Nueva Herramienta para la Ciencia de la

Separación – LC “Híbrido” SFC-UHPLC

Carlos Pérez

Agilent Technologies

Discovery Tour

sept 2012

¿Qué es la cromatografía de fluidos supercríticos?

Definicion:

La cromatografía de fluidos supercríticos (SFC) es una

forma de cromatografía de fase normal que se utiliza para el

análisis y purificación de moléculas de bajo a moderado

peso molecular. Los principios son similares a los de HPLC

sin embargo SFC típicamente utiliza CO2 como la fase

móvil.

2

Discovery Tour

sept 2012

Fundamentos - SFC

La Temperatura Critica Tc de una sustancia, es aquella

temperatura por encima de la cual no puede existir en fase

liquida independientemente de la presión.

La Presión de vapor de una sustancia cuando alcanza la Tc

es su Presión Critica Pc.

Una sustancia a temperatura y presión por encima de su

Tc y Pc “Punto Crítico”se denomina FLUIDO SUPERCRITICO

Un FLUIDO SUPERCRITICO tiene las propiedades de

expansión de un gas y la densidad de un líquido (e.j. para el CO2

0,2 a 0,5 g/cm3), lo que le proporciona una notable capacidad

para disolver moléculas grandes no volátiles.

3

Discovery Tour

sept 2012

Porque utilizamos CO2 como fluido para la

separación.......

April 2010 4

Confidential

T

FLUIDO

SUPER

CRITICO

P

SOLIDO LIQUIDO

GAS

Fundamentos - SFC

Courtesy of Dr. Christopher Rayner, University of Leeds

NO transición de fase

CO2: 31.1°C

CO2: 73.8 bar

Discovery Tour

sept 2012

H2O: 221 bar

H2O: 374°C

Fundamentos - SFC

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4

h

SFC

HPLC

mL/min

0 0.08 0.17 0.25 0.34 0.42 0.50 0.58 0.66 cm/s

250 mm x 4.6 mm ID x 5 µm RX-Sil

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VELOCIDAD LINEAL

EFICACIA HETP

Discovery Tour

sept 2012

Elimina la necesidad de utilizar LC en

fase normal

La mejor elección para compuestos quirales

Un sistema para separaciones hidrófilicas

e hidrófobicas en la misma solución

Ofrece una increíble capacidad ortogonal

de detección

Técnica complementaria a RP-LC o HILIC

Puede conectarse a un Detector de MS

para una confirmación de mayor confianza

Ventajas de la técnica SFC-UHPLC

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sept 2012

Historia SFC

8

El primer

instrumento SFC

de Hewlett Packard

1084 SFC (1983)

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sept 2012

9

La segunda

generación de

instrumentos SFC

de Hewlett Packard

G1205 SFC (1992)

Discovery Tour

sept 2012

Historia SFC

¿Hubo algo que mejorar?

Sí, el Agilent 1260 Infinity SFC lanzó la moneda

Page 10

Rendimiento Tan sensible como un HPLC con UV

El único SFC con rango de presión hasta 600 bar

Perfecto para conectarse a un MS o ELSD

Coste 10-15x menores costes de operación al utilizar CO2 gas de

calidad estándar

Bajo consumo de disolvente y de generación de residuos

Se puede comenzar con un SFC y actualizarlo en el futuro a la

gama alta MS/SFC

Todo en un único sistema hibrido SFC/UHPLC

Velocidad 3 x mas rápido que un HPLC

No requiere un tiempo significativo de equilibrio para cambiar de

modo UHPLC a SFC con la configuración híbrida SFC / UHPLC

Robustez Basado en la probada calidad del UHPLC Infinity 1260

Discovery Tour

sept 2012

Tecnologia: El corazón

Aurora– “The Fusion A5 Evolution module”

La bomba principal de CO2, re-destila el dióxido de carbono desde una fuente de CO2 gaseoso, para proporcionar CO2 supercrítico de alta calidad.

Regulador de presión de alta precisión (BPR), que controla la presión del CO2 de retorno del DAD. El BPR proporciona realimentación de alta precisión para la bomba principal.

Bomba de baja presión y válvula anti retorno para la inyección de loop fijo. Proporciona un lavado de la jeringa

Electrónica. Módulo de control.

11

El A5 se alimenta de una fuente de CO2 vapor de bajo

costo. El CO2 es destilado antes de su utilización.

Cualquier grado de CO2 ofrecerá SFC-líquido de alta calidad

Discovery Tour

sept 2012

Configuración general: 3 maneras de obtener

un SFC de Agilent ….

Sistema Hibrido

SFC/UHPLC

Sistema Analítico SFC LC 1100/1200/1260

Ampliación a SFC

1260 Infinity SFC analítico

LC bomba (Quat, Binaria)

2pos/10port valvula

kit hibrido SFC/UHPLC

Cambio de SFC a UHPLC

Separación Ortogonal

1260 Infinity SFC analítico

Máximo rendimiento SFC

Fusion A5

1260 SFC Bomba binaria

SFC kit de accesorios

Convierte 1100/1200/1260 a

SFC

Mas asequible

12

Discovery Tour

sept 2012

Agilent 1260 Infinity SFC/UHPLC

Sistema Hibrido

Dos técnicas

ortogonales en un

único sistema

Con un simple giro de válvula

13

Discovery Tour

sept 2012

HPLC

desecho

Sistema Hibrido en modo SFC

1 2 3

4

5

6 7

8

9

10

Regulador

de presión

Bomba SFC Binaria

Bomba LC

1100

1200

1260

Sa

lida

Bo

mb

a L

C

Sa

lida

Dete

cto

r

Entrada Iny. Aut. SFC

desecho

14

Detector

Válvula CO2 gas

Discovery Tour

sept 2012

1 2 3

4

5

6 7

8

9

10

Restrictor

Sistema Hibrido en modo UHPLC

15

Bomba LC

1100

1200

1260

Bomba SFC Binaria

Regulador

de presión

Sa

lida

Bo

mb

a L

C

Sa

lida

Dete

cto

r

Entrada Iny. Aut.

HPLC

desecho

Detector

Válvula CO2 gas

Discovery Tour

sept 2012

16

¿Cómo puedo utilizar la superior sensibilidad

del SFC analítico Agilent 1260 infinity?

Discovery Tour

sept 2012

¿Puede el SFC ser capaz de reemplazar las

aplicaciones en fase Normal?

17

Objetivo: Aumentar la velocidad de análisis, disminuir costos

Estrategia: Utilizar un 1260 Infinity SFC y demostrar la robustez

del nuevo método SFC desarrollado

A

Bprednisolone

betamethasone (App Note: 5991-0277EN)

Discovery Tour

sept 2012

18

Transferencia del método de la USP (1) para

Prednisolona y Betametasona de HPLC fase

normal a SFC

min1 2 3 4 5

mAU

0

10

20

30

40

504

.22

4

4.8

73

min2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5

mAU

-40

-30

-20

-10

0

10

20

30

40

12

.58

0

17

.90

8

Normal phase method

Beta

met

haso

ne

Pred

niso

lone

SFC methodBe

tam

etha

sone

Pred

niso

lone

Ventajas:

Prueba de idoneidad con

Similares resultados

4 x mas rapido

17x menor coste de solventes

Condiciones SFC:

SFC 15% MetOH en CO2

(App Note: 5991-0277EN)

Metodo LC:

butylchlorid/THF/MetOH/glacial

acetic acid (95/95/14/7.6)

Columna:

Columna: ZorbaxRx-Sil, 4.6x

250 mm, 5um

Discovery Tour

sept 2012

Análisis de pureza en Pharma por SFC

Detección de impurezas quirales

19

NO2

NO2O

NH

CH3

CH3

OOH

N

O

O

NH

O

O

OH

OH

N-(3,5-dinitrobenzoyl)leucine

Thalidomide

1,1’-bi-2-naphthol

Objetivo: Determinación de la pureza de enantiomeros por

SFC con un limite de detección de impureza del 0.05-0.1%

del pico principal

Estrategia: Utilizar un 1260 Infinity SFC para determinar el

exceso de enantiomeros

(Appl. Note 5990-5969EN)

Discovery Tour

sept 2012

20

Análisis Pureza SFC en Pharma.

Detección exceso de enantiomeros en tres modelos de

compuestos quirales

Ventajas: Separación completa de todos

los compuestos ChiralCel OD-H y

determinación de Impureza a 0,05%

del pico principal

(Appl. Note 5990-5969EN)

Discovery Tour

sept 2012

¿Cómo se puede acelerar y utilizar el rango de

potencia de 600 bar para aumentar la productividad

del laboratorio?

21

Conseguir un incremento de velocidad 2-3x en comparación

con HPLC sin perder eficiencia de separación

Uso de diferentes modificadores, incluyendo fases móviles con

una mayor viscosidad para optimizar la selectividad

Objetivo:

26 sept 2012

26 sept 2012

Discovery Tour

sept 2012

22

Analisis Farmaceutico: Incremento de la

productividad utilizando SFC UltraFast

Objetivo: Demostrar idoneidad de uso de columnas con partículas sub 2µm

STM para una disminución significativa del tiempo de análisis

Estrategia: Utilizar el Agilent 1260 Infinity System SFC y disminuir el tiempo

análisis y la longitud de la columna de forma secuencial

Appl. Note:5990-6412EN

26 sept 2012

Discovery Tour

sept 2012

Analisis Farmaceutico: Incremento de la

productividad utilizando SFC UltraFast 4.6x 250mm,

5 µm Zorbax RX-Sil

2.0ml/min,

22.5% MeOH

50°C, 150Bar

4.6x 150mm,

3.5 µm Zorbax RX-Sil

3.0ml/min, 22.5% MeOH

50°C, 150Bar

4.6x 50mm,

1.8 µm Zorbax RX-Sil

3.0ml/min, 22.5% MeOH

50°C, 150Bar

4.6x 50mm,

1.8 µm Zorbax RX-Sil

5.0ml/min, 22.5% MeOH

50°C, 150Bar

Condiciones:, 22.5% MeOH; 50°C,

150Bar; 1.7µL flow cell, filter <0.01min (20Hz), 2µL inj.;

ibuprofen, ketoprofen, caffeine, theophyline, theobromine.

Data courtesey: Terry Berger

Ventajas:

Separación en

menos de 30s a

través del uso de

columnas con

partículas STM

Appl. Note:5990-6412EN

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sept 2012

El Agilent 1260 Infinity SFC y el G6100

Espectrometro de Masas Cuadrupolo Simple

24

Discovery Tour

sept 2012

HPLC

desecho

Sistema SFC-MS Hibrido en modo SFC-MS

1 2 3

4

5

6 7

8

9

10

Bomba SFC

25

Detector

Bomba Aux.

Discovery Tour

sept 2012

MS G6100

1 2

3

4 5

6

Ventajas:

Superior Reproducibilidad

de areas y robustez.

Se pueden añadir

modificadores acidos para

mejorar la selectividad

Limitaciones:

Flujo máximo 3 ml/min

Caloraterm

60ºC

CO2 gas

26

¿Existen otros detectores no-UV adecuados

para la conexión con SFC?

Evaporative Light-Scattering encaja perfectamente conSFC

Para compuestos que no contienen cromoforos

Discovery Tour

sept 2012

¿Cuales son las mejores aplicaciones SFC?

27

Análisis Quiral:

Análisis de pureza quiral (cualitativa) por MS-API

Desarrollo de métodos quirales para cromatografía preparativa-SFC

La cuantificación de la pureza enantiomérica de las materias primas, productos

intermedios y medicamentos a granel (EE)

Análisis metabólicos y toxicológicos de productos quirales

Análisis A-Quiral:

Aplicaciones típicas para molécula pequeña en fase normal o fase reversa

Desarrollo de fármacos, librerías de cribado, generación de candidatos

Análisis previos para el desarrollo de métodos para cromatografía preparativa-SFC

Lípidos, ácidos grasos, vitaminas

Separación de productos naturales

Separaciones A-quirales en Petroquímica, Medido Ambiente, Alimentación e

Industria Farmaceútica

Discovery Tour

sept 2012

28

Aplicaciones Analíticas SFC

¿Que moleculas se separan por SFC?

Discovery Tour

sept 2012

Mas información en.....

29

Web page: http://www.chem.agilent.com/en-S/Products/Instruments/lc/analytical/systems/sfc

Brochure: http://intranet.chem.agilent.com/Library/brochures/1260-Infinity a-SFC-brochure.pdf

Notas de aplicación:

Chiral impurity analysis(5990-5969EN)

Achiral analysis (5990-6413EN)

Sub 2um analysis for ultra fast separation (5990-6412EN)

Highest resolution separation (5990-6934EN)

Strategies for column and mobile phase selection with the Agilent

1260 Infinity SFC System (5990-7147EN)

The Agilent SFC/MS solution (5990-7972EN)

Separation of enantiomers and conformers of Tofisopamon (5990-9315EN)

Enantiomer separation of nonsteroidal anti-infl ammatory drugs (5990-9459EN)

Agilent 1260 Infinity Hybrid SFC/UHPLC System (5990-9514)

Determination of polymer additives and migration products prevalent in food packaging

material (5990-9598EN)

Determination of phthalate migration from toys (5990-9597EN)

SFC cost calculator: calculates operating costs of SFC vs. LC

Hybrid SFC/UHPLC Video

Hybrid SFC/UHPLC E-seminar

SFC Compliance Primer

Discovery Tour

sept 2012

26 Septiembre 2012 30

Aurora´s SFC Systems

One Agilent Technologies Company

SFC Aurora. El mas rapido sistema

cromatografico

Discovery Tour

sept 2012

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