novi pristup istraŽivanju perifernog ŽivČanog sustava
DESCRIPTION
NOVI PRISTUP ISTRAŽIVANJU PERIFERNOG ŽIVČANOG SUSTAVA. dr. sc. Katarina Vukojević, dr. med. Zavod za anatomiju, histologiju i embriologiju, Sveučilište u Splitu, Medicinski fakultet 10. svibnja 2011. metode istraživanja. sakupljanje tkiva i određivanje starosti zametaka - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
NOVI PRISTUP ISTRAŽIVANJU PERIFERNOG ŽIVČANOG SUSTAVA
dr. sc. Katarina Vukojević, dr. med.
Zavod za anatomiju, histologiju i embriologiju, Sveučilište u Splitu, Medicinski fakultet
10. svibnja 2011.
metode istraživanja
• sakupljanje tkiva i određivanje starosti zametaka
• uklapanje tkiva u parafin i rezanje tkiva
• imunohistokemijsko i imunofluorescentno bojanje rezova
• kvantifikacijska analiza Phox2b, nestin, PGP 9.5, S100, GFAP, IB4 i NF200 +st.
Poprečni presjek kroz formirajuću neuralnu cijev
Mehano-receptor? A α/βNF200
Nociceptor? A δ / CGRP+C / IB4+
Glija st.S100GFAP
Razvojna sudbina st. neuralnog grebena (NG) u SG
Postoje li nediferencirane st. NG?
Molekularni biljezi NGNestin i Phox2b
Kako i kada dolazi do restrikcije u razvojnoj sudbini st. NG?
Kada se prvi put pojavljuju neuroni? PGP9.5
Koje st. proliferiraju? Ki-67
Kada se pojavljuju prve glija st.?
NestinPhox2bKi-67PGP9.5S100GFAPNF200IB4
Fenotipske karakteristike st. spinalnih ganglija (SG) se temelje na: a) morfologiji
- veličina- imunohistologija- TEM- mijelinizacija - somatotopska organizacija- modalitet
b) razvojuc) elektrofiziologiji
Poprečni presjek kroz SG
ljudskog embrija starog 5 tj.
Hematoksilin & eozin. Povećanje 20×,
ljestvica 40μm
Poprečni presjek kroz spinalni ganglij ljudskog zametka od 10 tjedana.Imunohistokemijsko bojanje na phox2b. Povećanje 100×, ljestvica 10μm.
Poprečni presjek kroz spinalni ganglij ljudskog zametka starosti 6 tjedana.Imunofluorescentno bojanje na nestin i DAPI. Povećanje 40×, ljestvica 20μm.
nestin DAPI
merge merge
nestin Ki-67 merge
DAPI merge
Poprečni presjek kroz SG ljudskog
embrija starog 6 tj. Imunofluorescentno
bojanje na nestin i Ki-67, x40
0
10
20
30
4050
60
70
80
90
5 i 6 tj 7 i 8 tj 9 i 10 tj
tjedni gestacije
% p
ozi
tivn
ih s
tan
ica
% nestin+
% phox2b+
Poprečni presjek kroz spinalni ganglij ljudskog zametka starosti 8 tjedana. Imunofluorescentno bojanje na PGP9.5 i Ki-67. Povećanje 40×, ljestvica 15μm.
PGP9.5 Ki-67 merge
Poprečni presjek kroz spinalni ganglij ljudskog zametka starosti 10 tjedana. Imunofluorescentno bojanje na PGP9.5, nestin i DAPI. Povećanje 100×, ljestvica 35μm
nestin
PGP9.5
merge
DAPI
merge
Poprečni presjek kroz spinalni ganglij ljudskog zametka starosti 5 tjedana. Imunofluorescentno bojanje na IB4. Povećanje 40×, ljestvica 20μm.
Poprečni presjek kroz spinalni ganglij ljudskog zametka starosti 5 tjedana. Imunofluorescentno bojanje na NF200. Povećanje 40×, ljestvica 10μm.
0
10
20
30
40
50
60
70
5 i 6 tj 7 i 8 tj 9 i 10 tj
tjedni gestacije
% p
ozi
tivn
ih s
tan
ica
% PGP9.5+
% IB4+
% NF200+
Poprečni presjek kroz spinalni ganglij ljudskog zametka starosti 9 tjedana. Imunofluorescentno bojanje na S100 i Ki-67. Povećanje 40×, ljestvica 35μm.
S100 Ki-67
merge
Poprečni presjek kroz spinalni ganglij ljudskog zametka starosti 10 tjedana. Imunofluorescentno bojanje na S100, nestin i DAPI. Povećanje 100×, ljestvica 20μm
S100
nestin
merge
merge
DAPI
05
101520253035404550
5 i 6 tj 7 i 8 tj 9 i 10 tj
tjedni gestacije
% p
ozi
tivn
ih s
tan
ica
% GFAP+
% S100+
Poprečni presjek kroz spinalni ganglij ljudskog zametka starosti 10 tjedana. Imunofluorescentno bojanje na GFAP, S100 i DAPI. Povećanje 100×, ljestvica 20μm.
merge
merge
GFAP S100
DAPI
Poprečni presjek kroz spinalni ganglij ljudskog zametka starosti 8 tjedana. Imunofluorescentno bojanje na GFAP, nestin i DAPI. Povećanje 100×, ljestvica 25μm.
GFAP nestin
merge DAPI
merge
Progenitorne stanice (nestin+, phox2b+i nestin+Ki-67+)
Stanice prethodnice potpornih stanica(nestin+S100+, S100+Ki-67+,nestin+GFAP+)
Diferencirane potporne stanice(GFAP+, S100+, GFAP+S100+)
Diferencirani neuroni (PGP9.5+, PGP9.5+nestin-, PGP9.5+Ki-67-)
Stanice prethodnice neurona (?)?
?
?
nociceptori (IB4+, IB4+Ki-67-)
mehanoreceptori (NF200+, NF200+Ki-67-)
Razvojna sudbina stanica neuralnog grebena u spinalnim ganglijima
Za Ki-67 bjelančevinu je točno sve OSIM:
a. izvrstan je biljeg proliferacijeb. stanice pozitivne na ovu bjelančevinu imaju
pozitivan signal u jezgric. prisutna je u svim aktivnim fazama
staničnog ciklusad. koristi se i u dijagnostičke svrhee. koristi se isključivo u znanstvenim
istraživanjima
Za imunofluorescencijsku metodu je točno slijedeće:
a. primarno protutijelo se vizualizira sekundarnim fluorescentnim protutijelom
b. moguće je detektirati koekspresiju dviju bjelančevina u istoj stanici
c. Texas Red se koristi kao sekundarno protutijelo
d. metoda je osjetljivija u odnosu na imunohistokemijsku metodu
e. sve navedeno je točno
