?
Qual é a escala de purificação?
Quais serão os procedimentos de purificação a serem utilizados?
Qual é o grau de pureza e atividade biológica desejados?
Luciano
![Page 16: Obtenção de Proteínas Para Análise Proteômica UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS Centro de Desenvolvimento Tecnológico – CDTec Curso de Pós-Graduação em Biotecnologia](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081604/5706384e1a28abb8238f718b/html5/thumbnails/16.jpg)
Preparação do extrato bruto para purificação
Condições básicas de obtenção
Realização rápida
Temperaturas baixas
Presença de tampão adequado e capaz de manter o pH e de força iônica que estabilize a amostra
Amostras limpas e livres de partículas insolúveis.
Luciano
![Page 17: Obtenção de Proteínas Para Análise Proteômica UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS Centro de Desenvolvimento Tecnológico – CDTec Curso de Pós-Graduação em Biotecnologia](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081604/5706384e1a28abb8238f718b/html5/thumbnails/17.jpg)
Escolha do tampão• Características do tampão• Concentração:quanto maior,maior tamponamento,mas
não maior que 0,1M• Tampões desejáveis:
– 1. pKa do tampão deve ser próximo ao pH final da solução e não exceder o limite de 1;
– 2. O pH do tampão não pode ser afetado pelas pequenas variações de temperatura, diluições e adição de sais neutros;
– 3. O tampão não deve ser reativo quimicamente;– 4. Não pode absorver luza 280 nm;– 5. Para cromatografias de troca iônica, usar tampão iônico;– 6.Tampões não podem interagir com componentes da
mistura(ex;ácidobórico e glicoproteínas).
![Page 18: Obtenção de Proteínas Para Análise Proteômica UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS Centro de Desenvolvimento Tecnológico – CDTec Curso de Pós-Graduação em Biotecnologia](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081604/5706384e1a28abb8238f718b/html5/thumbnails/18.jpg)
• Good’s buffers*:• MES, ADA, PIPES, ACES, BES, MOPS, HEPES, TAPS,
CHES, CAPS: quimicamente não reativos, não absorvem a 280 nm, o valor de pH não varia com temperatura e sais
• Muito mais caros• Variações pequenas no pH (0,05 u): concentrações de
0,1 a 0,2 mM• Variações bruscas no pH (> 0,1 u): concentrações acima
de 50mM• Reações enzimáticas: cuidar a liberação ou captação de
prótons•*N. E. Good. G. D. Winget, W. Winter, T. N. Connolly, S. Izawa, and R. M. M. Singh, Biochernisrry5, 467 (1966)
Escolha do tampão
![Page 19: Obtenção de Proteínas Para Análise Proteômica UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS Centro de Desenvolvimento Tecnológico – CDTec Curso de Pós-Graduação em Biotecnologia](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081604/5706384e1a28abb8238f718b/html5/thumbnails/19.jpg)
Caroline Rizzi
![Page 20: Obtenção de Proteínas Para Análise Proteômica UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS Centro de Desenvolvimento Tecnológico – CDTec Curso de Pós-Graduação em Biotecnologia](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081604/5706384e1a28abb8238f718b/html5/thumbnails/20.jpg)
Caroline Rizzi
![Page 21: Obtenção de Proteínas Para Análise Proteômica UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS Centro de Desenvolvimento Tecnológico – CDTec Curso de Pós-Graduação em Biotecnologia](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081604/5706384e1a28abb8238f718b/html5/thumbnails/21.jpg)
Aditivos ao tampão• NaCl;• EDTA;• Detergentes;• Inibidores de proteases;• Agentes redutores;• DNAsese RNAses;• Estabilizantes;• Conservantes.
Caroline Rizzi/Luciano
![Page 22: Obtenção de Proteínas Para Análise Proteômica UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS Centro de Desenvolvimento Tecnológico – CDTec Curso de Pós-Graduação em Biotecnologia](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081604/5706384e1a28abb8238f718b/html5/thumbnails/22.jpg)
Aditivos ao tampão
Caroline Rizzi
![Page 23: Obtenção de Proteínas Para Análise Proteômica UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS Centro de Desenvolvimento Tecnológico – CDTec Curso de Pós-Graduação em Biotecnologia](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081604/5706384e1a28abb8238f718b/html5/thumbnails/23.jpg)
Caroline Rizzi
![Page 24: Obtenção de Proteínas Para Análise Proteômica UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS Centro de Desenvolvimento Tecnológico – CDTec Curso de Pós-Graduação em Biotecnologia](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081604/5706384e1a28abb8238f718b/html5/thumbnails/24.jpg)
Caroline Rizzi
![Page 25: Obtenção de Proteínas Para Análise Proteômica UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS Centro de Desenvolvimento Tecnológico – CDTec Curso de Pós-Graduação em Biotecnologia](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081604/5706384e1a28abb8238f718b/html5/thumbnails/25.jpg)
Caroline Rizzi
![Page 26: Obtenção de Proteínas Para Análise Proteômica UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS Centro de Desenvolvimento Tecnológico – CDTec Curso de Pós-Graduação em Biotecnologia](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081604/5706384e1a28abb8238f718b/html5/thumbnails/26.jpg)
Caroline Rizzi
![Page 27: Obtenção de Proteínas Para Análise Proteômica UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS Centro de Desenvolvimento Tecnológico – CDTec Curso de Pós-Graduação em Biotecnologia](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081604/5706384e1a28abb8238f718b/html5/thumbnails/27.jpg)
Caroline Rizzi
![Page 28: Obtenção de Proteínas Para Análise Proteômica UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS Centro de Desenvolvimento Tecnológico – CDTec Curso de Pós-Graduação em Biotecnologia](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081604/5706384e1a28abb8238f718b/html5/thumbnails/28.jpg)
Caroline Rizzi
![Page 29: Obtenção de Proteínas Para Análise Proteômica UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS Centro de Desenvolvimento Tecnológico – CDTec Curso de Pós-Graduação em Biotecnologia](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081604/5706384e1a28abb8238f718b/html5/thumbnails/29.jpg)
Caroline Rizzi
![Page 30: Obtenção de Proteínas Para Análise Proteômica UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS Centro de Desenvolvimento Tecnológico – CDTec Curso de Pós-Graduação em Biotecnologia](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081604/5706384e1a28abb8238f718b/html5/thumbnails/30.jpg)
Preparação do extrato bruto
• Centrifugação• Remoção de ácidos nucléicos• Precipitação de proteínas• Diálise• Filtração• Concentração
Eliminação da maior parte dos contaminantes e substâncias insolúveis
Caroline Rizzi
![Page 31: Obtenção de Proteínas Para Análise Proteômica UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS Centro de Desenvolvimento Tecnológico – CDTec Curso de Pós-Graduação em Biotecnologia](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081604/5706384e1a28abb8238f718b/html5/thumbnails/31.jpg)
Caroline Rizzi
![Page 32: Obtenção de Proteínas Para Análise Proteômica UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS Centro de Desenvolvimento Tecnológico – CDTec Curso de Pós-Graduação em Biotecnologia](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081604/5706384e1a28abb8238f718b/html5/thumbnails/32.jpg)
Caroline Rizzi
![Page 33: Obtenção de Proteínas Para Análise Proteômica UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS Centro de Desenvolvimento Tecnológico – CDTec Curso de Pós-Graduação em Biotecnologia](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081604/5706384e1a28abb8238f718b/html5/thumbnails/33.jpg)
Caroline Rizzi
![Page 34: Obtenção de Proteínas Para Análise Proteômica UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS Centro de Desenvolvimento Tecnológico – CDTec Curso de Pós-Graduação em Biotecnologia](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081604/5706384e1a28abb8238f718b/html5/thumbnails/34.jpg)
Caroline Rizzi
![Page 35: Obtenção de Proteínas Para Análise Proteômica UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS Centro de Desenvolvimento Tecnológico – CDTec Curso de Pós-Graduação em Biotecnologia](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081604/5706384e1a28abb8238f718b/html5/thumbnails/35.jpg)
Caroline Rizzi
![Page 36: Obtenção de Proteínas Para Análise Proteômica UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS Centro de Desenvolvimento Tecnológico – CDTec Curso de Pós-Graduação em Biotecnologia](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081604/5706384e1a28abb8238f718b/html5/thumbnails/36.jpg)
Caroline Rizzi
![Page 37: Obtenção de Proteínas Para Análise Proteômica UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS Centro de Desenvolvimento Tecnológico – CDTec Curso de Pós-Graduação em Biotecnologia](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081604/5706384e1a28abb8238f718b/html5/thumbnails/37.jpg)
Caroline Rizzi
![Page 38: Obtenção de Proteínas Para Análise Proteômica UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS Centro de Desenvolvimento Tecnológico – CDTec Curso de Pós-Graduação em Biotecnologia](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081604/5706384e1a28abb8238f718b/html5/thumbnails/38.jpg)
Caroline Rizzi
![Page 39: Obtenção de Proteínas Para Análise Proteômica UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS Centro de Desenvolvimento Tecnológico – CDTec Curso de Pós-Graduação em Biotecnologia](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081604/5706384e1a28abb8238f718b/html5/thumbnails/39.jpg)
Caroline Rizzi
![Page 40: Obtenção de Proteínas Para Análise Proteômica UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS Centro de Desenvolvimento Tecnológico – CDTec Curso de Pós-Graduação em Biotecnologia](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081604/5706384e1a28abb8238f718b/html5/thumbnails/40.jpg)
Caroline Rizzi
![Page 41: Obtenção de Proteínas Para Análise Proteômica UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS Centro de Desenvolvimento Tecnológico – CDTec Curso de Pós-Graduação em Biotecnologia](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081604/5706384e1a28abb8238f718b/html5/thumbnails/41.jpg)
Caroline Rizzi
![Page 42: Obtenção de Proteínas Para Análise Proteômica UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS Centro de Desenvolvimento Tecnológico – CDTec Curso de Pós-Graduação em Biotecnologia](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081604/5706384e1a28abb8238f718b/html5/thumbnails/42.jpg)
Caroline Rizzi
![Page 43: Obtenção de Proteínas Para Análise Proteômica UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS Centro de Desenvolvimento Tecnológico – CDTec Curso de Pós-Graduação em Biotecnologia](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081604/5706384e1a28abb8238f718b/html5/thumbnails/43.jpg)
Caroline Rizzi