nitric oxide synthases in mammals

8/18/2019 Nitric Oxide Synthases in Mammals

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2 4 9B i o c h e m .J . ( 1 9 9 4 )2 9 8 ,2 4 9 - 2 5 8 P r i n t e di n G r e a tB r i t a i n )

R E V I E WA R T I C L E

N i t r i co x i d es y n t h a s e si n m a m m a l sR i c h a r dG .K N O W L E Sa n dS a l v a d o rM O N C A D AW e l l c o m eR e s e a r c hL a b o r a t o r i e s ,L a n g l e yC o u r t ,B e c k e n h a mB R 33 B S ,U . K .

I N T R O D U C T I O N

N i t r i co x i d e i s an i n o r g a n i cf r e er a d i c a lg a s , o f f o r m u l a *N=O a b b r e v i a t e das N O ) . T h e d i s c o v e r yi n 1 9 8 7 / 8 8t h a tv a s c u l a re n d o t h e l i a lc e l l sa r e a b l e t o s y n t h e s i z eNO f r o mL - a r g i n i n ea s at r a n s c e l l u l a rs i g n a l[ 1 - 4 ]was i n i t i a l l yr e c e i v e db y mos t b i o l o g i s t sw i t h c o n s i d e r a b l es c e p t i c i s m .B y now, h o w e v e r ,t h e e x i s t e n c eo ft h eL - a r g i n i n e :NO p a t h w a yh a s b e e n t h o r o u g h l yd o c u m e n t e da n d i t sr e l e v a n c ei nb i o l o g yi s s l o w l yb e i n gu n r a v e l l e d .A l lo f t h i sh a s l e dt o t h ea p p e a r a n c e o f a new a n d v i g o r o u sf i e l do f r e s e a r c h ,as e v i d e n c e db y t h ei n c r e a s i n gn u m b e ro f p u b l i c a t i o n sr e l a t i n gt oNO a n d NO s y n t h a s e s F i g u r e 1 ) .

T hi s r e v i e ww i l ld e s c r i b et h eknown b i o c h e m i c a lm e c h a n i s m si n v o l v e di n t h e s y n t h e s i so f NO f r o m L - a r g i n i n eb y t h eNOs y n t h a s e s a n d w i l la l s od e s c r i b et h en a t u r e o f t h e s ee n z y m e s ,t h e i ri n h i b i t i o na n d t h e i rm o l e c u l a rc h a r a c t e r i s t i c s .F o r moree x t e n s i v er e v i e w sa b o u t t h e b i o l o g i c a lr o l e so f NO, se e [ 5 - 7 ] .

G E N E R A LP R O P E R T I E SO F N OS Y N T H A S E S

T h ee n z y m e s r e s p o n s i b l ef o rt h es y n t h e s i so f NO f r o mL-argininei nmammal ian t i s s u e sa r e known as NO s y n t h a s e s E C1 . 1 4 . 1 3 . 3 9 ;t h e y a re n o t s y n t h e t a s e sa s t he r e a c t i o nd o e s n o t u t i l i z eAT P ) .T h e s e e n z y m e s a r e r e m a r k a b l ef o rt h r e ed i f f e r e n tr e a s o n s : t h er a p i d i t yw i t h w h i c ht h e y h a v e b e e nc h a r a c t e r i z e d , p u r i f i e da n dc l o n e d f i r s td e s c r i b e di n 1 9 8 9 [ 8 - 1 4 ] ,f i r s tp u r i f i e di n 1 9 9 0 [ 1 5 ]a n d f i r s tc l o n e di n 1 9 9 1 [ 1 6 ] ) ;f o rt h e c o m p l e x i t ya n d n u m b e ro fr e a c t i o n sc a r r i e do u t T a b l e 1 ) b y a m e d i u m - s i z e ds u b u n i t o f1 2 5 - 1 5 5k D a , a l b e i tp r o b a b l ya s a h o m o d i m e r[ 2 5 - 3 0 ] ;a n d f o rt h en u m b e ra n d r a n g e o f p h y s i o l o g i c a la n d p a t h o l o g i c a lr o l e si nw h i c ht h e y a re i n v o l v e d[ 5 - 7 ] .

1 4 0 0

1 2 0 0

NO o r EDRF

1000

C

800~ ~ ~

0

: 3 600

2 0 0 < ~ N Os y n t h a s e

1 9 8 7 1 9 8 8 1 9 8 9 1 9 9 0 1 9 9 1 1 9 9 2

Ye a r o f p u b l i c a t i o n

F i g u r e1 T he a n n u a lr a t eo fp u b l i c a t i o n so n n i t r i co x i d eo r e n d o t h e l i u m -d e r i v e dr e l a x i n gf a c t o r( E D R F )a n do n N Os y n t h a s e s

D a t ad e r i v e df r o m M e d l in e .

T a b l e1 R e a c t i o n sc a t a l y s e db yN Os y n t h a s eR e a c t i o n s2 - 5 h a v es of a ro n l yb e e nd e m o n s t r a t e dw i t hb r a i nN Os y n t h a s e .R e a c t i o n5 i sc o n t r o v e r s i a la n dm a yn o to c c u rf r o mf r e ed i h y d r o b i o p t e r i n B H 2 ) ,b u to n l ya s p a r to ft h er e c y c l i n go fb o u n dp t e r i nt o t h et e t r a h y d r of o r m B H 4 ) .C i tc i tr u ll i ne ; c y tc c y t o c h r o m ec

A c t i v i t y R e a c t i o n R e f e r e n c e s

A r g i n i n eN O - h y d r o x y l a s eN - H y d r o x y a r g i n i n em o n o - o x y g e n a s eN A D P Hd i a p h o r a s eC y t o c h r o m ec r e d u c t a s eN A D P Ho x i d a s e

5 D i h y d r o p t e r i d i n er e d u c t a s e

Ar g NADPH + 2 HydroxyArg A D P + 20HydroxyArg 1 N A D P H + ) 2 - Ci t NO 20N i t r oB l ue T e t r az o l i um NBT) NADPH + Reduced NBT A D P +Cyt c NADPH + - Reduced c y t c A D P +N A D P H H + 0 2 H 2 0 2 N A D P +1 N A D P H 2 - 0 2 ( N A D P + + )BH 2 NADPH + BH 4 A D P +

1 a1 b234

8 - 1 4 , 1 7 - 2 08 - 1 4 , 1 7 - 2 02 1 , 2 22 32 0 , 2 3 , 2 4

2 0

A b b r e v i a t i o n su s e d : B H 4 ,t e t r a h y d r o b i o p t e r i n ;L - N M M A ,N W - m o n o m e t h y l - L - a r g i n i n e ;L - A D M A , a s ym me t r i cN w N I - d i m e t h y l - L - a r g i n i n e ;L - N N A ,N 6 - n i t r o -

L - a r g i n i n e ;L - N A M E ,N \ - n i t r o - L - a r g i n i n em e t h y le s t e r ;L - N I O ,N 6 \ - i m i n o e t h y l - L - o r n i t h i n e ;D A H P,2 , 4 - d i a m i n o - 6 - h y d r o x y p y r i m i d i n e ;n N O S ,n e u r o n a lN Os y n t h a s e ;e N O S ,v a s c u l a re n d o t h e l i a lN Os y n t h a s e ;i N O S ,i n d u c i b l eN Os y n t h a s e ;P K A ,c y c l i cA M P - d e p e n d e n tp r o t e i nk i n a s e ; P K C ,p r o t e i nk i n a s e C ;C a M K ,c a l m o d u l i n - d e p e n d e n tk i n a s e .


2/10

2 5 0 R .G .K n o w l e sa n dS . M o n c a d a

T a b l e2 P a r t i c i p a n t si n N Os y n t h e s i sf r o mL - a r g i n i n e

P r o t e i n S u b u n i tm o l e c u l a rm a s s( k D a ) R e f e r e n c e s

N Os y n t h a s e 1 2 5 - 1 6 0 1 5 , 2 5 - 3 2C a l m o d u l i n 1 7 1 5 , 3 1 - 3 4

N o n - p r o t e i n T i g h t l yb o u n d * A f f i n i t y g u M ) R e f e r e n c e s

P r o t o p o r p h y r i nI Xh a e m Y e s 3 5 - 3 7F M N Ye s / n o 0 . 1 0 2 0 , 2 6 , 2 8 , 3 1F A D Ye s / n o 0 . 0 4 - 0 . 1 0 2 0 , 2 6 , 2 8 , 3 1B H 4 Ye s / n o 0 . 0 1 - 0 . 1 0 1 4 , 2 0 , 2 6 - 2 8 , 2 9 , 3 1 , 3 8 - 4 0N A D P H N o 0 . 1 - 1 . 0 8 - 1 5 , 2 5 - 3 2 , 4 1 , 4 2L - A r g i n i n e No 1 - 2 0 8 - 1 5 , 2 5 - 3 2 , 4 1 , 4 2

T i g h t l yb o u n d 'm e a n st h a tt h e c o fa c t o rr e m a i n sa t l e a s tp a r t l yb o u n dt ot h ee n z y m ee v e na f t e rp u r i f i c a t i o nt oh o m o g e n e i t y ;t h ed e g r e eo fc o f a c t o rl o s sd u r i n gp u r i f i c a t i o nv a r i e sa m o n gN Os y n t ha s e i s o en z ym e s.

T h e f i r s td e s c r i p t i o n so f NO s y n t h a s e sd e m o n s t r a t e dt h a t t h e

s y n t h e s i so f NO r e q u i r e sL - a r g i n i n ea n d N A D P H ,a n d r e su l t s i nt h ef o r m a t i o no f c i t r u l l i n e[ 8 - 1 4 ] .NO s y n t h e s i s r e q u i r e sn o t o n l yt h e s es u b s t r a t e sb u t a l s of o u ro t h e rc o e n z y m e s / c o f a c t o r s ,a sw e l la s t h ep r e s e n c eo f c a l m o d u l i n Ta b l e 2 ) .

S u b s e q u e n tw o r kd e m o n s t r a t e dt h a tm o le c u l a r o x y g e ni s a l s oa s u b s t r a t e f o rt h i sr e a c t i o n ,b e i n gi n c o r p o r a t e di n t ob o t h NOa n dc i t r u l l i n e[ 1 7 , 1 9 ] ;t h u s t h i sr e a c t i o na p p a r e n t l yc o n s t i t u t e sa nL - a r g i n i n eN W C -d i o x y g e n a t i o n .H o w e v e r ,a ss h o w ni n F i g u r e2 ,i t i s no w c l e a rt h a tNO s y n t h e s i sf r o m a r g i n i n ei s a r e a c t i o nw h i c hi n v o l v e st w o s e p a r a t em o n o - o x y g e n a t i o ns t e p s[ 1 7 - 1 9 , 4 1 ] .N I ' - H y d r o x y a r g i n i n ei s a n i n t e r m e d i a t es p e c i e sf o r m e d b yar e a c t i o nr e q u i r i n go n e 0 2 a n d o n e NADPH a n d t h ep r e s e n c eo ft e t r a h y d r o b i o p t e r i n B H 4 )[ 1 7 - 2 0 ] .T h i s r e a c t i o na p p e a r st o b es i m i l a rt o t h o s ec a r r i e do u t b y t h ea r o m a t i ca m i n oa c i dh y d r o x y -l a s e s ,w h i c h a l s or e q u i r eB H 4 . T h e s e c o n ds t e pi n t h e NOs y n t h a s er e a c t i o nr e s u l t si n t h eo x i d a t i o no f N o - h y d r o x y a r g i n i n et o f o r mc i t r u l l i n ea n d NO ( F i g u r e2 ) .T h ed e t a i l e dm e c h a n i s mo ft h i s r e a c t i o nr e m a i n s t o b e d e t e r m i n e d[ 4 1 ] ;h o w e v e r , t h eo b s e r v a t i o nt h a tt h eb r a i nNO s y n t h a s ec a n g e n e r a t e0 2 - a n dH 2 0 2i n t h ea b s e n c eo fL - a r g i n i n e ,w i t h c o n t i n u e do x i d a t i o no fN A D P H ,s u g g e s t st h a t t h ef l a v i nc o e n z y m e sm ay b e i n v o l v e di nt h e t r a ns f e ro f e l e c t r o n st o f o r m a r e d u c e d o x y g e ns p e c i e s[ 2 0 , 2 3 , 2 4 ] .T h i s h y p o t h e t i c a ls p e c i e sc o u l d t h e n r e a c tw i t h N o -h y d r o x y a r g i n i n ei n t h ep r e s e n c eo f a r g i n i n ea n d B H 4 ,o r i n t h e i ra b s e n c ef o r m 0 2 - o r H 2 0 2 . T h i s t y p e o f r e a c t i o nw o u l db es i m i l a rt o t h a to f b o t h t h e s u p e r o x i d e - g e n e r a t i n gNADPHo x i d a s ea n d c y t o c h r o m eP - 4 5 0r e d u c t a s e .I n f a c t ,t h es e q u e n c es i m i l a r i t yo f NO s y n t h a s ew i t h c y t o c h r o m eP - 4 5 0 r e d u c t a s e[ 1 6 , 4 3 - 4 8 ] ,t o g e t h e rw i t h t h ep r e s e n c eo f a h a e mc e n t r e w i t h t h es p e c t r a lp r o p e r t i e so f a c y t o c h r o m eP - 4 5 0[ 3 5 - 3 7 ] ,s h o wt h a tNOs y n t h a s ei st h ef i r s ts e l f - s u f f i c i e n tm a m m a l i a nP - 4 5 0e n z y m et ob ei d e n t i f i e d .I n a d d i t i o n ,t h e r ei s e v i d e n c et o s u g g e s tt h a tN W -h y d r o x y a r g i n i n ec a n b e c o n v e r t e dt o NO a n d c i t r u l l i n eb y l i v e rm i c r o s o m a lc y t o c h r o m eP - 4 5 0 / P - 4 5 0r e d u c t a s e[ 4 9 ] .

A S S A Y S F O RN OS Y N T H A S EA C T I V I T YNO s y n t h a s ea c t i v i t yc a n b e a s s a y e db y a r a n g e o f m e t h o d s ,b a s e d on t h ef o r m a t i o no f e i t h e rc i t r u l l i n eo r ( i n d i r e c t l y )NOi t s e l f .F o r m a t i o no f 3 H -o r 1 4 C - l a b e l l e dc i t r u l l i n ef r o ml a b e l l e dL -a r g i n i n ei sp e r h a p st h emost w i d e l yu s e d m e t h o d ,u s i n ga s i m p l ei o n - e x c h a n g es e p a r a t i o no f s u b s t r a t ea n d p r o d u c te i t h e ri nc o l u m n s[ 1 5 ]o r a s b a t c h a d d i t i o n[ 5 0 ] .T h i s t y p e o f a s s a y i ss e n s i t i v e( u s u a l l yr e q u i r i n gt h ef o r m a t i o no f < 1 0 0nM p r o d u c t )

- o o cH

N D , N H 2+ H 3 N

N H 2-NADPH+ H +

H 2 0

= 0 -

- o o cHN G NH2

+ H 3 N

N H H

I N A D P H+ H I

F i g u r e2 T he N Os y n t h a s er e a c t i o n

T h eb o x e d0 a n dNa t o m ss h o wt h eo r i g i no ft h ec o n s t i t u e n ta t o m so fN O( s e et h et e x ta n dTa b l e1 f o rr e f e r e n c e s ) .

a n d r e l a t i v e l yr o b u s t ,f o r i t i s u n a f f e c t e db y t h ep r e s e n c eo fh a e m o g l o b i na n dd o e sn o t r e q u i r eo p t i c a l l yc l e a re n z y m ee x t r a c t s .I n o r d e r t o o b t a i n q u a n t i t a t i v er e s u l t s ,h o w e v e r ,s u c h a s s a y s o fc r u d ec e l lo r t i s s u ee x t r a c t NO s y n t h a s ec a r r i e do u t a t a l o w L -a r g i n i n ec o n c e n t r a t i o n( f o rmaximums e n s i t i v i t y )w i l lr e q u i r et h eL - a r g i n i n ei n t h es a m p l e e . g . 1 0 0 , u Mi nt i s s u e s ;5 0 0 - 1 0 0 0,Mi n c e l lc u l t u r em e d i a )t o b e e i t h e rr e m o v e do r a c c o u n t e df o r .M o r e o v e r ,s o m e e x t r a c t s( e s p e c i a l l yf r o m l i v e r )a r e a b l et om e t a b o l i z ef u r t h e rt h el a b e l l e dc i t r u l l i n ep r o d u c e d ;t h i sc a n b e

i n h i b i t e db y t h e i n c l u s i o no f 1 mM L - c i t r u l l i n ei n t h e a s s a y[ 5 0 , 5 1 ] .


3/10

N i t r i co x i d es y n t h a s e si n m a m m a l s 2 5 1

O C H 3

H2NNH

N H ( DL - N I O

N w - A m i n o - L - a r g i n i n e

N HG3

L - A D M A L - C a n a v a n i n e

L - N N A

N HG3

F i g u r e3 T h e s t r u c t u r e so fa r g i n i n ea n d o f t h ea r g i n i n ea n a l o g u e sm o s t f r e q u e n t l yu s e d a s i n h i b i t o r so f N Os y n t h a s e s

T h ep r e d o m i n a n ti o n i cs p e c i e sa t n e u t r a lp H a r es h o w n .

T h e r e a re t wo w a y s o f m e a s u r i n gt h e g e n e r a t i o no f NOq u a n t i t a t i v e l y :t h eo x i d a t i o no f h a e m o g l o b i na n d t h ef o r m a t i o no f NO2-+NO3-. NO r a p i d l yr e a c t s w i t h o x y h a e m o g l o b i nt of o r m NO3- a n d m e t - h a e m o g l o b i n[ 5 2 ] ;t h e r e s u l t i n gs p e c t r a lc h a n g e sh a v e b e e nu s e d a s t h eb a s i so f a s p e c t r o p h o t o m e t r i ca s s a y o f NO s y n t h a s e w h i c hi s h i g h l ys e n s i t i v e[ 5 1 ] .With d u a lw a v e l e n g t hmeasurement a t 4 0 1 a n d 4 2 1 nm ( e 7 7 2 0 0M - 1 )t h i sh a s a s e n s i t i v i t yo f < 2 0 n M / m i n .H o w e v e r ,t h i sas say i s s o m e -w h a t l e s sw i d e l y a p p l i c a b l et h a n l a b e l l e dc i t r u l l i n ef o r m a t i o nb e c a u s eo f i n t e r f e r e n c eb y c o l o u r o r o p a l e s c e n c ei n s a m p l e s . I np a r t i c u l a r ,c o n t a m i n a t i o nw i t h b l o o d t h a t r e s u l t si n a haemo-g l o b i n c o n c e n t r a t i o no f > 5 , u M w i l lr e d u c e t h e s e n s i t i v i t yo ft h e a s s a y .

F o r m a t i o no f N O 2 N O 3 - ,t h e o x y g e n a t i o np r o d u c t so f NO,c a n b e m e a s u r e db y a v a r i e t yo f t e c h n i q u e s .Th e s i m p l e s tus er e d u c t i o n o f NO3- t o NO2- b y n i t r a t e r e d u c t a s e o r m e t a l l i cc a t a l y s t sf o l l o w e db y t h e c o l o r i m e t r i cG r i e s s r e a c t i o n [ 1 3 , 5 3 , 5 4 ]t o m e a s u r e N O 2 - . O t h e r methods m e a s u r e NO2- b y c h e m i -l u m i n e s c e n c ef o l l o w i n gr e c o n v e r s i o nt o NO [ 1 , 8 , 1 2 , 5 5 ]o r b yh . p . l . c .t e c h n i q u e sw i t h u . v . a b s o r p t i o nd e t e c t i o n [ 5 6 , 5 7 ] .Th e

s e n s i t i v i t yo f t h e s e t e c h n i q u e si s l i m i t e d b y t h e l e v e l so f N O 2 - /NO3 - a l r e a d yp r e s e n t i n b u f f e r s - 0 . 5, u M ) a n d c o n t r i b u t e db yt h e enzyme s a m p l e s( e . g .N O 3 - i n t i s s u e si s p r e s e n ta t > 10 , u M ) .O ne s i m p l i f i e dv a r i a n t o f t h i st y p e o f a s s a y m e a s u r e s o n l y t heNO 2 - f o r m e d .H o w e v e r ,s e v e r a lr e a c t i o n s( e s p e c i a l l yt h a t w i t ho x y h a e m o g l o b i n )ca n r e s u l ti nNO a n d N O 2 - b e i n gc o n v e r t e dt oNO 3 - [ 5 2 , 5 8 ] ,a n d t h e r e f o r et h i ss i m p l i f i e da s s a y m u s t b e u s e dw i t h g r e a t c a u t i o n .

T h e s t i m u l a t i o no f t h es o l u b l eg u a n y l a t ec y c l a s eh a s b e e nu s e da s t he b a s i so f a s s a y s f o rNO s y n t h a s e ,b o t h i n a s o l u b l ef o r m[ 8 , 1 0 - 1 2 , 4 2 ]a n d a l s ow i t h i n c e l l s[ 3 3 , 5 9 ] ,s u c h a s t h eRFL-6f i b r o b l a s tc e l ll i n e .A l t h o u g hs u c h a s s a y s a re s e n s i t i v ea n d h a v ey i e l d e du s e f u l d a t a ,i t i s d i f f i c u l tt o o b t a i n q u a n t i t a t i v eNOs y n t h a s ea c t i v i t yd a t a .M o r e o v e r ,t h e e x q u i s i t es e n s i t i v i t yo f s u c hassays t o t h e presence o f o x y h a e m o g l o b i n( I C 5 0< 1 0 0 n M ) ,0 2 -o r a ny o t h e r s p e c i e st h a t r e a c t s w i t h NO ( t h u sn e u t r a l i z i n gi t se f f e c ton g u a n y l a t ec y c l a s e )l i m i t st h e i ru s e f u l n e s s .

T h e c o m p o n e n t st h a t a re r e q u i r e df o rt h e f u l le x p r e s s i o no fNO s y n t h a s ea c t i v i t ya re s h o w n i nT a b l e2 ;w h i c h ,i f any, o f t h e s ec o m p o n e n t sn e e d t o b e a d d e d t o a ny p a r t i c u l a rNO s y n t h a s e

L - A r g i n i n e

C O 0 0

L-NMMA


4/10


T a b l e3 T y p e so f N Os y n t h a s ei n h i b i t o r

I n h i b i t o rt y p e T y p eo fi n h i b i t i o n C o m m e n t s

A r g i n i n ea n a l o g u e s e . g .L - N M M A ) C o m p e t i t i v ew i t ha r g i n i n e S e l e c t i v eD i p h e n y l e n e i o d o n i u m C o m p e t i t i v ew i t hN A D P H A l s oi n h i b i t ss o m eo t h e rN A D P H - e n z y m e sC a l m o d u l i na n t a g o n i s t s e . g .t r i f l u o p e r a z i n e ,W 7 ) C o m p e t i t i v ew i t hc a l m o d u l i n O n l yi n h i b i ts o m eN Os y n t h a s e s ,a l s o

i n h i b i to t h e rc a l m o d u l i n - d e p e n d e n te n z y m e sB H 4s y n t h e s i si n h i b i t o r s I n d i r e c t e . g .D A H P,N a c e t y l - 5 - h y d r o x y t r y p t a m i n e )

N O ,C O N o tk n o w n P r o b a b l yi n h i b i tb yi n t e r a c t i n gw i t hN Os y n t h a s eh a e m

enzyme a s s a y d e p e n d son t h ei s o e n z y m eu n d e rs t u d ya n dw h e t h e re n d o g e n o u sc o f a c t o r sa re p r e s e n t o r h a v e b e e nr e m o v e dd u r i n ga ny p u r i f i c a t i o np r o c e d u r e s .I f t h e c e l lo r t i s s u ee x t r a c t s c o n t a i na r g i n a s e ,t h e n a n a r g i n a s e i n h i b i t o rs u c h a s L - v a l i n emay a l s on e e d t o b e i n c l u d e dt o p r e v e n td e p l e t i o no f L - a r g i n i n e[ 5 1 ] .

W i t h a l l o f t he m e t h o d so f a s s a y in gNO s y n t h a s e ,i t i si m p o r t a n t t o c o n f i r m t h a t t he p r o d u c t m e a s u r e dh a s b e e n

s y n t h e s i z e db y t h i senzyme, b y c a r r y i n go u t i n c u b a t i o n si n t h epresence o f known i n h i b i t o r s( s e eb e l o w ) . M o r e o v e r ,i t i s a l s op a r t i c u l a r l yi m p o r t a n tt o c h e c kt h e t i m e cour se o f t h e r e a c t i o n ,b e c a u s et h e t i m e p e r i o df o r w h i c hl i n e a r i t yi s m a i n t a i n e di n t h ea s s a y i s d e p e n d e n tb o t h on t he p a r t i c u l a rNO s y n t h a s e b e i n gs t u d i e d a n d on t h e c o n d i t i o n so f t h e as say ( e . g .t h e L - a r g i n i n ea n d BH 4 c o n c e n t r a t i o n s ) .

I N H I B I T O R SO F N OS Y N T H A S E

T h e s t u d y o f NO s y n t h e s i si n m a m m a l i a n s y s t e m s h a s b e e ng r e a t l yf a c i l i t a t e db y t he e a r l yi d e n t i f i c a t i o no f c o m p e t i t i v ei n h i b i t o r so f NO s y n t h a s e [ 6 0 ] .Th e mos t w i d e l yu s e d o ft h e s e

i n h i b i t o r s ,N w - m o n o m e t h y l - L - a r g i n i n e L- NMMA; F i g u r e 3 ) ,was u s e d i n s t u d i e so f t h e c y t o t o x i c i t yo f a c t i v a t e dm a c r o p h a g e s[ 6 1 , 6 2 ]b e f o r e i t was d i s c o v e r e dt h a tNO was i n v o l v e di n t h i sprocess [ 6 3 ]a n d b e f o r e t h ef i r s td e s c r i p t i o n so f NO s y n t h a s e[ 8 - 1 4 ] .L-NMMA h a s b e e n s h o w nt o b e a c o m p e t i t i v ei n h i b i t o r( c o m p e t i t i v ew i t h L - a r g i n i n e )o f a l l t h e NO s y n t h a s e s s o f a re x a m i n e d ,w i t h a K , o f 1 , u M [ 1 3 - 1 5 , 2 5 , 2 7 , 4 2 , 6 4 - 6 6 ] ;t h i si n h i b i t i o ni s e n a n t i o m e r - s p e c i f i c .L - N M M Aa n d a sy m m e t r i cN w N w - d i m e t h y l - L - a r g i n i n e L-ADMA; F i g u r e 3 ) , a n o t h e r NOs y n t h a s ei n h i b i t o r ,a re b o t h n a t u r a l l yo c c u r r i n gc o m p o u n d s[ 6 7 ]t h a tca n b e d e r i v e df r o m m e t hy l a te dp r o t e i n a r g i n i n er e s i d u e sd u r i n g p r o t e i nt u r n o v e r . A l t h o u g ht he n o r m a lp l a s m aconcen -t r a t i o n so f t h e s e c o m p o u n d s < 1 , u M ) ar e l o w , u n d e r somec i r c u m s t a n c e s ,e . g . d u r i n gr e n a lf a i l u r e ,L-NMMA a n d L - A D M Ad o a c c u m u l a t ei n s u f f i c i e n tq u a n t i t i e st o i n h i b i tNO s y n t h e s i s[ 6 7 ] .I t i s a l s o p o s s i b l et h a t t h e y c o u l d b e p r e s e n t a t h i g h e rc o n c e n t r a t i o n si n s p e c i f i cc e l l s ,t i s s u e so r i n d i v i d u a l s .

A r ange o f s t r u c t u r a l l yr e l a t e dc o m p o u n d sh a s b e e nf o u n dt oi n h i b i tt h e NO s y n t h a s e s F i g u r e 3 ) [ 8 , 4 1 , 4 2 , 6 5 - 6 9 ] .L i k e L -NMMA, t h e s e c o m p o u n d sar e c o m p e t i t i v ei n h i b i t o r s .H o w e v e r ,t h e r e a re some d i f f e r e n c e sb e t w e e nt h e m . F o r e x a m p l e ,N w - n i t r o -L - a r g i n i n e L - N N A )a n d i t s m e t h y le s t e r L - N A M E ) ,u n l i k e L -NMMA, s h o w p r o g r e s s i v ea n d i r r e v e r s i b l eo r o n l y s l o w l yr e v e r s i b l ei n h i b i t i o no f b r a i n NO s y n t h a s e f o l l o w i n gt h e i n i t i a l( c o m p e t i t i v e )b i n d i n g [ 7 0 , 7 1 ] .S i m i l a r l y ,t h e a m i d i n e N ] ' -i m i n o e t h y l - L - o r n i t h i n e L - N I O ) h a s b e e n r e p o r t e d t o i n h i b i tp r o g r e s s i v e l yt he i n d u c i b l er o d e n t m a c r o p h a g ea n d n e u t r o p h i lNO s y n t h a s e s ,a g a i n u n l i k e L-NMMA [ 6 6 ] .T h e s e may b e

q u a n t i t a t i v er a t h e r t h a n q u a l i t a t i v ed i f f e r e n c e s ,h o w e v e r ,a s L -NMMA h a s b e e n r e p o r t e d t o cause i r r e v e r s i b l ei n h i b i t i o n o f

m a c r o p h a g ea n d b r a i nNO s y n t h a s e s d u r i n g p r o l o n g e di n -c u b a t i o n [ 7 2 , 7 3 ] .T h e m e c h a n i s mo f t h i s i s o e n z y m e - s p e c ii r r e v e r s i b l ei n h i b i t i o ni s n o t known a t p r e s e n t .

W h e r e a sL - N M M Aa p p e a r st o b e a n o n - s e l e c t i v ei n h i b i t o ro ft h ev a r i o u sNO s y n t h a s ee n z y m e s ,s o m ei n h i b i t o r sd o s h o ws o m es e l e c t i v i t y .L - C a n a v a n i n e ,N o - a m i n o - L - a r g i n i n ea n d L - N I O ,f o re x a m p l e ,i n h i b i tt h ei n d u c i b l em a c r o p h a g eNO s y n t h a s em o r e

p o t e n t l yt h a n t h ec o n s t i t u t i v eb r a i na n de n d o t h e l i a lNO s y n t h a s e s[ 8 , 4 1 , 6 5 - 6 9 ] .A n o t h e rp r o p e r t y w h i c h ma y o n l y a p p l y t o L -NMMA a n dL - A D M Ai st h a to f b e i n gm e t a b o l i z e dt oL - c i t r u l l i n ea n d / o r L - a r g i n i n ei n s o m ec e l l sa n d t i s s u e s[ 7 4 - 7 7 ] .T h i s c o u l dr e s u l ti n r e d u c e di n h i b i t i o nb y t h o s ec o m p o u n d s ,a n dc o u l de v e nc o n c e i v a b l yl e a dt o a p a r a d o x i c a ls t i m u l a t i o no f NO s y n t h e s i su n d e rs o m ec o n d i t i o n s ,i ft h ec o n c e n t r a t i o no fL - a r g i n i n ef o r m e dw e r eh i g h e n o u g h .

A n o t h e rd i s t i n c t i o nw i t h i nt h i sr e l a t e dg r o u po f i n h i b i t o r si s i nt h eo v e r a l lc h a r g en e u t r a l i t ya t p h y s i o l o g i c a lpH v a l u e so f t h eg u a n i d og r o u p so fL - N N Aa n d L - N A M E b e c a u s eo f t h e i rl o wP K a 0 ) , w h i c hc o n t r a s t s w i t h t h ep o s i t i v e l yc h a r g e dg u a n i d oa n d a m i d i n og r o u p so f t h eo t h e r s( P K a1 3 ) .One c o n s e q u e n c eo f t h i si s t h a tL - N N Aa n d L - N A M Ew o u l dn o t b e e x p e c t e dt ob e

t r a n s p o r t e do n t h ey +a m i n oa c i dt r a n s p o r t s y s t e m ,w h i c h i sr e s p o n s i b l ef o r a h i g h p r o p o r t i o n o f t h ec e l l u l a ru p t a k e o fp o s i t i v e l yc h a r g e da m i n oa c i d ss u c h a s L - a r g i n i n e ,L - o r n i t h i n ea n d L - l y s i n e[ 7 8 , 7 9 ] .T h i s i s c o n s i s t e n tw i t h d a t a s h o w i n gt h a t ,u n l i k eL-NMMA,L - N N Ad o e s n o t c o m p e t ew i t h L - a r g i n i n ef o rt r a n s p o r t[ 8 0 ] .

A r e c e n tr e p o r ts u g g e s t st h a tL - N A M Ea n d o t h e r a l k y le s t e ra n a l o g u e so f a r g i n i n eh a v e a n a d d i t i o n a lp r o p e r t yw h i c hl i m i t st h e i ru s e f u l n e s sa ss p e c i f i cp r o b e sf o rNO s y n t h e s i si nv i v o .T h e s ec o m p o u n d sa r e m u s c a r i n i ca c e t y l c h o l i n er e c e p t o ra n t a g o n i s t s ,w i t ha K iv a l u ef o rL - N A M Eo f a p p r o x .1 0 0, t M [ 8 1 ] .I n t r a c e l l u l a rc o n c e n t r a t i o n so fL - N A M Eo f t h i so r d e ra r e l i k e l yt ob e a c h i e v e df o l l o w i n gd o s e so f 2 0 - 3 0m g / k g .

A d i f f e r e n tt y p e o f i n h i b i t o ro f NO s y n t h a s e( T a b l e3 ) i sd i p h e n y l e n e i o d o n i u m[ 8 2 ] .T h i s c o m p o u n dh a s n o o b v i o u ss t r u c t u r a l s i m i l a r i t yw i t h a r g i n i n ea n d i s n o t c o m p e t i t i v ew i t ht h i ss u b s t r a t e ;i t si n h i b i t i o no f NO s y n t h a s ei s a n t a g o n i z e db yh i g h c o n c e n t r a t i o n so f N A D P H , a n d i t a l s oi n h i b i t so t h e rN A D P ) H - u t i l i z i n gf l a v i ne n z y m e s ,i . e .t h es u p e r o x i d e - g e n e rNADPH o x i d a s ea n d m i t o c h o n d r i a lNADH o x i d a s e[ 8 3 , 8 4 ] .D i p h e n y l e n e i o d o n i u ma c t sa sa p r o g r e s s i v e ,i r r e v e r s i b l ei n h i b i t o r ,s u c h t h a tt h ed e g r e eo f i n h i b i t i o nd e p e n d sn o t o n l yo n t h ec o n c e n t r a t i o no f t h ei n h i b i t o rb u t a l s oo n t h et i m e o f e x p o s u r ea n d t h et e m p e r a t u r e[ 8 2 ] .

C a l m o d u l i na n t a g o n i s t ss u c h a s t r i f l u o p e r a z i n e ,c h l o r p r o -m a z i n e ,c a l m i d a z o l i u m ,W 7 a n d W 1 3 h a v e a l lb e e n s h o w nt oi n h i b i tsome NO s y n t h a s ei s o e n z y m e s ,i n c l u d i n gt h e c o n s t i t u t i vC a 2 + - d e p e n d e n tn e u r o n a la n d v a s c u l a re n d o t h e l i a lNO s y n t h a s e s[ 1 5 , 3 3 , 8 5 ]a n d t h ei n d u c e dC a 2 + - i n d e p e n d e n tNO s y n t h a s ei n r a tl i v e r[ 3 1 ] .I n c o n t r a s t ,t h er o d e n t m a c r o p h a g ea n d e n d o t h e l i a


5/10


T a b l e4 F u n c t i o n a l l yd i s t i n c tN Os y n t h a s e s

Ty p e / s o u r c e C a 2 + - d e p e n d e n t C a M - d e p e n d e n t C o n s t i t u t i v e C y t o s o l i c / p a r t i c u l a t e

C o n s t i t u t i v ev a s c u l a re n d o t h e l i a l Y e s Y e s Y e s B o t hC o n s t i t u t i v en e u r o n a l Y e s Y e s Y e s C y t oM a c r o p h a g e N o N o N o C y t oL i v e r N o Ye s / n o N o C y t oR a b b i tc h o n d r o c y t e Y e s N o N o C y t oH u m a nc h o n d r o c y t e N o N o N o C y t o

i n d u c e dC a 2 l - i n d e p e n d e n te n z y m e s [ 2 6 , 2 8 , 8 5 ]a n d t h e r a b b i tc h o n d r o c y t ei n d u c e dC a 2 + - d e p e n d e n te n z y m e s [ 8 6 ]a re n o t i n -h i b i t e db y t h e s ec o m p o u n d s .T h i s d i f f e r e n c eb e t w e e ni s o f o r m so fNO s y n t h a s ei s t h u s n o t s i m p l yr e l a t e dt o t h e i rC a 2 + - d e p e n d e n c eo r - i n d e p e n d e n c eo r t o w h e t h e rt h e y a re c o n s t i t u t i v eo r i n d u c i b l e .T h e d i f f e r e n t i a ls e n s i t i v i t yt o s u c h i n h i b i t o r si s p r o b a b l yb a s e don t he a f f i n i t yo f t h e d i f f e r e n ti s o e n z y m e sf o rc a l m o d u l i n( s e e

b e l o w ) .A n o t h e rd i s t i n c tway o f i n h i b i t i n gNO s y n t h a s e i n b i o l o g i c a ls y s t e m si s t o l i m i tt h es u p p l y o f o ne o f i t ss u b s t r a t e so r c o f a c t o r s .T h i s t y p e o f i n d i r e c ti n h i b i t i o nh a s b e e n d e mo n s t r a t e du s i n gi n h i b i t o r so f BH 4 s y n t h e s i s .B e c a u s eo f t h et u r n o v e ro f BH 4 i ni n t a c tc e l l sa n d t i s s u e s ,i n h i b i t i o no f i t s s y n t h e s i se v e n t u a l l yr e s u l t si n d e p l e t i o n o f BH 4 t o c o n c e n t r a t i o n st h a tl i m i tNOs y n t h e s i s [ 8 5 , 8 7 - 9 0 ] .E x a m p l e so f s u c h i n h i b i t o r si n c l u d e2 , 4 -d i a m i n o - 6 - h y d r o x y p y r i m i d i n e D A H P ) ,a n i n h i b i t o ro f t h ee n z y m e G TP c y c l o h y d r o l a s e - Iw h i c hi n i t i a t e sd e novo s y n t h e s i so f B H 4 , a n d m e t h o t r e x a t e a n i n h i b i t o ro f d i h y d r o p t e r i d i n er e d u c t a s eo r N - a c e t y l - o r N - m e t h o x y a c e t y l - 5 - h y d r o x y t r y p t -a m i n e( i n h i b i t o r so f s e p i a p t e r i nr e d u c t a s e ) ,b o t ho f w h i c hp r e v e n ts a l v a g e o f s e p i a p t e r i nt o BH 4 [ 8 7 , 9 1 - 9 3 ] .T h e e f f i c a c yo f s u c h

i n d i r e c ti n h i b i t o r so f NO s y n t h e s i sw i l lva ry i n d i f f e r e n tb i o l o g i c a lsystems, d e p e n d i n g on t h e s a t u r a t i o n o f NO syn tha se w i t h BH4,

t he r a t e o f BH 4 t u r n o v e ra n d t he p r e d o m i n a t i n gp a t h w a y s )o fBH 4 s y n t h e s i s .

NO s y n t h a s e h a s ,very r e c e n t l y ,b e e n d e m o n s t r a t e dt o b es u b j e c tt o f e e d b a c ki n h i b i t i o nb y N O : t wo d i s t i n c tf o r m so f NOs y n t h a s e ( b r a i nc o n s t i t u t i v ea n d m a c r o p h a g ei n d u c i b l e )w e r es h o w nt o b e i n h i b i t e db y NO e i t h e rp r o d u c e db y t h eenzymei t s e l fo r g e n e r a t e df r o mc h e m i c a lNO d o n o r s[ 9 4 , 9 5 ] .I t i s l i k e l yt h a t t h i si n h i b i t i o nr e s u l t sf r o mi n t e r a c t i o nw i t h t h ehaem o f NOs y n t h a s e .O t h e r a g e n t s t h a ta r e t h o u g h t t o i n t e r a c tw i t h h a e m c a r b o nm o n o x i d ea n d M e t h y l e n eB l u e )h a v ea l s ob e e ns h o w nt oi n h i b i tNO s y n t h a s e [ 3 5 - 3 7 , 9 6 ] .

N OS Y NT H A S E I S O E NZ Y ME S

Th e m a m m a l i a n s y s t e m si nw h i c hNO s y n t h e s i swas f i r s tdemon-s t r a t e dw e r e t h e v a s c u l a r e n d o t h e l i u m ,t h e b r a i n a n d a c t i v a t e dm a c r o p h a g e s[ 1 , 2 , 6 3 , 9 7 ] .I t was i m m e d i a t e l ya p p a r e n tf r o m t h ef i r s t s t u d i e so f t h e NO s y n t h a s e s i n t h e s es y s t e m s t h a t t h em a c r o p h a g ee n z y m e was d i f f e r e n tf r o m t h e o t h e r s ,a s i t wasC a 2 + - i n d e p e n d e n t[ 8 - 1 4 ] .D i f f e r e n c e si n p r o p e r t i e s T a b l e 4 )a n dd i f f e r e n t i a li n h i b i t o r / s u b s t r a t es p e c i f i c i t i e ss u g g e s tt ha t t he r e a remore t h a n j u s ttw o f o r m so f NO s y n t h a s e ,h o w e v e r ,and t h i sh a sr e c e n t l yb e e nc o n f i r m e db y t h e c l o n i n gand c h a r a c t e r i z a t i o no ft h r e e d i s t i n c tNO s y n t h a s e c D N A s . T h i s p e r m i t s t h e d e f i n i t i v ec l a s s i f i c a t i o no f t h e gene p r o d u c t ss o f a r c h a r a c t e r i z e di n t h i sw a ya s : n N O S( o r i g i n a l l yi d e n t i f i e da s c o n s t i t u t i v ei n n e u r o n a lt i s s u e ,a l s ok n o w n as t y p e I NOS [ 9 8 ] ) ;e N O S ( o r i g i n a l l yi d e n t i f i e dasc o n s t i t u t i v ei n v a s c u l a re n d o t h e l i a lc e l l s ,a l s o k n o w n as t y p e I I I

N O S ) ; a n d iNOS ( o r i g i n a l l yi d e n t i f i e da s b e i n g i n d u c i b l eb yc y t o k i n e si n m a c r o ph a g e s a n dh e p a t o c y t e s ,a l s ok n o w na s t y p eI I N O S ) .E x a m p l e so f t h e p h y s i o l o g i c a ls e t t i n g si n w h i c ht h e s et h r e ei s o e n z y m e so p e r a t ea r es h o w ni n F i g u r e4 ; e N O S s y n t h e -s i z i n gNO i na v a s c u l a re n d o t h e l i a lc e l li n r e s p o n s et oa c e t y l c h o -l i n e ,n N O Ss y n t h e s i z i n gNO i na n e u r o ni nr e s p o n s et og l u t a m a t e ;a n d iNOS s y n t h e s i z i n gNO i n a m a c r o p h a g ef o l l o w i n g i t s

i n d u c t i o nb y a c y t o k i n e .

N E U R O N A LC O N S T I T U T I V EN OS Y N T H A S E :n N O S

T h e f i r s ti s o e n z y m et o b e p u r i f i e d[ 1 5 ]a n d c l o n e d[ 1 6 ]w a st h er a tnNOS. T h i s e n z y m ei sC a 2 + -a n dc a l m o d u l i n - d e p e n d e n t[ 8 , 1 0 , 1 5 ]a n d i sc o n s t i t u t i v e l ye x p r e s s e da t a h i g h a c t i v i t yi n t h e b r a i n ;t h er a tb r a i nh a s t h eh i g h e s tc o n s t i t u t i v eNO s y n t h a s ea c t i v i t yo f 2 0r a t t i s s u e se x a m i n e d[ 5 0 ] .B o t h a n t i b o d ys t a i n i n ga n d i n s i t umRNA h y b r i d i z a t i o nt e c h n i q u e sd e m o n s t r a t et h a tt h ee x p r e s s i o no f t h eg e n ee n c o d i n gt h i si s o e n z y m ei s w i d e s p r e a di n r a tb r a i n ,w i t h p a r t i c u l a r l yl a r g ea m o u n t so f t h ep r o t e i na n d mRNA b e i n gf o u n di n t h ec e r e b e l l u m[ 1 6 , 9 9 , 1 0 0 ] .T h e c D N A e n c o d i n gt h e

human n N O S h a s b e e n c l o n e d ,a n d i t s mRNA s h o w nt o b ee x p r e s s e da t h i g hl e v e l si n human b r a i na n d a l s o m o r e s u r -p r i s i n g l y )i n human s k e l e t a lm u s c l e[ 1 0 1 ] ;i n t h er a t ,t h en N O SmRNA i sn o t r e a d i l yd e t e c t e di n t h i st i s s u e[ 1 6 , 1 0 1 ] .H i s t o l o g i c a ls t u d i e ss u g g e s tt h a tt h i sNO s y n t h a s ei s o e n z y m ei s a l s ow i d e l yd i s t r i b u t e di n p e r i p h e r a ln e u r a ls y s t e m s ( e . g .m y e n t e r i cp l e x ii n t h eg u t )a n d i n t h es p i n a lc o r d ( e . g .i n d o r s a lr o o t g a n g l i a )[ 9 9 , 1 0 2 , 1 0 3 ] .P a r t i a lp u r i f i c a t i o na n d c h a r a c t e r i z a t i o no f t h eNOs y n t h a s et h o u g h tt ob e r e s p o n s i b l ef o rp r o d u c t i o no f NO b y n o n -a d r e n e r g i cn o n - c h o l i n e r g i cn e r v e sa l s os u g g e s t st h a t t h es a m ei s o e n z y m ei s p r e s e n t i n b o t h t h ep e r i p h e r a la n d c e n t r a ln e r v o u ss y s t e m s[ 1 0 4 ] .B e c a u s eo f t h i sw i d ee x p r e s s i o ni nd i f f e r e n tt i s s u e s ,a n d b e c a u s eo f t h eh i g ha c t i v i t yo f n N O S i n t h eb r a i na n ds k e l e t a lm u s c l e ,i t i s l i k e l yt h a tt h i si s o e n z y m ei s r e s p o n s i b l ef o rt h el a r g e s tp r o p o r t i o no fc o n s t i t u t i v eNO s y n t h a s ea c t i v i t yi nm a n .

T h e c l o n i n g ,s e q u e n c i n ga n d c h a r a c t e r i z a t i o no f t h ec D N Ae n c o d i n gr a t a n d human n N O S r e v e a l t h a tt h e yh a v e mRNAs p e c i e so f > 1 0k b w hi c h e n c o d ep r o t e i n so f 1 4 2 9 a n d 1 4 3 3a m i n oa c i d sr e s pe c t i v e l y [ 1 6 , 1 01 ]( T a b l e5 ) .T h e p r o t e i n sf r o mt h e s et w o s p e c i e ss h o w a h i g hs e q u e n c ei d e n t i t y( 9 3 ) . T h e yc o n ta i n t w oc o n s e n s u sb i n d i n gs e q u e n c e sf o rN A D P H ,t w o f o rFAD, o n e f o rFMN a n d o n e f o rc a l m o d u l i n( F i g u r e5 ) .T h e ya l s oh a v e a c o n s e n s u ss e q u e n c e KRFGS) f o rp h o s p h o r y l a t i o nb y c y c l i cA M P - d e p e n d e n tp r o t e i nk i n a s e P K A ) .A l t h o u g hi t ha sb e e n c o n f i r m e dt h a tn o t o n l yPKA b u t a l s op r o t e i nk i n a s eC P K C )a n d c a l m o d u l i n - d e p e n d e n tk i n a s e CaMK) c a n i n d e e dp h o s p h o r y l a t er a t n N O S ,t h ep h y s i o l o g i c a ls i g n i f i c a n c eo f t h i s

p h o s p h o r y l a t i o nr e m a i n su n c e r t a i na s t h e r ei se i t h e rn o d e t e c t a b l ee f f e c to f p h o s p h o r y l a t i o no n e n z y m ea c t i v i t y P K A )o r e l s et h ee f f e c to n a c t i v i t yi s c o n t r o v e r s i a l P K C ,CaMK) [ 1 0 5 - 1 0 7 ] .


6/10


a )

F i g u r e4 N Os y n t h e s i sb yt h ek n o w nN Os y n t h a s ei s o e n z y m e s

T h r e ee x a m p l e so fN Os y n t h e s i sa r es h o w n : a )s y n t h e s i so fN Ob ye N O Si na v a s c u l a re n d o t h e l i a lc e l ls t i m u l a t e db ya c e t y l c h o l i n e( A C h ) ; b )N Os y n t h e s i sb yn N O Si na n e ur o na l d e nd r it es t i m u l a t e db yg l u t a m a t e G l u ) ;a n d c )N Os y n t h e s i sb yi N O Si na m a c r o p h a g ef o l l o w i n gi n d u c t i o no fi N O Sm R N Aa n de n z y m eb yc y t o k i n e s .

E N D O T H E L I A LC O N S T I T U T I V EN OS Y N T H A S E :e N O S

T h e c o n s t i t u t i v eNO s y n t h a s e o f v a s c u l a r e n d o t h e l i a lc e l l sappea r s t o b e f u n c t i o n a l l ys i m i l a rt o n N O S a n d d i s t i n c tf r o mi N O S ,t h ei n d u c e di s o e n z y m ef o u n di n a c t i v a t e dm a c r o p h a g e s .T h u sb o t hc o n s t i t u t i v ee n z y m e s a re c l e a r l yC a 2 + -a n dc a l m o d u l i n -d e p e n d e n t ,u n l i k e t hem a c r o p h a g eenzyme T a b l e 4 ) .T h e r e f o r e ,u n t i lt he e n d o t h e l i a le n z y m e h a d b e e n c l o n e d ,i t was n o t c l e a rw h e t h e r o r n o t t h e n e u r o n a la n d e n d o t h e l i a lNO s y n t h a s e sw e r e d i s t i n c ti s o e n z y m e s ,d e s p i t et h e l o w e r a p p a r e n t s u b u n i tm o l e c u l a rmass o f t h e p u r i f i e de n d o t h e l i a lenzyme 1 3 5 k Daversus 1 5 5k D a f o r t he b r ai ne n z y m e [ 1 5 , 2 7 ] ) .

C l o n i n go f t h e b o v i n e[ 4 3 - 4 5 ]a n dh u m a n [ 1 0 8 , 1 0 9 ]c o n s t i t u t i v ee N O Sr e v e a l e dt h a t e N O Sa n d n N O Sa re d i s t i n c tgene p r o d u c t s ,w i t h o n l y 57 a m i n oa c i d i d e n t i t ys h a r e d b e t w e e nt h e t woh u m a n p r o t e i n s .N o r t h e r na n a l y s i ss h o w st ha t t hee N O SmRNAi s 4 . 4 k b i n l e n g t h ,l e s st h a n h a l f t he s i z eo f t h en e u r o n a lmRNAs p e c i e s T a b l e 5 ) .e N O S ,i n common w i t h nNOS, h a s c o n s e n s u sN A D P H - , FMN-, FA D - a n d c a l m o d u l i n - b i n d i n gs i t e sa n d ac o n s e n s u s PKA p h o s p h o r y l a t i o ns i t e F i g u r e 5 ) . T h e r e a r e ,h o w e v e r ,s i g n i f i c a n td i f f e r e n c e si n t h e N - t e r m i n a lp a r t o f t h eenzymes: t h e e N O S N - t e r m i n u si s s h o r t e r and h a s a c o n s e n s u sN - m y r i s t o y l a t i o ns i t e .T h i s f i n d i n gi s i n a g r e e m e n tw i t h r e p o r t st h a t e N O S i s m y r i s t o y l a t e d[ 1 1 0 ] ,and t h i sm a y e x p l a i nwh y i t i sp a r t i a l l ym e m b r a n e - a s s o c i a t e d .T h i s h a sb e e nc o n f i r m e db y s i t e -

d i r e c t e dm u t a g e n e s i sa t t h ep u t a t i v em y r i s t o y l a t i o ns i t e ,w h i c hr e s u l t si n t h ee x p r e s s i o no f a c y t o s o l i cNO s y n t h a s e [ 1 1 1 ] .I ts e e m sl i k e l yt h a t t h e' s o l u b l e 'a n d ' p a r t i c u l a t e 'e n d o t h e l i a lNOs y n t h a s e s ( d e s i g n a t e dt y p e sl b a n d I I I r e s p e c t i v e l yb y o n e g r o u p[ 9 8 ] )a r e t h es a m eg e n ep r o d u c t e N O S )a n d t h a tt h ee n z y m ei sp a r t l y a n d i n s o m e i n s t a n c e sp r e d o m i n a n t l y )m e m b r a n e -a s s o c i a t e db e c a u s eo f b i n d i n go f t h eN - t e r m i n a lm y r i s t a t et oc e l lm e m b r a n e s .

T h i s i s o f o r mo f NO s y n t h a s ei s p r o b a b l yr e s p o n s i b l ef o rt h eNO s y n t h a s ea c t i v i t yo f v a s c u l a re n d o t h e l i u mi nb l o o dv e s s e l so fa l lt y p e s :N o r t h e r nb l o ta n a l y s i sha s r e v e a l e dt h ep r e s e n c eo f t h emRNA f o re N O S i n h u m a n ,b o v i n e ,r a b b i ta n d r a t v a s c u l a re n d o t h e l i a lc e l l sd e r i v e df r o mc o n d u i ta r t e r i e s ,m i c r o v e s s e l so rv e i n s[ 4 3 , 4 5 , 1 0 8 ] .M o r e o v e r ,i m m u n o h i s t o c h e m i s t r yw i t h a n t i -b o d i e so f d i f f e r e n ts p e c i f i c i t i e sf o rn N O Sa n de N O Sha s r e v e a l e dt h ep r e s e n c eo f e N O Si m m u n o r e a c t i v i t yi nhuman l u n g ,l i v e ra n ds k i nb l o o dv e s s e l s[ 1 0 3 ] .

I N D U C I B L EN OS Y N T H A S E :i N O SF o l l o w i n ge x p o s u r eo f a w i d er a n g eo f c e l lt y p e sa n d t i s s u e st oc y t o k i n e so r b a c t e r i a lp r o d u c t s ,a n NO s y n t h a s e ( s )i s i n d u c e dw h i c hi s c l e a r l yd i f f e r e n tf r o mn N O Sa n d e N O S [ 5 , 4 1 ] .R o d e n tm a c r o p h a g e sh a v e b e e n t h e s o u r c e o f t h e m o s t e x t e n s i v e l y


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T a b l e5 C l o n e dN Os y n t h a s e s

A m i n oa c i di d e n t i t y( )C a l c u l a t e ds i z eo f

T y p e S p e c i e s S i z eo fm R N A k b ) p r o t e i n k D a ) B e t w e e ns p e c i e sB e t w e e ni s o f o r m s

R a t 1 0 . 5

H u m a n 1 0 . 0B o v i n e 4 . 4 ,4 . 8

H u m a n 4 . 7i N O S M u r i n e 4 . 0 , 4 . 4 ,5 . 0

H u m a n 4 . 4

1 6 0 . 59 3

1 6 1 . 51 3 3 . 0

9 41 3 3 . 01 3 0 . 6

8 11 3 1 . 2

PKAP

n NOS H 2 N

0

Ca M F MNw s~~~~0 0

M y r i s t

FAD N A D P H

. . . . . . . . . . . . . . . .H

10 0 0

H2N

H 2 NA

- [ 1 - - : : - I I : : 1 o 5 0 0 1 0 0 0 1 2 C

I .: m I I T r i - - - - - - - -

I5 0 0

1 I I

1 0 0 0

-COOH

0 3

i L - t-COOH

1 1 5 3

F i g u r e5 T he p r i m a r ys t r u c t u r eo f h u m a nN Os y n t h a s e sl s o e n z y m e s

T h i ss c h e m a t i cr e p r e s e n t a t i o ns h o w st h el e n g t h sa n dc o n s e n s u sb i n d i n gs i t e sf o rN A D P H ,F A D ,F M Na n d c a lm od u li n( C a M )a s w e l la s t h ec o n s e n s u sP K Ap h o s p h o r y l a t i o ns i t e( P K A P )a n dt h eN - t e r m i n a lm y r i s t o y l a t i o ns i t e M y r i s t ) .

s t u d i e d i n d u c i b l eC a 2 + - i n d e p e n d e n tNO s y n t h a s e .M a c r o p h a g eNO s y n t h a s eh a s b e e np u r i f i e d ;i t h a s a s u b u n i tm o l e c u l a rm a s so f approx. 1 3 0k Da a n d i s f u l l ya c t i v ei n t h e a b s e n c eo f e i t h e rC a 2 +o r a d d e dc a l m o d u l i n[ 2 6 , 2 8 ] .T h i s e n z y m e h a s now b e e nc l o n e db y t h r e e i n d e p e n d e n tgroups [ 4 6 - 4 8 ] .M u r i n em a c r o p h a g e

i N O S h a s a n mRNA s p e c i e so f 4 - 5 kb w h i c he n c o d e sa p r o t e i no f 1 3 0 6 0 0D a Ta b l e 5 ) . Th e n u c l e o t i d esequence c o n t a i n sa na l t e r n a t i v ep o t e n t i a lt r a n s l a t i o ns t a r ts i t ew h i c hc o u l d e n c o d eas m a l l e r p r o t e i n o f 1 1 8 k D a , a n d i n f a c t a s l i g h t l ys h o r t e rRAW264 .7 c e l l c D N A c l o n e was i d e n t i f i e db y o ne g r o u p ;h o w e v e r ,no e v i d e n c ewas f o u n df o rt h e e x p r e s s i o no f t h i sf o r ma t t h e p r o t e i n l e v e l[ 4 8 ] .Th e a m i n oa c i d sequence p r e d i c t e df o rt h e 1 3 0k D a s p e c i e ss h o w st h a t t h i si n d u c i b l eenzyme i s q u i t ed i s t i n c tf r o m t h e t wo k n o w n c o n s t i t u t i v ei s o e n z y m e s ,s h a r i n go n l y 5 1 a n d 5 4 0 sequence i d e n t i t yw i t h e N O S a n d n N O Sr e s p e c t i v e l y Ta b l e 5 ) .As f o rt h e o t h e r c l o n e di s o e n z y m e s ,t h e r ear e consensus sequences f o r b i n d i n go f N A D P H , FMN a n dFAD F i g u r e5 ) .S u r p r i s i n g l y ,i n v i e wo f t h e a p p a r e n tc a l m o d u l i n -i n d e p e n d e n c eo f i N O S a n d i t s i n s e n s i t i v i t yt o c a l m o d u l i ni n -

h i b i t o r ss u c h a s t r i f l u o p e r a z i n e ,t h i s i s o e n z y m ea l s oh a s aconsensus sequence f o r c a l m o d u l i nb i n d i n g , a l t h o u g h t h e s e -

quence c o m p a r i s o no f t h i s2 1 - a mi n o - a c i d r e g i o nw i t h t h a t o f

n N O S s h o w so n l y 4 3 i d e n t i t y .Th e s o l u t i o n o f t h i sp a r a d o xappear s t o b e t h a t i N O S b i n d sc a l m o d u l i ne x t r e m e l yt i g h t l y ,i na n a p p a r e n t l yC a 2 l - i n d e p e n d e n tmanner [ 3 4 ] .I t ca n b e shownt h a t c a l m o d u l i nr e m a i n s bound ( n o n - c o v a l e n t l y )t o t h e NOs y n t h a s ef o l l o w i n gb o i l i n gi n SD S a n d PA G E . T h u s c a l m o d u l i n

i s a c o n s t i t u t i v es u b u n i t o f i N O S [ 3 4 ] ,a s i t i s o f p h o s p h o r y l a s ek i n a s e a n d o ne c y c l i cn u c l e o t i d ep h o s p h o d i e s t e r a s e .P r o b e st o t h e cDNA e n c o d i n gmouse i N O S h a v e r e c e n t l yb e e n

u s e d t o c l o n e mRNA s p e c i e sf r o mr a t s m o o t hm u s c l ec e l l sa n dh e p a t o c y t e s[ 1 1 2 , 1 1 3 ] .T h e s e s t u d i e ss h o w t h a tt h e s et wo c e l lt y p e s c o n t a i n an mRNA f o r an i d e n t i c a li N O S w h i c hi s 9 4 0i d e n t i c a lt o t h e m u r i n em a c r o p h a g eenzyme. T h i s s u g g e s t st h a tt he same NO s y n t h a s e i s o f o r mca n b e i n d u c e di n a l l t h r e e c e l lt y p e s .

F u r t h e r m o r e ,a n i n d u c i b l eNO s y n t h a s eh a s b e e n c l o n e d ,i nt h e s e l a b o r a t o r i e s ,f r o m h u m a n c h o n d r o c y t e s[ 1 1 4 ] .F o l l o w i n gexposure t o i n t e r l e u k i n - 1 ,h u m a n c h o n d r o c y t e se x p r e s s an NOs y n t h a s ew h i c hi s s i m i l a rt o t h e r o d e n t i N O S i n t h a t i t i s C a 2 + -i n d e p e n d e n ta n d n o t i n h i b i t e db y t h e c a l m o d u l i na n t a g o n i s t

W 1 3 [ 1 1 5 ] .A n a l y s i so f t h e 4 . 4 kb mRNA f o r t h i se n z y m e s h o w st h a t t h e 1 3 1 2 0 0D a p r o t e i ni s 8 1 i d e n t i c a l a n d 8 8 s i m i l a r )t o t h e r o d e n tm a c r o p h a g ei n d u c i b l ee n z y m e Ta b l e 5 ) ,s u g g e s t i n g

n N O S

e N O S

N e u r o n a l c o n s t i t u t i v e )

E n d o t h e l i a l c o n s t i t u t i v e )

M a c r o p h a g e i n d u c i b l e )

C h o n d r o c y t e i n d u c i b l e )

5

5 45 1

eNOS

I C O O H

1 4 3 3

i N O S

--I

s ~~~1

iz - - I I .


8/10


t h a ti t i s l i k e l yt o b e t h e human h o m o l o g u eo f t h e r o d e n tm a c r o p h a g e / v a s c u l a rs m o o t hm u s c l e / h e p a t o c y t ei n d u c i b l eNOs y n t h a s e .T hi s ha sb e e n c o n f i r m e d b ya v e r yr e c e n tr e p o r t[ 1 1 6 ]o n t h ec l o n i n go f human h e p a t o c y t ei n d u c i b l eNO s y n t h a s e .

C H R O M O S O M A LL O C A L I Z AT I O NO F N O S Y N T H A S EG E N E S

T h e c h r o m o s o m a ll o c a t i o no f t h enNOS, e N O S a n d iNOS g e n e sha s b e e nd e t e r m i n e d ,u s i n g i s o e n z y m e - s p e c i f i cc D N Ap r o b e s ,b yS o u t h e r nb l o t t i n ga n a l y s i so f a p a n e l o f h u m a n - r o d e n th y b r i dc e l ll i n e s .T h e n N O S g e n e a pp e a r st o b e a n i n t r o n - c o n t a i n i n gg e n eo fa t l e a s t2 0 k b ,a n d i s u n e q u i v o c a l l yl o c a l i z e dt o a s i n g l ep o s i t i o no n human c h r o m o s o m e1 2[ 1 1 7 , 1 1 8 ] .T h e e N O S g e n em a p st o c h r o m o s o m e7 [ 1 1 9 ] .I n c o n t r a s tt o n N O S a n d e N O S ,iNOS c D N A p r o b e s i d e n t i f y s e v e r a l p o s i t i v eh y b r i d i z a t i o ns i g n a l s ,l o c a t e do n e i t h e r s i d eo f t h ec e n t r o m e r eo f c h r o m o s o m e1 7[ 1 1 9 ] .I t i s n o t c l e a rw h e t h e rt h e s ec o d e f o r a l t e r n a t i v ef o r m so f iNOS o r w h e t h e rs o m ea r ei n t r o n l e s sp s e u d o g e n e s .T h e NOs y n t h a s e g e n e s t h e r e f o r er e p r e s e n t a d i s p e r s e dg e n e f a m i l yo nt h r e ed i f f e r e n tc h r o m o s o m e s .

I N D U C T I O NO F C a 2 + - D E P E N D E N TN OS Y N T H A S E S

I t i sn o t c l e a rt h a ta l lo f t h ei n d u c e dNO s y n t h a s ea c t i v i t i e sc a nb e e x p l a i n e ds i m p l y b y t h ep r e s en c e o ft h eC a 2 + - i n d e p e n d e n t ,c a l m o d u l i n - i n d e p e n d e n tiNOS d e s c r i b e da b o v e . I n d u c t i o n o faC a 2 + - d e p e n d e n tNO s y n t h a s eb y e n d o t o x i no r i n t e r l e u k i n - 1h a sb e e nd e m o n s t r a t e di n r a b b i ta r t i c u l a rc h o n d r o c y t e si nv i t r o[ 8 6 ] .T h i sw a sd e m o n s t r a t e dt ob e a n i n d u c t i o np r o c e s sb y i t si n h i b i t i o nb y c y c l o h e x i m i d e ,b u t i t w a s n o t i n h i b i t e db y g l u c o c o r t i c o i d s .S i m i l a r l y ,i n c r e a s e da c t i v i t yo f C a 2 + - d e p e n d e n te n z y m eha s b e e no b s e r v e di n r e s p o n s et o e n d o t o x i ni n t h er a t i n t e s t i n ei n v i v o[ 5 0 ] .T h i s e n z y m ei n d u c t i o nw a s a l s o i n se n s i t i v et o g l u c o c o r t i -c o i d s .T h i s r e s p o n s ei sd i f f e r e n tf r o mt h a to f t h eC a 2 + - i n d e p e n d e n ti N O S ,t h ei n d u c t i o no f w h i c hi s p o t e n t l yi n h i b i t e db y g l u c o c o r t i -c o i d si n m a c r o p h a g e s ,v a s c u l a rs m o o t hm u s c l e ,e n d o t h e l i a lc e l l sa n d EMT-6 a d e n o c a r c i n o m ac e l l si nv i t r o[ 1 2 0 - 1 2 3 ]a n d i n l i v e r ,l u n g ,i l e u ma n d n e u t r o p h i l si nv i v o[ 5 0 , 1 2 4 , 1 2 5 ] .F u r t h e r m o r e ,a sm e n t i o n e da b o v e ,t h eC a 2 + - d e p e n d e n te n z y m ei n d u c e di n r a b b i tc h o n d r o c y t e si s n o t i n h i b i t e db y t h ec a l m o d u l i ni n h i b i t o r sW 1 3o r t r i f l u o p e r a z i n e ,u n l i k et h en e u r o n a la n d e n d o t h e l i a lc o n s t i -t u t i v eC a 2 + - d e p e n d e n tNO s y n th as e s T a b l e4 ) .I t t h e r e f o r es e e m st h a tt h i si n d u c i b l eC a 2 + - d e p e n d e n tNO s y n t h a s ei s b i o c h e m i c a l l yd i s t i n c tf r o m t h et w o o t h e rC a 2 + - d e p e n d e n te n z y m e s .A C a 2 + -d e p e n d e n tNO s y n t h a s ea c t i v i t yha s a l s ob e e n r e p o r t e d t o b ep r e s e n ti n t h em i c r o s o m a lf r a c t i o no f a c t i v a t e dr o d e n tm a c r o -p h a g e s ,i n a d d i t i o nt o t h e C a 2 + - i n d e p e n d e n tc y t o s o l i ciNOSa c t i v i t yd e s c r i b e da b o v e[ 1 2 6 , 1 2 7 ] .B e c a u s et h es e q u e n c eo f t h el a t t e re n z y m ed o e sn o t c o n t a i na c o n s e n s u sN - t e r m i n a lm y r i s t o y l -a t i o ns i t e[ 4 6 - 4 8 ] ,a n d b e c a u s eo f t h ed i f f e r e n tC a 2 +s e n s i t i v i t i e so ft h e s et w o a c t i v i t i e s ,i t a g a i n s e e m sp o s s i b l et h a tt h i si n d u c i b l e ,C a 2 + - d e p e n d e n t ,p a r t i c u l a t ee n z y m ec o u l db e a d i s t i n c te n z y m e :e i t h e ra n o v e l g e n e p r o d u c t o r a p o s t - t r a n s l a t i o n a l l ym o d i f i e de n z y m e .

F u r t h e r m o r e ,i t i s no w c l e a rt h a t t h e e x p r e s s i o no f t h ec o n s t i t u t i v en N O Sa n d e N O Si s a l s os u b j e c tt o r e g u l a t i o n ,a l b e i tb y q u i t ed i f f e r e n ts t i m u l if r o m t h e c y t o k i n e sa n d b a c t e r i a lc o m p o n e n t st h a ti n d u c ei N O S .W e h a v e f o u n dt h a tt h ea c t i v i t yo f C a 2 + - d e p e n d e n tNO s y n t h a s ei n t h eb r a i n a n d i n a v a r i e t yo fp e r i p h e r a lt i s s u e si s s u b s t a n t i a l l yi n c r e a s e dd u r i n g p r e g n a n c y ,e . g .> 4 - f o l di nt h eu t e r i n ea r t e r ya n d > 2 - f o l di n t h ec e r e b e l l u m ,h e a r t ,k i d n e y ,s k e l e t a lm u s c l ea n d o e s o p h a g u s ;t h e s ec h a n g e sa r ea c c o m p a n i e db y s u b s t a n t i a li n c r e a s e si n b o t h e N O Sa n d n N O Sm R N A s[ 1 2 8 ] .O e s t r o g e na l s oi n c r e a s e st h eC a 2 + - d e p e n d e n tNO

s y n t h a s e a c t i v i t yi n a r a n g e o f t i s s u e s ,a n d e N O S a n d n N O Sm R N A si ns k e l e t a lm u s c l e .T h u st h eC a 2 l - d e p e n d e n ti s o e n z y m e se N O Sa n d nNOS a r es u b j e c tt o i n d u c t i o nb y o e s t r o g e n[ 1 2 8 ] .I na d d i t i o n , t h ei nd uc t i o n o fb o t h e N O S mRNA a n d p r o t e i nha sb e e n d e m o n s t r at e df o l l o w i n ge x p o s u r e o f c u l t u r e dv a s c u l a re n d o t h e l i a lc e l l st o s h e a rs t r e s s[ 4 4 ] .S i g n i f i c a n ti n c r e a s e si nb r a i n NO s y n t h a s e a c t i v i t ya n d n N O S mRNA h a v e a l s ob e e n

d e m o n s t r a t e df o l l o w i n gt r e a t m e n t o f r a t s w i t h l i t h i u ma n dt a c r i n e [ 1 2 9 , 1 3 0 ] .F u r t h e r s t u d i e sw i l lb e r e q u i r e dt o d e t e r m i n et h e p h y s i o l o g i c a la n d p a t h o p h y s i o l o g i c a ls i g n i f i c a n c eo f t h i sr e g u l a t i o no f t h ea c t i v i t yo f C a 2 + - d e p e n d e n tNO s y n t h a s e s .

O T H E RI N D U C I B L EC a 2 + - I N D E P E N D E N TN O S Y N T H A S E S ?E n d o t o x i no r c e r t a i nm i c r o - o r g a n i s m sc a u s e a s u b s t a n t i a li n -d u c t i o n o f NO s y n t h a s e i n r a t l i v e r ,a n d a l a r g ep r o p o r t i o no f t h i si s i n t h ep a r e n c h y m a ll i v e rc e l l s( h e p a t o c y t e s )[ 5 1 , 1 3 1 ] .A l t h o u g ht h i si n d u c e de n z y m eha s a s u b u n i tm o l e c u l a rm a s so fa p p r o x . 1 3 0 kDa a n d i s C a 2 + - i n d e p e n d e n tl i k ei N O S ,d a t a f r o mt w o g r o u p s h a v en e v e r t h e l e s ss u g g e s t e dt h a tt h i s may b e ad i s t i n c tf o r m o f NO s y n t h a s e ,b e c a u s e i t i s a t l e a s tp a r t l y

c a l m o d u l i n - d e p e n d e n t[ 3 1 , 3 2 ] Ta b l e 4 ) .H o w e v e r ,b o t h o f t h es t u d i e so f c a l m o d u l i n - d e p e n d e n t ,C a 2 + - i n d e p e n d e n t ,i n d u c i b l eNO s y n t h a s ep u r i f i e df r o mr a tl i v e ru s e d C a 2 +c h e l a t o r si n t h e i re x t r a c t i o nb u f f e r s ,w h e r e a ss t u d i e si n w h i c h t h em a c r o p h a g eiNOS ha s n o t s h o w nc a l mo d ul i n d e pe n d e n c e h a v en o t u s e d C a 2 +c h e l a t o r s .I t i s t h e r e f o r e p o s s i b l et h a ta t v e r yl o w f r e eC a 2 +c o n c e n t r a t i o n s ,d i s s o c i a t i o no f c a l m o d u l i nf r o mt h em a c r o p h a g eNO s y n t h a s eo c c u r s ,g i v i n gr i s et o a c a l m o d u l i n - s t i m u l a t e dNOs y n t h a s e .F u r t h e rw o r kw i l lb e r e q u i r e dt o r e s o l v ew h e t h e ro r n o tt h el i v e re x p r e s s e sa d i s t i n c ti n d u c i b l eNO s y n t h a s e i s o e n z y m e .

C O N C L U S I O N

I n t e n s i v es t u d y o f t h eNO s y n t h a s e sd u r i n gt h el a s t 5y e a r sha s

r e v e a l e da f a m i l yo f e n z y m e s ,c a r r y i n go u t a c o m p l e xr e a c t i o n ,w h i c ha p p e a r t o b e h i g h l yc o n s e r v e db e t w e e nt h em a m m a l i a ns p e c i e ss t u d i e ds o f a r . S u c h c o n s e r v a t i o nb e t w e e ns p e c i e s ,t o -g e t h e rw i t h t h ed i v e r s i t yo f t h ei s o e n z y m e sa n d t h e l a r g e a n d s t i l lg r o w i n g )l i s to f p h y s i o l o g i c a lr o l e st h a tt h e y s e r v e ,s u g g e s tt h a ts y n t h e s i so f NO f r o mL - a r g i n i n ei s a r e g u l a t o r ya n d h o s td e f e n c em e c h a n i s mo f g r e a ti m p o r t a n c e .T h ec o m b i n a t i o no f t h et y p e so fr o l et h a tN O p l a y s ,n a m e l yi n t r a c e l l u l a rs i g n a l ,t r a n s c e l l u l a rs i g n a la n d c y t o t o x i cm o l e c u l e ,i s u n p r e c e d e n t e di n b i o l o g y .

W ea r eg r a t e f u lt o D r .H .F . H o d s o n ,D r .1 G .C h a r l e sa n dD r .E A .H i g g sf o rt h e i rc r i t i c a lr e a d i n go f t h em a n u s c r i p ta n dt o M a r g a r e tP a r r yf o ri t sp r e p a r a t i o n .

R E F E R E N C E S

1 P a l m e r ,R .M .J F e rr i g e , A .G .a n dM o n c a d a ,S . ( 1 98 7) N at ur e( L o n d o n )3 2 7 ,5 2 4 - 5 2 6

2 I g n a r r o ,L J B u g a ,G .M . ,Wo o d ,K .S B y r n e s ,R .E a n dC h a u d h u r i ,G .( 1 9 8 7 )P r o c .N a t i .A c a d .S c i .U . S . A . 8 4 ,9 2 6 5 - 9 2 6 9

3 P a l m e r ,R .M .J A s h t o n ,D . S .a n dM o n c a d a ,S . ( 1 98 8) N at u re( L o n d o n )3 3 3 ,6 6 4 - 6 6 6

4 S c h m i d t ,H . H .H .W . ,N a u ,H . ,W i t f f o h t ,W . , G e r l ac h ,J P r e s c h e r ,K .E K l e i n ,M .M . ,N i r o o m a n d ,F a n dB o h m e ,E ( 1 9 8 8 )E u r .J P ha r ma c ol . 1 5 4 ,2 1 3 - 2 1 6

5 F u r c h g o t t ,R .F ( 1 99 0) A ct aP h y s i o l .S c a n d .1 3 9 ,2 5 7 - 2 7 06 M o n c a d a ,S P a l m e r ,R .M .J . a n dH i g g s ,E A .( 1 99 1 ) P ha r ma c ol .R e v .4 3 ,1 0 9 - 1 4 27 S n y d e r ,S .H .a n dB r e d t ,D .S .( 1 9 9 2 )S c i .A m .2 6 6 ,6 8 - 7 78 K n o w l e s ,R .G . ,P a l a c i o s ,M . ,P a l m e r ,R .M .J . a n dM o n c a d a ,S .( 1 9 8 9 )P r o c .N a t l .

A c a d .S c i .U . S . A .8 6 ,5 1 5 9 - 5 1 6 29 P a l m e r ,R .M .J . a n dM o n c a d a ,S .( 1 9 89 ) B i oc h em .B i o p h y s .R e s .C o m m u n .1 5 8 ,

3 4 8 - 3 5 21 0 M a y e r ,B S c h m i d t ,K . ,H u m b e r t ,P .a n dB o h m e ,E .( 1 9 8 9 )B i o c h e m .B i o p h y s .R e s .

C o m m u n .1 6 4 ,6 7 8 - 6 8 5


9/10


1 1 M u l s c h ,A . ,B a s s e n g e ,E .a n dB u s s e ,R .( 1 9 8 9 )N a u n y n - S c h m i e d e b e r g ' sA r c h .P h a r m a c o l .3 4 0 ,7 6 7 - 7 7 0

1 2 P a l a c i o s ,M . ,K n o w l e s ,R . G . ,P a l m e r ,R .M .J . a n dM o n c a d a ,S .( 1 9 8 9 )B i o c h e m .B i o p h y s .R e s .C o m m u n .1 6 5 ,8 0 2 - 8 0 9

1 3 S t u e h r ,D .J K w o n ,N .S . ,G r o s s ,S .S . ,T h i e l ,B .A . ,L ev i, R .a n dN a t h a n ,C .F .( 1 9 89 ) B i oc h em .B i o p h y s .R e s .C o m m u n .1 6 1 ,4 2 0 - 4 2 6

1 4 Ta y e h ,M .A .a n dM a r l e t t a ,M .A .( 1 9 8 9 )J . B i o l .C h e m .2 6 4 ,1 9 6 5 4 - 1 9 6 5 81 5 B r e d t ,D .S .a n dS n y d e r ,S .H .( 1 9 9 0 )P r o c .N a t l .A c a d .S c i .U . S . A .8 7 ,6 8 2 - 6 8 51 6 B r e d t ,D .S . ,H w a n g ,P .M . ,G l a t t ,C .E L o w e n s t e i n ,C . ,R e e d ,R .R .a n dS n y d e r ,S .H .

1 9 . 9 1 )N at u r e ( L on d on )3 5 1 ,7 1 4 - 7 1 81 7 K w o n ,N .S . ,N a t h a n ,C .F G i l k e r ,C . ,G r i f f i t h ,0 .W . ,M a t t h e w s ,D .E .a n dS t u e h r ,

D .J . ( 1 9 9 0 )J . B i o l .C h e m .2 6 5 ,1 3 4 4 2 - 1 3 4 4 51 8 S t u e h r ,D .J K w o n ,N .S . ,N a t h a n ,C .F G r i f f i t h ,0 .W . ,F e l d m a n ,P .L .a n d

W i s e m a n ,J . ( 1 9 9 1 )J . B io l.C h e m .2 6 6 ,6 2 5 9 - 6 2 6 31 9 L e o n e ,A .M . ,P a l m e r ,R .M .J K n o w l e s ,R . G . ,F r a n c i s ,P .L A s h t o n ,D .S .a n d

M o n c a d a ,S . ( 1 9 9 1 )J . B i o l .C h e m .2 6 6 ,2 3 7 9 0 - 2 3 7 9 52 0 M a y e r ,B . ,J o h n ,M . ,H e i n z e l ,B . ,We r n e r ,E .R . ,Wa c h t e r ,H . ,S c h u l t z ,G .a n d

B o h m e ,E .( 1 9 9 1 )F E B SL e f t .2 8 8 , 1 8 7 - 1 9 12 1 H o p e ,B .T M i c h a e l ,G .J K n i g g e ,K .M . a n dV i n c e n t ,S .R .( 1 9 9 1 )P r o c .N a t l .A c a d .

S c i .U . S . A .8 8 ,2 8 1 1 - 2 8 1 42 2 D a w s o n ,T .M . ,B r e d t ,D .S . ,F o t u h i ,M . ,H w a n g ,P .M .a n dS n y d e r ,S .H .( 1 9 9 1 )

P r o c .N a t l .A c a d .S c i .U . S . A .8 8 ,7 7 9 7 - 7 8 0 1

2 3 H e i n z e l ,B . ,J o h n ,M . ,K la t t , P . ,B o h m e ,E .a n dM a y e r ,B .( 1 9 9 2 )B i o c h e m .J . 2 8 1 ,6 2 7 - 6 3 02 4 P o u ,S . ,P o u ,W .S . ,B r e d t ,D .S . ,S n y d e r ,S .H .a n dR o s e n ,G .M .( 1 9 9 2 )J . B i o l .

C h e m .2 6 7 ,2 4 1 7 3 - 2 4 1 7 62 5 S c h m i d t ,H . H . H .W . ,P o l l o c k ,J . S . ,N a k a n e ,M . ,G o r s k y,L . D . ,F o r s t e r m a n n ,U .a n d

M u r a d ,F .( 1 9 9 1 )P r o c .N a t l .A c a d .S c i .U . S . A .8 8 ,3 6 5 - 3 6 92 6 S t u e h r ,D .J C h o ,H .J K w o n ,N .S . ,We i s e ,M .F a n dN a t h a n ,C .F ( 1 9 9 1 )P r o c .

N a t l .A c a d .S c i .U . S . A .8 8 ,7 7 7 3 - 7 7 7 72 7 P o l l o c k ,J . S . ,F o r s t e r m a n n ,U . ,M i t c h e l l ,J . A . ,Wa r n e r ,T .D . ,S c h m i d t ,H . H .H .W . ,

N a ka n e , M .a n dM u r a d ,F .( 1 9 9 1 )P r o c .N a t l .A c a d .S c i .U . S . A .8 8 ,1 0 4 8 0 - 1 0 4 8 42 8 Yu i ,Y . ,H a t t o r i ,R . ,K o s u g a ,K . ,E i z a w a ,H . ,H i k i ,K .a n dK a w a i ,C .( 1 9 9 1 )J . B i o l .

C h e m .2 6 6 ,1 2 5 4 4 - 1 2 5 4 72 9 S c h m i d t ,H .H . H .W .a n dM u r a d ,F . ( 1 9 9 1 )B i o c h e m .B i o p h y s .R e s .C o m m u n .1 8 1 ,

1 3 7 2 - 1 3 7 73 0 O h s h i m a ,H . ,O g u c h i ,S . ,A d a c h i ,H . ,l id a, S . ,S u z u k i ,H . ,S u g i m u r a ,T .a n dE s u m i ,H .

( 1 9 9 2 )B i o c h e m .B i o p h y s .

R e s .C o m m u n .1 8 3 ,2 3 8 - 2 4 43 1 E v a n s ,T C a r p e n t e r ,A .a n dC o h e n ,J . ( 1 9 9 2 )P r o c .N a t l .A c a d .S c i .U . S . A .8 9 ,

5 3 6 1 - 5 3 6 53 2 l i d a ,S . ,O h s h i m a ,H . ,O g u c h i ,S . ,H a t a ,T S u z u k i ,H . ,K a w a s a k i ,H .a n dE s u m i ,H .

( 1 9 9 2 )J . B io l.C h e m .2 6 7 ,2 5 3 8 5 - 2 5 3 8 83 3 F d r s t e r m a n n ,U . ,P o l l o c k ,J . S S c h m i d t ,H .H . H .W . ,H e l l e r ,M .a n dM u r a d ,F .

( 1 9 9 1 )P r o c .N a t l .A c a d .S c i .U . S . A .8 8 ,1 7 8 8 - 1 7 9 23 4 C h o ,H .J X i e ,Q . ,C a l a y c a y ,J M u m f o r d ,R .A . ,S w i d e r e k ,K .M . ,L e e ,T .D .a n d

N a t h a n ,C .( 1 9 9 2 )J . E x p .M e d .1 7 6 ,5 9 9 - 6 0 43 5 K l a t t ,P S c h m i d t ,K .a n dM a y e r ,B .( 1 9 9 2 )B i o c h e m .J . 2 8 8 ,1 5 - 1 73 6 S t u e h r ,D .J . a n dI k e d a - S a i t o ,M .( 1 9 9 2 )J . B i o l .C h e m .2 6 7 ,2 0 5 4 7 - 2 0 5 5 03 7 W h i t e ,K .A .a n dM a r l e t t a ,M .A .( 1 9 9 2 )B i o c h e m i s t r y3 1 ,6 6 2 7 - 6 6 3 13 8 K w o n ,N .S N a t h a n ,C .F .a n dS t u e h r ,D .J . ( 1 9 8 9 )J . B i o l .C h e m .2 6 4 ,

2 0 4 9 6 - 2 0 5 0 13 9 M a y e r ,B J o h n ,M . a n dB d h m e ,E .( 1 9 9 0 )F E B SL e t t .2 7 7 ,2 1 5 - 2 1 9

4 0 G i o v a n e l l i ,J C a m p o s ,K .L .a n dK a u f m a n ,S .( 1 9 9 1 )P r oc . N a t i .A c a d .S c i .U . S . A .8 8 ,7 0 9 1 - 7 0 9 54 1 S t u e h r ,D .J . a n dG r i f f i t h ,0 .W .( 1 9 9 2 )A d v.E n z y m o l .6 5 ,2 8 7 - 3 4 64 2 K n o w l e s ,R .G . ,P a l a c i o s ,M . ,P a l m e r ,R .M .J . a n dM o n c a d a ,S . ( 1 9 9 0 )B i o c h e m .J .

2 6 9 ,2 0 7 - 2 1 04 3 L a m a s ,S M a r s d e n ,P .A . ,L iG .K . ,Te m p s t ,P .a n dM i c h e l ,T .( 1 9 9 2 )P r o c .N a t l .

A c a d .S c i .U . S . A .8 9 ,6 3 4 8 - 6 3 5 24 4 N i s h i d a ,K . ,H a r r i s o n ,D .G . ,N a v a s ,J . P F i s h e r ,A .A . ,D o c k e r y,S .P U e m a t s u ,M . ,

N e r e m ,R .M . ,A l e x a n d e r ,R .W .a n dM u r p h y ,T .J . ( 1 9 9 2 )J . C li n . I n ve s t .9 0 ,2 0 9 2 - 2 0 9 6

4 5 S e s s a ,W .C . ,H a r r i s o n ,J . K . ,B a r b e r ,C .M . ,Z e n g ,D . ,D u r i e u x ,M .E D A n g e l o ,D .D . ,L y n c h ,K . R .a n dP e a c h ,K .J . ( 1 9 9 2 )J . B i o l .C h e m .2 6 7 ,1 5 2 7 4 - 1 5 2 7 6

4 6 L o w e n s t e i n ,C .J G l a f t ,G .S . ,B r e d t ,D .S .a n dS n y d e r ,S .H .( 1 9 9 2 )P r o c .N a t l .A c a d .S c i .U . S . A .8 9 ,6 7 1 1 - 6 7 1 5

4 7 L y o n s ,R .C . ,O r l o f f ,G .J . a n dC u n n i n g h a m ,J . M .( 1 9 9 2 )J . B i o l .C h e m .2 6 7 ,6 3 7 0 - 6 3 7 4

4 8 X i e ,Q . ,C h o ,H .J C a l a y c a y ,J M u m f o r d ,R .A . ,S w i d e r e k ,K .M . ,L e e ,T .D . ,D i n g ,A . ,T r o s o ,T .a n dN a t h a n ,C .( 1 9 9 2 )S c i e n c e2 5 6 ,2 2 5 - 2 2 84 9 B o u c h e r ,J . - L . ,G e n e t ,A . ,Va d o n ,S . ,D e l a f o r g e ,M . ,H e n r y ,Y .a n dM a n s u y ,D .( 1 9 9 2 )

B i o c h e m .B i o p h y s .R e s .C o m m u n .1 8 7 ,8 8 0 - 8 8 6

5 0 S a l t e r ,M . ,K n o w l e s ,R .G .a n dM o n c a d a ,S . ( 1 9 9 1 )F E B SL e f t .2 9 1 ,1 4 5 - 1 4 95 1 K n o w l e s ,R .G . ,M e r r e t t ,M . ,S a l t e r ,M .a n dM o n c a d a ,S . ( 1 9 9 0 )B i o c h e m .J . 2 7 0 ,

8 3 3 - 8 3 65 2 F e e l i s c h ,M .a n dN o a c k ,E .A .( 1 9 8 7 )E u r .J . P h a r m a c o l .1 3 9 ,1 9 - 3 05 3 G r e e n ,L .C . ,Wa g n e r ,D .A . ,G l o g o w s k i ,J S k i p p e r ,P .L W i s h n o k ,J . S .a n d

Ta n n e n b a u m ,S .R .( 1 9 8 2 )A n a l .B i o c h e m .1 2 6 ,1 3 1 - 1 3 85 4 D a v i d s o n ,W .a n dWo l f ,C .( 1 9 7 8 )A n a l y s t1 0 3 ,4 0 3 - 4 0 65 5 B u s h ,P .A . ,G o n z a l e z ,N .E G r i s c a v a g e ,J . M . a n dI g n a r r o ,L .J . ( 1 9 9 2 )B i o c h e m .

B i o p h y s .R e s .C o m m u n .1 8 5 ,9 6 0 - 9 6 65 6 S t e i n ,C . ,C l a s s e n ,H . - G .a n dS c h w e d t ,G .( 1 9 8 8 )C l i n .C h i m .A c t a1 7 5 ,1 6 7 - 1 7 45 7 W i k l u n d ,N .P . ,L e o n e ,A .M . ,G u s t a f s s o n ,L .E .a n dM o n c a d a ,S .( 1 9 9 3 )N e u r o s c i e n c e

5 3 ,6 0 7 - 6 1 15 8 B e c k m a n ,J . S . ,B e c k m a n ,T .W .C h e n ,J M a r s h a l l ,P .A .a n dF r e e m a n ,B .A .( 1 9 9 0 )

P r o c .N a t l .A c a d .S c i .U . S . A .8 7 ,1 6 2 0 - 1 6 2 45 9 H e c k e r ,M . ,Wa l s h ,D .T .a n dVa n e ,J R .( 1 9 9 1 )F E B SL e t t .2 9 4 ,2 2 1 - 2 2 46 0 P a l m e r ,R .M .J R e e s ,D .D . ,A s h t o n ,D . S .a n dM o n c a d a ,S . ( 1 9 8 8 )B i o c h e m .

B i o p h y s .R e s .C o m m u n .1 5 3 ,1 2 5 1 - 1 2 5 66 1 H i b b s ,J . B J r T a i n t o r ,R .R .a n dVa v r i n ,Z .( 1 9 8 7 )S c i e n c e2 3 5 ,4 7 3 - 4 7 66 2 H i b b s ,J . B . ,J r Va v r i n ,Z .a n dT a i n t o r ,R .R .( 1 9 8 7 )J . I m m u n o l . 1 3 8,5 5 0 - 5 6 56 3 M a r l e t t a ,M .A . ,Yo o n ,P .S . ,l y e n g a r ,R . ,L e a f ,C . D .a n dW i s h n o k ,J . S .( 1 9 8 8 )

B i o c h e m i s t r y2 4 ,8 7 0 6 - 8 7 1 16 4 M a y e r ,B . ,J o h n ,M .a n d B o h m e ,E .( 1 9 9 0 )F E B SL e f t .2 7 7 ,2 1 5 - 2 1 96 5 R e e s ,D .D . ,P a l m e r ,R .M .J S c h u l z ,R . ,H o d s o n ,H .F .a n dM o n c a d a ,S . ( 1 9 9 0 )B r .

J P h a r m a c o l .1 0 1 ,7 4 6 - 7 5 26 6 M c C a l l ,T .B . ,F e e l i s c h ,M . ,P a l m e r ,R .M .J . a n dM o n c a d a ,S .( 1 9 9 1 )B r .J .

P h a r m a c o l .1 0 2 ,2 3 4 - 2 3 86 7 Va l l a n c e ,P L e o n e ,A . ,C a l v e r ,A . ,C o l l i e r ,J . a n dM o n c a d a ,S . ( 1 9 9 2 )L a n c e t3 3 9 ,

5 7 2 - 5 7 56 8 G r o s s ,S .S . ,S t u e h r ,D .A . ,A i s a k a ,K . ,J a f f e ,E A . ,L e v i ,R .a n dG r i f f i t h ,0 .W .( 1 9 9 0 )

B i o c h e m .B i o p h y s .R e s .C o m m u n .1 7 0 ,9 6 - 1 0 36 9 F u k u t o ,J . M . ,W o o d ,K .S . ,B y r n s ,R .E .a n dI g n a r r o ,L .J . ( 1 9 9 0 )B i o c h e m .B i o p h y s .

R e s .C o m m u n .1 6 8 ,4 5 8 - 4 6 57 0 D w y e r ,M .A . ,B r e d t ,D .S . a n dS n y d e r ,S .H .( 1 9 9 1 )B i o c h e m .B i o p h y s .R e s .

C o m m u n .1 7 6 ,1 1 3 6 - 1 1 4 17 1 F u r f i n e ,E S . ,H a r m o n , M .F P a i t h ,J Ea n dG a r v e y ,E P . ( 1 9 9 3 )B i o c h e m i s t r y3 2 ,

8 5 1 2 - 8 5 1 77 2 O l k e n ,N .M . ,R u s c h e ,K .M . ,R i c h a r d s ,M .K .a n dM a r l e t t a ,M .A .( 1 99 1 ) B i oc h em .

B i o p h y s .R e s .C o m m u n .1 7 7 ,8 2 8 - 8 3 3

7 3 F e l d m a n ,P . L .

G r i f f i t h ,0 .W . ,H o n g ,H .a n dS t u e h r ,D .J . ( 1 9 9 3 )J . M e d .C h e m .3 6 ,4 9 1 - 4 9 67 4 O g a w a ,T . K i m o t o ,M . ,Wa t a n a b e ,H .a n dS a s a o k a ,K .( 1 9 8 7 )A r c h .B i o c h e m .

B i o p h y s .2 5 2 ,5 2 6 - 5 3 77 5 O g a w a ,T . ,K i m o t o ,M .a n dS a s a o k a ,K .( 1 9 8 9 )J . B i o l .C h e m .2 6 4 ,1 0 2 0 5 - 1 0 2 0 97 6 O g a w a ,T . ,K i m o t o ,M . ,S a s a o k a ,K .( 1 9 9 0 )J . B i o l .C h e m .2 6 5 ,2 0 9 3 8 - 2 0 9 4 57 7 H e c k e r ,M . ,M i t c h e l l ,J . A . ,H a r r i s ,H .J K a t s u r a , M . ,T h i e m e r m a n n ,C .a n dVa n e ,

J . R .( 1 9 9 0 )B i o c h e m .B i o p h y s .R e s .C o m m u n .1 6 7 ,1 0 3 7 - 1 0 4 37 8 W h i t e ,M .F G a z z o l a ,G .C .a n dC h r i s t e n s o n ,H .N .( 1 9 8 2 )J . B i o l .C h e m .2 5 7 ,

4 4 4 3 - 4 4 4 97 9 W h i t e ,M .F ( 1 9 8 5 )B i o c h i m .B i op h ys . A ct a8 2 2 ,3 5 5 - 3 7 48 0 B o g l e ,R .G . ,M o n c a d a ,S P e a r s o n ,J D .a n dM a n n ,G .E ( 1 9 9 2 )B r .J P h a r m a c o l .

1 0 5 ,7 6 8 - 7 7 08 1 B u x t o n ,I L 0 . ,C h e e k ,D .J E c k m a n ,D . ,We s f f a l l ,D .P S a n d e r s ,K .M .a n dK e e f ,

K . D .( 1 9 9 3 )C i r c .R e s .7 2 ,3 8 7 - 3 9 58 2 S t u e h r ,D .J F a s e h u n ,0 .A . ,K w o n ,N .S . ,G r o s s ,S .S G o n z a l e z ,J A . ,L e v i ,R .a n d

N a t h a n ,C .F ( 1 9 9 1 )F A S E BJ 5 ,9 8 - 1 0 38 3 R a g a n ,C . a n dB l o x h a m ,D .P . ( 1 9 7 7 )B i o c h e m .J . 1 6 3 ,6 0 5 - 6 1 58 4 C r o s s ,A .R .a n dJ o n e s ,0 .T .G .( 1 9 8 6 )B i o c h e m .J 2 3 7 ,1 1 1 - 1 1 68 5 G r o s s ,S .S J a f f e ,E A . ,L e v i ,R .a n dK i l b o u r n ,R .G .( 1 9 9 1 )B i o c h e m .B i o p h y s .R e s .

C o m m u n .1 7 8 ,8 2 3 - 8 2 98 6 P a l m e r ,R .M .J A n d r e w s ,T F o x w e l l ,N .A .a n dM o n c a d a ,S . ( 1 9 9 2 )B i o c h e m .

B i o p h y s .R e s .C o m m u n .1 8 8 ,2 0 9 - 2 1 58 7 We r n e r - F e l m a y e r ,G . ,We r n e r ,E R F u c h s ,D . ,H a u s e n ,A . ,R e i b n e g g e r ,G .a n d

Wa c h t e r ,H .( 1 9 9 0 )J . E x p .M e d .1 7 2 ,1 5 9 9 - 1 6 0 78 8 G r o s s ,S .S .a n dL e v i ,R .( 1 9 9 2 )J B i o l .C h e m .2 6 7 ,2 5 7 2 2 - 2 5 7 2 98 9 S c h m i d t ,K . ,We r n e r ,E R M a y e r ,B Wa c h t e r ,H .a n dK u k o v e t z ,W .R .( 1 9 9 2 )

B i o c h e m .J . 2 8 1 ,2 9 7 - 3 0 09 0 S a k a i ,N . ,K a u f m a n ,S . a n dM i l s t e i n ,S . ( 1 9 9 3 )M o l .P h a r m a c o l .4 3 ,6 - 1 09 1 S m i t h ,G .K . ,D u c h ,D .S . ,E d e l s t e i n ,M .P . a n dB i g h a m ,E C .( 1 9 9 2 )J . B i o l .C h e m .

2 6 7 ,5 5 5 9 9 - 5 5 6 0 79 2 G a l ,E .M . ,N e l s o n ,J . M .a n dS h e r m a n ,A .D .( 1 9 7 8 )N e u r o c h e m .R e s .3 , 6 9 - 8 8

9 3 N i c h o l ,C .A . ,L e e ,C .L E d e l s t e i n ,M .P C h a o ,J Y .a n dD u c h ,D .S . 1 9 8 3 )P r o c .N a t l .A c a d .S c i .U . S . A .8 0 ,1 5 4 6 - 1 5 5 09 4 R o g e r s ,N .E .a n dI g n a r r o ,L T . ( 1 9 9 2 )B i o c h e m .B i o p h y s .R e s .C o m m u n .1 8 9 ,

2 4 2 - 2 4 9


10/10


9 5 A s s r e u y ,J C u n h a ,F .Q . ,L i e w ,F . Ya n dM o n c a d a ,S . ( 1 9 9 3 )B r .J . P h a r m a c o l .1 0 8 ,8 3 3 - 8 3 7

9 6 M a y e r ,B . ,B r u n n e r ,F .a n dS c h m i d t ,K .( 1 9 9 3 )B i o c h e m .P h a r m a c o l .4 5 ,3 6 7 - 3 7 49 7 G a r t h w a i t e ,J C h a r l e s ,S .L .a n dC h e s s - W i l l i a m s ,R .( 1 9 8 8 )N a t u r e( L o n d o n )3 3 6 ,

3 8 5 - 3 8 89 8 F o r s t e r m a n n ,U . ,S c h m i d t ,H .H . H .W . ,P o l l o c k ,J . S . ,S h e n g ,H . ,M i t c h e l l ,J . A . ,

Wa r n e r ,T .D . ,N a k a n e ,M .a n dM u r a d ,F .( 1 9 9 1 )B i oc h e m. P ha r m ac o l.4 2 ,1 8 4 9 - 1 8 5 7

9 9 B r e d t ,D .S . ,H w a n g ,P .M .a n dS n y d e r ,S .H .( 1 9 9 0 )N a t u r e( L o n d o n )3 4 7 ,7 6 8 - 7 7 0

1 0 0 V i n c e n t ,S .R .a n dK i m u r a ,H .( 1 9 9 2 )N e u r o s c i e n c e4 6 ,7 7 5 - 7 8 41 0 1 N a k a n e ,M . ,S c h m i d t ,H . H . H .W . ,P o l l o c k ,J . S . ,F o s t e r m a n n ,U .a n d

M u r a d ,F .( 1 9 9 3 )F E B SL e t t .3 1 6 ,1 7 5 - 1 8 01 0 2 S c h m i d t ,H . H . H .W . ,G a g n e ,G .D . ,N a k a n e ,M . ,P o l l o c k ,J . S . ,M i l l e r ,M .F .a n d

M u r a d ,F .( 1 9 9 2 )J . H i s t o c h e m .C y t o c h e m .4 0 ,1 4 3 9 - 1 4 5 61 0 3 S p r i n g a l l ,D .R . ,S u b u r o ,A . ,B i s h o p ,A .E M e r r e t t ,M . ,R i v e r o s - M o r e n o ,V . ,

M o n c a d a ,S .a n dP o l a k ,J . M .( 1 9 9 2 )H i s t o c h e m .9 8 ,2 5 9 - 2 6 61 0 4 S h e n g ,H . ,S c h m i d t ,H . H . H .W . ,N a k a n e ,M . ,M i t c h e l l ,J . A . ,P o l l o c k ,J . S . ,

F o r s t e r m a n n ,U .a n dM u r a d ,F .( 1 9 9 2 )B r .J . P h a r m a c o l .1 0 6 ,7 6 8 - 7 7 31 0 5 B r u n e ,B .a n dL a p e t i n a ,E .G .( 1 9 9 1 )B i o c h e m .B i o p h y s .R e s .C o m m u n .1 8 1 ,

9 2 1 - 9 2 61 0 6 N a k a n e ,M . , M i t c he l l ,J F o r s t e r m a n ,U .a n dM u r a d ,F .( 1 9 9 1 )B i o c h e m .B i o p h y s .

R e s .C o m m u n .1 8 0 ,1 3 9 6 - 1 4 0 2

1 0 7 B r e d t ,D .S . ,F e r r i s ,C .D .a n dS n y d e r ,S .H .( 1 9 9 2 )J . B i o l .C h e m .2 6 7 ,1 0 9 7 6 - 10 9 8 11 0 8 J a n s s e n s ,S .P . ,S h i m o u c h i ,A . ,Q u e r t e r m o u s ,T . ,B l o c h ,D .B .a n dB l o c h ,K .D .

( 1 9 9 2 )J . B io l.C h e m . 2 6 7 ,1 4 5 1 9 - 1 4 5 2 21 0 9 M a r s d e n ,P .A . ,S c h a p p e r t ,K .T C h e n ,H .S . ,F l o w e r s ,M . , S u n d e l l ,C .L W i l c o x ,J .

N . ,L a m a s ,S .a n dM i c h e l ,T .( 1 9 9 2 )F E B SL e t t .3 0 7 ,2 8 7 - 2 9 31 1 0 P o l l o c k ,J . S . ,K l i n g h o f e r ,V . ,F o r s t e r m a n n ,U .a n dM u r a d ,F .( 1 9 9 2 )F E B SL e t t .

3 0 9 ,4 0 2 - 4 0 41 1 1 S e s s a ,W .C . ,B a r b e r ,C .M .a n dLy n c h ,K . R .( 1 9 9 3 )C i r c .R e s .7 2 ,9 2 1 - 9 2 41 1 2 N u n o k a w a ,Y . ,I s h i d a ,N .a n dTa n a k a ,S .( 1 9 9 3 )B i o c h e m .B i o p h y s .R e s .C o m m u n .

1 9 1 ,8 9 - 9 41 1 3 W o o d ,E .R . ,B e r g e r ,H . ,J r S h e r m a n ,P .A .a n dL a p e t i n a ,E .G .( 1 9 9 3 )B i o c h e m .

B i o p h y s .R e s .C o m m u n .1 9 1 ,7 6 7 - 7 7 4

1 1 4 C h a r l e s ,I G . ,P a l m e r ,R .M .J H i c k e r y ,M .S . ,B a y l i s s ,M .T . ,C h u b b ,A .P . ,H a l l ,V .S . ,M o s s ,D .W . a nd M o n ca d a ,S . ( 1 9 9 3 )P r o c .N a t l .A c a d .S c i .U . S . A .9 0 ,1 1 4 1 9 - 1 1 4 2 3

1 1 5 P a l m e r ,R .M .J H i c k e r y ,M .S . ,C h a r l e s ,I G . ,M o n c a d a ,S .a n dB a y l i s s ,M .T .( 1 9 9 3 )B i o c h e m .B i o ph y s. R e s.C o m m u n .1 9 3 ,3 9 8 - 4 0 5

1 1 6 G e l l e r , D .A . ,L o w e n s t e i n ,C .J S h a p i r o ,R .A . ,N u s s l e r ,A .K . ,D iS i l v i o ,M . ,W a n g ,S .C . ,N a k a y a m a ,D .K . ,S i m m o n s ,R .L S n y d e r ,S .H .a n dB i l l i a r ,T .M .( 1 9 9 3 )P r o c .N a t l .A c a d .S c i .U . S . A .9 0 ,3 4 9 1 - 3 4 9 5

1 1 7 K i s h i m o t o ,J S p u r r ,N . ,L i a o ,M . ,L i z h i ,L E m s o n ,P .a n dX u ,W .( 1 9 9 2 )G e n o m i c s1 4 ,8 0 2 - 8 0 4

1 1 8 X u ,W . ,G o r m a n ,P . ,S h e e r ,D . ,B a t e s ,G . ,K i s h i m o t o ,J . , L i u ,L .a n dE m s o n ,P .( 1 9 9 3 )C y t o g e n eC e l lG e n e t .6 4 ,6 2 - 6 3

1 1 9 X u ,W . ,C h a r l e s ,I G . ,M o n c a d a ,S . ,G o r m a n ,P . ,S h e e r ,D . ,L i u ,L .a n dE m s o n ,P .( 1 9 9 4 )G e n o m e ,i n t h ep r e s s

1 2 0 D iR o s a ,M . ,C a r n u c c i o ,R . ,R a d o m s k i , M .W . a nd M o n c a d a ,S . ( 1 9 90 ) B i oc h em .B i o p h y s .R e s .C o m m u n .1 7 2 ,1 2 4 6 - 1 2 5 2

1 2 1 R e e s ,D .D . ,C e l l e k ,S . ,P a l m e r ,R .M .J . a n dM o n c a d a ,S .( 1 9 9 0 )B i o c h e m .B i o p h y s .R e s .C o m m u n .1 7 3 ,5 4 1 - 5 4 7

1 2 2 R a d o m s k i ,M .W . ,P a l m e r ,R .M .J . a n dM o n c a d a ,S . ( 1 9 9 0 )P r o c .N a t l .A c a d .S c i .U . S . A .8 7 ,1 0 0 4 3 - 1 0 0 4 7

1 2 3 O ' C o n n o r ,K .J . a n dM o n c a d a ,S .( 1 9 9 1 )B i o c h i m .B i o p h y s .A c t a1 0 9 7 ,2 2 7 - 2 3 11 2 4 K n o w l e s ,R .G . ,S a l t e r ,M . ,B r o o k s ,S .L .a n dM o n c a d a ,S . ( 1 9 90 ) B i oc h em .

B i o p h y s .R e s .C o m m u n .1 7 2 ,1 0 4 2 - 1 0 4 81 2 5 M c C a l l ,T .B . ,P a l m e r ,R .M .J . a n dM o n c a d a ,S . ( 1 9 9 1 )E u r .J . I m m u n o l .2 1 ,

2 5 2 3 - 2 5 2 71 2 6 H i k i ,K . ,Yu i ,Y . ,H a t t o r i ,R . ,E i z a w a ,H . ,K o s u g a ,K .a n dK a w a i ,C .( 1 9 9 1 )J p n .J .P ha r ma c ol . 5 6 ,2 1 7 - 2 2 0

1 2 7 H e c k e r ,M . ,Wa l s h ,D .T .a n dVa n e ,J . R .( 1 9 9 2 )J . C a r d i o v a s c .P h a r m a c o l .2 0 S u p p l .1 2 ) ,S 13 9 - S 14 1

1 2 8 We i n e r ,C .P . ,L i z a s o a i n ,I B a y l i s ,S . ,K n o w l e s ,R .G . ,C h a r l e s ,I G .a n d M o n c a d a ,S . ( 1 9 9 4 )P r o c .N a t i .A c a d .S c i .U . S . A . ,i n t h ep r e s s

1 2 9 B a g e t t a ,G . ,M a s s o u d ,R . ,R o d i n o ,P . ,F e d e r i c i ,G .a n dN i s t i c o , G .( 1 9 9 3 )E u r .J .P h a r m a c o l .2 3 7 ,6 1 - 6 4

1 3 0 B a g e t t a ,G . ,C o r a s a n i t i ,M .T . ,M e l i n o ,G . ,P a o l e t t i ,A .M . ,F i n a z z i - A g r o ,A .a n dN i s t i c o ,G .( 1 9 94 ) B i oc h em .B i o p h y s .R e s .C o m m u n . ,i n t h ep r e s s

1 3 1 B i l l i a r ,T .R . ,C u r r a n ,R .D . ,S t u e h r ,D .J S t a d l e r ,J S i m m o n s ,R .L .a n dM u r r a y ,S .A .( 1 9 90 ) B i o ch e m .B i o p h y s .R e s .C o m m u n .1 6 8 ,1 0 3 4 - 1 0 4 0

nitric oxide synthases in mammals

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