NUEVAS TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO DE

ENFERMEDADES DEL CAMARÓNNIMIADINA HERRERA T

XI SIMPOSIO INTERNACIONAL

DE CAMARON DE CULTIVO Y EXHIBICION COMERCIAL

LAS ENFERMEDADES

EL MAYOR DESAFIO

LA COSTOS DE

PRODUCCION#1,

ENFERMEDADES #2

EN ASIA LAS

ENFERMEDADES SON #1

¿Cómo disminuimos el

impacto?

• Identificación

del agente

causal de la

enfermedad

• Técnicas no

invasivas

• Alta

especificidad y

sensibilidad

MANEJO - CONTROL The role of genomics in shrimp

improvement. a.tassanakajon

•Histopatología

•Hibridación in situ

•Ensayo de anticuerpos monoclonales,

•Inmunohistoquímica

•Cromatografía de flujo lateral

•Microscopía electrónica.

•Métodos moleculares (PCR, PCR de un paso,

anidados, tiempo real, isotermal (aislada o loop

mediated), digital.

TECNICAS DE DIAGNOSTICO

ACTUALES

Histórico

Frederick Sanger

ANALISIS DE LOS DATOS

DIAGNOSTICO MOLECULAR

Incluye técnicas de biología molecular

en beneficio de la salud humana y de las

especies animales de interés económico,

detectando y/o cuantificando secuencias

genéticas específicas de ácido

desoxirribonucleico (ADN), ácido

ribonucleico (ARN) o proteínas

Técnicas Moleculares

Herramientas de la Biología Molecular

• Aloenzimas, Southern,

Northern, Dot Blot

• RFLP’s

• PCR- simples, multiples,

cuantitativas

– Microsatélites

– AFLP’s

• SECUENCIACION

– Sanger

– NGS

• MICROARREGLOS

PGH

3BILLONES DE PARES DE

BASES ES DECIR 3GB

GENOMA DEL CAMARON

ES DE 2.5 GB

LOS “OMA”

• Genoma: Gen + cromosoma. Núcleo.

• Proteoma

• Metaboloma

• Microbioma

• La biología de sistemas se dedica a estudiar

las interacciones que se están produciendo

dentro de una célula en respuesta a cualquier

cambio externo o interno y así establecer la red

de interacciones (el interactoma).

Una hoja de ruta de la secuenciación

PlatformTemplate

PreparationChemistry

Max

Read

length

(bases)

Run Times

(days)

Max Gb per

Run

Roche 454 Clonal-emPCR Pyrosequencing 400‡ 0.42 0.40-0.60

GS FLX

TitaniumClonal-emPCR Pyrosequencing 400‡ 0.42 0.035

Illumina MiSeqClonal Bridge

Amplification

Reversible Dye

Terminator2x300 0.17-2.7 15

Illumina HiSeqClonal Bridge

Amplification

Reversible Dye

Terminator2x150 0.3-11 1000

Illumina

Genome

Analyzer IIX

Clonal Bridge

Amplification

Reversible Dye

Terminator[13][14]2x150 2-14 95

Life

Technologies

SOLiD4

Clonal-emPCR

Oligonucleotide 8-

mer Chained

Ligation

35-50 4-7 35-50

Life

Technologies

Ion Proton

Clonal-emPCRNative dNTPs,

proton detection200 0.5 100

Complete

Genomics

Gridded DNA-

nanoballs

Oligonucleotide 9-

mer Unchained

Ligation[17][18][19]

7x10 11 3000

Helicos

Biosciences

Heliscope

Single

Molecule

Reversible Dye

Terminator35‡ 8 25

Pacific

Biosciences

SMRT

Single

Molecule

Phospholinked

Fluorescent

Nucleotides

10,000

(N50);

30,000+

(max)[20]

0.08 0.5

NGS Platforms

15

DATOS

1. Especificidad (pueden detectar solo la molécula o microorganismo de

interés),

2. Sensibilidad (son capaces de detectar la presencia de un solo

microorganismo), VIH

3. Rapidez (se puede identificar un microorganismo en menos de 24

horas) y

4. Pueden ser automatizadas (permiten tener un diagnóstico en un

menor tiempo y reducir los costos).

5. Identificar nuevos microorganismos, los cuales no había sido posible

su cultivo e identificación por técnicas tradicionales

6. Permiten estudiar las poblaciones microbianas sin hacer

aislamientos, de microorganismos altamente patógenos, los cuales

pueden ser identificados muertos evitando así los riesgos de

infección del analista

7. Nuevas variantes de enfermedades genéticas, cáncer, enfermedades

infecciosas

DIAGNOSTICO MOLECULAR

Transportar la PCR desde la mesa de trabajo en el laboratorio

a la Finca.

POCKIT Xpress

cubee mini centrifuga

Pipetas

Analizador de Acidos Nucleicos

1000ul

50ul

1. Relacionado con las enfermedades de la lista de la OIE

2. Fines:

a. vigilancia;

b. “certificación” de existencias o de la instalación

c. diagnóstico de la enfermedad.

Muestreo

¿Qué muestra tomar ?

• dependen de la enfermedad o agente patógeno por

detectar

• del tamaño de los animales

• el objetivo de los análisis, diagnóstico de una enfermedad manifiesta,

una detección de portadores subclínicos del agente

patógeno o

una toma de muestras para la vigilancia dirigida con el fin

de demostrar la ausencia de una determinada

enfermedad.

Guía de la OIE para la Vigilancia Sanitaria de los Animales Acuáticos (Corsin et al.,

2009) y los capítulos sobre cada enfermedad en particular en este Manual

Acuático.

¿Cómo preservo mis muestras ?

• DNA – ETANOL 95% GRADO MOLECULAR

• DNA – Buffer de Lisis

• DNA – Congelado

• RNA – Muestras vivas

• RNA – ETANOL 95%

• RNA Later o Trizol

Tipo y cantidad de muestra

El número y tipo de muestras que deben tomarse para

el análisis varían en función de cuál fin se persiga.

Importante tomar el tejido adecuado donde se puede

detectar el patógeno, la cantidad y la calidad de la

muestra son importantes

una técnica 100% sensible y

especifica, PCR.

Tamaño de

la muestras

De acuerdo

al tamaño

del

espécimen

Ems- IQ PLUSTipo de

muestra Tamaño de muestra

Estomago 1 pieza

Intestino

medio1 cm

Muestra de

heces 1 cm

< PL6 25-50 PLs

PL6-15 10-30 PLs

Agua del

estanque

1.5 ml agua del estanque;

Centrifugar la muestra a 12.000

x g (12.000 rpm, r = 5 ~ 8 cm) o

en cubee durante 3 minutos.

Desechar el sobrenadante y

resuspender pellet en 100 μl de

PBS. Ir al procedimiento de

extracción paso 1

Muestra Cantidad de la

prueba

Límite de

detección

(Copias /

reacción)

Plásmido de

ADN de AHPND

/ EMS

50 copias / μl 100

<PL6 25-50 PLs 200

PL6 a 15 10-30 PL 200

Estómago 1 pieza 200

Intestino medio 1 cm 200

Hepatopancreas 10-25% 200

Estanque de

agua

1,5 ml de agua

del estanque

(véase la sección

V, parte c)

200

Organismo de

alimentación

(artemia, ostra,

calamar y

gusano de

sangre)

20 mg 200

Muestra fecal 1 cm 200

3 4 5 6

7

Kit IQ PLUS un sólo formato

todas las enfermedades

Procedimiento

Muestreo

Preparacion de la Muestra

Extraccion de DNA/RNA

Disolver la premezcla

Agregar Acidos nucleicos

Corrida en el POCKIT

Resultados en la pantalla del

POCKIT

15~20 minutes

57 minutes

15~20 minutes

• 1. IQ2000™ Sistema para la Detección y Prevención del AHPND/EMS Toxina 1: Para detectar el factor de virulencia, toxina 1, y el plásmido asociado a la AHPND/EMS (la región más estable del plásmido del AHPND)

• 2. IQ REALTM Sistema Cuantitativo AHPND/EMS Toxina 1: Para detectar el factor de virulencia, de la toxina 1, y el marcador del plásmido asociado al AHPND/EMS- ( en la región más estable del plásmido del AHPND)

• 3. IQ Plus™ Kit para Detección de AHPND/EMS Toxina 1: Para detectar la IQ Plus™ la secuencia de la proteína Toxina 1 relacionada con la virulencia por AHPND/EMS en el plásmido en camarones de cultivos y en los ambientes de fincas,

• 4. IQ Plus™ kit para la detección del plásmido a AHPND/EMS: Para detectar y monitorear el plásmido asociado a Vibrio que puede o no contener el factor de virulencia la toxina 1.

IQ Plus™ AHPND/EMS

Toxina 1

IQ Plus™ AHPND/EMS Plásmido

Multiplex iiPCR para la detección cualitativa del

plásmido o la toxina 1 en muestras de tejido de

camarón (estómago, intestino medio), muestras

fecales, PL, agua y alimentos vivos.

Los fluorocromos o fluoróforos son VIC para

Plásmido y NED para el IC en el kit de deteccion

del plasmido. Para la deteccion de la Toxina 1 los

flouroforos son FAM Y NED.

Su uso es complementarios ya que cada Sistema

tiene reactivos para la deteccion del control

interno de las muestras.

Un laboratorio de PCR portátil

En la granja En el laboratorio de diagnóstico

Resultados de la Prueba

Mostrados en la pantalla Data almacenada en la tarjeta SD

Interpretar los

Resultados

1-2 control positivo, 3 control

negativo, 4 positivo ambos toxina 1

y plásmido; 5y7 negativo plásmido;

6 NTC;.

Formato IQ2000 IQ REALIQ

PLUS P

IQ PLUS

TOXIN 1 IQ2000

PLASMIDO 558 bpCt 14< + <Ct 35

+ + 0

TOXINA1 252bp Ct 14< + <Ct 35 + + 0

LIMITE DE

DETECCION100 copias 10 copias

10

copias10 copias na

Detección de blanco: AHPND-asociado

al plásmido Colección de muestras(intestino medio, estómago, heces, agua,

alimentos vivos, u otra possible fuentes)

Pruebas en el

sitio

Positiva Negativa

•Contiene el plásmido asociado al

AHPND

• Debe hacer un confirmatorio con

laboratorio central o local.

•Procedimiento de emergencia

que pueda ser aplicada a la finca.

•No contiene plásmido

asociado al AHPND.

•Debe continuar el

monitoreo periódicamente.

Eficaz para controlar / prevenir la

enfermedad infecciosa mediante la

detección temprana - Gestión de riesgos– Genera resultados rápidos

– Mejorar el nivel de seguridad biológica

• Monitoreo en tiempo real

• Inicie el control de la epidemia temprano de forma

oportuna

• Reducir las posibilidades de propagación de la

enfermedad

– Minimizar las pérdidas económicas

Diagnóstico in situ (punto de atención):

37

Si todos avanzamos juntos, entoncesel éxito se hace cargo de sí mismo.

• Henry Ford