1

İİNSANNSANİİ TTÜÜKETKETİİM AMAM AMAÇÇLI SULARDA LI SULARDA MEMBRAN FMEMBRAN FİİLTRASYON YLTRASYON YÖÖNTEMNTEMİİİİLE MLE MİİKROBKROBİİYOLOJYOLOJİİK ANALK ANALİİZLERZLER

Prof. Dr. Kadir HALKMAN

Ankara Üniversitesi, Gıda Mühendisliği Bölümü

Su Mikrobiyolojisi 02Su Mikrobiyolojisi 02Ankara; 12 Aralık 2014

2

Chromogenic Coliform Agar 012014 yılında yayımlanarak revize edilen TS EN ISO 9308-1, koliform grup analizlerinde yeni bir besiyeri sunmuştur: Chromogenic Coliform Agar (CCA)(CCA). Standardın önceki baskısı 2000 yılı idi.

ISO’da geçen ismi ile Lactose TTC Agar with sodiumheptadecylsulfate (Tergitol TTC) ve CCA arasındaki en önemli fark CCA’da E. coli’nin, diğer koliform bakterilerden çok açık bir şekilde ayırt edilmesidir. Tergitol TTC’de böyle bir ayrım yoktur.

Tergitol TTC bileşimi; Lactose 20,0 g/L; Peptone 10,0 g/L; Yeast extract 6,0 g/L; Meat extract 5,0 g/L; Bromothymol Blue 0,05 g/L; Tergitol 7 0,1 g/L ve 0,025 g/L konsantrasyonda olacak şekilde filtre ile sterilize edilmiş 2,3,5 Triphenyl-tetrazoliumchloride(TTC) şeklindedir.

3

Chromogenic Coliform Agar 02Laktoz+ olan koliform grup bakteriler laktozu kullanarak asit oluştururlar. Bu asit, bromothymolblue indikatörü ile membran altında sarı renk oluşumu ile belirlenir. Selektivite, Tergitol 7 veTTC ile sağlanır. TTC, aynı zamanda tanımlama için de etkilidir. TTC’nin laktoz– koloniler tarafından kuvvetli olarak indirgenmesi sonucunda koyu kırmızıkoloniler oluşur. Laktoz+ E. coli ve diğer koliform bakteriler TTC’yi zayıf olarak indirgerler ve dolayısıile koloni rengi sarı-turuncu olur. E. coli ve diğer koliformlar arasında laktozdan asit oluşturma ve TTC indirgeme arasında fark yoktur.

4

Chromogenic Coliform Agar 03CCA bileşimi; Peptone 3,0 g/L; Sodium chloride 5,0 g/L; Sodium dihydrogen phosphate 2,2 g/L; di-Sodiumhydrogen phosphate 2,7 g/L; Sodium pyruvate 1,0 g/L; Tryptophane 1,0 g/L; Sorbitol 1,0 g/L; Tergitol-7 0,15 g/L; Chromogenic mixture 0,4 g/L şeklindedir.

Besiyeri bileşiminde bulunan seçilmiş peptonlar, piruvat ve fosfat tampon, ağır hasar görmüş koliform bakterilerin kendilerini onarmalarını sağlarken tergitol-7, Gram pozitiflerin ve bazı Gram negatiflerin gelişimini baskılar. Koliform grup bakteriler için karakteristik olan ß-D-galactosidase enzimi, Salmon-GAL kromojenik substratını parçalayarak koliform bakterilerin pembemsi kırmızı koloni oluşturmasını sağlar.

5

Chromogenic Coliform Agar 04

Bileşimdeki X-Glucuronide substratı ise E. coli için karakteristik olan ß-D-glucuronidase enzimi tarafından parçalanır. Böylece E. coli, koliform bakteri olarak Salmon-GAL’i parçalaması yanında X-Glucuronide substratını da parçalayarak diğer koliform bakterilerden koyu mavi-menekşe renkli koloni oluşturması ile ayrılır. Besiyeri bileşimindeki triptofan varlığı, doğrudan koloni üzerinde indol testi yapılmasına izin verir.

6

Chromogenic Coliform Agar 05Chromocult Coliform Agar besiyerinde diğer Gram negatifler renksiz koloni oluştururlar. Bunlardan bir kısmı ß-D-Glucuronidase aktivitesi nedeni ile açık mavi-turkuaz renkli koloniler meydana getirirler.

7

8

Chromogenic Coliform Agar 06Kromojenik besiyerleri, karakteristik bakteriyel enzimlerin, kromojenik substratlar aracılığı ile belirlendiği hızlı tanımlama besiyerleridir. Besiyerinin bileşimi bir yandan hedef bakterinin gelişmesini özellikle desteklerken, diğer yandan karakteristik enzimlerin optimum aktivite göstermesini sağlar. Tanımlama, koloninin tipik rengi ile yapılır. Kromojenik besiyerlerinde oluşan renk, besiyerine difüze olmadığı için ışık, pH ve sıcaklık gibi olumsuzluklardan etkilenmez ve sabit kalır.

9

Chromogenic Coliform Agar 07ISO 9308ISO 9308--1 1 ThirdThird editionedition 20142014--0909--1515WaterWater qualityquality —— EnumerationEnumeration of of Escherichia coli Escherichia coli and and coliformcoliform bacteriabacteria —— PartPart 1:1:MembraneMembrane filtrationfiltration methodmethod forfor waterswaters with with lowlowbacterialbacterial background florabackground flora

Yeni standardın özelliklerinden bir diğeri, adında da belirtildiği gibi düşük refakatçi flora olan sularda membran filtrasyon yöntemi ile E. coli ve koliform grup bakterilerin sayımı içindir.

Besiyerinin düşük selektivitesi nedeni ile yüzey suları ve sığ kuyu sularının analizine uygun değildir.

10

Chromogenic Coliform Agar 08ISO 9303-1, içme suları, dezenfekte edilmiş havuz suları ya da içme suyu arıtma tesislerinde arıtılmış su gibi numunelerde filtrasyon sonrasında CCA besiyerinde toplam 100 ve daha az sayıda koloni olan numunelerin analizi için uygundur.

E. coli O157:H7 gibi bazı E. coli serotiplerinde β-D-glucuronidase enzimi yoktur. Buna bağlı olarak bu serotip, CCA besiyerinde diğer koliform grup bakterilerde de olduğu gibi sadece β-D-galactosidaseenzim varlığı ile E. coli dışındaki koliform grup bakteri gibi koloni oluşturur.

Numunede Aeromonas spp gibi bakteriler E. coliolmayan koliformlar gibi koloni oluşturabilirler. Dolayısı koliform grup bakteri doğrulaması için oksidaz testi zorunludur.

11

Chromogenic Coliform Agar 09Tercihen tüm tipik kolonilere ya da en az 10 tipik koliform kolonisine oksidaz testi uygulanmalıdır. Koliform grup bakteriler oksidaz negatif sonuç verir.

Eğer CCA üzerinde çok sayıda tipik koliform kolonisi varsa ve koloniler birbirine deymiş ise ya da koloniler oksidaz testinde kesin sonuç alınamayacak kadar küçük ise Tryptone (Tryptic) Soy Agar gibi genel bir besiyerinde alt kültürü yapıldıktan sonra saf kültür ile oksidaz testi yapılmalıdır.

CCA bileşimindeki Tryptophane, koloni üzerinde indol testi uygulanmasını sağlar. Ancak, indol testi uygulanmış koloniye oksidaz testi yapılamayacağıgibi alt kültür için örnek alma da uygulanamaz.

12

Chromogenic Coliform Agar 10CCA besiyerinde E. coli gibi görülmeyen koliform grup kolonisi indol pozitif sonuç verirse E. coliO157:H7 olması büyük olasılıktır.

K I R M I Z I A L A R M K I R M I Z I A L A R M

–Kırmızı+E. coli O157:H7

+Mavi–E. coli biyotip 2

+Mavi+E. coli biyotip 1

β-GUR (MUG)CCA renkİndolBakteri