BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐÀO THU TRANG

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ DƯỢC LIỆU

CÓ TÁC DỤNG ỨC CHẾ ENZYM

LIPOXYGENASE

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2013

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐÀO THU TRANG

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ DƯỢC LIỆU

CÓ TÁC DỤNG ỨC CHẾ ENZYM

LIPOXYGENASE

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:

TS. Hoàng Quỳnh Hoa

Nơi thực hiện:

1. Bộ môn Thực vật

2. Bộ môn Vật lý – Hóa lý

Trường Đại Học Dược Hà Nội

HÀ NỘI – 2013

LỜI CẢM ƠN

Trước hết, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Hoàng

Quỳnh Hoa,người thầy đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá

trình thực hiện khóa luận này.

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới tập thể giảng viên, kĩ thuật viên Bộ môn Thực

vật đã giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi trong thời gian làm thực nghiệm tại Bộ

môn Thực vật.

Tôi cũng xin cảm ơn các thầy cô Bộ môn Vật lý – Hóa lý đã tạo mọi

điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình sử dụng máy đo quang phổ tại bộ

môn Vật lý – Hóa lý.

Tôi xin cảm ơn toàn thể cán bộ, giảng viênTrường Đại học Dược Hà

Nội đã cho tôi những kiến thức quý báu trong quá trình học tập tại trường.

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn vô hạn tới bố mẹ, người thân và

bạn bè của tôi – những người đã luôn động viên, chăm sóc và giúp đỡ tôi

trong suốt thời gian qua.

Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2013

Sinh viên

Đào Thu Trang

MỤC LỤC

Trang

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ …...……………………………………….………………. 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN…………………..………………………… 3

1.1. T

ổng quan về enzym Lipoxygenase ….…………………………… 3

1.1.1. Đị

nh nghĩa….…………………………………………………. ……3

1.1.2. P

hân loại enzym LOX...……………………………………….. ……3

1.1.3. C

ơ chế phản ứngcủa enzym LOX và cơ chất……………….……..4

1.1.4. V

ai trò của LOX trong động thực vật …...……………………….… 5

1.1.5. C

ác chất ức chế LOX ..………………………………………… ...…6

1.1.6. C

ơ chế ức chế LOX….…………………………………………. …...7

1.2. C

ác mô hình thử tác dụng ức chế LOX………………………......... 7

1.2.1. N

guyên lý của các mô hình thử tác dụng ức chế LOX…………... 7

1.2.2. C

ác mô hình thử tác dụng ức chế LOXdựa trên phương pháp

đo độ hấp thụ…………………………………………………………......... 9

1.3. T

ổng quan vềrutin và các dược liệu thực hiện nghiên cứu……….. 14

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…….. 18

2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị trong nghiên cứu…….…………………….. 18

2.2. Nội dung nghiên cứu…..…………………………………………….. 19

2.3. Phương pháp nghiên cứu……………………………………………. 20

2.3.1. Phương pháp chiết xuất dược liệu……………….………………… 20

2.3.2. Phương pháp lựa chọn điều kiện nghiên cứu……………….…….. 20

2.3.3. Phương pháp khảo sát tương tác enzym – chất ức chế……….…… 23

2.3.4. Lựa chọn mô hình thử tác dụng ức chế LOX của dược liệu….…… 24

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN …….…… 27

3.1. Lựa chọn điều kiện nghiên cứu…………………………..…………. 27

3.1.1. Xác định hoạt độ enzym …………………………….……….…… 27

3.1.2. Lựa chọn nồng độ enzym………… ………………..……..…….. 27

3.1.3. Lựa chọn nồng độ cơ chất……………………………….…….….. 29

3.1.4. Lựa chọn thời gian ủ………………………………….………..….. 31

3.2. Khảo sát tương tác enzym – chất ức chế…………………...…….…. 33

3.3. Thử tác dụng ức chế LOX của dược liệu theo mô hình 6 cuvet.……. 33

3.4. Bàn luận……………………………………………………….…….. 35

3.4.1. Về mô hình thử tác dụng ức chế LOX bằng phương pháp

đo quang ………………………………………………………………… 35

3.5.2. Về kết quả thử tác dụng ức chế LOX của dược liệu……………… 38

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ…………………………………………… 41

TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AST Aspartate aminotransferase

ALT Alanine aminotransferase

DMSO Dimethylsulfoxid

LOX Enzym Lipoxygenase

LDL Low Density Lipoprotein

% ƯC Phần trăm ức chế

DANH MỤC CÁC BẢNG

STT Số bảng Tên bảng Trang

1 1.1 Bố trí thí nghiệm đánh giá độ ức chế LOX của

Cayman 11

2 2.1 Danh mục các mẫu nghiên cứu 18

3 3.1 Độ hấp thụ của mẫu thử so với mẫu trắng ở 5

nồng độ enzym 28

4 3.2 Độ hấp thụ của mẫu thử so với mẫu trắng ở 6

nồng độ cơ chất 30

5 3.3 Độ hấp thụ của mẫu thử so với mẫu trắng theo

thời gian ủ 32

6 3.4 Kết quả khảo sát tương tác enzym – chất ức chế 33

7 3.5 Kết quả khảo sát tác dụng ức chế LOX của các

mẫu nghiên cứu 34

8 3.6 Kết quả khảo sát tác dụng ức chế LOX của chè

dây 35

DANH MỤC CÁC HÌNH

STT Số hình Tên hình Trang

1 1.1 Cơ chất thường gặp của LOX 3

2 1.2 Cấu trúc của 15-LOX ở thỏ 4

3 1.3 Cơ chế xúc tác của LOX 5

4 1.4 Phương pháp đo độ hấp thụ của

hydroperoxid 9

5 1.5 Mô hình đĩa 96 giếng của Cayman 11

6 1.6 Cấu trúc hóa học của rutin 14

1

ĐẶT VẤN ĐỀ Trong cơ thể người, enzym lipoxygenase (LOX) đóng vai trò quan trọng

trong quá trình sinh tổng hợp các chất trung gian hóa học gây ra các phản ứng

viêm, dị ứng và phản ứng miễn dịch [17]. Sản phẩm xúc tác của LOX liên

quan nhiều bệnh như hen phế quản [23], xơ vữa động mạch [40], [48], ung

thư [56], viêm loét đại tràng [21], viêm khớp, viêm cầu thận [17] và bệnh vẩy

nến [32].

Các chất ức chế LOX đã được chứng minh có tác dụng ngăn cản nguy cơ

ung thư [59] và đã được sử dụng để điều trị ung thư tuyến tụy [36], ung thư dạ

dày [66], ung thư vú [25],ung thư gan di căn [28] và ung thư miệng [45], v.v.

Một số chất ức chế LOX đã được sử dụng để điều trị hen mạn tính [52], phổi

tắc nghẽn mạn tính, bệnh viêm đường hô hấp trên[15], viêm đại tràng [22],

[51],viêm khớp gối [29]và bệnh da liễu [15]. Có nhiều chất ức chế LOX đã

được nghiên cứu có nguồn gốc từ cây cỏ. Đây là một hướng nghiên cứu rất

tiềm năng trong việc sàng lọc và phát triển các sản phẩm chữa bệnh theo cơ

chế ức chế enzym LOX.

Nhiều phương pháp đã được tìm ra để thử hoạt tính của LOX như: Sử

dụng điện cực oxygen [14], gắn đồng vị phóng xạ 14C [16] hay phương pháp

đo màu [65], [38]. Những phương pháp trên yêu cầu các thiết bị chuyên dụng

đồng thời lại phức tạp nên không phù hợp với sự sàng lọc nhanh nhiều mẫu.

Phương pháp đo quang dựa trên cơ chế hình thành hydroxyperoxid (sản phẩm

tạo thành trong phản ứng enzym – cơ chất) có nối đôi liên hợp hấp thụ ánh

sáng mạnh nhất ởbước sóng 234nm là phương pháp đơn giản, nhanh chóng và

tiết kiệm nhất để đánh giá hoạt tính của LOX [27]. Tuy nhiên, cho tới nay,

chúng tôi chưa thu thập được tài liệu nào công bố tại Việt Nam về phương

pháp này. Trên thế giới, cũng chưa có một mô hình thống nhất để thử tác

dụng ức chế LOX bằng phương pháp đo quang, đồng thời các tài liệu đều

2

không đưa ra vấn đề khảo sát để tìm ra nồng độ enzym, cơ chất hay thời gian

ủ phù hợp nhất.

Xuất phát từ thực tế đó, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu “Nghiên

cứu một số dược liệu có tác dụng ức chế enzym lipoxygenase” với hai mục

tiêu sau:

Mục tiêu 1: Xây dựng mô hình thử tác dụng dụng ức chế enzym lipoxygenase

của dịch chiết dược liệu bằng phương pháp đo quang.

Mục tiêu 2: Áp dụng mô hình vừa xây dựng để khảo sát tác dụng ức chế

enzym lipoxygenase của dịch chiết các dược liệu: chè dây, dâu tằm, lá móng,

kim ngân, cườm rụng, cúc áo, mã đề, xạ đen.

3

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN

1.1. Tổng quan vềenzym lipoxygenase

1.1.1. Định nghĩa

Lipoxygenases (LOX)là một nhóm các enzyme phức tạp. Thành phần

cấu tạo gồm có phần protein và phần nhóm ngoại chứa sắt. LOX xúc tác cho

phản ứnggắn phân tử oxy vào các acid béo có nhóm cis, cis-1,4-pentadien.

Hai acid béo acid linoleic và acid arachidonic là những cơ chất thường gặp

của LOX trong động thực vật [19], [26].

Hình 1.1. Cơ chất thường gặp của LOX

1.1.2. Phân loại enzym LOX

LOX có trong thực vật, động vật và nấm. Có nhiều loại LOX, nếu phân

loại dựa trên vị trí hydroperoxide hóa thì có các loại LOX sau: LOX-1, LOX-

3, LOX-5, LOX-9, LOX-12, LOX-13, LOX-15. Trong đó chỉ có LOX-5,

LOX-12, LOX-15 được tìm thấy trên người. Hiện nay các nhà khoa học đã

tìm ra cấu trúc của LOX-1 và LOX-3 từ đậu nành, LOX-15 từ thỏ[58].

4

Hình 1.2. Cấu trúc của LOX-15 ở thỏ [18]

Trong cấu trúc của LOX-15 được mô tả ở hình 1.2, có 2 phần riêng biệt:

phần màu xanh là phần gắn với acid béo do có cấu trúc tương tự một phần cấu

trúc lipase tụy người, phần còn lại là phần xúc tác, vị trí màu tím là trung tâm

hoạt động của enzym.

1.1.3. Cơ chế phản ứng của enzym LOX và cơ chất

Ở bước đầu tiên của phản ứng, 1 H được tách ra khỏi –CH2– nằm giữa 2

nối đôi trong phân tử acid béo. Gốc carbon còn lại sẽ mang một điện tử tự do.

Một phân tử oxygen sẽ gắn vào nguyên tử Cacbon ở vị trí +2 và -2 tạo thành

một acid béo chưa no có gốc peroxy và 2 nối đôi liên hợp. Gốc peroxy không

bền nên sẽ bị hydrogen hóa tạo thành dạng hydroperoxid [61].

5

Hình 1.3. Cơ chế xúc tác của LOX

1.1.4. Vai trò của LOX trong động thực vật

Trong thực vật, LOX tham gia vào các hoạt động sinh lý khác nhau bao

gồm sinh trưởng phát triển (LOX là một loại protein dự trữ cho quá trình phát

triển, đặc biệt là trong hạt lúc nảy mầm [24]), phản ứng khi bị thương, thiếu

nước [49], sâu bệnh [47].

Ở động vật có vú, LOX là một trong những enzym chính trong quá trình

sinh tổng hợp các chất trung gian hóa học gây ra các phản ứng viêm, dị ứng

và phản ứng miễn dịch [17]. Sản phẩm xúc tác của LOX liên quan đến các

bệnh hen phế quản [23], xơ vữa động mạch do làm tăng sự oxy hóa LDL

6

trong máu [40],[48], ung thư [56],viêm loét đại tràng [21], viêm khớp, viêm

cầu thận [17] và bệnh vẩy nến [32].

Các chất ức chế LOX có tác dụng ngăn cản nguy cơ ung thư [59] và đã

được sử dụng để điều trị ung thư tuyến tụy [36], ung thư dạ dày [66], ung thư

vú [25],ung thư gan di căn [28], ung thư miệng [45], hen mạn tính [52], phổi

tắc nghẽn mạn tính, bệnh viêm đường hô hấp trên[15], viêm đại tràng [22],

[51],viêm khớp gối [29] và bệnh da liễu [15].

Bên cạnh đó, các chất ức chế LOX cũng có vai trò quan trọng trong

ngành công nghiệp thực phẩm. Sự xúc tác quá trình oxy hóacác acid béo trong

thực phẩm của LOX là một trong những nguyên nhân gây ôi thiu thực

phẩmvà làm thay đổi hương vị, màu sắc của thực phẩm. Nước chè đã được

ứng dụng để bảo quản cá do các hợp chất polyphenol trong chè có tác dụng ức

chế LOX tốt [61].

1.1.5. Các chất ức chế LOX

Cho tới nay, các nhà khoa học đã tìm ranhiều chất có tác dụng ức chế

LOX bao gồm cả các chất có nguồn gốc thiên nhiên và các chất tổng hợp hóa

học. Trong số các hoạt chất có nguồn gốc thiên nhiên, flavonoid chiếm đa số,

bao gồm: Rutin [60], quercetin [30], baicalein, esculetin [54], artemitin và

casticin [20]. Ngoài ra còn có tanin như epigallocatechin gallate [31] và nhiều

hợp chất phenolic tự nhiên khác như acid boswellic [25], acid caffeic,

curcuminoid [39], eugenol [50], acid nordihydroguiaretic [64], daidzein và

genistein [63]. Các chất tổng hợp hóa học có tác dụng ức chế LOX

gồmzileuton, tebufelone, darbufelone, phenidone, docebenone và lonapalene

[18]. Các chất đã liệt kê ở trên đều đã được nghiên cứu trên invitro cho kết

quả ức chế LOX tốt, zileuton còn được ứng dụng trên lâm sàng dùng để điều

trị hen mạn tính và phổi tắc nghẽn mạn tính [52], [15]. Một số chất đã được

thử nghiệm trên người và cho thấy kết quả điều trị tốt như acid boswellic

7

chiết xuất từ cây Boswellia serratatrong điều trị ung thư vú [25] và viêm đại

tràng [29], baicalein trong điều trị ung thư dạ dày [66]...

Bên cạnh đó, rất nhiều dịch chiết thực vật đã được chứng minh có tác

dụng ức chế lipoxygenase tốt nhưng chưa phân lập chất tinh khiết như: Bidens

pilosa, Solanum nigrum, Justicia flava, Galinsoga parviflora, Oxygonum

sinuatum, Chenopodium album, Cleome monophylla, Physalis viscosa

[60],Embrica ribes, Terminala chebula, Symplocos racemosa, Rosa

demacena [13],Thespesia lampas [41], Woodfordia fructicosa [42], Mahonia

aquifolium [46], Camellia sinensis, Theobroma cacao [61],…

1.1.6. Cơ chế ức chế LOX

Enzym LOX được ức chế bằng 2 cách chính: (1) tạo phức chelat với ion

ở vị trí hoạt động của enzym, (2) chuyển enzym từ dạng ferric (dạng có hoạt

tính) thành dạng ferrous (bất hoạt) [35]. Các chất ức chế LOX có thể hoạt

động theo một trong 2 cách trên.

1.2. Các mô hình thử tác dụng ức chế LOX

1.2.1. Nguyên lý của các mô hình thử tác dụng ức chế LOX

Các phương pháp thử hoạt tính của lipoxygenase có thể dựa trên lượng

oxy tiêu thụ, lượng cơ chất tiêu thụ hoặc lượng sản phẩm hydroperoxid tạo

thành.

- Dựa trên lượng oxy tiêu thụ: xác định lượng oxy tiêu thụ sử dụng điện

cực oxygen [14]. Phương pháp tuy chính xác nhưng lại yêu cầu thiết bị

chuyên dụng và không phù hợp với sự sàng lọc nhanh nhiều mẫu.

- Dựa trên lượng cơ chất tiêu thụ:sử dụng acid linoleic gắn đồng vị

phóng xạ 14C, sản phẩm tạo thành gắn đồng vị phóng xạ sẽ được tách ra bằng

phương pháp sắc ký [16]. Phương pháp này phức tạp và không nhanh.

- Dựa trên lượng sản phẩm hydroperoxide tạo thành:

8

Sản phẩm đầu tiên của phản ứng biến đổi acid linoleic dưới xúc tác của

lipoxygenase là một acid béo chưa no có chứa 4-hydroperoxy-cis, trans-1,3-

pentadien liên hợp [19], [26].Việc xác định lượng hydroperoxid tạo thành

được thực hiện dựa trên 2 nguyên tắc đo màu và đo độ hấp thụ.

o Phương pháp đo màu: sản phẩm hydroperoxid tạo thành phản ứng

với I– giải phóng I2, thêm hồ tinh bột, định lượng sản phẩm có màu tạo

thànhdo hồ tinh bột kết hợp với I2bằng phương pháp đo màu [65].Một số tác

giả khác cho sản phẩm hydroperoxide oxy hóa Fe2+ thành Fe3+ , sau đó cho

Fe3+phản ứng với thiocyanat và định lượng sản phẩm có màu tạo thành bằng

phương pháp đo màu [38]. Bên cạnh đó, một số tác giả lại cho hydroperoxid

oxy hóa cặp 3-methyl-2-benzothiazolinon và 3-(dimethylamino)benzoic acid

dưới xúc tác của hemoglobin tạo thành sản phẩm có màu rồi định lượng bằng

phương pháp đo màu [27]. Phương pháp đo màu đơn giản, tuy nhiên không

phù hợp với các mẫu có màu.

o Phương pháp đo độ hấp thụ: Sản phẩm hydroperoxid tạo thành có

nối đôi liên hợp, hấp thụ ánh sáng mạnh nhất ở bước sóng 234nm [27] nên có

thể xác định lượng sản phẩm tạo thành qua sự thay đổi độ hấp thụ ở bước

sóng 234nm.Đa số các phương pháp thử hoạt tính của lipoxygenase đều áp

dụng phương pháp này vì đơn giản, nhanh chóng.Thiết bị là máy đo quang

phổ UV-VIS sử dụng cuvet hoặc máyquang phổ Elisasử dụng đĩa nhiều giếng.

Acid béo + O2 → Hydroperoxidcủa acid béo (R-O-O-H) LOX

9

Hình 1.4. Phương pháp đo độ hấp thụ của hydroperoxid

Phương pháp đo độ hấp thụ của sản phẩm hydroperoxid tạo thành có

nhiều mô hình đo khác nhau.

1.2.2. Các mô hình thử tác dụng ức chế LOX dựa trên phương pháp đo

độ hấp thụ

1.2.2.1. Mô hình của Sigma – Aldrich [57]

Mô hình của Sigma – Aldrich sử dụng máy quang phổ

spectrophotometer UV – VIS và cuvet thạch anh, đọc độ hấp thụ ở bước sóng

234nm.

Đơn vị hoạt tính enzym được sử dụng là Unit, được định nghĩa như sau:

1 unit enzym tương ứng sự tăng của độ hấp thụlà 0,001mỗi phút ở bước sóng

234nm, pH9,0, nhiệt độ 25oC, cơ chất sử dụng là acid linoleic, tổng thể tích

dung dịch trong cuvet là 3ml, bề dày dung dịch là 1cm, 1unit tương ứng với

sự oxy hóa 0.12µmol acid linoleic.

Có cis, cis-1,4-pentadien Acid béo chưa no có chứa 4-hydroperoxy-

cis,trans-1,3-pentadien liên hợp

Có nối đôi liên hợp hấp thụ ánh sáng mạnh nhất ở bước

sóng 234 nm [27] → Đo được hydroperoxid tạo

thành bằng phương pháp quang phổ hấp thụ UV

10

Phương pháp xác định hoạt tính enzym là phương pháp đo quang. Phản

ứng thực hiện trong cuvet. Có 2 cuvet: cuvet chứa mẫu thử và cuvet chứa mẫu

trắng. Mẫu thử bao gồm 900µl đệm borat, 2ml dung dịch cơ chất, 100µl dung

dịch enzym. Mẫu trắng bao gồm 1ml đệm borat và 2ml dung dịch cơ chất.

Nồng độ dung dịch cơ chất là 536µM, nồng độ dung dịch enzym là 5000 –

10000U/ml và đệm borat pH9,0. Ở 25oC, bước sóng 234nm, đo độ hấp thụ

của mẫu thử so với mẫu trắngtại thời điểm 5 phút.

Hoạt độ thực sự của dung dịch enzym được tính theo công thức:

Trong đó:

ΔA là độ hấp thụ của mẫu thử so với mẫu trắng.

df là độ pha loãng

0,001 là độ hấp thụ tăng lên mỗi phút tương ứng với 1 unit enzym

5 là 5 phút

Ưu điểm của phương pháp này là dễ thực hiện nhưng nhược điểm là mỗi

lần đo chỉ đo được một mẫu.

1.2.2.2. Mô hình của Cayman [19]

Mô hình của Cayman sử dụng máy quang phổ Elisa microplate reader và

đĩa 96 giếng, ngừng phản ứng bằng chromogen, đọc độ hấp thụ ở bước sóng

490 – 500 nm.Mô hình đĩa 96 giếng được trình bày trong hình 1.4. Bố trí thí

nghiệm được trình bày trong bảng 1.1.

11

Hình 1.5. Mô hình đĩa 96 giếng của Cayman

Bảng 1.1. Bố trí thí nghiệm đánh giá độ ức chế LOX của Cayman

Các bước phản ứng B + * 1-45

100µl đệm 10µl đệm 10µl methanol 90µl 15-LO 90µl 15-LO 90µl 15-LO

10µl chất ức chế

Bắt đầu phản ứng 10µl cơ chất 10µl cơ chất 10µl cơ chất 10µl cơ chất

Lắc đĩa trong 5 phút Ngừng

phản ứng 100µl

chromogen 100µl

chromogen 100µl

chromogen 100µl

chromogen Lắc đĩa trong 5 phút

Đọc độ hấp thụ ở 490 – 500nm

12

Tỷ lệ phần trăm ức chế của chất ức chế được tính theo công thức:

Trong đó:

IA là độ hấp thụ trung bình của các mẫu mà enzym có 100% hoạt tính

I là độ hấp thụ trung bình của các mẫu chất ức chế giống nhau

Ưu điểm của phương pháp này là cho kết quả chính xác vì tất cả các mẫu và

tất cả các nồng độ đo cùng thời điểm. Tuy nhiên nhược điểm của phương

pháp này là khó thưc hiện vì cần pha các mẫu cùng lúc để đo độ hấp thụ ở

cùng thời điểm.

1.2.2.3. Các mô hìnhthử hoạt tính kháng LOX của dịch chiết thực vật

Tất cả các nghiên cứu thử hoạt tính của dịch chiết thực vật đều thực hiện

ở 25oC. Phần lớn các nghiên cứusử dụng máy quang phổ spectrophotometer

UV – VIS với cuvet thạch anh và giống nhau ở quy trình thí nghiệm như

sau:Phối hợp enzym với chất ức chế. Sau 5 phút, thêm cơ chất. Đo độ hấp thụ

ở 234nm.

Công thức tính % ức chế của dịch chiết dược liệu so chất ức chế chuẩn:

Các mô hình nghiên cứu khác nhau về chất chuẩn, dung môi chiết xuất,

dung môi hòa tan cắn,dung dịch đệm sử dụng, nồng độ enzym và nồng độ cơ

chất.

a. Mô hình của Kumaraswamy M.V.[41], [42]

Kumaraswamy M.V. và cộng sự đã sử dụng phương pháp chiết xuất

dược liệu bằng methanol, cất thu hồi dung môi thu được cắn, hòa tan cắn

13

trong đệm borat pH9,0. Thêm 0,25ml dung dịch enzym (20 000U/ml). Ủ 5

phút ở 25oC rồi thêm 1ml dung dịch acid linoleic 0,6mM. Đo độ hấp thụ ở

234nm. Song song thực hiện với mẫu indomethacin chuẩn.

b. Mô hình của Veronica Sanda Chedea[62]

Veronica Sanda Chedea và cộng sự đã thử tác dụng ức chế LOX theo

quy trình sau: Ủ 160µl dung dịch LOX (2300U/ml) với 50µl chất ức chế trong

5 phút. Thêm 8,4µl dung dịch cơ chất 2,2mM. Đo độ hấp thụ ở 234nm. Song

song làm một mẫu trắng gồm 840µl đệm borat pH9,0 và 160µl dung dịch

LOX.

c. Mô hình của Ali Shah S.M.[13]

Ali Shah S.M. dùng methanol để chiết xuất dược liệu. Cắn thu được sau

khi cất thu hồi dung môi được hòa tan trong Tris-buffer pH7,4. Ủ dung dịch

ức chế tạo thành với enzym trong 10 phút ở 25oC, thêm cơ chất. Đo độ hấp

thụ sau 6 phút. Song song làm với baicalein chuẩn để so sánh.

d. Mô hình của Sekhar Rao [53]

Sekhar Rao và cộng sự dùng ethyl acetat để chiết xuất dược liệu, thu hồi

dung môi thu cắn, hòa tan cắn trong DMSO. Quy trình thí nghiệm như sau:

Phối hợp 60µl dung dịch cơ chất 10mM với 10µl dung dịch chất ức chế, thêm

2,91ml đệm borat, bắt đầu phản ứng bằng cách thêm 20µl enzym. Đo độ hấp

thụ sau 3 phút. Song song làm mẫu trắng, thay 10µl dung dịch chất ức chế

bằng 10µl DMSO.

e. Mô hình của Uma Sankar Akula [60]

Uma Sankar Akula và cộng sự đã công bố phương pháp chiết xuất

dược liệu bằng methanol, cất thu hồi dung môi thu được cắn, hòa tan cắn

trong DMSO. Dung môi hòa tan enzym và cơ chất là đệm phosphate pH9,0.

Chất chuẩn được sử dụng là rutin và nordihydroguaiaretic acid.Phối hợp 50µl

dung dịch enzym với 30µl dung dịch chất ức chế. Thêm 2ml dung dịch cơ

14

chất 100µM. Đo độ hấp thụ ở 234nm. Song song làm một mẫu trắng, thay

30µl dung dịch chất ức chế bằng 30µl đệm phosphate pH9,0.

1.3. Tổng quan về rutin và các dược liệu thực hiện nghiên cứu

1.3.1. Rutin

Hình 1.6. Cấu trúc hóa học của rutin

Rutin có nhiều trong các loại dược liệu như cây hoa hòe (Sophora

japonica L.), táo ta (Zizyphus jujuba Lamk.), mạch ba góc (Fagopyrum

esculentum Moench.) [8].Rutin có khả năng ức chế LOX mạnh nên đã được

dùng làm chất chuẩn trong nhiều nghiên cứu về khả năng ức chế LOX của

dịch chiết thực vật [60]. Nhiều tác dụng của rutin liên quan trực tiếp đến khả

năng ức chế LOX đã được thử nghiệm trên động vật cho thấy kết quả tốt như

tác dụng chống viêm [55], chống oxy hóa [33] và giảm nguy cơ tim mạch do

làm giảm oxi hóa LDL [34].

1.3.2. Chè dây (Ampelopsis cantoniensis Planch.), họ Nho (Vitaceae)

Lá chè dây chứa flavonoid, tanin, đường, protein, giàu K+, Ca2+, Fe2+,

Zn2+, cùng các vitamin E, B1, B2. Lá chè dây có hàm lượng flavonoidvà tanin

cao.Hai flavonoid của lá chè dây là myricetin và dihydromyricetin. Tanin

trong lá chè dây thuộc loại tannin catechic [12].

15

Chè dây có tác dụng thanh nhiệt, giải độc, khu phong, lợi thấp, giảm đau,

chống viêm[1].Chè dây có tác dụng tốt trong điều trị viêm loét dạ dày – hành

tá tràng, có tác dụng kháng khuẩn khá và tác dụng chống oxy hóa mạnh [12].

Cao khô chè dây có hoạt tính chống oxy hóa, ức chế sự phát triển của

một số chủng vi khuẩn, điều trị hiệu quả bỏng và loét dạ dày tá tràng, ức chế

đột biến gen gây nên bởi một số tác nhân độc hại [43].

1.3.3. Dâu tằm(Morus alba L.), họ Dâu Tằm (Moraceae)

Lá dâu tằm chứa 4 flavonol là quercetin-3-β-D-glucose, quercetin-3-O-

glucose-6″-acetate, rutin và quercetin[37]. Ngoài ra còn có caroten, tanin, rất

ít tinh dầu, vitamin C, cholin, adenin, trigonellin, pentozan, đường, canxi

malat và canxi cacbonat [8].Các flavonol khử các gốc peroxyl, gốc hydroxyl

nên chống oxy hóa mạnh [37].

1.3.4. Lá móng(Lawsonia inermis L.), họ Tử Vi (Lythraceae)

Trong lá và rễ cây lá móng chứa flavonoid, saponin, acid hữu cơ, đường

khử, chất béo, hợp chất steroid và polysaccharid [3]. Ngoài ra còn có tannin,

tinh dầu, chất nhựa, chất màu, glucose, manitol. Rễ chiết được chất sterol là

lawsaritol và dihydroxysterol là lawsaritol A. Hoa chứa tinh dầu có ionon. Hạt

chứa protein, chất béo và hydratcarbon.Vỏ cành cây chứa một naphtoquinon

gọi là isoplumbagin [8], [2]. Lá chứa anthranoid. Từ lá đã phân lập được 6

chất sau: 2β, 3β–dihydroxy–12–oleanen–28–oic acid; 1β, 2α, 3α, 19α–

tetrahydroxy–12–ursen–28–oic acid; Suavissimoside R1; Afzelin; Catechin;

và Rubinaphthin [3]. Ngoài ra, lá móngcòn chứa một oxynaphtoquinon gọi là

Lawsone, một hydrocarbon no là 3–methylnonacosan–1–ol, một lawsoniasid

có cấu trúc 1,2,4–trihydroxynaphtalen–1,4–dibeta–D–glucopyranosid và một

laliosid là 2,3,4,6–tetrahydroxyacetophenol–2–beta–D–glucopyranosid[8],

[2].

16

Lá móng có tác dụng kháng khuẩn, giảm đau, hạ sốt, chống viêm, lợi

tiểu, lợi mật, ức chế co thắt cơ trơn gây bởi histamine và acetylcholine trên

chuột lang, giảm AST và ALT huyết thanh chuột, kháng estrogen chuột nhắt

trắng [2]

1.3.5. Kim ngân (Lonicera japonica Thunb.), họ Cơm Cháy

(Caprifoliaceae)

Trong kim ngân có 2 nhóm chất chủ yếu là flavonoid và saponin

triterpenoid. Flavonoid được biết đến nhiều trong kim ngân là luteolin và

luteolin – 7 – glucosid.Ba loại saponin triterpenoid là caroten, cryptoxanthin

và auroxanthin. Lonicerosid là một saponin kim ngân có có tác dụng chống

viêm. Tinh dầu kim ngân chứa α–pinem, genaniol, α–terpeniol, eugnol,

linalol. Tanin kim ngân gồm acid chlorogenic và acid isochlorogenic.

Kim ngân có tác dụng kháng khuẩn, tăng đường huyết, chống choáng

phản vệ [8], kháng virus, chống lao [2], hạ cholesterol máu [10]. Tác dụng

chống viêm [6], chữa viêm kết mạc tốt [2], chống oxy hóa mạnh bằng cách

làm tăng hoạt động của peroxydase trong máu người và ức chế sự peroxyd

hóa lipid màng tế bào [4].

1.3.6. Cườm rụng (Ehretia acuminata P. Br), họ Vòi Voi (Boraginaceae)

[5]

Trong lá và cành cườm rụng có flavonoid, tanin, acid hữu cơ, acid amin,

đường khử. Acid hữu cơ chỉ có trong cành, saponin và sterol thì chỉ có ở lá.

Cườm rụng có tác dụng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư, bảo vệ

gan (giảm hoạt độ các enzm ALT và AST ở gan chuột bị gây độc bằng

paracetamol)

1.3.7. Xạ đen (Ehretia asperula Zoll. et Mor), họ Vòi Voi (Boraginaceae)

Thành phần hóa học của lá xạ đen gồm có flavonoid, tanin, các acid

amin, đường khử, cyanoglycosid, triterpenoid.

17

Xạ đen có tác dụng hữu hiệu trong chữa trị ung thư doức chế sự phát

triển của tế bào ung thư [5], [7], bảo vệ gan (giảm hoạt độ các enzm ALT và

AST ở gan chuột bị gây độc bằng paracetamol), điều trị mụn nhọt, ung thũng,

tiêu viêm, giải độc, giảm tiết dịch trong xơ gan cổ chướng, giúp ăn ngon, mát

huyết, chữa mất ngủ, vàng da. Hợp chất lấy từ xạ đen kết hợp với phylamin

còn có tác dụng kéo dài tuổi thọ trung bình của động vật bị ung thư [7]. Xạ

đen cũng được bào chế thành những sản phẩm chức năng hỗ trợ điều trị ung

thư hiện có trên thị trường như “Trà bảo thọ xạ đen Hòa Bình” của Công ty cổ

phần y dược học cổ truyền Hòa Bình kết hợp với Công ty Dược liệu Trung

ương I, và “Trà tam thất – Xạ đen” của Học viện quân y.

1.3.8. Cúc áo (Spilanthes acmella L. Murr.), họ Cúc Asteraceae [8]

Trong cụm hoa cúc áo có chứa một tinh dầu mùi cay hăng, thành phần

chủ yếu của tinh dầu là một chất tecpen đặc biệt gọi là spilanthen và một chất

rượu gọi là spilantola.

Cúc áo có tác dụng giảm đau, sưng, gây tê, chữa sâu răng, chảy máu

chân răng.

1.3.9. Mã đề (Plantago asiatica L.), họ Mã Đề (Plantaginaceae) [8]

Toàn cây mã đề chứa plantagin và một glucosid gọi là aucubin. Trong lá

chứa chất nhầy, chất đắng, carotin, Vitamin C, vitamin K, vitamin T, acid

citric. Trong hạt chứa nhiều chất nhầy, acid plantenolic, adenine và cholin.

Mã đề có tác dụng lợi tiểu, chữa ho trừ đờm, ức chế một số vi trùng bệnh

ngoài da, đắp lên mụn nhọt đỡ mung mủ và viêm tấy, chữa viêm khí quản,

mắt đỏ đau, chữa cao huyết áp và tả lỵ.

18

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị trong nghiên cứu

2.1.1. Nguyên vật liệu

Danh mục các mẫu nghiên cứu được trình bày trong bảng 2.1.

Bảng 2.1. Danh mục các mẫu nghiên cứu

STT Tên Việt Nam Bộ phận dùng Nơi thu mẫu Thời gian

thu mẫu

1 Chè dây Toàn cây Sa Pa, Lào Cai 3/2013

2 Dâu tằm Lá Trường Đại học

Dược Hà Nội 3/2013

3 Lá móng Toàn cây Ngọc Trục, Hà Đông,

Hà Nội 10/2012

4 Kim ngân Toàn cây Ngọc Trục, Hà Đông,

Hà Nội 10/2012

5 Cườm rụng Cành nhỏ Cúc Phương, Ninh

Bình 12/2009

6 Cúc áo Hoa Yên Định, Thanh

Hóa 8/2012

7 Mã đề Toàn cây Gia Lâm, Hà Nội 3/2013

8 Xạ đen lá Kim Bôi, Hòa Bình 3/2013

Các mẫu thu được sấy khô ở 50oC, bảo quản ở nơi thoáng mát, nhiệt độ

phòng, tại Bộ môn Thực vật, Trường Đại học Dược Hà Nội.

19

2.1.2. Hóa chất

- Enzym Lipoxygenase Type I – B, mã số L1376-1G (Sigma – Mỹ).

- Cơ chất acid linoleic, mã số L7395-15MU (Sigma – Mỹ).

- Rutin (Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương).

- Methanol, acid boric, natrihydroxide (Trung Quốc).

- Nước cất 2 lần (Khoa dược, Bệnh viện 108).

2.1.3. Thiết bị

- Máy quang phổ Spectrophotometer U – 1900 UV/VIS, model 3J0 –

0003 (Bộ môn Vật lý – Hóa lý Trường Đại học Dược Hà Nội).

- Máy đo pH BenchMeter pH 510 (Bộ môn Hóa phân tích, Trường Đại

học Dược Hà Nội).

- Máy cất quay thu hồi dung môi BUCHI – Đức (Bộ môn Thực vật,

trường Đại học Dược Hà Nội).

- Tủ sấy Memmert (Bộ môn Thực vật, Trường Đại học Dược Hà Nội).

- Cân phân tích Shimadzu (Bộ môn Thực vật, Trường Đại học Dược Hà

Nội).

- Pipet Eppendorf (Bộ môn Thực vật, Trường Đại học Dược Hà Nội).

2.2. Nội dung nghiên cứu

- Khảo sát các điều kiện nghiên cứu: Xác định hoạt độ enzym, lựa chọn

nồng độ enzym, lựa chọn nồng độ cơ chất và lựa chọn thời gian ủ.

- Kiểm tra tương tác giữa enzym và các mẫu nghiên cứu bao gồm rutin,

chè dây, dâu tằm, lá móng, kim ngân, cườm rụng, cúc áo, mã đề, xạ

đen. Từ đó lựa chọn mô hình thử phù hợp với từng mẫu nghiên cứu

- Thử tác dụng ức chế LOX của các mẫu nghiên cứu.

20

2.3. Phương pháp nghiên cứu

2.3.1. Phương pháp chiết xuất dược liệu

Cân 20g bột dược liệu bằng cân kĩ thuật. Thấm ẩm bằng methanol, ngâm

trong 300ml methanol trong 1 tuần. Gạn lấy dịch chiết. Cất thu hồi dung môi

thu được cắn.Làm khô cắn, cắn pha trong methanol tạo dung dịch có nồng độ

từ1mg/ml đến 10mg/ml.

2.3.2. Phương pháp lựa chọn điều kiện nghiên cứu

Chúng tôi tiến hành khảo sát để lựa chọn điều kiện thí nghiệm bao

gồm: xác định lại hoạt độ enzym, lựa chọn nồng độ enzym, lựa chọn nồng độ

cơ chất và lựa chọn thời gian ủ.

2.3.2.1. Chuẩn bị hóa chất

A. Đệm borat 200mM, pH 9,0

- Pha NaOH1M: cân khoảng 2g NaOH hòa tan trong vừa đủ 50ml nước

cất 2 lần

- Cân chính xác khoảng 6,183g acid boric hòa tan trong ≈ 500ml nước cất

2 lần, điều chỉnh đến pH 9,0 bằng NaOH 1M vừa pha, bổ sung nước cất

2 lần vừa đủ 500ml.

B. Ethyl alcohol 95% (v/v)

Thêm nước cất 2 lần vào ethyl alcohol tuyệt đối đến khi cồn kế chỉ 95%

C. Dung dịch acid linoleic

Phối hợp 0,05ml ethyl alcohol 95% và 0,05ml acid linoleic, thêm từ từ

đệm borat đến vừa đủ 50ml. Lắc ở máy vortex đến đồng nhất. Lấy 5ml dung

dịch này thêm 20ml đệm borat và 5,0ml nước cất 2 lần được dung dịch acid

linoleic có nồng độ 536µM

D. Dung dịch enzym LOX

21

Chuẩn bị dung dịch enzyme khoảng 2000 – 5000U/ml bằng cách cân

chính xác khoảng 2 mg enzym rắn rồi hòa tan enzyme rắn trong đệm borat.

2.3.2.2. Tiến hành khảo sát các điều kiện nghiên cứu

Phương pháp chung: Phương pháp đo quang. Phản ứng thực hiện

trong cuvet. Có 2 cuvet: cuvet chứa mẫu thử và cuvet chứa mẫu trắng. Mẫu

thử bao gồm 900µl đệm borat, 2ml dung dịch cơ chất, 100µl dung dịch

enzym. Mẫu trắng bao gồm 1ml đệm borat và 2ml dung dịch cơ chất. Ở 25oC,

đo độ hấp thụ của mẫu thử so với mẫu trắngtại bước sóng 234nm.

a. Phương pháp xác định hoạt độ enzym

Chúng tôi sử dụng nồng độ cơ chất là 536µM và nồng độ enzyme ≈

2000 – 5000U/ml. Đo độ hấp thụ của mẫu thử so với mẫu trắng tại thời điểm

5 phút. Thực hiện 3 lần lấy kết quả trung bình.

Đơn vị hoạt độ enzym là unit (U). Độ hấp thụ của mẫu thử so với mẫu trắng

tăng lên mỗi phút là 0,001 tương ứng với 1 unit enzym.

Hoạt độ của dung dịch enzym được tính theo công thức:

Trong đó:

ΔA là độ hấp thụ của mẫu thử so với mẫu trắng .

df là độ pha loãng.

0,001 là độ hấp thụ tăng lên mỗi phút tương ứng với 1 unit enzym.

5 là 5 phút.

22

Hoạt độ của enzym rắn được tính theo công thức:

Trong đó:

Units/ml là hoạt độ của dung dịch enzym

Units/mg là hoạt độ của enzym rắn.

mg/ml là nồng độ của dung dịch enzym rắn trong đệm borat.

b. Phương pháp lựa chọn nồng độ enzym

Cố định nồng độ cơ chất là 536µM. Với hoạt độ enzym đã xác định được

ở mục 2.3.2.2a, pha loãng enzym ra thành 5 nồng độ khác nhau khoảng

D1=5000U/ml, D2=2500U/ml, D3=1250U/ml, D4= 625U/ml và

D5=312U/ml.Đo độ hấp thụ của mẫu thử so với mẫu trắng. Ngừng đo khi giá

trị độ hấp thụ của mẫu thử so với mẫu trắng lớn hơn 0,9 hoặc sau thời gian

15phút.Cứ 30 giây đọc 1 lần. Thực hiện 3 lần lấy kết quả trung bình.

Lựa chọn nồng độ enzym phù hợp để khoảng thời gian độ hấp thụ nằm

nằm trong khoảng tuân theo định luật Lambert – Beer (0,2 – 0,8 và càng gần

0,435 càng tốt) không quá ngắn (enzym hoạt động quá mạnh) cũng không quá

dài (enzym hoạt động quá yếu).

c. Phương pháp lựa chọn nồng độ cơ chất

Cố định nồng độ enzym đã lựa chọn ở mục 2.3.2.2 b. Pha loãng cơ chất

ra thành 6 nồng độ C1= 536µM,C2= 268µM, C3=134µM, C4=67µM,

C5=33,5µM và C6=16,75µM. Đo độ hấp thụ của mẫu thử so với mẫu trắng

trong 18 phút, cứ 30 giây đọc 1 lần. Thực hiện 3 lần lấy kết quả trung bình.

23

Lựa chọn nồng độ cơ chất thấp nhất để với nồng độ enzym vừa lựa chọn

ở mục 2.3.2.2 b thì thí nghiệm ở trạng thái bão hòa cơ chất.

d. Phương pháp lựa chọn thời gian ủ

Với nồng độ enzym đã lựa chọn ở mục 2.3.2.2 b và nồng độ cơ chất đã

lựa chọn ở mục 2.3.2.2 c, đo độ hấp thụ của mẫu thử so với mẫu trắng trong

15 phút, cứ 1 phút đọc 1 lần. Thực hiện 3 lần lấy kết quả trung bình.

Chọn thời gian ủ phù hợp để độ hấp thụ nằm trong khoảng tuân theo

định luật Lambert – Beer (0,2 – 0,8 và càng gần 0,435 càng tốt)

Sau khi khảo sát, hoạt độ enzym đã được xác định, lựa chọn được các

điều kiện nghiên cứu bao gồm nồng độ enzym, nồng độ cơ chất, thời gian ủ

và áp dụng cho các nghiên cứu sàng lọc tiếp theo.

2.3.3. Phương pháp khảo sát tương tác enzym – chất ức chế

Chúng tôi tiến hành khảo sát tương tác giữa enzym và các chất ức chế.

Các chất ức chế bao gồm rutin và cắn của 8 dược liệu pha trong methanol có

nồng độ5 mg/ml.Phương pháp khảo sát vẫn là phương pháp đo quang. Phản

ứng thực hiện trong cuvet. Có 4 cuvet chứa: mẫu thử, mẫu trắng của thử, mẫu

trắng và mẫu trắng của trắng.

- Mẫu thử bao gồm 2875µl đệm borat, 100µl dung dịch enzym và 25µl

dung dịch chất ức chế.

- Mẫu trắng của thửbao gồm 2975µl đệm borat và 25µl dung dịch chất

ức chế.

- Mẫu trắng bao gồm 2900µl đệm borat và 100µl dung dịch enzym.

- Mẫu trắng của trắng bao gồm 3000µl đệm borat.

Ở 25oC, đo độ hấp thụ tại bước sóng 234nm của mẫu thửso với mẫu

trắng của thử (ΔA thử), và độ hấp thụ của mẫu trắngso với mẫu trắng của

trắng(ΔA trắng).Thực hiện 3 lần lấy kết quả trung bình. ΔA thử luôn lớn hơn

24

hoặc bằng ΔA trắng. Nếu ΔA thử lớn hơn ΔA trắng thì enzym kết hợp với

chất ức chế tạo thành sản phẩm hấp thụ ánh sáng ở 234nm. Nếu ΔA thử = ΔA

trắng thì enzym kết hợp với chất ức chế không tạo thành sản phẩm hấp thụ

ánh sáng ở 234nm.

2.3.4. Lựa chọn mô hình thử tác dụng ức chế LOX của dược liệu

Phương pháp thử tác dụng ức chế LOX của dược liệu là phương pháp

đo quang. Cắn dược liệu pha trong methanol là dung dịch chất ức chế cần thử.

Sau khi khảo sát được tương tác enzym – chất ức chế theo phương pháp đã

trình bày trong mục 2.3.3, việc thử tác dụng ức chế LOX của dược liệu sẽ

được lựa chọntừ một trong 2 mô hình sau:

2.3.4.1. Mô hình 4 cuvet

Mô hình 4 cuvet được áp dụng nếu enzym kết hợp với chất ức chế

không tạo thành sản phẩm hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 234nm. 4 cuvet

chứa: mẫu thử, mẫu trắng của thử, mẫu trắng và mẫu trắng của trắng.

- Mẫu thử bao gồm 875µl đệm borat, 100µl dung dịch enzym, 25µl dung

dịch chất ức chế. Sau 5 phút, thêm 2ml dung dịch cơ chất.

- Mẫu trắng của thửbao gồm 975µl đệm borat, 25µl dung dịch chất ức

chế và 2ml dung dịch cơ chất.

- Mẫu trắng bao gồm 900µl đệm borat, 100µl dung dịch enzym và 2ml

dung dịch cơ chất.

- Mẫu trắng của trắng bao gồm 1ml đệm borat và 2ml dung dịch cơ

chất.

Ở 25oC, đo độ hấp thụ tại bước sóng 234nm của mẫu thửso với mẫu

trắng của thử (ΔA thử), và độ hấp thụ của mẫu trắngso với mẫu trắng của

trắng(ΔA trắng). Thực hiện 3 lần lấy kết quả trung bình

Phần trăm ức chế được tính theo công thức:

25

2.3.4.2. Mô hình 6 cuvet

Mô hình 6 cuvet được áp dụng nếu enzym kết hợp với chất ức chế tạo

thành sản phẩm hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 234nm. Khi đó độ hấp thụ của

mẫu thử (gồm đệm borat, dung dịch enzym, dung dịch chất ức chế và dung

dịch cơ chất) sẽ bằng tổng độ hấp thụ của hydroperoxide tạo thành trong phản

ứng enzym – cơ chất và sản phẩm của tương tác enzym – chất ức chế.

6 cuvet chứa: mẫu thử 1, mẫu trắng của thử 1, mẫu thử 2, mẫu trắng

của thử 2, mẫu trắng và mẫu trắng của trắng.

- Mẫu thử 1bao gồm 875µl đệm borat, 100µl dung dịch enzym, 25µl

dung dịch chất ức chế. Sau 5 phút, thêm 2ml dung dịch cơ chất.

- Mẫu trắng của thử 1bao gồm 975µl đệm borat, 25µl dung dịch chất ức

chế và 2ml dung dịch cơ chất.

- Mẫu thử 2 bao gồm 2875µl đệm borat, 100µl dung dịch enzym, 25µl

dung dịch chất ức chế. Đợi 5 phút.

- Mẫu trắng của thử 2 bao gồm 2975µl đệm borat, 25µl dung dịch chất

ức chế.

- Mẫu trắng bao gồm 900µl đệm borat, 100µl dung dịch enzym và 2ml

dung dịch cơ chất.

- Mẫu trắng của trắng bao gồm 1ml đệm borat và 2ml dung dịch cơ

chất.

Ở 25oC, đo độ hấp thụ tại bước sóng 234nm của mẫu thử 1 so với mẫu

trắng của thử 1 (ΔA thử 1), độ hấp thụ của mẫu thử 2 so với mẫu trắng của

26

thử 2 (ΔA thử 2)và độ hấp thụ của mẫu trắngso với mẫu trắng của

trắng(ΔA trắng). Thực hiện 3 lần lấy kết quả trung bình.

Phần trăm ức chế được tính theo công thức:

Chú ý: ΔA trắng được xác định vào đầu và cuối mỗi buổi đo, kết quả

phải giống nhau để đảm bảo hoạt độ enzym không thay đổi trong suốt quá

trình thí nghiệm. Enzym đã pha chia nhỏ vào nhiều lọ nhỏ, bảo quản trong đá,

khi nào dùng thì ngâm 1 lọ nhỏ vào nước 25oC trong 5 phút.

27

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1. Lựa chọn điều kiện nghiên cứu

3.1.1. Xác định hoạt độ enzym

Cân chính xác được 2,2 mg enzym rắn hòa tan vào 3ml đệm borat được

dung dịch enzym D1. Pha loãng D1 hai lần được dung dịch D2.Xác định hoạt

độ của dung dịch enzym D2.

Kết quả:

ΔA = 1,258

Hoạt độ của dung dịch enzym D2 là:

Hoạt độ của enzym rắn là:

3.1.2. Lựa chọn nồng độ enzym

Cố định nồng độ cơ chất ở 536µM. Pha loãng enzym ra thành 5 nồng độ

khác nhau là D1=5032U/ml, D2=2516U/ml, D3=1258U/ml, D4=629U/ml và

D5=314,5U/ml. Tiến hành đo để lựa chọn nồng độ enzym tối ưu. Kết quả

phép đo được trình bày trong bảng 3.1.

28

Bảng 3.1. Độ hấp thụ của mẫu thử so với mẫu trắng ở 5 nồng độ enzym

Thời gian (phút) D1 D2 D3 D4 D5

0,5 0,120 0,072 0,039 0,055 0,042 1,0 0,348 0,165 0,060 0,057 0,048 1,5 0,642 0,327 0,088 0,064 0,054 2,0 0,998 0,430 0,122 0,076 0,059 2,5 0,595 0,148 0,090 0,069 3,0 0,717 0,175 0,106 0,079 3,5 0,858 0,209 0,123 0,088 4,0 1,013 0,254 0,141 0,097 4,5 1,110 0,290 0,161 0,106 5,0 1,258 0,344 0,181 0,116 5,5 0,395 0,198 0,127 6,0 0,435 0,222 0,138 6,5 0,466 0,242 0,152 7,0 0,511 0,265 0,172 7,5 0,565 0,284 0,186 8,0 0,632 0,305 0,194 8,5 0,692 0,324 0,206 9,0 0,723 0,342 0,219 9,5 0,754 0,364 0,231 10,0 0,792 0,380 0,251 10,5 0,841 0,399 0,263 11,0 0,893 0,417 0,268 11,5 0,933 0,435 0,278 12,0 0,955 0,454 0,289 12,5 0,471 0,304 13,0 0,488 0,316 13,5 0,507 0,325

29

14,0 0,526 0,336 14,5 0,546 0,346 15,0 0,564 0,360

Chú thích: Trong các ô , giá trị độ hấp thụ nằm trong khoảng

tuân theo định luật Lambert – Beer.

Nhận xét: Ở nồng độ D1 và D2, độ hấp thụ tăng lên quá nhanh, khoảng

tuân theo định luật Lambert – Beer ngắn nên không chọn 2 nồng độ này. Ở

nồng độ D5 độ hấp thụ tăng quá chậm, enzym hoạt động yếu nên cũng không

chọn nồng độ này.

Có thể chọn nồng độ D3 hoặc D4.

Nếu chọn nồng độ enzym cao hơn (D3) thì lượng chất ức chế cũng phải

cần nhiều hơn. Trong nghiên cứu này,chất ức chế là dịch chiết thực vật chứ

chưa phải là chất tinh khiết, nếu lượng dịch chiết nhiều thì dung dịch sẽ có

màu, đo quang sẽ không ổn định ở bước sóng 234nm. Do đó chúng tôi chọn

nồng độ D4=629U/ml để khảo sát các điều kiện thí nghiệm tiếp theo.

3.1.3. Lựa chọn nồng độ cơ chất

Cố định nồng độ enzym là D4=629U/ml. Pha loãng cơ chất ra thành 6

dung dịch với các nồng độ: C1=536µM, C2=268µM, C3=134µM, C4=67µM,

C5=33,5µM và C6=16,75µM. Tiến hành đo độ hấp thụ của mẫu thử so với

mẫu trắng ở 6 nồng độ cơ chất. Kết quả đo được trình bày trong bảng 3.2.

30

Bảng 3.2. Độ hấp thụ của mẫu thử so với mẫu trắng ở 6 nồng độ cơ chất Thời gian (phút) C1 C2 C3 C4 C5 C6

0,5 0,055 0,057 0,059 0,058 0,055 0,059 1,0 0,057 0,067 0,069 0,070 0,066 0,079 1,5 0,064 0,076 0,086 0,086 0,080 0,098 2,0 0,076 0,084 0,095 0,098 0,097 0,122 2,5 0,090 0,090 0,109 0,118 0,125 0,142 3,0 0,106 0,108 0,123 0,131 0,145 0,157 3,5 0,123 0,133 0,138 0,157 0,162 0,167 4,0 0,141 0,151 0,159 0,184 0,179 0,186 4,5 0,161 0,171 0,177 0,207 0,198 0,198 5,0 0,181 0,195 0,197 0,233 0,212 0,210 5,5 0,198 0,213 0,211 0,264 0,252 0,225 6,0 0,222 0,233 0,233 0,302 0,285 0,238 6,5 0,242 0,249 0,256 0,337 0,309 0,256 7,0 0,265 0,272 0,276 0,372 0,337 0,271 7,5 0,284 0,292 0,297 0,390 0,356 0,289 8,0 0,305 0,318 0320 0,417 0,379 0,313 8,5 0,324 0,338 0,342 0,445 0,405 0,330 9,0 0,342 0,362 0,361 0,476 0,441 0,343 9,5 0,364 0,382 0,381 0,506 0,464 0,358 10,0 0,380 0,407 0,406 0,538 0,494 0,373 10,5 0,399 0,425 0,428 0,557 0,509 0,386 11,0 0,417 0,447 0,446 0,578 0,527 0,398 11,5 0,435 0,467 0,464 0,610 0,546 0,410 12,0 0,454 0,488 0,487 0,641 0,564 0,423 12,5 0,471 0,512 0,504 0,663 0,588 0,433 13,0 0,488 0,532 0,532 0,691 0,610 0,447 13,5 0,507 0,554 0,549 0,712 0,627 0,459 14,0 0,526 0,575 0,572 0,751 0,651 0,470 14,5 0,546 0,588 0,593 0,777 0,670 0,480 15,0 0,564 0,620 0,610 0,806 0,697 0,492 15,5 0,581 0,636 0,636 0,825 0,709 0,502 16,0 0,599 0,660 0,660 0,847 0,729 0,513 16,5 0,621 0,669 0,679 0,864 0,746 0,524 17,0 0,643 0,694 0,705 0,887 0,762 0,534 17,5 0,660 0,708 0,734 0,911 0,773 0,543 18,0 0,677 0,727 0,752 0,934 0,790 0,552

31

Chú thích: Trong các ô , giá trị độ hấp thụ nằm trong khoảng

tuân theo định luật Lambert – Beer.

Nhận xét: Xét khoảng thời gian từ 5 phút đến 18 phút ( khoảng thời gian

mà hầuhết các giá trị độ hấp thụ nằm trong khoảng tuân theo định luật

Lambert – Beer 0,2 – 0,8). Thử bắt đầu từ nồng độ cơ chất thấp nhất C6 và

tăng dần nồng độ cơ chất lên C5, C4, C3, C2, C1. Độ hấp thụ của mẫu thử so

với mẫu trắng ở nồng độ C6 là thấp nhất, độ hấp thụ tăng dần khi tăng dần

nồng độ lên C5, C4 và độ hấp thụ không tăng thêm nữa khi tăng nồng độ lên

C3, C2, C1. Như vậyở nồng độ enzym D4 = 629U/ml, khi nồng độ cơ chất ≥

C4 = 67µM thì thí nghiệm ở trạng thái bão hòa cơ chất.

Kết luận: Chọn nồng độ cơ chất C4 = 67µM.

3.1.4. Lựa chọn thời gian ủ

Cố định nồng độ enzym là D4=629U/ml và nồng độ cơ chất là

C4=67µM. Tiến hành đo độ hấp thụ của mẫu thử so với mẫu trắng trong 15

phút. Kết quả đo được trình bày trong bảng 3.3.

32

Bảng 3.3. Độ hấp thụ của mẫu thử so với mẫu trắng theo thời gian ủ

Thời gian (phút) A thử A trắng

1 0,085 2 0,130 3 0,185 4 0,238 5 0,293 6 0,349 7 0,405 8 0,459 9 0,512 10 0,564 11 0,614 12 0,662 13 0,710 14 0,755 15 0,780

Nhận xét: Tại thời điểm 8 phút, A thử A trắng = 0,459 gần với giá trị

0,435 nhất. Vì vậy chúng tôi lựa chọn thời gian ủ là 8 phút.

Kết luận:Sau khi khảo sát, chúng tôi đã xác định được hoạt độ enzym rắn là

6862U/mg. Chúng tôi đã lựa chọn được các điều kiện nghiên cứu như sau:

Nồng độ enzym là D4=629U/ml, nồng độ cơ chất là C4=67µM, thời gian ủ là

8 phút. Các điều kiện nghiên cứu này được áp dụng cho toàn bộnghiên cứu

phía sau.

33

3.2. Khảo sát tương tác enzym – chất ức chế

Kết quả khảo sát tương tác enzym – chất ức chế được trình bày trong bảng

3.4.

Bảng 3.4. Kết quả khảo sát tương tác enzym – chất ức chế

STT Chất ức chế ΔA thử ΔA trắng Kết luận 1 Rutin 0,094

0,023

Có tương tác 2 Chè dây 0,139 Có tương tác 3 Dâu tằm 0,116 Có tương tác 4 Lá móng 0,073 Có tương tác 5 Kim ngân 0,056 Có tương tác 6 Cườm rụng 0,147 Có tương tác 7 Cúc áo 0,082 Có tương tác 8 Mã đề 0,072 Có tương tác 9 Xạ đen 0,035 Có tương tác

Kết luận: Enzym kết hợp với các chất ức chế đều tạo thành sản phẩm

hấp thụ ánh sáng ở 234nm. Do đómô hình sử dụng để thử tác dụng ức chế

LOX của các mẫu nghiên cứu sẽ là mô hình 6 cuvet.

3.3. Thử tác dụng ức chế LOX của dược liệu theo mô hình 6 cuvet

Kết quả thử tác dụng ức chế LOX của các mẫu nghiên cứu theo mô

hình 6 cuvet được trình bày trong bảng 3.5.

34

Bảng 3.5. Kết quả khảo sát tác dụng ức chế LOX của các mẫu nghiên cứu

STT Chất ức chế

ΔA trắng Nồng độ chất ức chế (mg/ml)

5 6 7 8 9 10

1 Rutin 0,459 ΔAthử1 0,242 ΔAthử2 0,094 % ƯC 67,8

2 Chè dây 0,459 ΔAthử1 0,192 0,154 ΔAthử2 0,139 0,154 % ƯC 88,5 100

3 Dâu tằm 0,460 ΔAthử1 0,369 0,359 0,275 0,239 0,236 0,188 ΔAthử2 0,116 0,117 0,124 0,128 0,128 0,133 % ƯC 45,0 47,3 67,1 75,9 76,5 88,0

4 Lá móng 0,451 ΔAthử1 0,388 0,383 0,379 0,298 0,292 0,249 ΔAthử2 0,073 0,073 0,097 0,107 0,108 0,116 % ƯC 30,2 31,3 37,5 57,6 59,2 70,5

5 Kim ngân 0,459

ΔAthử1 0,339 0,331 0,305 0,284 0,258 0,206 ΔAthử2 0,056 0,056 0,057 0,058 0,059 0,061 % ƯC 38,3 40,1 45,9 50,8 56,6 68,4

6 Cườm rụng 0,446

ΔAthử1 0,481 0,478 0,449 0,445 0,440 0,351 ΔAthử2 0,147 0,147 0,166 0,167 0,168 0,188 % ƯC 25,1 25,8 36,5 37,7 39,0 63,5

7 Cúc áo 0,450 ΔAthử1 0,438 0,433 0,433 0,424 0,423 0,422 ΔAthử2 0,082 0,082 0,083 0,105 0,105 0,105 % ƯC 20,9 22,0 22,2 29,1 29,3 29,6

8 Mã đề 0,458 ΔAthử1 0,434 0,433 0,433 0,433 0,422 0,382 ΔAthử2 0,072 0,072 0,072 0,073 0,085 0,088 % ƯC 21,0 21,2 21,2 21,4 26,4 35,8

9 Xạ đen 0,448 ΔAthử1 0,447 0,446 0,440 0,440 0,437 0,411 ΔAthử2 0,035 0,035 0,063 0,063 0,064 0,067 % ƯC 8,0 8,3 14,7 14,7 16,7 23,2

35

Khả năng ức chế LOX của chè dây ở nồng độ >5mg/ml rất mạnh nên chúng

tôi thử thêm tác dụng ức chế LOX của chè dây ở các nồng độ từ 1mg/ml đến

4mg/ml. Kết quả được trình bày trong bảng 3.6.

Bảng 3.6. Kết quả khảo sát tác dụng ức chế LOX của chè dây

Chất ức

chế ΔAtrắng

Nồng độ chất ức chế (mg/ml)

1 2 3 4 5 6

Chè dây 0,459

ΔAthử1 0,319 0,309 0,287 0,293 0,192 0,154

ΔAthử2 0,090 0,089 0,082 0,120 0,139 0,154

% ƯC 50,1 52,1 55,3 62,3 88,5 100

3.4. Bàn luận

3.4.1. Về mô hình thử tác dụng ức chế LOX bằng phương pháp đo quang

- Ưu nhược điểm của mô hình thử tác dụng ức chế LOX bằng phương

pháp đo quang:

Ưu điểm: Mô hình thử tác dụng ức chế LOX bằng phương pháp đo

quang là một mô hình đơn giản và tiết kiệm, phù hợp với sàng lọc nhanh

nhiều mẫu dược liệu để thuận lợi cho việc chọn lựa dược liệu có tác dụng

mạnh cho các nghiên cứu phân lập ra hoạt chất có tác dụng ức chế LOX. Kết

quả nghiên cứu cũng chính xác vì mô hình không máy móc áp dụng bất kì

nghiên cứu nào mà khảo sát tất cả các yếu tố liên quan đến thí nghiệm như

thời gian ủ, nồng độ enzym và cơ chất thích hợp, cũng như tương tác giữa

enzym và chất ức chế nhằm đưa ra một điều kiện nghiên cứu thích hợp nhất.

Đặc biệt mô hình này có khảo sát lại hoạt độ enzym, đây là một bước rất quan

36

trọng nhằm kiểm tra lại hoạt độ enzym vì có thể hoạt độ enzym thực tế không

đúng như hoạt độ ghi trên nhãn sau quá trình vận chuyển, mở niêm phong,

bảo quản.

Nhược điểm: Thiết bị sử dụng là Máy quang phổ Spectrophotometer U –

1900 UV/VIS model 3J0 – 0003 không có chức năng cố định nhiệt độ 25oC

trong buồng chứa cuvet. Mặc dù phòng thí nghiệm được điều hòa ở 25oC tuy

nhiên buồng chứa cuvet có thể nhiệt độ sẽ khác 25oC trong quá trình máy vận

hành. Mẫu nghiên cứu cũng không có chức năng chiếu hai tia sáng qua mẫu

trắng và mẫu thử cùng lúc, mẫu trắng sau khi Autozero mới đo mẫu thử,

chênh lệch thời gian đo 2 mẫu khoảng 5 giây.

- Về quá trình khảo sát các điều kiện nghiên cứu:

So sánh hoạt độ enzym xác địnhđược với hoạt độ ghi trên nhãn: Hoạt độ

enzym ghi trên nhãn 221700U/mg. Sau khi khảo sát lại cho kết quả hoạt độ là

6862U/mg. Như vậy hoạt độ của enzym thực tế thấp hơn 32 lần so với hoạt

độ ghi trên nhãn. Điều này có thể do quá trình vận chuyển, thời gian sử dụng,

bảo quản làm hoạt độ của enzym giảm đi.

Về quá trình lựa chọn nồng độ enzym, có hai nồng độ có thể lựa chọn là

D3=1258U/ml và D4=629U/ml. So với nồng độ D4, ở nồng độ D3, enzym

hoạt động mạnh hơn nên thời gian ủ ngắn hơn. Thời gian ủ ngắn hơn sẽ chính

xác hơn vì thời gian ủ tăng lên, hoạt độ của enzym dần giảm đi do môi trường

thay đổi (sản phẩm liên tục được tạo ra) không còn là môi trường tối ưu cho

enzym hoạt động.Như vậy nếu lựa chọn nồng độ D3 thì kết quả nghiên cứu sẽ

chính xác hơn. Tuy nhiên, trong nghiên cứu này, chất ức chế là dịch chiết

thực vật chứ chưa phải là chất tinh khiết, nếu chọn nồng độ enzym cao hơn

(D3) thì lượng chất ức chế cũng phải cần nhiều hơn, nếu lượng dịch chiết

nhiều thì dung dịch sẽ có màu, đo quang sẽ không ổn định ở bước sóng 234

nm. Do đó nồng độ D4 đã được lựa chọn . Trong những nghiên cứu sau này,

37

khi đã phân lập ra được hoạt chất tinh khiết, có thể áp dụng mô hình với nồng

độ enzym D3.

Về quá trình lựa chọn nồng độ cơ chất, theo lý thuyết, khi giữ nguyên

nồng độ enzym và tăng dần nồng độ cơ chất thì tốc độ phản ứng sẽ tăng dần,

đến một nồng độ cơ chất nào đó sẽ có sự bão hòa cơ chất đối với enzym, tức

là nếu tiếp tục tăng nồng độ cơ chấtthì tốc độ phản ứng không thể tăng lên

nữa [11].Trong nghiên cứu này, khi tăng dần nồng độ cơ chất từ C6 lên C5,

C4, tốc độ phản ứng tăng dần và đạt cực đại ở nồng độ C4. Khi đã bão hòa cơ

chất, nếu tiếp tục tăng nồng độ cơ chất, tốc độ phản ứng không những không

tăng,mà còn giảm. Điều này có thểdo nồng độ cơ chất quá lớn so với nồng độ

bão hòa enzym tạo nên một môi trường không phù hợp cho enzym hoạt động.

Như vậy việc lựa chọn nồng độ cơ chất có 3 ưu điểm: Thứ nhất, tiết kiệm

được cơ chất (vì lựa chọn được nồng độ cơ chất thấp nhất để ứng với nồng độ

enzym đã lựa chọn thí nghiệm vẫn ở trạng thái bão hòa cơ chất). Thứ hai, khi

đã bão hòa cơ chất lựa chọn được nồng độ bão hòa cơ chất mà môi trường

phản ứng tạo ra là tối ưu cho enzym hoạt động. Thứ ba, tránh được việc khi

nồng độ cơ chất quá cao enzym đã bị bất hoạt bởi chất ức chế lại trở nên có

hoạt tính trở lại(Theo kết quả nghiên cứu về khả năng ức chế LOX của

quercetin, ở một nồng độ cơ chất nhất định, enzym bị ức chế bới quercetin,

nhưng khi tăng nồng độ cơ chất thì enzym lại có hoạt tính trở lại [62]). Khi

đó, để ức chế được enzym sẽ cần một lượng dịch chiết nhiều hơn, dung dịch

sẽ có màu, đo quang sẽ không ổn định ở bước sóng 234nm. Các nghiên cứu

sau này có thể khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đối với khả năng ức

chế LOX của chất ức chế.

- Về dung môi và pH của đệm:

Do điều kiện nghiên cứu có hạn, chúng tôi không khảo sát mà cố định

đệm sử dụng là đệm borat pH9,0 . Theo như kết quả của các nghiên cứu khác,

38

có thêm 3 loại đệm có thể sử dụng là đệm phosphat pH9,0, đệm Tris-HCl

pH8,5 và đệm Tris-buffer pH7,4 (xem tổng quan). Như vậy ở các nghiên cứu

sau này, có thể khảo sát để chọn ra loại đệm tối ưu hòa tan enzym và cơ chất

để enzym có hoạt tính tối đa. Đồng thời, dung môi chiết xuất dược liệu và

dung môi hòa tan cắn chúng tôi đều sử dụng methanol. Theo như kết quả của

các nghiên cứu khác (xem tổng quan), dung môi chiết xuất có thể là methanol,

ethanol, ethyl acetat. Còn dung môi hòa tan cắn có thể là đệm borat pH9,0,

đệm Tris-HCl pH8,5, đệm Tris-buffer pH7,4, DMSO, ethanol, methanol. Như

vậy có thể tiếp tục nghiên cứu sàng lọc các dung môi để tìm được dung môi

chiết xuất và hòa tan cắn sao cho tỷ lệ phần trăm ức chế LOX là lớn nhất.

3.4.2. Về kết quảthử tác dụng ức chế LOX của dược liệu

Cả 8 dược liệu đều có tác dụng ức chế LOX. Ở cùng một nồng độ dịch

chiết, khả năng ức chế LOX của 8 dược liệu giảm dần theo thứ tự sau: Chè

dây > dâu tằm > lá móng > kim ngân > cườm rụng > cúc áo > mã đề >xạ đen.

Chúng tôi chia 8 dược liệu thành 4 nhóm:

- Nhóm 1: khả năng ức chế rất mạnh: Chè dây (Ampelopsis cantoniensis

Planch.)

- Nhóm 2: khả năng ức chế mạnh: Dâu tằm(Morus alba L.)

- Nhóm 3: khả năng ức chế trung bình: Lá móng(Lawsonia inermis L.),

kim ngân (Lonicera japonica Thunb.), cườm rụng (Ehretia acuminata

P. Br.).

- Nhóm 4: khả năng ức chếyếu: cúc áo(Spilanthes acmella L. Murr.), mã

đề (Plantago asiatica L.), xạ đen (Ehretia asperula Zoll. et Mor.).

Dịch chiết chè dây có khả năng ức chế LOX rất mạnh, mạnh hơn cả hoạt

chất tinh khiết là rutin. Ở nồng độ 1mg/ml, dịch chiết chè dây ức chế trên

50% enzym và ở nồng độ ≥ 6 mg/ml thì ức chế 100% enzym. Nồng độ mà

khả năng ức chế lipoxygenase trên 50% của dâu tằm là 6,5mg/ml, lá móng và

39

kim ngân là 8mg/ml, cườm rụng là 10mg/ml.Cúc áo, mã đề và xạ đen ở nồng

độ 10mg/ml khả năng ức chế LOX vẫn < 50%.

Khả năng ức chế LOX của cả 8 dược liệu đều phụ thuộc vào nồng độ.

Khi nồng độ dịch chiết tăng thì khả năng ức chế cũng tăng, tuy nhiên lại

không tăng theo một tỷ lệ nhất định.

Như vậy có thể thực hiện các nghiên cứu sâu hơn đối với chè dây và dâu

tằm để phân lập ra hoạt chất có tác dụng ức chế LOX, thử tác dụng ức chế

LOX của các bộ phận khác nhau của cây để tìm ra bộ phận có hàm lượng hoạt

chất cao nhất. Bên cạnh đó, cần sàng lọc thêm nhiều dược liệu để chọn ra

những dược liệu có khả năng ức chế LOX mạnh nhất trước khi tiến hành phân

lập ra hoạt chất có tác dụng. Sau khi phân lập được hoạt chất, dung dịch hoạt

chất có thể pha thành nhiều nồng độ rất gần nhau để từ đó vẽ đồ thị biểu diễn

khả năng ức chế để xác định IC50, IC100 một cách chính xác nhất.

Chè dây có tác dụng ức chế LOX rất mạnh. Các nghiên cứu khác (xem

tổng quan) đã chứng minh được rằng chè dây có khả năng chống oxy hóa

mạnh và chống viêm tốt, là 2 tác dụng có được khi ức chế LOX. Như vậy tác

dụng ức chế LOX rất mạnh của chè dây phù hợp với kết quả các nghiên cứu

khác.

Dâu tằm có khả năng ức chế LOX mạnh, điều nàu cũng phù hợp với kết

luận của các nghiên cứu trước đó rằng dâu tằm có tác dụng chống oxy hóa

mạnh (xem tổng quan).

Xạ đen được biết đến như một vị thuốc điều trị ung thư hiệu quả (xem

tổng quan). Tuy nhiên trong số 8 dược liệu trên, xạ đen có tác dụng ức chế

LOX kém nhất. Như vậy tác dụng điều trị ung thư tốt của xạ đen chủ yếu là

do các cơ chế khác.Các gốc tự do tạo ra trong quá trình peroxy hóa lipid là

một trong những nguyên nhân gây ung thư. Có thể thực hiện thêm các nghiên

cứu sau này để thử khả năng khử các gốc tự do của xạ đen.

40

Cùng thuộc họ Vòi Voi (Boraginaceae) nhưng tác dụng ức chế LOX

của cườm rụng tốt hơn hẳn xạ đen. Ở nồng độ 5mg/ml, phần trăm ức chế của

Cườm Rụng là 25,1% gấp khoảng 3 lần của xạ đen là 8,0%. Như vậy mặc dù

trong cùng chi nhưng loài khác nhau thì tác dụng ức chế LOX khác nhau.

Cúc áo có tác dụng chống viêm hiệu quả, đặc biệt là trong viêm răng.

Tuy nhiên khả năng ức chế LOX của cúc áo yếu. Như vậy tác dụng chống

viêm hiệu quả của cúc áo chủ yếu là do cơ chế khác ví dụ ức chế COX-2, cần

tiến hành thêm các nghiên cứu thử tác dụng ức chế COX-2 của cúc áo.

Tác dụng ức chế LOX có thể liên quan đến thành phần flavonoid và

tanin của dược liệu. Kết quả thử tác dụng ức chế LOX của 8 dược liệu cho

thấy chè dây có tác dụng ức chế LOX rất mạnh phù hợp với việc lá chè dây có

hàm lượng flavonoid và tanin cao, dâu tằm có khả năng ức chế LOX mạnh

phù hợp với việc dâu tằm có đến 4 loại flavonoid và tanin. Trong thành phần

của lá móng, kim ngân, cườm rụng - những dược liệu ức chế LOX trung bình

cũng đều có flavonoid và tanin (xem tổng quan). Bên cạnh đó, Phần 1.1.5

tổng quan đã tổng hợp được các hoạt chất có nguồn gốc thiên nhiên đã được

chứng minh có tác dụng ức chế LOX. Trong đó, flavonoid và tanin chiếm đa

số: Các flavonoid bao gồm rutin, quercetin, baicalein, esculetin, artemetin,

casticin và tanin là epigallocatechin gallate. Như vậy, những nghiên cứu sau

có thể định lượng hàm lượng flavonoid và tanin của 8 dược liệu để khẳng

định xem tác dụng ức chế LOX có liên quan đến hàm lượng flavonoid và

tannin trong dược liệu hay không. Nếu có, khi phân lập ra hoạt chất có tác

dụng ức chế LOX sẽ theo chiều hướng phân lập ra các thành phần flavonoid

và tanin trong dược liệu.

41

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

KẾT LUẬN

- Đã xây dựng được mô hình thử tác dụng ức chế enzym LOX – 1bằng

phương pháp đo quang với các điều kiện nghiên cứu như sau: Nồng độ enzym

LOX – 1 là 629 U/ml, nồng độ cơ chất acid linoleic là 67 µM, thời gian ủ là 8

phút, đo quang ở bước sóng 234 nm, điều kiện nhiệt độ 25oC.

- Đã áp dụng mô hình thử tác dụng ức chế enzym LOX bằng phương

pháp đo quang để thử tác dụng ức chế enzym LOX-1 của 9 mẫu nghiên cứu

gồm: Rutin, chè dây (Ampelopsis cantoniensis Planch.), dâu tằm (Morus alba

L.), lá móng (Lawsonia inermis L.), kim ngân (Lonicera japonica Thunb.),

cườm rụng (Ehretia acuminata P. Br.), cúc áo (Spilanthes acmella L. Murr.),

mã đề (Plantago asiatica L.), xạ đen (Ehretia asperula Zoll. et Mor).Xác định

được khả năng ức chế LOX của các mẫu nghiên cứu ở 6 nồng độ 5, 6, 7, 8, 9,

10 mg/ml. Trong đó, ở nồng độ 5mg/ml, phần trăm ức chế LOX của rutin là

67,8%, của chè dây là 88,5%, của dâu tằm là 45,0%, của lá móng là 30,2%,

của kim ngân là 38,3%, của cườm rụng là 25,1%, của cúc áo là 20,9%, của

mã đề là 21,0%, và của xạ đen là 8,0%.

42

KIẾN NGHỊ

- Sử dụng máy quang phổ UV – VIS 2 chùm tia có chức năng kiểm soát

nhiệt độ bên trong buồng đovới cuvet thạch anh hoặc máy quang phổ Elisa

microplate reader với đĩa thạch anh để phép đo chính xác hơn.

- Phân lập ra hoạt chất có tác dụng ức chế LOX của chè dây và dâu tằm,

thử với các bộ phận khác nhau của cây để tìm ra bộ phận có hàm lượng hoạt

chất cao nhất. Bên cạnh đó, cần sàng lọc thêm nhiều cây thuốc để chọn ra

những cây thuốc có khả năng ức chế LOX mạnh.

- Sử dụng dung môi chiết khác nhau (methanol, ethanol, ethyl acetat),

dung môi hòa tan cắn khác nhau (đệm borat pH9,0, đệm Tris-HCl pH8,5, đệm

Tris-buffer pH7,4, DMSO) và các loại đệm khác nhau (đệm borat pH9,0, đệm

Tris-HCl pH8,5, đệm Tris-buffer pH7,4), từ đó chọn ra dung môi chiết, dung

môi hòa tan cắn và đệm phù hợp để khả năng ức chế LOX là mạnh nhất.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng việt:

1. Đỗ Huy Bích (2004), Cây thuốc và động vật làm thuốc, NXB khoa học

kỹ thuật, tập I, tr.423 – 425.

2. Đỗ Huy Bích (2004), Cây thuốc và động vật làm thuốc, NXB khoa học

kỹ thuật, tập II.

3. Nguyễn Thị Bình (2008), Nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác

dụng sinh học của lá và rễ cây lá móng (Lawsonia internis L.Họ Tử vi

Lythcaceae), Luận án thạc sỹ dược học, Trường Đại học Dược Hà Nội, tr.51 –

52.

4. Nguyễn Minh Hằng (2006), “Ảnh hưởng của các phần chiết giàu

flavonoid của hoa kim ngân lên hoạt độ peroxidase trong máu người và sự

peroxy hóa lipid màng”,Tạp chí dược học, số 1, tr. 18 – 22.

5. Hoàng Quỳnh Hoa (2010), Nghiên cứu một số cây thuốc chi cườm rụng

(Ehretia P.Br.), họ Vòi Voi (Boraginaceae) ở miền Bắc Việt Nam, Luận án

tiến sĩ dược học, tr.82 – 85.

6. Lưu Thị Diễm Hồng, Nguyễn Xuân Thắng (2005), “Tác dụng chống

viêm của flavonoid cây kim ngân khi kết hợp với amylase”, Tạp chí dược

học,số 3, tr. 8 – 11.

7. Ninh Ngọc Bảo Kim (2012), Cây thuốc người Dao Ba Vì,Quỹ Châu Á –

Trung tâm môi trườngvà phát triển cộng đồng, tr. 90.

8. Đỗ Tất Lợi (2005), Cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB y học.

9. Trương Minh Lương, Nguyễn Thị Thu Hạnh (2009), “Góp phần nghiên

cứu thành phần hóa học của thân và lá của cây kim ngân (Lonicera japonica

Thunb.) ở Bắc Giang”, Tạp chí khoa học, 54(3), tr.80-85.

10. Vũ Thị Ngọc Thanh, Phan Thị Vân Anh và cs. (2005), “Bước đầu nghiên

cứu tác dụng của flavonoid từ hoa kim ngân lên một số chỉ số lipid máu”, Tạp

chí dược học, số 1, tr.15 – 18.

11. Nguyễn Xuân Thắng (2005), Hóa sinh học, NXB y học, tr. 139-140.

12. Phùng Thị Vinh (1995), Nghiên cứu về thực vật, thành phần hóa học và

tác dụng sinh học của cây chè dây (Ampelopsis cantoniensis Planch.,

Vitaceae), Luận án phó tiến sỹ khoa học y dược, Trường Đại học Dược Hà

Nội.

Tiếng Anh:

13. Ali Shah S.M. et al. (2013), “Anti-lipoxygenase activity of some

indigenous medical plants”, Journal of Medicinal Plants Reseach, 7(6),

pp.219-222.

14. Axelrol B. et al.(1981), “Lipoxygenase from soybeans”, Methods in

Enzymology, 71, pp.441-451.

15. Berger W. et al. (2007), “Zileuton: clinical implications of 5-

lipoxygenase inhibition in severe airway disease”, International Journal of

Clinical Practice, 61, pp.663-676.

16. Berkeley H. D., Galliard T. (1976), “Measurement of lipoxygenase

activity in crude and partially purified potato extracts”, Phytochemistry, 15,

pp.1475-1479.

17. Bhattacharjee Soumen (2007), “Reactive oxygen species and oxidative

burst: roles in stress, senescence and signal transduction in plants”, Current

science, 89(7), pp.1113 – 1121.

18. Caroline Charlier, Catherine Michaux (2003), “Dual inhibition of

cyclooxygenase-2 (COX-2) and 5-lipoxygenase (5-LOX) as a new strategy to

provide safer non-steroidal anti-inflammatory drugs”, European Journal of

Medicinal Chemistry, 38, pp.645-659.

19. Cayman Chemical Company (2011), Lipoxygenase Inhibitor Screening

Assay Kit, Item No. 760700, pp5.

20. Choudhary M.I. et al. (2009), “Antiinflammatory and lipoxygenase

inhibitory compounds from Vitex agnus castus”, Phytotherapy Reseach,

23(9), pp.1336-9.

21. Cole A.T. et al. (1996), “Mucosal factors inducing neutrophil movement

in ulcerative colitis: the role of interleukin 8 and leukotriene B4, Gut, 39,

pp.248-254.

22. Cuzzocrea S. et al. (2005), “5-lipoxygenase modulates colitis through the

regulation of adhesion molecule expression and neutrophil migration”,

Laboratory Investigation, 85, pp.808-822.

23. Drazen J.M. et al. (1994), “Role of cysteinyl leukotrienes in spontaneous

asthmatic responses”, Advances in Prostaglandin Thromboxane and

leukotriene research, 22, pp.251-262.

24. Fischer A. M. et al. (1999), “Protein dynamics activity and cellular

localization of soybean lipoxygenases indicate distinct functional roles for

individual isoforms”, ThePlant Journal, 19, pp.543-554.

25. Flavin D.F. (2007), “A lipoxygenase inhibitor in breast cancer brain

metastaces”, Journal of Neuro-Oncology, 82(1), pp.91-93.

26. Gardner (1991), “Recent investigations into the lipoxygenase pathway in

plants”, Biochimica Biophysica Acta, 1084 (3), pp.221-239.

27. Gordon E. Anthon, Diane M. Barret (2001), “Colorimetric Method for

the Determination of lipoxygenase Activity”, Journal of agricultural and food

chemistry, 49(1), pp.32 – 37.

28. Gregor J.I. et al. (2005), “Effects of selective COX-2 and 5-LOX

inhibition on prostaglandin and leukotriene systhesis in ductal pancreatic

cancer in Syrian hamster”, Prostaglandins Leukot Essent Fatty acids, 73,

pp.89-97.

29. Gupta I. et al. (2001), “Effects of gum resin of Boswellia serrata in

patients with chronic colitis”, Planta Medica, 67(5), pp.391-5.

30. Ha T.J. et al. (2010), “Inhibition mode of soybean lipoxygenase-1 by

quercetin”, Chemistry and Biodiversity, 7(8), pp.1893-1903.

31. Ho C.T. et al. (1992), “Antioxidative effect of polyphenol extract

prepared from various Chinese teas”, Preventive Medicine, 21, pp.520-525.

32. Iversen L., Kragballe K., Ziboh V. (1997), “Significance of leukotriene

A4 hydrolase in the pathogenesis of psoriasis”, Skin Pharmacology, 10,

pp.169-177.

33. Kamalakkannan N., Prince P.S. (2006), “Antihyperglycaemic and

antioxidant effect of rutin, a polyphenolic flavonoid, in streptozotocin-

induced diabetic wistar rats”, Basic and Clinical Phamacology, 98 (1), pp. 97-

103.

34. Kamalakkannan N., Prince P.S. (2006), “Protective effect of rutin on

lipids, lipoproteins, lipid metabolizing enzyms and glycoproteins in

streptozotocin-induced diabetic rats”, Journal of Pharmacy and

Pharmacology, 58 (10), pp. 1373-1383.

35. Kazuo Tsuijmoto et al. (2007), “Anacardic Acids and Ferric Ion

Chelation”, Journal of biosciences 62c, pp. 710 –716.

36. Kennedy T.J. et al. (2003), “Lipoxygenase inhibitors for the treatment of

pancreatic cancer”, Expert Review of Anticancer Therapy, 3(4), pp.525-36.

37. Kim G.N. and Jang H.D. (2011), “Flavonol content in the water extract

of the mulberry (Morus alba L.) leaf and their antioxidant capacities”, Journal

of food science 76, pp C869 – 73.

38. Koch R.B. et al. (1958), “Linoleic acid and trilinolein substrates for

soybean lipoxydases”, Archives of Biochemistry and Biophysics, 78, pp.165-

179.

39. Koshihara Y. et al. (1983), “Selective inhibition of 5-lipoxygenase by

natural compounds isolated from Chinese plant, Artemisia rubripes Nakai”,

FEBS Letters, 158(1), pp.41-44.

40. Kris-Etherton P.M., Keen C. L. (2002), “Evidence that the Antioxidant

Flavonoids in Tea and Cocoa are Beneficial for Cardiovascular Health”,

Current Opinion in Lipidology, 13(1), pp.41-9.

41. Kumaraswamy M.V. and Satish S. (2008), “Antioxidant and Anti-

Lipoxygenase Activity of Thespesia lampas Dalz & Gibs”, Advances in

Biological Reseach, 2(3-4), pp.56-59.

42. Kumaraswamy M.V. et al. (2010), “Antioxidant and anti-inflammatory

activity of isolated phytoconstituent from Woodfordia fructicosa”, Journal of

Pharmacy Reseach, 3(7), pp.1492-1495.

43. Laughton M.J. , Halliwell B., Evans P.J. (1989), “Antioxidant and pro-

oxidant antions of the plant phenolics quercetin, gossypol and myricetin

effects on lipid proxidand, hydroxyl radical generation and bleomycin

depentdent damage to DNA”, Biochemical Pharmacology, 38(17), pp. 457 –

63.

44. Lehnigk et al. (1998), “Effects of a 5-lipoxygenase inhibitor, ABT-761,

on exercise-induced bronchoconstriction and urinary LTE4 in asthmatic

patients”, The European Respiratory Journal, 11(3), pp.617-623.

45. Li N. et al. (2005), “Overexpression of 5-lipoxygenase and

cyclooxygenase 2 in hamster and human oral cancer and chemopreventive

effects of zileuton and celecoxib”, Clinical Cancer Reseach, 11, pp.2089-

2096.

46. Lucia Rackova et al. (2007), “Free radical scavenging activity and

lipoxygenase inhibition of Mahonia aquifolium extract and isoquinoline

alkaloids”, Journal of Inflammation, 4(15), pp.1186-1476.

47. Melan M. A. et al. (1993), “An Arabidopsis thaliana lipoxygenase gene

can be induced by pathogens, abscisic acid, and methyl jasmonate, Plant

Physiology, 101, pp.441-450.

48. Natarajan R. and Nadler J.L. (2004), “Lipid inflammatory mediators in

diabetic vascular disease”, Arterioscler Thrombosis and Vascular Biology, 24,

pp.1542-1548.

49. Porta H. et al. (1999), “Analysis of lipoxygenase mRNA accumulation in

the common bean (Phaseolus vulgaris L.) during development and under

stress conditions”, Plant Physiology, 40(8), pp.850-858.

50. Raghavenra H. et al. (2006), “Eugenol-The active principle from cloves

inhibits 5-lipoxygenase activity and leukotriene-C4 in human PMNL cells”,

Prostaglandins Leukot Essent Fatty acids, 74(1), pp.23-27.

51. Rask – Madsen J. et al. (1992), “5-Lipoxygenase inhibitors for the

treatment of inflammatory bowel disease”, Special Conference Issue, C37-46.

52. Rossi A. et al. (2010), “The 5-lipoxygenase inhibitor, zileuton,

suppresses prostaglandin biosynthesis by inhibition of arachidonic acid

release in macrophages”, British Journal of Pharmacology, 161(3), pp.555-

570.

53. Sekhar Rao K.C. et al. (2002), “A lipoxygenase inhibitor from

Aspergillus niger”, Applied Microbiology and Biotechnology, 58, pp.539-542.

54. Sekiya K. and Okuda H. (1982), “Selective inhibition of platelet

lipoxygenase by baicalein” , Biochemical and Biophysical Reseach

Communications”, 150 (3), pp.1090-1095.

55. Selloum L. et al. (2003), “Anti-inflammatory effect of rutin on rat paw

oedema, and on neutrophils chemotaxis and degranulation”, Experimental and

Toxicologic Pathology, 54 (4), pp. 313-318.

56. Shureiqi I. and Lippman S.M. (2001), “Lipoxygenase modulation to

reverse carcinogenesis”, Cancer research, 61, pp.6307-6312.

57. Sigma – Aldrich company (1997), Enzymatic Assay of Lipoxydase, EC

1.13.11.12, SPLINo 01.

58. Skrzypczak – Jankun et al.(2003), “Inhibition of lipoxygenase by (-)-

epigallocatechin gallate: X-ray analysis at 2.1 A reveals degradation of EGCG

and shows soybeans LOX-3 complex with EGC instead”, International

Journal of Molecular Medicine, 12, pp.415-420.

59. Steele V.E. et al. (1999), “Lipoxygenase inhibitors as Potential Cancer

Chemopreventives”, Cancer Epidemiology, Biomarkers and Prevention, 8(5),

pp.467-83.

60. Uma Sankar Akula, Bharti Odhav (2008), “In vitro 5-Lipoxygenase

inhibition of polyphenolic antioxidants from undomesticated plants of South

Africa”, Journal of Medicinal Plants Reseach, 2(9), pp.207-212.

61. Veronica Sanda Chedea, Mitsuo Jisaka (2011), “Inhibition of Soybean

Lipoxygenase – Structural and Activity Models for the Lipoxygenase

Isoenzymes Family”, In Tech, IBSN 978-953-307-533-4, pp.110-130.

62. Veronica Sanda Chedea et al. (2012), “Lipoxygenase – Quercetin

Interaction: A Kinetic Study Through Biochemical and Spectroscopy

Approaches”, In Tech, IBSN 978-953-51-0249-6, pp.152-178.

63. Vicas S.I. et al. (2011), “Inhibitory effects of isoflavones on soybean

lipoxygenase-1 activity”, Journal of Food Biochemistry, 35, pp. 613-627.

64. West M. et al. (2004), “Nordihydroguaiaretic acid, an inhibitor of

lipoxygenase, also inhibits cytochrome P-450-mediated monoxygenase

activity in rat epidermal and hepatic microsomes”, Journal of

Neurochemistry, 91(1), pp.133-143.

65. Williams D.C. et al. (1986), “Blanching of vegetables for freezing:

which indicator enzyme to choose”, Food technology, 40(6), pp.130-140.

66. Wong B. C. et al. (2001), “Lipoxygenase inhibition induced apoptosis in

human gastric cancer cells”, Carcinogenesis, 22(9), pp.1349-54.