obtenÇÃo de hidrolisados enzimÁticos de minhoca … · proteína solúvel, ... funcionais e...
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CENTRO UNIVERSITÁRIO UNIVATES
PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA
OBTENÇÃO DE HIDROLISADOS ENZIMÁTICOS DE MINHOCA E
ESTUDO DAS SUAS PROPRIEDADES FUNCIONAIS
Mariano Rodrigues
Lajeado, março de 2014.
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Mariano Rodrigues
OBTENÇÃO DE HIDROLISADOS ENZIMÁTICOS DE MINHOCA E
ESTUDO DAS SUAS PROPRIEDADES FUNCIONAIS
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, do Centro Universitário UNIVATES, como parte da exigência para a obtenção do grau de Mestre em Biotecnologia
Orientador: Prof ª Dra Lucélia Hoehne Coorientador: Profº Dr Eduardo Miranda Ethur
Lajeado, março de 2014.
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AGRADECIMENTO
Quero inicialmente agradecer a meus pais Celso e Lory Rodrigues e a todos meus
familiares por todo carinho e incentivo.
A minha orientadora professora Lucélia Hoehne pelo incentivo, dedicação, orientação,
confiança e amizade. Com certeza me deixou marcas profundas que jamais serão esquecidas.
Ao meu co-orientador professor Eduardo Miranda Ethur pela dedicação e empenho a
mim prestado durante este período.
A professora Claucia Fernanda Volken de Souza pela disposição em me ajudar na
realização deste trabalho e principalmente pelas palavras proferidas nas horas de desânimo.
Aos colegas de laboratório, os bolsitas Virgínia Basso, Maira Cristina Martini, Wagner
Mânica Carlesso, Jordana Finatto, Rosecler Ribeiro e Taciélen Altmeyer, pela ajuda na
realização deste trabalho e pelo companherismo.
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DEDICATÓRIA
Dedico esse trabalho a meu filho Lucas Conzatti Rodrigues; o maior amor da minha
vida.
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RESUMO
Hidrolisados são proteínas que por ação química ou enzimática produzem peptídeos de vários tamanhos, sendo que pelo método enzimático o valor nutricional da proteína é mantido, sem a degradação dos aminoácidos. Vários pesquisadores demonstraram a possibilidade de se obter hidrolisados proteicos de origem animal a partir de enzimas, utilizando como matéria prima peixes e frango, podendo estes serem utilizados em alimentos, visto que promovem a modificação das propriedades funcionais das proteínas. As minhocas apresentam cerca de 70% de proteínas (base seca) e vêm sendo utilizadas no Brasil na alimentação de pequenos animais, sob a forma de farinha e também na transformação de resíduos orgânicos em húmus. Sendo assim este trabalho teve como objetivo obter hidrolisados proteicos utilizando como matéria - prima a minhoca e avaliar as suas propriedades funcionais, visto que a mesma apresenta elevado valor nutricional e até hoje tem sido pouco utilizada na obtenção destes produtos. Para isto, os hidrolisados foram obtidos após hidrólise enzimática, variando-se a concentração enzima/substrato, pH, temperatura, tempo de hidrólise e agitação do meio, e utilizando como enzimas as proteases Alcalase e Flavourzyme (Novozymes), a partir de um planejamento experimental. Os produtos obtidos foram avaliados com relação ao grau de hidrólise, a fim de se obter a condição mais adequada para a formação da maior quantidade de proteína solúvel, sendo então realizado um estudo de suas propriedades funcionais e teor de aminoácidos por cromatografia a líquido de alta eficiência. Os resultados demonstraram que a condição mais adequada para a obtenção da maior fração solúvel foi em meio alcalino e utilizando a enzima Alcalase, sendo que o produto apresentou algumas propriedades funcionais e praticamente todos os aminoácidos essenciais. Dessa forma a minhoca surge como uma nova e importante fonte na obtenção de hidrolisados, sendo que no futuro pode ser fornecido ao mercado um bioproduto que possa ser usado na alimentação de pequenos animais.
Palavras Chave: Hidrólise, aminoácidos, propriedades funcionais
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ABSTRACT
Hydrolysates are proteins which through chemical or enzymatic action produce peptides of various sizes, being the enzymatic method the one where the nutritional value of the protein is preserved, without amino acid degradation. Several researchers have demonstrated the possibility of obtaining hydrolyzed protein from animal sources through the use of enzymes, utilizing chicken and fish as raw materials and enabling this product to be used in feeding, considering that it promotes the modification of the functional properties of proteins. Earthworms present around 70% of protein in their composition (dried earthworm powder) and have been used in Brazil in the feeding of small animals, under the form of meal and also in the transformation of organic matter into humus. The aim of the present study was to obtain hydrolyzed protein utilizing the earthworm as raw material and to assess the resulting functional properties, taking into account that earthworms present a high nutritional value and have been so far underused in the obtainment of these products. In order to do so, hydrolyzed protein was obtained through enzymatic process, by varying the concentration of enzyme/substrate, pH, temperature, hydrolysis time and agitation speed, and employing as enzymes the proteases Alcalase and Flavourzyme (Novozymes), from a previously established study design. The products of the process were evaluated as to their degree of hydrolysis in order to obtain the most suitable condition to the formation of the highest amount of soluble protein. After that, a study of their functional properties and amount of amino acids was performed through the process of high performance liquid chromatography. Results demonstrated that the most viable condition for obtaining the highest possible amount of protein was in an alkaline means and using Alcalase enzyme, originating a product that presented some functional properties and practically all the essential amino acids. Considering these findings, the earthworm arises as a new and important source for the obtainment of hydrolysates, making it possible for the market to offer in the future a bioproduct that can be used in the feeding of small animals.
Keywords: Hydrolysis, amino acids, functional properties.
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LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Composição química da espécie Eisenia foetida................................................... 19
Tabela 2 – Diferenças entre as características dos processos de hidrólise química e
enzimática.................................................................................................................................33
Tabela 3 – Planejamento experimental empregado para hidrólise enzimática das
minhocas...................................................................................................................................43
Tabela 4 – Valores das variáveis do planejamento experimental em estudo............................44
Tabela 5 – Composição físico-química da Eisenia Andrei.......................................................52
Tabela 6 – Graus de hidrólise com as enzimas Alcalase e Flavorzyme nas condições
estudadas...................................................................................................................................53
Tabela 7 – Nível de significâncias das 5 variáveis estudadas para o grau de hidrólise com a
Alcalase.....................................................................................................................................54
Tabela 8 – Composição físico-química do hidrolisado obtido na melhor condição de
hidrólise.....................................................................................................................................57
Tabela 9 – Análise de aminoácidos por HPLC da minhoca e do hidrolisado...........................59
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Fisiologia das Minhocas..........................................................................................18
Figura 2 – Estrutura geral de um aminoácido...........................................................................20
Figura 3 – Formação da ligação peptídica................................................................................22
Figura 4 – Minhocas em processo de vermicompostagem.......................................................42
Figura 5 – Minhocário vertical..................................................................................................42
Figura 6 – Processo de obtenção do hidrolisado de minhoca...................................................46
Figura 7 – Eletroforese SDS- PAGE comparativa antes e após a hidrólise..............................58
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LISTA DE QUADROS
Quadro 1 – Fórmula estrutural dos aminoácidos......................................................................21
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LISTA DE ABREVIATURAS
AOAC do inglês: Official Methods of Analysis
CE Capacidade emulsificante
CFE Capacidade de formação de espuma
CRO Capacidade de retenção de óleo
Da Daltons
DPPH 2,2–difenil–1-picrilhidrazil
HPLC Cromatografia a líquido de alta eficiência
m/m Massa/Massa
m/v Massa/Volume
pH Potencial hidrogeniônico
PHEA 2-Hidróxietilaspartamidasílica
PSA Polisulfoetil aspartamida
SDS-PAGE Gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio
SE–HPLC Cromatografia a líquido de alta eficiência por exclusão molecular
SEC Cromatografia de exclusão molecular
TCA Ácido Tricloro acético
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SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO....................................................................................................................12
1.1 Objetivos............................................................................................................................13
1.1.1 Objetivo geral.................................................................................................................13
1.1.2 Objetivos específicos......................................................................................................13
1.2 Justificativa........................................................................................................................14
2 REFERENCIAL TEÓRICO...............................................................................................17
2.1 Minhocas............................................................................................................................17
2.2 Aminoácidos......................................................................................................................20
2.3 Proteínas............................................................................................................................23
2.3.1 Propriedades funcionais e nutricionais de proteínas..................................................25
2.3.2 Capacidade emulsificante..............................................................................................26
2.3.3 Capacidade de retenção de óleo....................................................................................27
2.3.4 Capacidade espumante..................................................................................................27
2.3.5 Digestibilidade in vitro...................................................................................................28
2.3.6 Atividade antioxidante...................................................................................................29
2.4 Enzimas..............................................................................................................................29
2.5 Hidrolisados protéicos......................................................................................................31
2.6 Técnicas de determinação quantitativa de aminoácidos em hidrolisados...................37
2.7 Determinação de proteínas total .....................................................................................39
2.8 Determinação de proteínas solúvel ................................................................................39
2.9 Separação de proteínas por eletroforese.........................................................................40
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3 METODOLOGIA................................................................................................................41
3.1 Soluções tampões...............................................................................................................41
3.2 Enzimas utilizadas.............................................................................................................41
3.3 Hidrólise enzimática das minhocas.................................................................................41
3.4 Preparo da amostra..........................................................................................................44
3.5 Métodos Analíticos............................................................................................................47
3.5.1 Análises Físico-Químicas...............................................................................................47
3.5.2 Análise quantitativa de aminoácidos por HPLC.........................................................47
3.5.3 Análise de proteínas por eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE)........ 47
3.6 Análises das propriedades funcionais.............................................................................48
3.6.1 Capacidade emulsificante (CE).....................................................................................48
3.6.2 Propriedades espumantes (CFE)..................................................................................49
3.6.3 Digestibilidade in vitro...................................................................................................49
3.6.4 Atividade antioxidante...................................................................................................50
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO.........................................................................................52
4.1 Caracterizações físico-químicas da matéria prima........................................................52
4.2 Resultados do planejamento experimental de hidrólise de minhoca...........................53
4.2.1 Condição de hidrólise para Alcalase e Flavorzyme....................................................53
4.3 Composições físico-químicas do hidrolisado..................................................................57
4.4 Análise do hidrolisado por eletroforese em gel de poliacrilamida – SDS PAGE........58
4.5 Análise de aminoácidos por cromatografia a liquido de alta eficiência.......................59
4.6 Análises das propriedades funcionais e nutricionais.....................................................61
4.6.1 Capacidade emulsificante..............................................................................................61
4.6.2 Propriedade espumante.................................................................................................62
4.6.3 Digestibilidade in vitro...................................................................................................62
4.6.4 Atividade antioxidante...................................................................................................63
5 CONCLUSÕES....................................................................................................................64
REFERÊNCIAS………..................................................................................................……65
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1 INTRODUÇÃO
Para a Sociedade Brasileira de Ciência e Tecnologia de Alimentos, a tecnologia de
alimentos consiste na aplicação de métodos e de técnicas desde o preparo, passando pelo
armazenamento, processamento, controle, embalagem, distribuição e utilização dos alimentos.
Esta ciência tem como objetivo disponibilizar ao consumidor produtos nutritivos, apetitosos,
bem apresentados e de maior vida útil, lançando ao mercado novos tipos de alimentos, seja de
procedência natural ou sintética. Um dos focos desta ciência é o de converter matérias-primas
simples e complexas em alimentos (EVANGELISTA, 2008).
As indústrias alimentícias, através de pesquisadores da área, estão permanentemente
criando produtos convenientes, com a presença de nutrientes, tanto para o consumo humano
como para outros animais; como por exemplo, a criação de produtos com qualidades especiais
a partir da ação de enzimas. Uma melhor qualidade nutricional depende da matéria-prima
utilizada, elevando seu valor como alimento; matérias-primas com maior rendimento de
nutrientes são de interesse industrial, com o intuito de atender as exigências mínimas do
organismo no que diz respeito a seu valor nutricional (ibidem).
Nesta visão, os hidrolisados proteicos vêm sendo utilizados desde 1940, sob forma
terapêutica ou nutricional para pacientes com restrições proteicas ou de nascidos prematuros e
também pessoas com alergia a determinadas proteínas, visto que uma alimentação com
hidrolisados proteicos pode proporcionar uma melhor utilização das proteínas (SGARBIERI,
1996). O interesse por hidrolisados proteicos vem aumentando pelo fato de que proporções
contendo pequenos peptídeos, especialmente di e tripeptídeos, provenientes da hidrólise
parcial das proteínas, são absorvidas de forma mais rápida do que na forma de aminoácidos
livres (CARREIRA et al., 2003).
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Já existem na literatura estudos relacionados à hidrólise enzimática de pescados
(BHASKAR et al., 2008; JUN et al., 2004; MARTINS; COSTA; PRENTICE, 2009) e frango
(CENTENARO, 2009; KUROSAWA et al., 2009; ROSSI, 2007; SCHMIDT; SALLAS-
MELLADO, 2009). Há poucos relatos na literatura de hidrolisados de minhoca (LIU et al.,
2003) sendo assim torna-se importante tal estudo visto que as mesmas contêm cerca de 70%
de proteínas na sua composição (base seca) e todos os aminoácidos essenciais em sua
constituição, sendo utilizadas na aeração de solos, na produção de húmus por
vermicompostagem, na alimentação de pequenos animais (na forma de farinha) e na
alimentação humana em países orientais (PEREIRA, 1997).
1.1 Objetivos
1.1.1 Objetivo geral
Obter a condição adequada, contendo a maior fração solúvel, de hidrólise enzimática
de minhoca com o uso de proteases comerciais.
1.1.2 Objetivos específicos
� Obter hidrolisados enzimáticos de minhoca com o uso de proteases comerciais
com diferentes atividades: Alcalase e Flavourzyme;
� Avaliar os efeitos da temperatura, grau de agitação, pH, tempo de hidrólise e
relação enzima/ substrato para obter a melhor condição de hidrolise, utilizando
planejamento experimental para otimizar as condições adequadas para os testes;
� Obter o maior grau de hidrólise dos hidrolisados na parte solúvel;
� Identificar e quantificar aminoácidos, após a hidrólise enzimática proposta, através
de técnicas cromatográficas;
� Avaliar as propriedades funcionais e nutricionais do hidrolisado, com maior grau
de hidrólise, por meio de análises físico-químicas.
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1.2 Justificativa
Segundo a Fundação Estadual de Proteção Ambiental (FEPAM), a Bacia hidrográfica
do Taquari-Antas situa-se na região noroeste do estado do Rio Grande do Sul, com uma área
de 26.428 km2, equivalente a 9% do território estadual, abrangendo 98 municípios. Esta Bacia
apresenta elevado índice de industrialização, com predomínio da produção primária, zonas
intensamente urbanizadas, sendo uma das regiões mais desenvolvidas do estado, de modo que
os municípios desta bacia concentram 16% da população do estado e concentram 20% do
Produto Interno Bruto (PIB) estadual (FEPAM, www.fepam.org.br). Lajeado, situado no Vale
do Taquari, é um dos municípios integrantes desta Bacia, com cerca de 70 mil habitantes. É
uma cidade com predomínio da população na zona urbana e com poder aquisitivo acima da
média estadual. Possui sistema de coleta seletiva e aterro sanitário adequado, sendo que a
média mensal de lixo coletada, nesta cidade, é de 85 toneladas (coleta seletiva) e 1.363
toneladas (lixo domiciliar), segundo dados da Prefeitura Municipal de Lajeado (Prefeitura
Municipal de Lajeado, www.lajeado-rs.gov.br).
Com isso, há uma geração significativa de resíduos orgânicos os quais podem ser
reutilizados após passar por um processo de compostagem e vermicompostagem. Com base
nos dados relatados, a construção de minhocários para a vermicompostagem seria uma
alternativa para a transformação dos resíduos orgânicos em húmus (PEREIRA, 1997), o que
aumentaria a vida útil dos aterros sanitários e provocaria menores impactos ambientais. A
construção de minhocários requer baixo investimento, tem vida útil de cerca de 4 anos, e além
de ser um excelente destino para os resíduos orgânicos, proporcionando rendimento extra,
devido a produção de húmus para jardinagem, agricultura em geral e pode ser utilizado nas
pastagens onde são criados bovinos. Além de se ser um negócio rentável, o custo com a
manutenção da infraestrutura é baixo, e esta atividade não requer uso de mão de obra
especializada, nem tratamento veterinário e exige pouco espaço, no caso de minhocários
verticais (SEBRAE, 2006). Aliado a essas vantagens citadas, as minhocas poderiam ser
utilizadas para a obtenção dos hidrolisados, que é alvo deste estudo. Claro que,
preliminarmente, deve-se fazer uma análise para a verificação da presença de resíduos
tóxicos.
Preparações de hidrolisados proteicos contendo pequenos peptídeos, provenientes da
hidrólise parcial de proteínas são absorvidas de maneira mais rápida e eficiente do que na
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forma de aminoácidos livres. Em determinados casos a introdução nas dietas de hidrolisados
com maior teor de peptídeos é de suma importância, resultando melhor aproveitamento das
proteínas (CARREIRA et al., 2003). O interesse tecnológico destes hidrolisados, vem
aumentando nos últimos anos, visto que a hidrólise enzimática pode ajudar na melhoria das
propriedades funcionais das proteínas (LÉONIL et al., 2000).
Já existem hidrolisados de proteínas de origem animal, como peixes e frango. Dessa
forma, a avaliação de hidrolisados proteicos a partir de minhocas torna-se importante uma vez
que estes podem ser utilizados em ampla variedade de produtos alimentícios, visto que as
mesmas, segundo Pereira (1997) possuem elevado teor de proteínas, podendo ser utilizadas
como complementação alimentar para peixes e outros pequenos animais sob a forma de
farinha.
Segundo o Boletim Informativo do Sindirações, de Março de 2011, a produção da
indústria de alimentação animal no Brasil registrou crescimento de 5,3% em 2010,
movimentando cerca de R$ 33 bilhões somente em matérias primas, sendo que o consumo de
aminoácidos para nutrição animal consumiu neste mesmo ano cerca de 21,208 toneladas, o
que demonstra o potencial deste mercado (MINISTÉRIO DA AGRICULTURA, 2011).
Segundo o Sindirações, a demanda da piscicultura em 2011 foi de cerca de 500 mil toneladas
de rações, representando crescimento de 33% (PET FOOD BRASIL, 2012).
Já para 2020 estima-se que a produção brasileira seja de aproximadamente 40 milhões
de toneladas de rações para frango de corte, 6 milhões de toneladas para poedeiras, 19
milhões de toneladas para suínos, 3 milhões de toneladas para gado de corte, 7 milhões para
gado leiteiro, mais de 1 milhão de toneladas para peixes e camarões, 3,5 milhões para cães e
gatos e 2 milhões para caprinos, ovinos, equinos e etc., totalizando 81,5 milhões de toneladas
(crescimento médio de 2,54% ao ano desde 2011). No caso dos suplementos, o crescimento
médio de 8,1% ao ano poderá culminar na produção de quase 5 milhões de toneladas (idem,
março/abril 2013) . Dessa forma nota-se que o mercado de alimentação para animais tem uma
fatia importante no mercado nacional, o que sugere que o lançamento de um novo produto
neste setor, a partir de uma nova fonte de matéria prima (minhoca) tem possibilidade de
sucesso no mercado.
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Este estudo, ao propor a produção de hidrolisados enzimáticos de minhoca está de
acordo com a linha de raciocínio de Barros e Neto (2007), que segundo os mesmos este é o
século da Biotecnologia. Para acompanhar o crescimento desta área, métodos apropriados
deverão ser desenvolvidos e aplicados na avaliação de custos e benefícios econômicos,
voltados para a saúde e para a produção de alimentos. Estes processos devem ser eficientes do
ponto de vista ambiental, economizando energia e água e minimizando a geração de resíduos
tóxicos.
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2 REFERENCIAL TEÓRICO
2.1 Minhocas
As minhocas são consideradas animais segmentados pertencentes ao filo anelida,
sendo chamados de anelídeos por apresentaram divisões semelhantes a anéis, os metâmeros.
Pertencem à classe Oligochaeta, sendo encontradas variedades cujo tamanho varia de 0,5 mm
até 3,30 m de comprimento (minhoca gigante), possuindo corpo lumbriforme, afilado nas
extremidades e achatado na parte de trás, pesando até 30 g. São distribuídas em cinco
famílias: Monoligastridae, Megascolicidae, Eudrilidae, Glossoscolici Jae e Lumbricidae
(PEREIRA, 1997).
Apresentam uma pequena quantidade de projeções cutâneas espiniformes que as
auxiliam na locomoção e na fixação nas suas galerias subterrâneas. A maioria habita o solo
úmido nas camadas superficiais, entretanto algumas chegam a uma profundidade de até 8
metros, em busca de solos mais úmidos e frescos (LONGO, 1995). As minhocas são de
sangue frio (pecilotermos), sendo que a sua temperatura varia de acordo com o ambiente que
vive. A pele das mesmas é sempre úmida, absorvendo oxigênio e liberando gás carbônico,
logo sua respiração é feita pela pele (PEREIRA, 1997).
São hermafroditas, possuindo um mesmo indivíduo órgão reprodutor masculino
(testículos) e feminino (ovários), no entanto a maior parte das espécies necessita de dois
indivíduos para a fecundação (ibidem), de maneira que os mesmos devem se colocar em
sentido contrário, de maneira que os clitelos coincidam com os anéis do parceiro; após
algumas horas do acasalamento, irão produzir os casulos que contém ovos, sendo expelidos
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por contração (LONGO, 1995). Reproduzem-se na idade adulta, o que pode ser verificado
pela presença do clitelo (região do corpo mais saliente, parecendo um colar) bem
desenvolvido, e sendo essa fase normalmente atingida cerca de 40 a 60 dias de vida
(SCHIEDECK; GONÇALVES; SCHWENGBER, 2006). O poder de reprodução das mesmas
é alto, sendo que estima-se que cada 8 minhocas, em condições favoráveis, produzam em seis
meses cerca de mil e quinhentos indivíduos (CHAVES; DUARTE, 2012).
Todos os seus órgãos vitais estão perto da boca e do clitelo; não possuem olhos, nem
ouvidos e geralmente evitam a luz direta do sol, preferindo ambientes sombreados e mais
úmidos, porém não encharcados. O tato e o paladar são os sentidos mais desenvolvidos nas
minhocas, sendo importantes, pois a ajudam a localizar os alimentos, identificar parceiros e
fugir de predadores (SCHIEDECK; GONÇALVES; SCHWENGBER, 2006).
Como possui aparelho reprodutor, excretor, reprodutores, circulatório, digestivo,
nervoso e muscular bastante desenvolvido não deveriam ser chamados de vermes (PEREIRA,
1997). São dotadas de cérebro, 5 corações, papo, moela, rins e intestino. O sangue é levado a
todo organismo do animal, por uma complexa ramificação (LONGO, 1995). A Figura 1
apresenta a fisiologia das minhocas.
Figura 1: Fisiologia das Minhocas
Fonte: http://dc365.4shared.com/doc/7wzkfuvp/preview.html
As minhocas conseguem se movimentar em todos os sentidos, graças a músculos
especiais que possuem, sendo distendidas ou retraídas, conforme o comando cerebral. Assim
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o animal pode empurrar-se para frente ou arrastar-se a outra parte para junto da anterior.
Possuem enorme força muscular, podendo remover pesos 60 vezes maiores que seu próprio
peso (LONGO, 1995).
As minhocas vivem bem com outros seres vivos, no interior do solo, removendo e
fertilizando o mesmo. Do que se alimenta, utiliza cerca de 30 a 40% para seu consumo
próprio, devolvendo o resto sob a forma de húmus. A sua alimentação é a base de vegetais
decompostos e resíduos orgânicos. Pelo fato de produzirem o húmus, as mesmas têm sido
amplamente comercializadas (PEREIRA, 1997). Estima-se que a minhoca ingere
aproximadamente o seu peso em alimento por dia, e o húmus criado por elas é cerca de 70%
mais rico em nutrientes que o húmus convencional. Esse húmus é neutro pelo fato de que as
minhocas apresentam glândulas calcíferas, que transformam o húmus e a matéria orgânica
em um produto neutro, auxiliando a correção do solo (LONGO, 1995).
Acredita-se que existam cerca de 8 mil espécies no mundo, enquanto que no Brasil são
conhecidas cerca de 240 a 260 espécies. O processo de vermicompostagem ocorre na digestão
das minhocas. A espécie mais utilizada para a produção de vermicompostagem é a Vermelha-
da Califórnia (Eisenia andrei), devido à sua capacidade de se adaptar aos cativeiros, grande
capacidade de produção de húmus e elevada capacidade de reprodução (SCHIEDECK;
GONÇALVES; SCHWENGBER, 2006).
As minhocas são animais ricos em proteínas, sendo que a composição média segundo
Pereira (2007) da espécie Eisenia foetida, encontra-se na Tabela 1.
Tabela 1 – Composição química da espécie Eisenia foetida
Componente % (peso seco) Carboidrato
Lipídios Proteína
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60-70 Fonte:Pereira (1997)
Em alguns países, como China e Japão, a minhoca vem sendo utilizada na alimentação
humana devido ao seu elevado teor de proteínas e na indústria farmacêutica para a produção
de medicamentos. No Brasil ainda não é de costume a utilização de minhocas na alimentação
humana, sendo utilizada para a alimentação de animais de pequeno porte, sob a forma de
farinha (PEREIRA, 1997).
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As minhocas são consideradas uma importante fonte de estudos ecotoxicológicos, pois
têm a capacidade de acumular metais e pesticidas em seu organismo, sendo assim
consideradas indicadores para controle de contaminação ambiental (CHAVES; DUARTE,
2012).
Segundo Longo (1995) a produção em larga escala de minhocas pode ser considerada
uma fonte rentável, não apenas como fonte de alimentos para pequenos animais e fabricação
de farinhas, mas também para a produção de húmus, bem como na regeneração de solos, já
que a mesma tem uma função importante na refertilização do solo, na recomposição da vida
do solo e na recolocação dos alimentos no solo em condições apropriadas a planta,
apresentando assim efeitos benéficos à agricultura. Na produção de húmus estima-se que a
minhoca é capaz de substituir mais de 80% de adubos químicos que dependem da produção
do petróleo.
2.2 Aminoácidos
Os aminoácidos são compostos orgânicos que apresentam em sua estrutura dois
grupos funcionais característicos: amino (-NH2) e carboxila (-COOH). Estes grupos estão
ligados a carbono α, no qual se encontra ligado um átomo de hidrogênio e uma cadeia lateral
variável (R), sendo o mesmo assimétrico, exceto na glicina. Aminoácidos com este carbono
assimétrico apresentam dois isômeros opticamente ativos: D (encontrado em antibióticos e
algumas bactérias) e L (encontrado nas proteínas dos seres vivos) (NELSON; COX, 2011),
conforme Figura 2.
Figura 2 – Estrutura geral de um aminoácido
R CH
NH2
COOH
Fonte: do autor
Segundo Damodaran, Parkin e Fennema (2010) este grupo R pode ser hidrofóbico ou
hidrofílico, de acordo com a interação com a água, classificando deste modo as proteínas em
apolares ou polares, respectivamente. Essa afinidade ou não pela água torna-se importante
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para a função das proteínas. Os aminoácidos apolares apresentam o grupo R constituídos por
cadeias orgânicas com características de hidrocarbonetos, tendo normalmente uma localização
interna na molécula de proteína; fazem parte desse grupo: valina (Val), leucina (Leu),
isoleucina (Ile), glicina (Gly), alanina (Ala), metionina (Met), prolina (Pro), fenilalanina (Phe)
e triptofano (Trp).
Por sua vez, segundo Marzzoco e Torres (1999), os aminoácidos polares apresentam o
grupo R que os capacitam a interagir com a água (completamente solúveis em água), sendo
normalmente encontrados na superfície da molécula da proteína, podendo estes ser:
� Ácidos (carga negativa): aspartato (Asp) e glutamato (Glu);
� Básicos (carga positiva): lisina (Lys), arginina (Arg) e histidina (His);
� Sem carga (neutro): serina (Ser), treonina (Thr), tirosina (Tyr), asparagina (Asn),
glutamina (Gln) e cisteína (Cys).
O Quadro 1 apresenta a fórmula estrutural dos aminoácidos citados anteriormente.
Quadro 1 – Fórmula estrutural dos aminoácidos
Aminoácido Fórmula Estrutural Aminoácido Fórmula Estrutural
Glicina
Tirosina
Alanina
Asparagina
Leucina
Glutamina
Valina
Aspartato
Isoleucina
Glutamato
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Aminoácido Fórmula Estrutural Aminoácido Fórmula Estrutural
Prolina
Lisina
Fenilalanina
Histidina
Serina
Triptofano
Treonina
Metionina
Cisteína
Fonte: adaptado de NELSON e COX (2011)
A partir de ligações peptídicas (Figura 3), que ocorre entre carbono e nitrogênio por
exclusão de uma molécula de água, os aminoácidos podem formar polímeros.
Figura 3 – Formação da ligação peptídica
Fonte: adaptada de MARZZOCO e TORRES (1999)
O número de aminoácidos numa cadeia polipeptídica é variável, podendo conter de
dois a milhares deles (MARZZOCO; TORRES, 1999). Por apresentarem um grupo ácido
(carboxílico) e um básico (amina) os aminoácidos são anfóteros, ou seja, apresentam
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comportamento tanto como ácido como também básico, podendo atuar em diferentes estados
de ionização, conforme o pH do meio (DAMODARAN; PARKIN; FENNEMA, 2010).
2.3 Proteínas
As proteínas devem ser entendidas como longas cadeias de aminoácidos unidas por
ligações peptídicas (CAMPBELL; FARREL, 2007; DAMODRAN; PARKIN; FENNEMA,
2010), que desempenham função estrutural e dinâmica nas células, formando os componentes
do esqueleto celular e das estruturas de sustentação, além de participar de praticamente todos
os processos biológicos e serem responsáveis, também, pelo transporte de moléculas. As
proteínas atuam no controle do metabolismo, sendo parte integrante dos mecanismos de
defesa dos organismos, são responsáveis por mecanismos de contração dos músculos e
controlam a atividades dos genes (NELSON; COX, 2011). Segundo Coultate (2004) as
mesmas apresentam peso molecular variando de 10.000 até vários milhões de Kilodaltons
(kDa).
A base da estrutura das proteínas são os polipeptídeos, que são formados por ligações
peptídicas entre o grupo –NH2 de um aminoácido e outro grupo –COOH de outro aminoácido.
Dependendo do número de ligações peptídicas são chamados de dipeptídeos, tripeptídeos,
polipeptídeos. Quando o peso ultrapassa 6000 Daltons (Da) a estrutura é considerada uma
proteína (MARZZOCO; TORRES, 1999).
O início das pesquisas bioquímicas foi concentrado no estudo das proteínas. As
mesmas fazem parte de um grupo de moléculas que apresentam propriedades físico-químicas
definidas, sendo assim mais facilmente caracterizadas e isoladas do que outras estruturas
como ácidos nucléicos, polissacarídeos e lipídios (VOET; VOET, 2011). Segundo Sgarbieri
(1996), as proteínas são nutrientes necessários e essenciais aos humanos e animais, devendo
por isso estarem presentes na alimentação em quantidade adequada. As proteínas por sua vez
contêm aminoácidos, sendo que alguns aminoácidos são sintetizados pelo organismo (os
chamados não essenciais), enquanto que os outros são fornecidos por fontes alimentares.
O valor nutritivo de uma proteína depende da sua digestibilidade e da composição ou
da presença de aminoácidos essenciais em quantidades e proporções adequadas, devendo os
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mesmos estarem em forma biodisponível. As proteínas podem estar na forma simples,
apresentando apenas aminoácidos na sua composição ou conjugadas. As que são encontradas
na natureza são formadas entre 18 a 25 aminoácidos. O que difere uma proteína das outras é o
número, tipo e a sequência de aminoácidos, bem como o formato das moléculas proteicas
(MARZZOCO; TORRES, 1999).
As proteínas, podem se apresentar, segundo Conn e Stumpf (2007), sob a forma
primária, secundária, terciária ou quaternária:
a) Primária: representado pelas ligações peptídicas entre os aminoácidos.
b) Secundária: representado por dobras na cadeia (α-hélice) que são estabilizadas por
pontes de hidrogênio.
c) Terciária: neste caso a proteína apresenta maior grau de enrolamento, surgindo as
pontes de dissulfeto para estabilizar a estrutura. A quantidade dessas ligações é
bastante variável entre as proteínas.
d) Quaternária: Estrutura bastante complexa, ocorrendo quando quatro cadeias
polipeptídicas se associam através de pontes de hidrogênio.
A estrutura nativa de uma proteína é o produto ambiente da proteína, uma entidade
bem definida, sendo considerado o mais estável com a energia livre mais baixa possível.
Fatores como pH, força iônica, temperatura e composição do solvente forçará a molécula a
assumir uma nova estrutura de equilíbrio. Diz-se que a proteína foi desnaturada quando a
mesma sofreu mudanças importantes nas estruturas secundária, terciária e quaternária, sem a
clivagem das ligações peptídicas da cadeia principal, originando assim uma estrutura mal
definida. Quando desnaturadas podem perder algumas de suas propriedades sem, no entanto
ocorrer nenhuma mudança química (DAMODARAN; PARKIN; FENNEMA, 2010).
As proteínas são mais resistentes ao ataque de enzimas proteolíticas em sua forma
nativa do que desnaturada (alteração da estrutura). Isso se explica pelo fato de que quando a
mesma estiver mais aberta (menos organizada), as enzimas possuem acesso a um maior
número de ligações peptídicas, aumentando desse modo o grau de hidrólise. Essa
desnaturação pode ser provocada por diversos fatores com temperatura e pH, sendo
geralmente um processo irreversível (SGARBIERI, 1996).
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Para se conhecer a estrutura primária de um polipeptídeo é necessário determinar
qualitativamente e quantitativamente os aminoácidos que a compõe, bem como a sequência
dos mesmos. Para conhecer a composição de aminoácidos de um polipeptídio ou de uma
proteína, é necessário realizar a hidrólise da mesma e realizar a determinação quantitativa de
cada aminoácido (SGARBIERI, 1996).
Segundo Damodaran, Parkin e Fennema (2010) as propriedades físico-químicas das
proteínas e peptídeos (estrutura, solubilidade) é a hidrofobicidade dos resíduos de
aminoácidos constituintes. Essa hidrofobicidade deve ser definida como o excesso de energia
livre de um soluto dissolvido em água, comparado ao de um solvente orgânico.
É importante observar que os grupos reativos (amino, carboxílico, hidroxila e outros)
presentes em proteínas e aminoácidos livres, têm a capacidade de realizar reações químicas.
Sendo assim essas reações podem ser usadas propositalmente com a intenção de alterar as
propriedades de proteínas e peptídeos (ibidem).
2.3.1 Propriedades funcionais e nutricionais de proteínas
Segundo Araújo (2008) as propriedades funcionais são definidas como as propriedades
físico-químicas que afetam o comportamento do alimento, ou de um dos seus componentes,
durante seu processo, influenciando nas propriedades sensoriais. As proteínas nos alimentos
podem ser influenciadas pela composição e sequência de aminoácidos, estruturas em que se
encontram, bem como a polaridade. As principais propriedades funcionais das proteínas em
alimentos são: capacidade de retenção ao óleo, capacidade emulsificante e capacidade de
retenção de água.
As propriedades funcionais das proteínas dependem das suas propriedades
físico-químicas, expressando o comportamento das proteínas em um sistema alimentício. Já
as propriedades funcionais de um determinado alimento dependem tanto das proteínas, como
dos outros componentes da sua composição. As propriedades funcionais podem ser avaliadas
quanto a sua afinidade pela água, pela sua capacidade das moléculas se unirem e formarem
uma película, da habilidade em formar ligações cruzadas e também as que se manifestam
pelos sentidos (SGARBIERI, 1996).
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Segundo Sgarbieri (1996) fatores como pH, agentes (químicos, físicos e biológicos)
nos processos de obtenção ou isolamento das proteínas, temperatura, método de extração,
força iônica, condições de secagem e estocagem da proteína isolada, podem afetar as
propriedades funcionais da mesma. Além disso, é importante considerar que as propriedades
dependem também de como será realizada a análise: isolado proteico, no sistema natural de
origem ou combinando-se o isolado proteico com outro alimento. Sendo assim essas
propriedades dependem do sistema em que são avaliadas, sendo que o resultado pode ser
afetado pelo meio e por eventuais interações com os demais componentes do sistema.
Por sua vez, o valor nutritivo de uma proteína depende da composição, digestibilidade,
biodisponibilidade dos aminoácidos essenciais e da ausência de toxicidade e/ou de
propriedades antinutricionais (ibidem).
2.3.2 Capacidade emulsificante
A emulsão consiste em um líquido imiscível, na forma de gotículas com diâmetro
superior a 0,1 mícron. Para se fazer uma emulsão é necessário: água, óleo, emulsificante e
energia mecânica. Quando as gotículas de óleo estão imersas na fase aquosa a emulsão é
classificada como óleo/água; já quando as gotículas de água estão dispersas na fase oleosa a
mesma é classificada como emulsão água/óleo (ARAÚJO, 2008).
Qualquer substância capaz de formar uma mistura homogênea, anteriormente
imiscível é chamada de agente emulsificante. Devem ser entendidos como moléculas que se
aderem às superfícies das gotículas, formando uma membrana protetora que evita a
agregação. As proteínas podem apresentar esta propriedade, pois migram para o interior da
emulsão óleo/água, tornando a mistura homogênea. A principal função destes agentes, que
possuem grupos hidrofílicos e lipofílicos, é promover a formação e estabilidade das emulsões
(ibidem).
A capacidade emulsificante é uma propriedade funcional primários em muitas
proteínas alimentícias por estarem relacionadas com a capacidade das proteínas de diminuir a
tensão interfacial entre os componentes hidrofóbicos e hidrofílicos em alimentos, sendo
importantes para produtos cárneos. Sendo assim o que torna uma emulsão estável é a presença
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de um agente emulsificante, sendo que o mesmo diminui a tensão superficial existente entre
as duas fases. Esse agente apresenta na sua molécula partes hidrofílicas e hidrofóbicas,
formando uma camada entre essas duas fases. São fatores que interferem na capacidade de
emulsão: temperatura, tamanho da partícula de gordura, pH, quantidade e tipo da proteína e
viscosidade. A intensidade no grau de polaridade do agente emulsificante determina a sua
aplicabilidade. É importante destacar dois aspectos em uma emulsão (SGARBIERI, 1996):
a) Capacidade de emulsificação: quantidade de lipídios que as proteínas são capazes
de emulsificar;
b) Estabilidade da emulsão: capacidade das proteínas em manter a mistura, quando
submetida à ação de uma força ou calor.
2.3.3 Capacidade de retenção de óleo
A capacidade de retenção do óleo é determinada a partir da quantidade que a amostra
(hidrolisado) tem de absorver certa quantidade de óleo. O mecanismo de retenção de absorção
de óleo é atribuído à ligação física do óleo. Observa-se que quanto maior for a densidade da
proteína, maior será a absorção do óleo, devido o caráter hidrófobo da proteína. Essa Essa
propriedade é fundamental para a aplicação em produtos à base de carne ou em produtos onde
a absorção de gordura é desejada (KRISTINSSON; RASCO, 2000).
2.3.4 Capacidade espumante
Segundo Damodaran, Parkin e Fennema (2010) as espumas consistem de uma fase
aquosa e uma gasosa, sendo que as minúsculas partículas de ar dispersas provocam as
propriedades sensoriais em produtos com essa propriedade. As proteínas são os agentes ativos
que ajudam na formação na formação e na estabilização da fase gasosa. Normalmente a
formação de bolhas ou simplesmente o fato de agitar uma solução proteica criam espumas
estabilizadas por proteínas.
Podem-se utilizar proteínas em alguns tipos de alimentos para estabilizar ou formar
espuma. As proteínas formam películas, estabilizando-se, ao redor da espuma. A adsorção e
união das proteínas (caráter hidrofóbico) reduzem a tensão superficial da água, facilitando a
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formação de maior quantidade de espuma, ate que ocorra a estabilidade. Quanto mais
facilmente a proteína for desnaturada, maior será o seu poder espumante (BELITZ;
GROSCH, 1997).
A capacidade de formação de espuma, por uma proteína, refere-se à expansão de
volume com o acréscimo de ar, por batimento, agitação ou aeração. Depende da natureza da
proteína, da solubilidade e do estado de desnaturação da proteína, da presença de sais e de
outros aditivos utilizados no processamento dos alimentos. É uma propriedade muito
importante já que as moléculas de proteína podem ser flexíveis para estender-se na interface
ar - água e estabilizar as novas células de ar (SGARBIERI, 1996).
Pode-se medir a capacidade de formação de espuma a partir do aumento do volume de
uma dispersão proteica, que pode ser provocada por agitação. Para que as mesmas tenham boa
capacidade de formar espuma, as proteínas devem formar uma membrana em torno das bolhas
de ar passando por certo grau de desnaturação que parece ser crítico para a estabilização das
espumas e de sua estrutura tridimensional (ibidem).
Geralmente o poder espumante aumenta com a concentração proteica, até um valor
máximo. A formação de espuma pode ser influenciada pelo pH, sais, açúcares, lipídios e a
concentração proteica (DAMODARAN; PARKIN; FENNEMA, 2010).
2.3.5 Digestibilidade in vitro
A digestibilidade é um fator extremamente importante na determinação do valor
nutritivo de uma proteína. As proteínas de origem animal apresentam digestibilidade acima de
90%, enquanto que as de origem vegetal abaixo de 80%; sendo que quando as proteínas são
isoladas de sua forma natural (com bastantes cuidados) e que sofreram desnaturação podem
apresentar maior grau de digestibilidade. No entanto desnaturações com a ação do calor
tendem a diminuir o grau de digestibilidade (SGARBIERI, 1996).
A digestibilidade de uma proteína representa a parte da proteína que pode ser
hidrolisada pelas enzimas digestivas; estas proteínas seriam então quebradas em aminoácidos,
estando disponíveis ao organismo humano. Nestes ensaios procura-se imitar as condições de
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acidez do estômago, sendo por isso chamada in vitro. Consiste numa propriedade importante,
pois representa o valor nutritivo de uma proteína (SGARBIERI, 1996).
2.3.6 Atividade antioxidante
A oxidação dos lipídios consiste num processo que acarreta a deterioração de muitos
alimentos, levando os mesmos a perda da qualidade e valor nutricional, podendo inclusive
ocasionar a formação de produtos tóxicos. A oxidação ocasiona a formação de radicais livres
que pode acarretar muitos problemas na saúde (BALTI et al., 2011). A oxidação nos
alimentos afeta a cor, flavor, vitaminas, minerais, carboidratos, lipídios e proteínas; sendo
necessário adicionar antioxidantes aos alimentos (ARAÚJO, 2008).
O efeito antioxidante consiste na inativação dos radicais livres, na complexação dos
íons metálicos ou na redução de hiperóxidos. A escolha de um antioxidante, segundo o
mesmo, deve estar baseada no seu conhecimento químico, seu modo de ação, sendo que a
estrutura do mesmo influi nas diferenças de atividades antioxidantes (ibidem).
2.4 Enzimas
As enzimas devem ser entendidas como proteínas, de elevado peso molecular, que
atuam como catalisadores de reações biológicas. Industrialmente são utilizadas, em forma
isolada ou conjugada, na obtenção de inúmeros produtos alimentícios. No que se refere à
produção de novos alimentos pela ação enzimática, é importante observar que as mesmas
promovem melhoria das características sensoriais, melhor controle de fabricação e em alguns
casos com menores custos operacionais. Quando se utiliza estes componentes biológicos em
alimentos, deve-se considerar a sua seleção e controle de atividade, inativando-a quando a
mesma for indesejável (MARZZOCO; TORRES, 1999). Segundo Lahl e Braun (1994) é
bastante frequente o uso de enzimas nas indústrias de alimentos com o intuito de converter
matérias-primas em produtos de elevada qualidade, resultando alimentos de alta
funcionalidade e elevado valor nutricional.
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O interesse industrial pelas enzimas se deve a fatores como: temperaturas mais
amenas, menor impacto ambiental, pH moderado e a pureza do produto final. Além desses
fatores é importante salientar o desenvolvimento de enzimas naturais e mais baratas
(CHERRY; FIDANTSEF, 2003). Segundo Lahl e Braun (1994) nas indústrias de alimentos e
pesquisas científicas as enzimas mais utilizadas são as hidrolases, proteases e lipases. As
proteases tem tido largo emprego por serem eficientes e por apresentarem custo mais baixo. A
escolha da enzima vai depender do substrato que se pretende hidrolisar e em qual extensão da
ligação se deseja a ruptura.
As enzimas são mediadoras de inúmeras reações essenciais à vida humana, no entanto
apesar de as mesmas estarem sujeitas as mesmas leis que comandam o comportamento de
outras substâncias, elas diferem de catalisadores químicos comuns em alguns aspectos como:
maior rendimento nas reações, condições mais amenas de reação, maior especificidade e
maior controle (VOET; VOET, 2011).
As enzimas são sensíveis aos agentes térmicos, principalmente calor, que pode gerar
modificações irreversíveis em sua configuração, comprometendo seu centro ativo.
Apresentam constituição característica, que as tornam aptas a desenvolver sua ação em
diversos meios (substratos) e que são adequados à sua atividade (MARZZOCO; TORRES,
1999).
O que as diferencia dos demais catalisadores é a sua importante propriedade de
apresentar ação específica sobre determinado substrato, que é resultante do encaixamento
estrutural entre o substrato e a enzima (chave e fechadura). O que reconhece, une e orienta o
substrato é o centro ativo da enzima, sendo que somente o substrato com o desenho
semelhante ao da superfície enzimática pode atingir este centro ativo (NELSON; COX, 2011).
As enzimas proteolíticas ou proteases degradam proteínas, produzindo polipeptídeos,
peptídeos e aminoácidos, desdobrando ainda amidas e ésteres de aminoácidos, podendo ser de
origem vegetal, animal ou microbiológica (EVANGELISTA, 2008). As mesmas pertencem ao
grupo das hidrolases, havendo a formação de água no produto, catalisando reações de
hidrólise das ligações peptídicas de proteínas (WHITAKER, 1994).
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Centenaro et al. (2009) relatam que a Alcalase é uma enzima alcalina produzida a
partir do Bacillus licheniformis, tendo sido utilizada por muitos pesquisadores para a
obtenção de hidrolisados proteicos; da mesma forma Schmidt (2008) cita em seu trabalho que
a Alcalase tem sido comprovada por muitos pesquisadores como sendo a melhor enzima para
a obtenção de hidrolisados proteicos em geral. A Flavourzyme é uma enzima produzida pela
fermentação de um tipo de Aspergillus oryzae, apresentando pH ótimo entre 5,0 e 7,0 e
temperatura ótima em torno de 50ºC (ROSSI, 2007).
2.5 Hidrolisados proteicos
Martins, Costa e Prentice-Hernandez (2009) relatam que os hidrolisados são proteínas,
que por ação química ou enzimática, são separadas em peptídeos de vários tamanhos.
Segundo os mesmos, são várias as utilizações de hidrolisados proteicos em produtos
alimentícios, como substitutos de leite, realçadores de sabor, suplementos proteicos,
estabilizadores de bebidas. Segundo Roman e Sgarbieri (2005), a hidrólise de proteínas tem
como principais objetivos alterar as propriedades funcionais e produzir aminoácidos e
pequenos peptídeos para serem utilizados em alimentos.
A hidrólise química ocorre em condições mais agressivas, com baixos rendimentos, de
difícil controle, baixos custos e tempo relativamente curto. A hidrólise enzimática, por sua
vez, ocorre em condições amenas, sendo as enzimas utilizadas biodegradáveis, porém os
custos ainda são relativamente altos, apresentam longo tempo de hidrólise, mas em
contrapartida originam produtos com altos rendimentos (RODRIGUES, 2009). Além disso, é
importante salientar que o uso de enzimas ao invés de soluções alcalinas ou ácidas, diminui os
riscos a saúde, visto que mudanças bruscas de pH, podem modificar as propriedades
nutricionais das proteínas, bem como as suas propriedades funcionais. Ainda podem provocar
alterações, aumentando as chances da racemização dos aminoácidos, promoverem a
destruição dos mesmos e formar subprodutos (SGARBIERI, 1996). É importante relatar que a
hidrólise enzimática leva a uma maior exposição de grupos carregados. Além disso, a reação
diminui o tamanho molecular e aumenta a hidrofilicidade das proteínas, a partir de um
aumento na capacidade de formar ligações de hidrogênio com a água, aumentando assim a
solubilidade (SATHIVEL et al., 2005).
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Segundo Pigott (1982), métodos químicos e biológicos são utilizados para realizar a
hidrólise, sendo que na prática industrial há predominância na utilização do método químico.
O mesmo salienta que quando se deseja produtos com alta funcionalidade e valor nutritivo o
método biológico com a ação de enzimas deve ser usado; a extração da proteína a partir do
tecido animal pode ser realizada com a utilização de água e solventes orgânicos, por
cozimentos, aplicação de altas pressões, secagem e extração a quente de óleo. Segundo
Fonkwe e Singh (1996) a hidrólise enzimática, além dos fatores anteriormente citados,
permite o controle do processo, ocasionando a obtenção de produtos com melhores
propriedades, além do que esse método é mais simples e eficiente. Adler (1986) relata que
fatores como reagentes químicos, tipo da enzima e substrato, pH, temperatura, tempo de
incubação e concentração da enzima são fatores determinantes para a produção de
hidrolisados por via enzimática.
Guadix et al. (2000) enfatizam que a vantagem da hidrólise enzimática sobre a
química se deve a fatores como: melhor controle sobre o processo (evitando formação de
subprodutos tóxicos), condições moderados de pH (4-8) e temperatura (40 a 60ºC), valor
nutricional é mantido, sem a degradação de aminoácidos. No entanto, tal método é bastante
lento, necessitando condições de assepsia para evitar contaminação durante o processo. Várias
proteases comerciais podem ser utilizadas para a hidrólise, sendo que a Alcalase opera numa
faixa de pH entre 4 e 11,5 e a uma temperatura entre 50 e 60ºC, atuando sobre a proteína e
rompendo a ligação entre os grupos amino e carboxila, que podem estar parcialmente
ionizados, dependendo do pH do meio, sendo portanto uma ótima alternativa para tal
processo. A hidrólise não consiste apenas de uma única reação, mas de uma série de reações
simultâneas, promovendo a ruptura das ligações. O mesmo conclui que uma das melhores
maneiras de se separar e identificar aminoácidos de hidrolisados é por Cromatografia a
Líquido de Alta eficiência por Exclusão Molecular (SE-HPLC), pois a mesma fornece
maiores informações sobre a composição do hidrolisado.
A Tabela 2 apresenta um comparativo entre hidrólise química e enzimática.
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Tabela 2 – Diferenças entre as características dos processos de hidrólise química e enzimática
QUÍMICA ENZIMÁTICA - Condições agressivas - Baixo rendimento - Baixo custo - Curto tempo - Difícil controle - Predomínio na indústria
- Condições amenas - Elevado rendimento - Elevado custo - Longo tempo - Controle do processo - Enzimas são biodegradáveis - Menos riscos à saúde - Condições moderadas de pH 4 a 8 e
temperatura 40 a 60º C - Valor nutricional é mantido, sem degradação
das proteínas Fonte: RODRIGUES (2009); SGARBIERI (1996); PIGOTT (1982); GUADIX et al. (2000)
No trabalho de Schmidt e Sallas-Mellado (2009), os mesmos relatam que a indústria
de alimentos vem utilizando a modificação enzimática das proteínas com o intuito de romper
ligações peptídicas; modificando assim as suas propriedades físico-químicas e funcionais,
sem, no entanto alterar o valor nutritivo. Neste relato afirmam que as enzimas mais utilizadas
para tal fim são as hidrolases, seguida das proteases e lipases; afirmando que tem sido
comprovado por vários pesquisadores que a Alcalase é a melhor enzima a ser utilizada para
tal finalidade. No estudo experimental estes autores obtiveram hidrolisados enzimáticos de
peito e coxa de frango, com a enzima Alcalase e Flavourzyme, com diferentes graus de
hidrólise conforme tempo de reação e relação enzima/substrato. Sendo assim os mesmos, em
sua pesquisa, concluíram que a Alcalase promoveu produtos com maior grau de hidrólise,
sendo que os hidrolisados podem ser utilizados como ingredientes alimentícios, observando-
se as propriedades funcionais desejadas.
Para se obter hidrolisados dos aminoácidos, alguns fatores devem ser cuidadosamente
avaliados no desenvolvimento dos métodos. Fatores esses como pH, temperatura, tipo da
enzima, tempo de hidrólise, tipo do substrato, concentração do substrato, relação
enzima/substrato e a inativação da enzima no fim do processo são fatores importantes e
determinantes na obtenção de hidrolisados com qualidade nutricional (CÂNDIDO et al.,
1998).
As proteínas, além de apresentar propriedades nutricionais, tecnológicas e funcionais,
podem apresentar certas propriedades, como antioxidante, associada a peptídeos bioativos que
são somente liberados após a hidrólise enzimática. Baseado nisso Costa, Gontijo e Netto
(2007), realizaram a hidrólise da proteína do soro do leite, com a enzima Alcalase, para
estudar o efeito das mesmas na pressão arterial de ratos. Jun et al. (2004) relataram em seu
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trabalho que os peptídeos bioativos devem ser entendidos como uma sequência de pequenas
cadeias de aminoácidos, inativos dentro da proteína, que quando liberados podem exercer
atividades de interesse para a conservação de alimentos. Peptídeos antioxidantes de linguado
de cauda amarela foram produzidos por hidrólise enzimática, utilizando pepsina e enzimas
intestinais de cavalo, sendo que os aminoácidos foram identificados por Cromatografia a
Líquido de Alta Eficiência (HPLC) com coluna de octadecilsilano (JUN et al., 2004).
Também Centenaro, Piotrowicz e Prentice-Hernandez (2008) propuseram obter hidrolisados
de músculo de frango e de corvina, utilizando a enzima Flavourzyme (1% em relação ao
substrato); como resultado o hidrolisado de frango apresentou grau de hidrólise de 46,9% e o
do pescado 59,8%, concluindo assim que essa protease pode ser utilizada para a hidrólise de
proteínas de origem animal.
Martins, Costa e Prentice-Hernandez (2009) realizaram uma pesquisa para a obtenção
de hidrolisados proteicos de pescados, a partir de corvina, utilizando o método químico e
enzimático. A extração por via enzimática foi realizada em reator de vidro encamisado,
utilizando as enzimas Alcalase e Flavourzyme. Neste estudo constatou-se que a Alcalase
promoveu um grau de hidrólise maior, sendo que as condições utilizadas foram: 0,5% de
concentração enzima/substrato, 60ºC, pH 8,0 por 1 h.
Kurosawa, Park e Hubinger (2009) avaliaram a influência do pH, temperatura, tempo
e relação enzima/substrato na hidrólise enzimática na carne de frango utilizando a enzima
Alcalase. Os pesquisadores citam que diversos relatos foram publicados com a relação à
hidrólise enzimática em catla (peixe), vísceras de carneiro, moluscos e outros. Nesse estudo
obtiveram os hidrolisados propostos, verificando que a temperatura é a variável com maior
efeito no grau de hidrólise das suas amostras.
Nas duas últimas décadas houve grande interesse de hidrolisados proteicos pela
indústria farmacêutica e alimentícia, para o desenvolvimento de dietas contendo ingredientes
funcionais capazes de controlar funções fisiológicas específicas. Há, também, peptídeos
capazes de controlar a enzima responsável pela regulação da pressão arterial; tais peptídeos
foram obtidos a partir de proteínas da soja, da pele de bacalhau utilizando a enzima Alcalase
(NEVES; CAMPOS; MARQUES, 2006).
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A extração de proteínas de cereais foi realizada a partir dos mais diversos solventes,
sendo que se verificou que a presença de lipídios e carboidratos pode interferir na separação
de proteínas. Usando a combinação de Alcalase e Flavourzyme foi possível realizar a extração
da proteína da soja com rendimentos em torno de 89 e 94%, bem como a extração da proteína
de arroz com rendimento de 75%. Avaliou-se, também, a extração enzimática das proteínas de
fubá de milho, sendo que o produto obtido apresentou rendimento de 83,8% sendo que o
tempo e a temperatura influenciaram diretamente no rendimento do processo
(CAPOBIANGO et al., 2006 ).
Schmidt (2008) relata em seu trabalho a obtenção de hidrolisados de frango, a partir
do peito e da coxa, utilizando as enzimas Alcalase e Flavourzyme. Com a Alcalase, o
pesquisador relata ter obtido hidrolisados com grau de hidrólise entre 18,6 a 57,4%. Além
disso, os hidrolisados dessa enzima apresentaram maiores valores de digestibilidade
(avaliados in vitro), quando comparados aos obtidos pelo uso da Flavourzyme. O mesmo
relata que a concentração da enzima, concentração do substrato e tempo de hidrólise são
importantes variáveis a serem consideradas no processo.
Centenaro (2009) relata diversos estudos a partir da hidrólise enzimática de proteína
de tubarão, salmão, soro de leite, proteína de soja, arenque, capelin, sardinha e soro de leite.
Enfatiza-se que a origem da proteína a ser utilizada como matéria-prima e seu respectivo grau
de hidrólise devem ser controlados de acordo com as propriedades funcionais que se desejam.
Os hidrolisados enzimáticos de corvina foram obtidos, com diferentes graus de hidrólise a
partir da enzima comercial Alcalase, confirmando que esta enzima pode ser considerada uma
das melhores para a obtenção de hidrolisados proteicos, conforme outras pesquisas relatam.
Dong et al. (2007) obtiveram hidrolisados enzimáticos de carpa prateada. Em seu
estudo foram utilizadas as enzimas Alcalase e Flavourzyme. O grau de hidrólise foi
influenciado pelos fatores como pH e tempo. Além disso, os hidrolisados em questão foram
estudados quanto a sua atividade antioxidante, bem como as suas propriedades bioquímicas.
Souisse et al. (2007) obtiveram hidrolisados de peixe, com cerca de 73 a 75% de proteínas,
com diferentes graus de hidrólise, a partir da cabeça e víscera da sardinha (Sardinella aurita),
utilizando a enzima Alcalase; além disso o hidrolisado apresentou boa atividade antioxidante.
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Pesquisas relatam que a qualidade da proteína utilizada, o método de hidrólise e o
tamanho da cadeia do produto obtido, refletem no valor nutricional do hidrolisado obtido. Os
hidrolisados de melhor qualidade devem conter baixo teor de aminoácidos livres e de
peptídeos com massa molecular superior a 800 Da, e também elevados teores de di e
tripeptídeos (SOARES et al., 2004).
Bhaskar et al. (2008) realizaram um trabalho para a obtenção de hidrolisados a partir
de visceras de catla (carpa de água doce), estudando o efeito do tempo, temperatura, pH e
relação enzima/substrato. Obtiveram um grau de hidrólise superior a 50% utilizando a enzima
Alcalase, nas condições de 135 min, 50ºC, pH 8,5 e 1,5% enzima/substrato. Os pesquisadores
concluíram que o produto obtido tem potencial para ser usado como ingrediente em dietas
balanceadas de peixes.
A produção de hidrolisado proteico a partir de carne mecanicamente separada de
carcaças de frango foi alvo do estudo de Rossi (2007). Em seu estudo foram utilizadas as
enzimas Alcalase e Flavourzyme, variando-se a temperatura, pH e concentração de enzima.
Para a enzima Alcalase as condições ideais foram de 50ºC, pH 7,5 e 2,5% de enzima; para a
Flavourzyme, as condições ideais foram 50ºC, pH 6,0 e 3,5% enzima. A Alcalase obteve uma
maior recuperação proteica de 89%, sendo utilizada para a produção do hidrolisado proteico.
Santos et al. (2009) avaliaram as variáveis na obtenção de hidrolisado enzimático de
peixes, utilizando as enzimas Alcalase e Flavorzyme. O maior grau de hidrólise foi obtido
com a Alcalase (34,7%), nas condições: pH 7,5, temperatura de 70ºC, e 0,5% a relação de
enzima/substrato, durante 1 h. Souisse et al. (2007) promoveram a hidrólise de vísceras de
Sardinella aurita, utilizando a enzima Alcalase mantendo pH em 8,0 e a 50ºC obtendo grau
de hidrólise de 10,16% .
Foh et al. (2011) obtiveram hidrolisados de tilápia (Oreochromis niloticus), com a
enzima Alcalase. Neste estudo as condições que apresentaram maior grau de hidrólise foram
em pH 8,0 55°C, 1,5% a concentração enzima/substrato, por um período de 2 h. Os graus de
hidrólise obtidos foram aproximadamente entre 23,40 e 25,43%.
Salazar-Posada, Lopes-Padilla e Cano-Salazar (2012) realizaram estudo do efeito do
pH e da temperatura na hidrólise enzimática de subprodutos bovinos, mais precisamente do
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extrato do osso. Em sua pesquisa foram utilizadas as enzimas Alcalase e Flavourzyme. Os
mesmos observaram que a temperatura tem um efeito positivo no grau de hidrólise com a
Alcalase, sendo que o maior grau de hidrólise foi de 8,21% a 55ºC e pH 5,79. Já quando foi
utilizada a Flavourzyme o grau de hidrólise obtido foi de 20,23% a 45ºC e pH 6,5 , sendo que
o pH apresentou um efeito significativo no grau de hidrólise.
São poucos os estudos sobre hidrolisados de minhoca. Liu et al. (2003) relataram o
estudo de hidrolisados de minhoca, sendo o estudo realizado em pH 6,5 a 50 ºC durante 8 h,
com 1% de enzima (codificada pelo nome de ASL.398), obtiveram 72,09% de rendimento.
Dessa forma torna-se importante verificar a hidrólise enzimática de minhocas, uma vez que
ela possui elevado teor de proteínas e pode ser utilizada como suplemento alimentar para
peixes e outros animais de pequeno porte.
2.6 Técnicas de determinação quantitativa de aminoácidos em hidrolisados
Segundo Araujo (2007) a técnica de HPLC é a mais usada para determinar
aminoácidos. Ela consiste num processo de migração em que os componentes da amostra são
seletivamente retidos pela fase estacionária (líquida ou sólida). Utiliza-se como fase móvel
um líquido no qual a amostra seja solúvel, já que envolve a integração dos componentes da
mistura com a fase móvel. A fase estacionária, sólida, consiste em pequenas partículas
empacotadas em colunas pequenas (menores de 30 cm), podendo operar a temperatura
ambiente até 65ºC e sendo operada com elevada pressão. Utiliza de equipamentos sofisticados
e automatizados, gerando resultados precisos (ARAÚJO, 2008). Este tipo de cromatografia
tem a capacidade de realizar separações e análises quantitativas de uma gama de compostos
presentes em vários tipos de amostras, em escala de tempo de poucos minutos com alta
resolução, eficiência e sensibilidade (ARAUJO, 2007).
A análise de aminoácidos, por cromatografia, é geralmente utilizada por derivatização
pré ou pós-coluna, com o objetivo de aumentar a sensibilidade e a seletividade de detecção,
sendo que existem vários tipos, cada qual com características próprias, dependendo do grupo
de interesse. Para analisar os aminoácidos é necessário hidrolisar a proteína e dependendo do
tipo de tratamento, eliminar os reagentes utilizados para tal finalidade (SCHIMADZU,
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www.schimadzu.com.br). Vários estudos relatam a determinação de aminoácidos por HPLC:
Alpert et al. (1990); Biasutti (2006); Carreira et al. (2003); Soares et al. (2004).
Soares et al. (2004) relatam a existência de duas patentes relativas a preparação
industrial de hidrolisados proteicos de caseína, com excelente qualidade, com a utilização de
enzimas bacterianas, tripsina (isoladas ou em associação), sendo que os fracionamentos foram
separados por HPLC e de troca ligante.
Na pesquisa realizada por Alpert et al. (1990) empregando-se as colunas de poli-(2-
hidróxietilaspartamida)-sílica (PHEA) e a polisulfoetil aspartamida (PSA) foi possível separar
13 aminoácidos. Estas colunas foram utilizadas empregando a técnica de HPLC com interação
hidrofílica. Já na pesquisa realizada por Carreira et al. (2002) foi realizada a separação e a
identificação de hidrolisados de caseína, utilizando a coluna de PHEA e detector
espectrofotométrico de ultra violeta visível, não sendo necessária a derivação pré coluna e
permitindo trabalhar de modo isocrático.
Carreira et al. (2003) descrevem em sua pesquisa a utilização de técnicas
cromatográficas no fracionamento de peptídeos de hidrolisados proteicos, como:
Cromatografia de Exclusão Molecular (SEC) e Cromatografia Líquida de Troca de Ligantes.
Em seu trabalho os mesmos separaram, identificaram e quantificaram hidrolisados de caseína
usando pepsina, por HPLC com coluna de PHEA. A mesma coluna foi utilizada por Silva et
al. (2009) para separar e quantificar hidrolisados de soro de leite, por Cromatografia a Líquido
de Alta Eficiência por Exclusão Molecular (SE-HPLC); neste trabalho a pancreatina mostrou-
se eficiente na clivagem das ligações peptídicas.
Biasutti (2006) obteve em seu trabalho, hidrolisados proteicos de soro de leite
utilizando como enzimas a subtilisina e pancreatina. Foram testadas diversas condições como
tempo, temperatura e concentração da enzima. Para a separação dos aminoácidos empregou-
se a técnica de SE-HPLC, contendo o complexo poli-(2-hidroxietil-aspartamida)-silica
(PHEA).
Existe uma variedade de detectores para a técnica de HPLC, devendo-se optar de
acordo com os parâmetros desejados, de acordo fase móvel e da amostra. Os detectores mais
utilizados são: detectores por absorvância no ultravioleta e visível, detectores por
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fluorescência, detectores por índice de refração, detectores por espalhamento de luz e
detectores químicos (COLLINS; BRAGA; BONATO, 2006).
2.7 Determinação de proteínas total
Existem diversos métodos para a determinação de proteínas totais em alimentos,
porém o mais utilizado é o método de Kjeldahl. Este método, reconhecido internacionalmente
se baseia na degradação química da proteína e conversão do nitrogênio total a íons amônio.
O método de Kjeldahl consiste basicamente de três fases: digestão, destilação e
titulação. A digestão da amostra é feito em tubo contendo ácido sulfúrico, mantendo-se em
aquecimento ate que a mesma adquira a cor azul ou verde claro. A seguir a amostra digerida é
destilada, para que ocorra a eliminação da amônia. Por fim titula-se com Ácido Clorídrico
0,1 N. O teor total de proteínas é obtido segundo a equação (ESTEVES, 2006):
Proteína Total (%): V x f x 0,014 x 6,25 x100
P
Onde:
V: Volume gasto de HCl 0,1 N
f: Fator do HCl 0,1 N
0,014: miliequivalente grama do nitrogênio
6,25: fator de conversão geral do nitrogênio em proteína (origem animal)
P: peso em grama
2.8 Determinação de proteína solúvel
Diversos estudos determinaram a quantidade de proteínas solúveis pelo método de
Lowry et al. (1951), que é um método colorimétrico para a dosagem de concentração de
proteínas. Este método baseia-se numa mistura contendo tungstanato de sódio, ácido
clorídrico e ácido fosfórico (reagente Folin), que sofre uma redução quando reage com
proteínas na presença de Cu (II), reduzindo o composto com absorção máxima em 750 nm
(ZAIA et al., 1998).
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Segundo Zaia et al. (1998) esta técnica é muito utilizada para determinar proteínas em
alimento e no tecido animal; porém apesar de ser bastante sensível pode estar sujeita a ação de
diversos interferentes. Estes interferentes podem aumentar o valor de absorvância do branco
ou a formação de algum tipo de precipitado. O uso de ácido tricloroacético (TCA), para
provocar a precipitação das proteínas, elimina a maior parte de interferentes deste método.
2.9 Separação de proteínas por eletroforese
Segundo Simpson (2003) a eletroforese em gel de poliacrialamida é um dos métodos
mais confiáveis para avaliar a separação de proteínas em uma mistura e para avaliar a pureza
das mesmas. Além disso, auxiliam na determinação da massa relativa de uma proteína, na
detecção de modificações protéicas, na verificação da concentração de proteínas, no
mapeamento de peptídeos entre outras.
A Dodecil Sulfato de Poliacrilamida (SDS - PAGE) é uma técnica muito utilizada
para a separação de proteínas, com base em seu tamanho. A mesma consiste numa
eletroforese desnaturante, visto que a amostra é desnaturada por calor, rompendo as pontes de
dissulfeto. A amostra é colocada em um gel e aplica-se um campo elétrico, movendo as
proteínas maiores mais lentamente que as menores. Com o intuito de identificar as proteínas
na amostra, padrões de proteínas de um tamanho conhecido são carregados juntamente com as
amostras e são executados sob as mesmas condições. Além do peso da proteína, outro fator
que influencia são os tamanhos dos poros do gel, podendo-se utilizar géis com gradientes de
até 20%. Dessa forma as proteínas grandes ficarão retidas no início da corrida e os pequenos
peptídeos irão migrar até o final do gel na eletroforese (LOVRIC, 2011); (NELSON; COX,
2011).
Como as partículas são carregadas com velocidades diferentes, ocorre a formação de
zonas distintas. Desse modo a eletroforese pode ser aplicada para a separação de componentes
de uma mistura, bem como para criar imagens características de um determinado substrato.
Utilizada principalmente para analisar proteínas e peptídeos, já que as mesmas são anfóteras,
cuja carga depende do pH e do seu meio. Como podem torna-se com carga positiva ou
negativa, migram em direção ao cátodo ou ânodo (WESTERMEIR et al., 2006).
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3 METODOLOGIA
3.1 Soluções tampões
As soluções tampões foram preparadas com fosfato de sódio monobásico e dibásico,
utilizando-se pHmetro de bancada digital marca Digimed, modelo DM-20 (LUTZ, 2005).
3.2 Enzimas utilizadas
As enzimas utilizadas neste estudo foram Alcalase 2.4 L e Flavourzyme 1000 L MG,
ambas fornecidas pela Novozymes Latin America Ltda.
3.3 Hidrólise enzimática das minhocas
Para a realização deste trabalho foram utilizadas amostras de minhocas (25 g) da
espécie Vermelha da Califórnia (Eisenia andrei), oriundas dos minhocários verticais
instalados no laboratório de Experimentação I da Univates, provenientes do projeto de
pesquisa intitulado de “Bioprodução de hidrolisados proteicos e avaliação de metais pesados
em farinha de minhoca e em biossólidos a partir de vermicompostagem vertical”. As
minhocas foram alimentadas exclusivamente com resíduos orgânicos, dando preferência a
alimentos sem sal, sendo as mesmas mantidas a uma temperatura média de 25ºC e com teor
de umidade do húmus em 80%.
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A Figura 4 exemplifica as minhocas utilizadas neste trabalho, oriundas de minhocários
utilizados para vermicompostagem e a Figura 5 representa um minhocário vertical.
Figura 4: Minhocas em processo de vermicompostagem
Fonte: redwormcomposting.com
Figura 5: Minhocário vertical
Fonte: minhocario.eco.br
Baseado em trabalhos Chae et al. (1998); Hathwar et al. (2011); Schmidt (2008);
Schmidt; Sallas-Mellado (2009); Rossi (2007); sobre hidrólise enzimática, optou-se em
realizar um planejamento experimental para o processo de hidrólise da minhoca, que segundo
Rodrigues (2009) reduz o número de experimentos, melhorando a qualidade da informação
obtida e consequentemente a diminuição do trabalho, tempo e custo final. Optou-se em
realizar um planejamento experimental completo para as 5 variáveis independentes em
estudo: pH, temperatura, relação enzima/substrato, tempo de incubação e grau de agitação; a
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partir de uma estratégia 25 com 10 pontos axiais e 3 repetições no ponto central, utilizando o
Software Statística versão 7.0, totalizando 45 testes de hidrólise para cada enzima. A Tabela 3
evidencia os níveis codificados do planejamento experimental para as 5 variáveis em estudo; a
Tabela 4 demonstra os valores das variáveis do planejamento experimental para as 5 variáveis
em estudo.
Tabela 3 – Planejamento experimental empregado para hidrólise enzimática das minhocas
pH
Temperatura
Tempo
Agitação
Enzima/Substrato
1 -1,00000 -1,00000 -1,00000 -1,00000 -1,00000 2 -1,00000 -1,00000 -1,00000 -1,00000 1,00000 3 -1,00000 -1,00000 -1,00000 1,00000 -1,00000 4 -1,00000 -1,00000 -1,00000 1,00000 1,00000 5 -1,00000 -1,00000 1,00000 -1,00000 -1,00000 6 -1,00000 -1,00000 1,00000 -1,00000 1,00000 7 -1,00000 -1,00000 1,00000 1,00000 -1,00000 8 -1,00000 -1,00000 1,00000 1,00000 1,00000 9 -1,00000 1,00000 -1,00000 -1,00000 -1,00000 10 -1,00000 1,00000 -1,00000 -1,00000 1,00000 11 -1,00000 1,00000 -1,00000 1,00000 -1,00000 12 -1,00000 1,00000 -1,00000 1,00000 1,00000 13 -1,00000 1,00000 1,00000 -1,00000 -1,00000 14 -1,00000 1,00000 1,00000 -1,00000 1,00000 15 -1,00000 1,00000 1,00000 1,00000 -1,00000 16 -1,00000 1,00000 1,00000 1,00000 1,00000 17 1,00000 -1,00000 -1,00000 -1,00000 -1,00000 18 1,00000 -1,00000 -1,00000 -1,00000 1,00000 19 1,00000 -1,00000 -1,00000 1,00000 -1,00000 20 1,00000 -1,00000 -1,00000 1,00000 1,00000 21 1,00000 -1,00000 1,00000 -1,00000 -1,00000 22 1,00000 -1,00000 1,00000 -1,00000 1,00000 23 1,00000 -1,00000 1,00000 1,00000 -1,00000 24 1,00000 -1,00000 1,00000 1,00000 1,00000 25 1,00000 1,00000 -1,00000 -1,00000 -1,00000 26 1,00000 1,00000 -1,00000 -1,00000 1,00000 27 1,00000 1,00000 -1,00000 1,00000 -1,00000 28 1,00000 1,00000 -1,00000 1,00000 1,00000 29 1,00000 1,00000 1,00000 -1,00000 -1,00000 30 1,00000 1,00000 1,00000 -1,00000 1,00000 31 1,00000 1,00000 1,00000 1,00000 -1,00000 32 1,00000 1,00000 1,00000 1,00000 1,00000 33 -2,37841 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 34 2,37841 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 35 0,00000 -2,37841 0,00000 0,00000 0,00000 36 0,00000 2,37841 0,00000 0,00000 0,00000 37 0,00000 0,00000 -2,37841 0,00000 0,00000 38 0,00000 0,00000 2,37841 0,00000 0,00000 39 0,00000 0,00000 0,00000 -2,37841 0,00000 40 0,00000 0,00000 0,00000 2,37841 0,00000 41 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 -2,37841 42 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 2,37841 43 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 44 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 45 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000
Fonte: do autor
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Tabela 4 – Valores das variáveis do planejamento experimental em estudo
pH Temperatura(ºC) Tempo (h) Agitação (rpm) Enzima/Substrato(%) 6,3 38 1,52 58 2,67 6,3 38 1,52 58 5,83 6,3 38 1,52 142 2,67 6,3 38 1,52 142 5,83 6,3 38 2,99 58 2,67 6,3 38 2,99 58 5,83 6,3 38 2,99 142 2,67 6,3 38 2,99 142 5,83 6,3 57 1,52 58 2,67 6,3 57 1,52 58 5,83 6,3 57 1,52 142 2,67 6,3 57 1,52 142 5,83 6,3 57 2,99 58 2,67 6,3 57 2,99 58 5,83 6,3 57 2,99 142 2,67 6,3 57 2,99 142 5,83 8,2 38 1,52 58 2,67 8,2 38 1,52 58 5,83 8,2 38 1,52 142 2,67 8,2 38 1,52 142 5,83 8,2 38 2,99 58 2,67 8,2 38 2,99 58 5,83 8,2 38 2,99 142 2,67 8,2 38 2,99 142 5,83 8,2 57 1,52 58 2,67 8,2 57 1,52 58 5,83 8,2 57 1,52 142 2,67 8,2 57 1,52 142 5,83 8,2 57 2,99 58 2,67 8,2 57 2,99 58 5,83 8,2 57 2,99 142 2,67 8,2 57 2,99 142 5,83 5,00 47,5 2,25 100 4,25 9,5 47,5 2,25 100 4,25 7,25 25,0 2,25 100 4,25 7,25 70,0 2,25 100 4,25 7,25 47,5 0,50 100 4,25 7,25 47,5 4,00 100 4,25 7,25 47,5 2,25 0 4,25 7,25 47,5 2,25 200 4,25 7,25 47,5 2,25 100 0,50 7,25 47,5 2,25 100 8,00 7,25 47,5 2,25 100 4,25 7,25 47,5 2,25 100 4,25 7,25 47,5 2,25 100 4,25
Fonte: Do autor
3.4 Preparo da amostra
As minhocas foram deixadas por 24 h, em repouso em água, e após foram lavadas em
água e acondicionadas em sacos plásticos e estocadas em freezer comum a -10,5ºC, sendo
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descongeladas em refrigerador, a 6ºC, 12 h antes do uso. A amostra foi então moída em Mixer
Black Britânia de 200 W e transferida para erlenmeyer (reator), onde foi adicionado 25 mL de
solução tampão de fosfato de sódio monobásico e dibásico, de acordo com o pH desejado na
proporção 1:1 (massa substrato:volume solução tampão). A quantidade da enzima (Alcalase e
Flavourzyme), pH, tempo de incubação, temperatura e agitação do meio foi conforme
planejamento experimental descrito anteriormente, sendo que a variação das condições
(mínima e máxima) respectivamente foram de: pH de 5,0 a 9,5 , temperatura de 25 a 70ºC,
tempo de incubação de 0,5 a 4 h, relação enzima/substrato (m/m) de 0,5 a 8,0% e agitação do
meio de 0 a 200 rpm, baseados nos trabalhos de Schmidt (2008); Schmidt e Sallas-Mellado
(2009); Rossi (2007); Hathwar et al. (2011); Chae et al. (1998). As condições de temperatura
e agitação da hidrólise foram controladas em Incubadora Refrigerada MA 830 Marconi.
Transcorrido o tempo de hidrólise pré-definido, alíquotas de 1 mL do hidrolisado
(triplicata) foram inativadas pela adição de 9 mL de solução de ácido tricloroacético (TCA)
6,25%, sendo deixadas em repouso por cerca de 15 min. A seguir a amostra foi filtrada, sendo
separado o líquido do sobrenadante, posteriormente a parte líquida (chamada hidrolisado) foi
congelada até a realização da análise de teor de proteínas solúveis, utilizando o método de
Lowry et al. (1951) onde foi estimado o grau de hidrólise como a porcentagem de proteínas
solúveis em relação a quantidade de proteína total, que foi calculado a partir da equação:
Grau de Hidrólise: Proteína final (hidrolisado) – Proteína inicial
Proteína total da Amostra (por Kjeldahl)
Onde a proteína final corresponde à quantidade de proteína solúvel nas condições de
hidrólise desejadas, a proteína inicial corresponde à quantidade de proteína solúvel
imediatamente após a adição da enzima (inativadas com TCA 6,25%), e a proteína total
corresponde à quantidade de proteína total na amostra determinada por Kjeldahl, utilizando-se
fator de correção 6,25 que corresponde a proteína animal (N x 6,25)
Para os demais testes a enzima foi inativada por aquecimento a 80ºC por 25 min,
sendo a amostra centrifugada e o sobrenadante separado e congelado em freezer comum a
-10,5ºC.
O fluxograma da Figura 6 mostra o processo descrito.
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Figura 6 – Processo de obtenção do hidrolisado de minhoca
Minhocas mantidas 24 h em repouso em água
Repouso
Erlenmeyer proporção 1 :1 ( Massa substrato: volume solução tampão)
Adicionada Enzima alícota 1 mL
Incubadora Refrigerada
(controle temperatura, tempo e agitação) alícota 1 mL
Inativação da enzima
Centrifugação
Sobrenadante (hidrolisado) Análises
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3.5 Métodos Analíticos
Cabe salientar que todas as análises foram feitas em triplicata, com a amostra que
apresentou maior grau de hidrólise. Já para o planejamento experimental foram feitos testes
individuais.
3.5.1 Análises Físico-Químicas
A matéria-prima e o hidrolisado protéico, da melhor condição de hidrólise, tiveram sua
composição físico-química determinada de acordo com a metodologia recomendada pela
Official Methods of Analysis (AOAC) (2005):
• Proteínas: utilizando o método de Kjeldahl (N x 6,25)
• Cinzas: método gravimétrico em mufla, aquecendo-se a amostra na temperatura de
550 – 600ºC.
• Umidade: método gravimétrico em estufa, aquecendo-se a mistura a 105ºC.
• Lipídios: método gravimétrico de extração a quente de lipídios utilizando extrator de
Soxhlet.
3.5.2 Análise quantitativa de aminoácidos por HPLC
Com a amostra que apresentou a condição ótima de hidrólise foi realizado um estudo
quantitativo de aminoácidos por HPLC, em laboratório externo da Univates, pertencente à
Universidade Federal de Santa Maria: LAMIC – Laboratório de Análises Micotoxicológicas.
3.5.3 Análise de proteínas por eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE)
Inicialmente amostras de minhoca antes da hidrólise e do hidrolisado, foram
quantificadas pelo método de Lowry et al. (1951), com o intuito de quantificar a proteína
solúvel, utilizando albumina sérica como padrão.
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O gel de corrida 12% utilizado foi composto de uma solução de acrilamida/bis-
acrilamida 40% (39% de acrilamida e 1% de bis-acrilamida), Tris 0,37 M pH 8,8, SDS 0,1%,
20 µL de persulfato de amônio 10% e 3 µL de TEMED, em volume total de 5 mL. O gel de
entrada consistiu em acrilamida 4,5%, bis acrilamida 0,1%, Tris 0,125 M pH 6,8, SDS 0,1%,
20 µL de persulfato de amônio 10% e 3 µL de TEMED, em um volume total de 2,5 mL.
A corrida foi realizada em tampão de corrida gelado (1,44% de glicina, 0,3% de Tris e
SDS 0,01%). Será utilizado o Mini-Protean Tetra Cell (Bio-Rad) cuba de eletroforese vertical
para géis de 13 cm, alimentado por fonte de eletroforese nas condições: 100 V, 20 mA por
gel. Foram realizados no mínimo três mapas proteicos (géis) por amostra, objetivando garantir
a reprodutibilidade da técnica.
Os géis foram corados com solução de Coomassie Blue R-250 1% em metanol (50%)
e ácido acético (7%) por 3 horas. Após, os géis foram descorados em solução de metanol
(50%) e ácido acético (7%) por 2 horas, e digitalizados, baseando-se no método de Laemmli e
Favre (1973).
3.6 Análises das propriedades funcionais
3.6.1 Capacidade emulsificante (CE)
A capacidade emulsificante do hidrolisado proteico obtido na condição ótima de
hidrólise, foi determinada baseando-se no trabalho de Schmidt (2008), adaptada as condições
da nossa amostra. Foi preparada uma suspensão contendo 1 g de amostra (cerca de 0,03 g de
proteína) com 1 mL de solução de NaCl 3%, em agitador de soluções (vórtex) modelo AP 56
marca Phoenix Luferco, nº série 14864 por 30 segundos em velocidade média. Com auxílio
de uma pipeta foram adicionados 0,9 mL de óleo vegetal de soja sob agitação. A emulsão
formada foi transferida para tubos de centrífuga e levados a um banho de água a 85ºC por 15
minutos. Após as amostras foram centrifugadas por 40 minutos em centrífuga. O volume de
óleo separado em cada amostra após a centrifugação foi transferido para uma pipeta graduada
e efetuada a leitura. A diferença entre a quantidade de óleo medido e a quantidade de óleo
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adicionado foi expressa como a quantidade de óleo emulsificado por grama de proteína
contida na amostra, e calculada da seguinte forma:
CE = quantidade de óleo emulsificado (mL)
massa de proteína (g)
3.6.2 Propriedades espumantes (CFE)
A capacidade de formação de espuma do hidrolisado obtido na condição ótima de
hidrólise foi determinada baseando-se no trabalho de Schmidt (2008), adaptada as condições
da nossa amostra. Primeiramente foi preparada uma suspensão protéica de 5 g de amostra
(cerca de 0,175 g de proteína) com 3,2 mL de água. A suspensão foi agitada em agitador de
soluções (vórtex) modelo AP 56 marca Phoenix Luferco, nº série 14864 por 5 minutos sob
agitação média, em seguida foi transferida a dispersão para uma proveta graduada de 10 mL.
A capacidade de formação de espuma foi calculada como a porcentagem de aumento de
volume após a agitação em relação ao volume inicial, e foi calculada da seguinte forma:
CFE = (B – A) x 100
A
Onde: A = volume antes da agitação (mL);
B = volume após a agitação (mL).
3.6.3 Digestibilidade in vitro
A avaliação nutricional do hidrolisado de minhoca obtido na condição ótima de
hidrólise foi realizada mediante a determinação da digestibilidade in vitro, baseando-se no
trabalho de Schmidt (2008), adaptada as condições da amostra desse estudo. Inicialmente foi
pesada uma quantidade de amostra que correspondesse ao equivalente a 0,5 g de proteína. Foi
adicionada à mesma 15 mL de uma solução de 1,5 mg de pepsina por mL de HCl 0,1 N e após
foi adicionado 0,5 mL de solução de digluconato de clorexidina (10 mg/mL),
homogeneizando e levado a banho-maria a 37ºC por 3 horas, com agitação periódica.
Decorrido este tempo os tubos contendo as amostras foram resfriados e a solução foi ajustada
a pH 8,0 com uma solução de NaOH 0,2 N.
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Ao produto hidrolisado pela pepsina, foi adicionado 10 mL de uma solução de
pancreatina (0,5 mg de pancreatina por mL de tampão fosfato pH 8,0) e foi deixado em
banho-maria a 37ºC, porém por 24 horas com agitação periódica. Após o tempo de hidrólise
foram adicionados 5 mL de uma solução de TCA 5% a amostra e a mesma foi centrifugada
por 15 minutos para separação do material insolúvel, sendo o filtrado recolhido para posterior
determinação do nitrogênio digerido, pelo método de Kjeldhal. A digestibilidade in vitro foi
expressa como a porcentagem de nitrogênio digerido em relação ao nitrogênio total na
amostra inicial, e foi calculada da seguinte forma:
Digestibilidade (%) = Nitrogênio digerido x 100
Nitrogênio total
3.6.4 Atividade antioxidante
A atividade antioxidante, do hidrolisado na condição ótima de hidrólise, foi
determinada a partir da avaliação do hidrolisado concentrado pela captura do radical livre,
2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH), in vitro segundo Mensor et al. (2001). Nesse método
utilizou-se solução de DPPH a 0,004% em metanol, utilizando uma curva padrão de ácido
ascórbico diluída em metanol. Foram realizadas em triplicata, sendo as absorbâncias lidas em
espectrofotômetro a 517 nm.
Para avaliar a atividade antioxidante do hidrolisado, os mesmos foram reagidos com
DPPH em solução metanólica. Havendo atividade antioxidante o concentrado transfere
elétrons, reduzindo o DPPH, que pode ser observada pela mudança de cor e pela redução dos
valores de absorvância.
Da amostra retirou-se 1 mL que foi acrescido da solução metanólica anteriormente
citada e realizada leitura após 30 min. A atividade antioxidante foi expressa de acordo com a
equação :
% Atividade Antioxidante = 100 – (Aa – Ab) x 100
Ac
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Sendo:
Aa: absorbância da amostra
Ab: absorbância do branco
Ac: Absorbância do controle
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4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Caracterizações físico-químicas da matéria-prima
A Tabela 5 mostra os resultados obtidos para as análises de cinzas, umidade, proteína
e lipídios da minhoca Eisenia andrei.
Tabela 5 – Composição físico-química da Eisenia andrei
Propriedade % ( Base úmida) % ( Base seca) Desvio padrão
Umidade 86,54 - 0,01
Cinzas 0,83 6,17 0,01
Proteína
Lipídios
9,55
1,70
65
10
0,14
0,08
Fonte: Do autor
O valor de proteína encontrado de 9,55% na base úmida corresponde a
aproximadamente 65% se for considerada a base seca. Sendo assim o valor encontrado está de
acordo com Pereira (2007) que afirma que o valor de proteína, em minhocas, situa-se entre 60
a 70% (base seca).
O teor encontrado de lipídios de 1,7% na base úmida corresponde a cerca de 10% se
for considerada a base seca. Desse modo o valor encontrado está de acordo com Pereira
(2007) que afirma que o valor de lipídios, em minhocas, é de 9% (base seca).
Não existem dados na literatura em relação à umidade e cinzas da minhoca, sendo
assim não é possível comparar os resultados obtidos com outras pesquisas. No entanto o valor
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de 6,17% (base seca) indica baixo teor de compostos inorgânicos, logo elevada quantidade de
matéria orgânica.
4.2 Resultados do planejamento experimental de hidrólise de minhoca
4.2.1 Condição de hidrólise para Alcalase e Flavorzyme
A Tabela 6 mostra os valores dos graus de hidrólise obtidos com as enzimas Alcalase
e Flavourzyme.
Tabela 6 – Graus de hidrólise com as enzimas Alcalase e Flavorzyme nas condições estudadas
pH Temperatura(ºC) Tempo (h)
Agitação (rpm)
Enzima/Substrato(%) Grau hidrólise
Alcalase(%)
Grau hidrólise Flavorzyme(%)
6,3 38 1,52 58 2,67 9,80 2,62 6,3 38 1,52 58 5,83 41,18 4,89 6,3 38 1,52 142 2,67 42,03 2,87 6,3 38 1,52 142 5,83 43,93 3,78 6,3 38 2,99 58 2,67 27,60 2,92 6,3 38 2,99 58 5,83 37,58 6,74 6,3 38 2,99 142 2,67 41,74 2,84 6,3 38 2,99 142 5,83 39,43 3,98 6,3 57 1,52 58 2,67 12,61 1,78 6,3 57 1,52 58 5,83 23,87 2,38 6,3 57 1,52 142 2,67 21,40 3,53 6,3 57 1,52 142 5,83 18,43 2,25 6,3 57 2,99 58 2,67 12,32 1,55 6,3 57 2,99 58 5,83 18,84 4,23 6,3 57 2,99 142 2,67 19,85 3,34 6,3 57 2,99 142 5,83 21,72 1,29 8,2 38 1,52 58 2,67 2,74 3,54 8,2 38 1,52 58 5,83 32,16 3,68 8,2 38 1,52 142 2,67 40,34 1,93 8,2 38 1,52 142 5,83 12,28 1,51 8,2 38 2,99 58 2,67 15,12 4,02 8,2 38 2,99 58 5,83 33,44 3,90 8,2 38 2,99 142 2,67 13,04 4,48 8,2 38 2,99 142 5,83 19,09 2,64 8,2 57 1,52 58 2,67 19,27 3,31 8,2 57 1,52 58 5,83 9,44 5,50 8,2 57 1,52 142 2,67 13,02 6,85 8,2 57 1,52 142 5,83 7,82 3,27 8,2 57 2,99 58 2,67 4,90 3,77 8,2 57 2,99 58 5,83 4,97 2,13 8,2 57 2,99 142 2,67 8,77 4,11 8,2 57 2,99 142 5,83 9,83 1,70 5,00 47,5 2,25 100 4,25 16,79 2,49 9,5 47,5 2,25 100 4,25 16,65 1,08 7,25 25,0 2,25 100 4,25 6,06 2,08
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pH Temperatura(ºC) Tempo (h)
Agitação (rpm)
Enzima/Substrato(%) Grau hidrólise
Alcalase(%)
Grau hidrólise Flavorzyme(%)
7,25 70,0 2,25 100 4,25 13,67 2,51 7,25 47,5 0,50 100 4,25 20,18 2,03 7,25 47,5 4,00 100 4,25 16,40 1,81 7,25 47,5 2,25 0 4,25 13,30 5,33 7,25 47,5 2,25 200 4,25 22,75 5,31 7,25 47,5 2,25 100 0,50 12,15 2,74 7,25 47,5 2,25 100 8,00 11,62 2,85 7,25 47,5 2,25 100 4,25 18,31 3,93 7,25 47,5 2,25 100 4,25 18,09 2,73 7,25 47,5 2,25 100 4,25 19,13 2,33
Fonte: Do autor
Utilizando-se de programas estatísticos observou-se que o nível de significância das
variáveis de hidrólise com a Alcalase foram inferiores a 0,05, enquanto que com a
Flavorzyme esses valores foram superiores a 0,05. Com base nesse resultado e nos graus de
hidrólise, adotou-se a Alcalase como a enzima com maior eficiência na obtenção de
hidrolisados enzimáticos de minhocas.
A Tabela 7 mostra o nível de significância das variáveis estudadas com a Alcalase.
Tabela 7 – Nível de significâncias das 5 variáveis estudadas para o grau de hidrólise com a
Alcalase
Variável Efeito P pH 11,0992 0,000579 Temperatura -13,6717 0,000382 Tempo - 2,1722 0,014806 Agitação 3,0178 0,007754 Enzima/substrato 2,4099 0,01280
Fonte: Do autor
Como se pode observar pela Tabela 7 as variáveis de maior significância foram a
temperatura e o pH. No trabalho de Santos et al. (2009) a temperatura e o pH foram a
variáveis de maior significância, sendo importante observar que nesse trabalho foram testadas
condições de obtenção de hidrolisados de pescado variando-se as temperatura de 43,2 a
76,8ºC e pH entre 7,10 a 8,84 , ou seja, dentro da faixa considerada ideal para a Alcalase
segundo o fabricante.
Salazar-Posada; Lopes-Padilla e Cano-Salazar (2012) ao obterem hidrolisados de
ossos de bovino, também concluíram que a temperatura foi a variável com maior
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significância. Rossi (2007) observou que a temperatura, pH e a concentração da enzima
tiveram efeito no grau de hidrólise relatado. Com base no exposto, observa-se que os
resultados encontrados neste trabalho, estão de acordo com as pesquisas anteriores.
Conforme já foi mencionada na revisão bibliográfica, o pH , a temperatura, o tipo do
substrato e a enzima são os fatores que irão determinar o grau de hidrólise obtido. Sabe-se que
de acordo com a faixa de pH e temperatura haverá uma maior eficiência ou não da enzima a
ser utilizada, confirmando assim os resultados obtidos.
Utilizando-se programas estatísticos, a partir das condições do planejamento
experimental chegou-se a condição ótima de hidrólise com a enzima Alcalase: pH 9,5, 25ºC,
2,15 h , 200 rpm e 1,77% relação enzima/substrato, resultando grau de hidrólise de 89%.
Observa-se desse modo que a enzima com maior eficácia para a obtenção de
hidrolisados enzimáticos de minhoca, com maior grau de hidrólise, foi a Alcalase. Esse
resultado corrobora com Schmidt e Sallas-Mellado (2009); Martins; Costa e Prentice-
Hernandez (2009); Rossi (2007) que testaram as enzimas Alcalase e Flavorzyme quanto ao
grau de hidrólise de proteínas a partir de matéria-prima de origem animal, concluindo também
que a Alcalase apresenta maior eficiência.
O grau de hidrólise obtido, no presente estudo, de 89% é igual ao grau de hidrólise
obtido por Rossi (2007) com carcaças de frango. Porém é bastante superior ao grau de
hidrólise obtido por Schmidt (2008) com frango, que obteve 57,4% e de Santos (2009) com
peixes que foi de 34,7% e de Foh et al. (2011) com hidrolisados de tilápia cuja grau de
hidrólise foi 25,43%. Sendo assim constata-se um excelente grau de hidrólise, nas condições
estabelecidas para a hidrólise de minhocas. Um dos fatores que pode ter contribuído para o
elevado grau de hidrólise é o baixo teor de lipídios da matéria-prima (1,70%). Segundo
Schmidt e Sallas-Mellado (2009) relatam que a quantidade elevada de lipídios acarreta em
grau de hidrólise mais baixo, ao fato que uma quantidade relativamente alta de lipídios
poderia formar complexos proteína/lipídio, sendo estes mais resistentes à hidrólise
enzimática.
Guadix et al. (2000) relatam que a Alcalase opera numa faixa ótima de pH entre 4 e
11,5 e de temperatura de 50 a 60ºC. Com base nos resultados obtidos observa-se que o pH da
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condição ótima desse trabalho (pH 9,5) está de acordo com os pesquisadores citados, porém a
temperatura (25ºC) encontra-se num patamar abaixo da faixa. É importante salientar que
todos os trabalhos citados no item 2.5 estudaram a relação entre 3 variáveis, com intervalos
pequenos, gerando um número reduzido de condições. Neste trabalho foram envolvidas 5
variáveis, o que acarretou maior número de ensaios. Sendo assim provavelmente essa
temperatura mais baixa, se deve a combinação de fatores, até então não estudada e também ao
tipo do substrato ser bastante diferente dos anteriormente estudados, visto que praticamente
não há relatos de hidrolisados de minhocas. Outro fator que pode contribuir para temperatura
ideal ser mais branda é o fato do substrato em questão apresentar elevada quantidade de
umidade; logo as ligações peptídicas se rompem a uma temperatura mais amena. Segundo
Souisse et al. (2007) o tipo do substrato é um dos principais fatores que influenciam a
hidrólise.
Com relação à quantidade de enzima/subtrato a condição ótima desse estudo revelou
ser 1,77%. Observa-se que essa proporção é bastante variável, dependendo do tipo do
substrato; Rossi (2007) utilizou a proporção de 2,5% com carcaças de frango, Santos (2009)
0,5% para peixes, Foh et al. (2011) 1,5% para tilápias. Com base nos resultados
apresentados sugere-se que a proporção de 1,77% está dentro do utilizados em trabalhos
semelhantes, porém com outro tipo de matéria-prima.
A condição ideal relatada neste trabalho foi com pH 9,5. No trabalho de Souisse et al.
(2007) em que obtiveram hidrolisados de sardinelas, o pH com a Alcalase foi mantido 8,0;
Zavareze et al. (2009) obtiveram hidrolisados de pescados mantendo o pH em 8,0; Santos et
al. (2009) obtiveram hidrolisados de pescado em pH 9,5. Com bases nesses estudos observa-
se que o pH do maior grau de hidrólise de minhoca está de acordo com trabalhos anteriores e
dentro da faixa ideal de pH para essa enzima.
No que se refere ao tempo da melhor condição, nesse trabalho foi observado ser de
2,15 h, corroborando com o tempo utilizado por Santos et al. (2009) que foi de 2 h, porém
temperatura de 60ºC. Já no trabalho de Zavareze et al. (2009) o tempo foi de 1 h a 60ºC;
sendo assim observa-se que o tempo pode estar relacionado com todas as variáveis em estudo,
inclusive ao tipo de substrato, o que explicaria os resultados encontrados nesse trabalho.
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4.3 Composições físico-químicas do hidrolisado
A Tabela 8 mostra a composição físico-química do hidrolisado obtido na melhor
condição de hidrólise.
Tabela 8 – Composição físico-química do hidrolisado obtido na melhor condição de hidrólise
Componente Resultado base úmida (%)
Resultado base seca (%)
Desvio padrão
Umidade Proteína Cinzas Lipídios
93,01 3,50 0,55 0,14
- 50,07 7,86 2,00
0,08 0,05 0,01 0,03
Fonte: Do autor
O hidrolisado obtido apresentou 93,01% de umidade; comparando-se com o
hidrolisado de frango obtido por Schmidt (2008) antes do mesmo sofrer a secagem, observa-
se que apresentou umidade em torno de 85 a 93%. Considerando que na hidrólise de frango a
matéria-prima apresentou umidade de 75 a 79%, inferior a da minhoca (86,54%), conclui-se
que a umidade obtida no hidrolisado de minhoca está dentro do esperado, porém cabe
ressaltar que a carne de frango é diferente da carne da minhoca.
No trabalho de Balti et al. (2011) foi encontrado teor de cinzas de 4,96% para
hidrolisados de lula; já no trabalho de Silva, Park e Hubinger (2010) o índice encontrado no
hidrolisado de mexilhão foi de 11,14%. Comparando-se com estes estudos sugere-se que o
teor encontrado de 7,86%, no hidrolisado de minhoca, está dentro do esperado.
O teor de lipídios encontrado no hidrolisado de pescado por Neves, Mira e Marquez
(2004) foram entre 0,90% e 1,80%, porém deve-se ressaltar que os mesmos foram
liofilizados. Já nos hidrolisados de minhoca o percentual encontrado, na base úmida, foi
inferior (0,14%) o que constitui um aspecto favorável, em relação à oxidação lipídica e a
estabilidade durante o armazenamento, conforme mencionado pelos autores do trabalho
citado. Se for considerada a base seca o índice encontrado de 2% é semelhante ao encontrado
no trabalho anteriormente citado.
O percentual de proteína encontrado no hidrolisado de minhoca (3,5%) é bastante
inferior a outros trabalhos: hidrolisado de pescado em média 75% (NEVES; MIRA;
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MARQUEZ, 2004), 72,97% nos hidrolisados de carne de mexilhão (SILVA;PARK;
HUBINGER, 2010), porém é importante ressaltar que ambos hidrolisados comparados
sofreram secagem, o que acarreta a diferença dos valores encontrados. Optou-se por não
realizar a secagem dos hidrolisados deste trabalho, devido à elevada umidade da matéria-
prima, o que acarretaria a necessidade de grande quantidade de minhoca, o que levaria a um
custo mais elevado, inviabilizando a sua comercialização no futuro. No entanto se for
considerada a base seca o teor de proteínas obtido foi de 50,07%, sendo também inferior aos
trabalhos citados, porém representando um elevado valor protéico.
Além disso, é importante salientar que não há praticamente trabalhos com minhocas, o
que torna difícil a comparação com os resultados obtidos neste trabalho.
4.4 Análise do hidrolisado por eletroforese em gel de poliacrilamida – SDS PAGE
A Figura 6 mostra o resultado obtido na análise por eletroforese em gel, comparando-
se um padrão, a amostra antes da hidrólise e a amostra após a hidrólise da condição ótima do
experimento.
Figura 7 – Eletroforese SDS- PAGE comparativa antes e após a hidrólise
Fonte: Do autor Legenda: MW= padrão com meso molecular conhecido Hidrol = produto hidrolisado Controle= produto antes da hidrólise
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No que se refere à amostra antes de ocorrer a hidrólise, observou-se várias bandas de
proteínas. Já na amostra hidrolisada observou-se uma diminuição bastante acentuada das
bandas, indicando que as proteínas foram clivadas. Percebeu-se que o perfil das proteínas foi
substancialmente alterado em relação ao controle.
O resultado obtido por essa técnica vai ao encontro ao grau de hidrólise obtido nesse
trabalho que foi de 89%. No trabalho de Silva; Park e Hubinger (2010), no qual os mesmos
obtiveram hidrolisados a partir de mexilhões e na análise por eletroforese realizada também
apresentou uma diminuição da intensidade das bandas, corraborando com os resultados
obtidos nesta pesquisa. Na eletroforese em gel realizada nos hidrolisados obtidos a partir de
resíduos de tilápia, realizada por Silva (2010), também se verificou uma diminuição das
bandas do hidrolisado em relação ao padrão e o controle, o que confirma os resultados obtidos
nos hidrolisados de minhoca.
Ademais, é importante salientar que a Figura 7 ilustra que houve diferença na
composição da proteína, porém isso não precisa ser necessariamente igual ao número de
aminoácidos, ou seja, pode ter ocorrido a quebra de grandes proteínas ate pequenas proteínas.
4.5 Análise de aminoácidos por cromatografia a liquido de alta eficiência
A Tabela 9 mostra a quantidade de aminoácidos na matéria-prima e no hidrolisado
obtido na melhor condição de hidrólise.
Tabela 9 – Análise de aminoácidos por HPLC da minhoca e do hidrolisado
Aminoácidos Minhoca (g/100 g) base úmida Hidrolisado (g/100 g) base úmida Aspartato 0,94 0,43 Glutamato 1,05 0,52 Serina 0,47 0,24 Glicina 0,43 0,17 Histidina 0,51 0,14 Arginina 0,62 0,23 Treonina 0,43 0,17 Alanina 0,42 0,19 Prolina 0,29 0,12 Tirosina 0,32 0,12 Valina 0,34 0,20 Isoleucina 0,29 0,19 Leucina 0,65 0,33 Fenilalanina 0,37 0,17
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Aminoácidos Minhoca (g/100 g) base úmida Hidrolisado (g/100 g) base úmida Lisina 0,28 0,27 Total 7,44 3,53
Fonte: Do autor
Com base na Tabela 9, observa-se que tanto a minhoca in natura como o hidrolisado
obtido apresentam boa parte dos aminoácidos essenciais ao organismo humano ou animal. No
que se refere à quantidade total de aminoácidos, o hidrolisado apresentou cerca de 47,44% de
aminoácidos livres.
Analisando individualmente os aminoácidos a capacidade de lise das proteínas no
hidrolisado foi: Aspartato (45,74%), Glutamato (49,52%), Serina (51,06%), Glicina (30,53%),
Histidina (27,45%), Arginina (37,09%), Treonina (39,53%), Alanina (45,23%), Prolina
(41,37%), Tirosina (37,5%), Valina (58,82%), Isoluecina (65,51%), Leucina (50,76%),
Fenilalanina (45,95%), Lisina (96,42%). Comparando-se esses resultados observa-se que a
Lisina foi o aminoácido que apresentou maior hidrólise, enquanto que o que apresentou a
menor foi a Histidina.
As variações na composição de aminoácidos dos hidrolisados em relação ao substrato
in natura (minhoca), pode ser decorrente da distribuição variável dos aminoácidos entre o
hidrolisado e o resíduo protéico insolúvel, além de que deve ser considerado o elevado teor de
umidade do substrato. Comparando-se com o trabalho de Silva; Park e Hubinger (2010)
observa-se que a quantidade de aminoácidos no substrato do mexilhão é superior ao da
minhoca, bem como o nível de recuperação dos mesmos. No entanto deve-se salientar que na
análise de aminoácidos deste trabalho foi considerada a base úmida, que é parte
predominante, enquanto que no trabalho citado o percentual refere-se a g/100 g de proteína.
No trabalho de Neves; Marquez e Mira (2004) os mesmos realizaram um estudo do
perfil de aminoácidos de hidrolisados de pescado. Os autores citam que a alteração da
distribuição dos aminoácidos entre a fração protéica solúvel e insolúvel, pode ser um
resultado do tratamento térmico para inativar a enzima ao final do processo de hidrólise; o que
explicaria os resultados encontrados nesse trabalho, já que parte dos aminoácidos pode ter
ficado na parte insolúvel; desse modo futuramente poderia ser estudada seca e usada como
suplemento alimentar.
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4.6 Análises das propriedades funcionais e nutricionais
4.6.1 Capacidade emulsificante
A quantidade de óleo emulsificado por grama de proteína do hidrolisado com maior
grau de hidrólise foi 0,39 mL/g (± 0,06) na base úmida; se for considerada a base seca foi de
5,57 mL/g.
Sabe-se que o grau de hidrólise e a especificidade da enzima influenciam na
capacidade emulsificante (SOARES et al, 2000). No trabalho de Roman e Sgarbieri (2005)
apenas o hidrolisado de menor grau de hidrólise apresentou propriedade emulsificante, já que
segundo esses pesquisadores, a hidrólise parcial geralmente diminui o peso molecular,
aumenta o número de grupos apolares e hidrofóbicos, alterando a forma da proteína; já
quando ocorre uma hidrólise extensiva das proteínas, como é o caso desse estudo, resulta em
perda das propriedades funcionais de superfície.
Comparando-se o resultado obtido neste trabalho com os de outros trabalhos, observa-
se a obtenção de um valor mais baixo, já que Schmidt (2008) em seu trabalho de hidrólise de
carne de frangos, encontrou o valor de 9 mL por grama de proteína, observando também que a
medida que aumentava o grau de hidrólise, diminuía a capacidade emulsificante. Em seu
trabalho o mesmo ainda observou que conforme o músculo (peito ou coxa) a propriedade
emulsificante sofria variação. No estudo das propriedades funcionais de cabrinha, também é
relatado que à medida que aumenta o grau de hidrólise, diminui a capacidade de emulsão
(ZAVAREZE et al., 2009).
Por sua vez, no trabalho de Centenaro et al. (2009), foram avaliados hidrolisados de
corvina e na análise da propriedade emulsificante desse pescado, obteve valores entre 6 a 12,5
g/mL de proteína, conforme o grau de hidrólise.
Ressalta-se que foi realizado testes com o produto de maior grau de hidrólise, o que
acarretou valores baixos, indo ao encontro aos estudos anteriormente relatados em que essa
propriedade diminuía, com o aumento do grau de hidrólise. Desse modo os hidrolisados de
minhoca não seriam bons aditivos para alimentos do tipo salsicha (SCHMIDT, 2008).
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4.6.2 Propriedade espumante
Na amostra analisada não houve formação de espuma. Esse resultado provavelmente
se deve ao fato de que o hidrolisado obtido apresenta baixa quantidade de proteína, conforme
Tabela 8. Segundo Cândido et al. (1998), quando a proteína se difundir na interface ar/água e
orientar-se de forma a baixar a tensão interfacial e se polimerizar, haverá a formação de
espuma; salientando-se que essa propriedade está relacionada com a propriedades da proteína
constituinte. Sendo assim como o produto obtido tem cerca de 3,50% de proteína esse
processo provavelmente não chegou a ocorrer.
Comparando-se com outros trabalhos observa-se que Schmidt (2008) avaliou a
capacidade de formação de espuma de hidrolisados de frango com a enzima Alcalase, obtendo
valores entre 10 a 57,3%. Porém é importante ressaltar que tais hidrolisados apresentam uma
quantidade muito superior de proteína.
No trabalho de Govindaraju e Srinivas (2006), que avaliaram hidrolisados de farinha
de amendoim, utilizando a enzima Alcalase, ao testar a propriedade de formação de espuma
do seu hidrolisado, constatou que após uma hidrólise elevada, essa propriedade reduziu de 23
para 8,63%. Desse modo, isso poderia explicar o fato de o hidrolisado de minhoca não
apresentar a capacidade de formação de espuma, visto que o grau de hidrólise obtido foi
elevado.
4.6.3 Digestibilidade in vitro
O resultado da digestibilidade in vitro do hidrolisado com maior grau de hidrólise foi
72,57% (± 1,06).
Observa-se que o hidrolisado analisado obteve uma boa digestibilidade, porém se
comparado com os obtidos de outras fontes apresentou um valor inferior. Segundo Schmidt
(2008) um menor grau de digestibilidade pode ser ocasionado quando ocorre a desnaturação
durante o processo, sendo assim sugere-se que possa ter ocorrida pequena desnaturação na
inativação enzimática, visto que não há estudos da matéria-prima utilizada neste trabalho.
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No estudo de Schmidt (2008) os hidrolisados de frango, na condição ótima da enzima
Alcalase, apresentaram digestibilidade entre 93,70 a 97, 76%. Em seu trabalho o mesmo relata
que outros estudos obtiveram elevados valores de digestibilidade como os hidrolisados de
corvina, com valores superiores a 96%; hidrolisados de tilápia do Nilo cujo grau encontrado
foi de 95%. Foh et al. (2011), obtiveram hidrolisados de tilápia cuja digestibilidade
encontrada foi superior a 87%.
Centenaro (2009) relata que a digestibilidade aumenta à medida que aumenta o grau
de hidrólise, fato esse que confirma a obtenção de uma digestibilidade de 72,57%. Além
disso, o mesmo afirma que moléculas de menor peso molecular são facilmente digeridas e
absorvidas, aumentando o valor nutritivo.
É importante salientar que todos os hidrolisados comparados anteriormente foram
secos, logo o hidrolisado desse estudo, por ser líquido, irá apresentar digeastibilidade
diferente dos demais.
Ademais, cabe ressaltar que, o valor de digestibilidade do hidrolisado de minhoca,
tornam a proteína hidrolisada da minhoca um satisfatório e promissor suplemento nutricional.
A minhoca demonstra ser uma nova fonte de proteína, cuja digestibilidade é elevada.
4.6.4 Atividade antioxidante
O hidrolisado não apresentou atividade antioxidante. Souisse et al. (2007) relatam que
diversos hidrolisados de peixes apresentaram atividade antioxidante. Acredita-se que o fato da
amostra estar na forma líquida, ou seja, diluída, seja o motivo para a mesma não apresentar
atividade antioxidante.
Segundo Costa; Gontijo e Netto (2007) a atividade antioxidante de uma proteína se
deve a presença de peptídeos bioativos, que são liberados após a hidrólise enzimática. Ainda
segundo Neves, Campos e Marquez (2006) a atividade antioxidante depende da sequencia,
composição e massa molecular dos aminoácidos. Sendo assim sugere-se que o hidrolisado de
minhocas não contem esses peptídeos bioativos.
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5 CONCLUSÕES
O planejamento experimental apresentou a melhor condição de obtenção de
hidrolisados enzimáticos de minhoca. A partir dos resultados do mesmo, observou-se a
obtenção de hidrolisados enzimáticos de minhoca com diferentes graus de hidrólise, maiores
para os obtidos com a enzima Alcalase comparados com aqueles obtidos com a enzima
Flavourzyme, corroborando com o relatado por outros autores. As variáveis de maior
significância foram o pH e a temperatura.
Obteve-se um hidrolisado com elevado grau de hidrólise (89%) e com boa propriedade
funcional como grau de digestibilidade in vitro, sendo fonte de aminoácidos essenciais.
Comparando-se com outros trabalhos, verificou-se que o hidrolisado obtido apresenta
baixa capacidade emulsificante, não apresentando a propriedade de formação de espuma e de
atividade antioxidante.
Com relação aos aminoácidos presentes após ocorrer a hidrólise, verificou-se que o
hidrolisado de minhoca apresentou cerca de 47,44% de aminoácidos livres. Provavelmente a
parcela restante de aminoácidos pode estar na parte insolúvel do produto obtido, que não foi
alvo deste estudo.
A hidrólise enzimática mostrou ser um eficiente processo de obtenção de proteína
hidrolisada a partir de uma matéria-prima nova e de baixo valor agregado, podendo ser
utilizada no futuro na alimentação de pequenos animais. Sendo assim sugere-se novas linhas
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de pesquisa com a parte insolúvel do hidrolisado e avaliar alguns tipos de conservante para ser
adicionado ao hidrolisado, podendo dessa forma o produto ser oferecido ao mercado.
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