Nešpecifická imunitaNešpecifická imunita

Imunita - mnohozložkový, vyregulovaný systémImunita - mnohozložkový, vyregulovaný systémÚlohy Úlohy

imunitný dozor - autoimunita, imunitný dozor - autoimunita, protinádorová imunita sledovanie protinádorová imunita sledovanie adekvátnosti - alergia adekvátnosti - alergia obrana proti infekcii - anti infekčná imunitaobrana proti infekcii - anti infekčná imunita

Obranné línie antiinfekčnej imunity: Obranné línie antiinfekčnej imunity: - špecifická humorálna - špecifická humorálna - špecifická - špecifická bunková bunková - nešpecifická- nešpecifická

Imunitná - obranná líniaImunitná - obranná línia ŠpecifickáŠpecifická - - bunková bunková -kvantitatívna -kvantitatívna -funkčná - -funkčná - i.d.testy (tuberkulin)i.d.testy (tuberkulin) -- humorálna humorálna - kvantitatívna- kvantitatívna - funkčná - - funkčná - protilátky proti špecifickým protilátky proti špecifickým

bakteriálnym a vírusovým antigénom - SEROLOGICKÉ REAKCIE bakteriálnym a vírusovým antigénom - SEROLOGICKÉ REAKCIE NešpecifickáNešpecifická - - bunková bunková - kvantitatívna - - kvantitatívna - počet lymfocytov počet lymfocytov

(rozety), počet buniek - KO - leu, lymfo, mono, eosino………(rozety), počet buniek - KO - leu, lymfo, mono, eosino……… - funkčná - - funkčná - fagocytóza, FA, FI, test fagocytóza, FA, FI, test

aktivácie lymfocytov aktivácie lymfocytov - - humorálna humorálna - kvantitatívna - - kvantitatívna - IgG,IgA,IgM, IgG,IgA,IgM,

C3,C4,CH50,CIK, proteiny akútnej fázy zápalu-CRP, C3,C4,CH50,CIK, proteiny akútnej fázy zápalu-CRP,

- funkčná - klinicky, - funkčná - klinicky, baktericídna baktericídna aktivita séra, stanovenie lyzozymuaktivita séra, stanovenie lyzozymu

Podozrenie na IDSPodozrenie na IDS

Skríningové vyšetrenia: Skríningové vyšetrenia: - všeobecné - KO + diff., FW, CRP, ASLO, RF - všeobecné - KO + diff., FW, CRP, ASLO, RF - imunologické - - imunologické - protilátková imunita: IgG, IgA, IgM, hladiny protilátok po protilátková imunita: IgG, IgA, IgM, hladiny protilátok po očkovaní proteinovými ag (diftéria, tetanus), očkovaní proteinovými ag (diftéria, tetanus), poysacharidovými ag (Hib), vírusovými ag, bežným poysacharidovými ag (Hib), vírusovými ag, bežným antigénom ASLO) antigénom ASLO)

- bunková imunita - celkový počet lymfocytov - bunková imunita - celkový počet lymfocytov - rozety, subpopulácie, kožné testy- rozety, subpopulácie, kožné testy

- fagocytóza - diff. leukogram, FA,FI- fagocytóza - diff. leukogram, FA,FI - komplementový systém - CH50, C3, C4, - komplementový systém - CH50, C3, C4,

DemonštráciaDemonštrácia Lyzozym - funkcia makrofágového systémuLyzozym - funkcia makrofágového systému Baktericídna aktivita séra - humorálna imunita - Baktericídna aktivita séra - humorálna imunita -

funkčný test funkčný test CRP - proteiny akútnej fázy zápalu CRP - proteiny akútnej fázy zápalu T lymfocyty, B lymfocyty - kvantitatívne T lymfocyty, B lymfocyty - kvantitatívne

hodnotenie bb imunityhodnotenie bb imunity IgG, IgA, IgM - kvantitatívna humorálna imunita, IgG, IgA, IgM - kvantitatívna humorálna imunita,

funkčné hodnotenie B lymfocytovfunkčné hodnotenie B lymfocytov Fagocatóza - Fagocytárny indexFagocatóza - Fagocytárny index

Stanovenie lyzozýmuStanovenie lyzozýmu Lyzozým - bázická nízkomolekulová bielkovinaLyzozým - bázická nízkomolekulová bielkovina Micrococcus lysodeikticus - baktéria rozpustiteľná lyzozýmomMicrococcus lysodeikticus - baktéria rozpustiteľná lyzozýmom Vzorka, v ktorej predpokladáme lyzozým - sliny, krv, moč, CSMVzorka, v ktorej predpokladáme lyzozým - sliny, krv, moč, CSM Agarv ktorom rozmiešame suspenziu kmeňa a vylejeme na Agarv ktorom rozmiešame suspenziu kmeňa a vylejeme na

sklenú platňusklenú platňu Vyrežeme jamky, do ktorých nakvapkáme štandardy o známej Vyrežeme jamky, do ktorých nakvapkáme štandardy o známej

koncentrácii lyzozýmu a neznáe vzorkykoncentrácii lyzozýmu a neznáe vzorky Odčítame prejasnenie - sérum s obsahom lyzozýmu rozpustilo Odčítame prejasnenie - sérum s obsahom lyzozýmu rozpustilo

bakteriálnu suspenziu v agarebakteriálnu suspenziu v agare Veľkosť zóny vzorky porovnáme s veľkosťou zóny známej Veľkosť zóny vzorky porovnáme s veľkosťou zóny známej

štandardy - vypočítame podľa vzorcaštandardy - vypočítame podľa vzorca

Štandardy lyzozýmuNeznáme vzorky

Agar + bakteriálna suspenzia

Úloha 1: Stanovenie lyzozýmu

- schopnosť lyzovať bunky Micrococcus lysodeiticus

Zahriaty MPA + susp. Mikroorg vyliať na sklo

- po stuhnutí vykrojenie jamiek- do jamiek vzorka (roztok lyzozýmu v rôznych koncentráciách- od pacienta)- inkubácia 24 hod vo vlhkej komôrke pri lab. teplote- odčítanie zóny inhibície rastu Micrococcus lysodeiticus

Úloha 2: Baktericídna aktivita séraÚloha 2: Baktericídna aktivita séra

Escherichia coli Escherichia coli Plná krv - stanoví sa počet leukocytovPlná krv - stanoví sa počet leukocytov Pripraví sa suspenzia baktérii - nefelometricky - meraním Pripraví sa suspenzia baktérii - nefelometricky - meraním

zákalu - s rôznou koncentráciou baktérií 10, 100, 10zákalu - s rôznou koncentráciou baktérií 10, 100, 103 3 10104 4 10105 5

10106 6

Pridá sa sérum a kultivuje saPridá sa sérum a kultivuje sa Počíta sa počet baktérií, ktoré vyrástli v prítomnosti séra v zo Počíta sa počet baktérií, ktoré vyrástli v prítomnosti séra v zo

vzorca sa vypočíta baktericídna aktivita:vzorca sa vypočíta baktericídna aktivita: Podstata - v prítomnosti zdravého séra určité množstvo Podstata - v prítomnosti zdravého séra určité množstvo

baktérii je zabitébaktérii je zabité

Baktericídna aktivita séra

čerstvé ľudské sérum + suspenzia baktérií ( E. coli)( na porovnanie pripravujeme aj skúmavky s inaktivovaným sérom )

premiešať, inkubácia vo vodnom kúpeli alebo v termostate pri 37 st.C 1 hod.

-obsah skúmaviek do Petriho misiek + agar = ink. 24-48 hod

počítanie kolónií

Úloha 3: CRP - C reaktívny protein Úloha 3: CRP - C reaktívny protein protein reagujúci so protein reagujúci so

substanciou C v stene pneumokokovsubstanciou C v stene pneumokokov

Do kapiláry sa naleje roztok s protilátkou Do kapiláry sa naleje roztok s protilátkou proti CRP a opatrne sa navrství sérum.proti CRP a opatrne sa navrství sérum.

Ak sa v sére nachádza CRP - vznikne na Ak sa v sére nachádza CRP - vznikne na rozhraní biely precipitátrozhraní biely precipitát

Test kvalitatívny v kapilárachTest kvalitatívny v kapilárach Kvantitatívne stanovenie - difúziou v agare Kvantitatívne stanovenie - difúziou v agare

a porovnaním so štandardou (ako lyzozým, a porovnaním so štandardou (ako lyzozým, Ig, proteiny akútnej fázy zápalu, C3, C4)Ig, proteiny akútnej fázy zápalu, C3, C4)

Imunodifúzia v agareImunodifúzia v agare Test na stanovenie koncentrácie - napr. IgG, IgA, IgM, Test na stanovenie koncentrácie - napr. IgG, IgA, IgM,

C3, C4, proteiny akútnej fázy - ceruloplazmín, C3, C4, proteiny akútnej fázy - ceruloplazmín, makoglobulín………….makoglobulín………….

Princíp - do agaru sa zamieša protilátka proti látke, Princíp - do agaru sa zamieša protilátka proti látke, ktorú chceme dokázať. Do vytvorených jamiek ktorú chceme dokázať. Do vytvorených jamiek kvapneme štandardy (4-5) so známou klesajúcou kvapneme štandardy (4-5) so známou klesajúcou koncentráciou a neznáme vzorky. Vytvorí sa prstenec koncentráciou a neznáme vzorky. Vytvorí sa prstenec na základe difúzie séra s hľadanou látkou a reakcie na základe difúzie séra s hľadanou látkou a reakcie AgAb. Veľkosť prstenca je úmerná koncentrácii a AgAb. Veľkosť prstenca je úmerná koncentrácii a porovnaním so štandardou vypočítame koncentráciu. porovnaním so štandardou vypočítame koncentráciu.

KomplementKomplement

Úloha 4: stanovenie zložiek komplementuÚloha 4: stanovenie zložiek komplementu

Úloha 5: Fagocytóza a fagocytárny indexÚloha 5: Fagocytóza a fagocytárny index Leukocytom (PMNL) ponúkneme cudzorodú láktu - Leukocytom (PMNL) ponúkneme cudzorodú láktu -

kvasinky - tak, že plnú krv inkubujeme z kvasinky - tak, že plnú krv inkubujeme z pekárenskýmikvasnicami. Leu ich fagocytujú. Urobíme pekárenskýmikvasnicami. Leu ich fagocytujú. Urobíme krvný náter, ktorý zafarbíme May Grunwaldovou krvný náter, ktorý zafarbíme May Grunwaldovou metódou. Pod mikroskopom počítame - počet metódou. Pod mikroskopom počítame - počet fagocytujúcich a nefagocytujúcich PMNL do 100. Počet fagocytujúcich a nefagocytujúcich PMNL do 100. Počet fagocytujúcich leu udáva fagocytózu v %. U fagocytujúcich leu udáva fagocytózu v %. U fagocytujúcich leu spočítavame aj počet gafocytovaných fagocytujúcich leu spočítavame aj počet gafocytovaných čiastočiek. Počet fagocytovaných čiastočiek delíme čiastočiek. Počet fagocytovaných čiastočiek delíme počtom fagocytujúcich leu a dostaneme fagocytárny počtom fagocytujúcich leu a dostaneme fagocytárny index - hodnotu, ktorá určuje aktivitu fagocytovindex - hodnotu, ktorá určuje aktivitu fagocytov

Určenie fagocytárnej schopnosti PMNL

počet fagocytujúcich PMNL FA % = x 100 200

počet fagocytovaných kandíd FI = počet fagocytujúcich PMNL

FA = 77,1 +- 8,8 % FI = 3,6 +- 0,8