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TitleBeiträge zur Kenntnis über die Agglutination von Sp. icterohaemorrhagiae.Vorschlag einer Methode zur Abschätzung der Agglutination mit blossemAuge.

Author(s) Naito, Tatsuo; Chin, Reisui

Citation Acta Medica Nagasakiensia. 1942, 3, p.59-66

Issue Date 1942

URL http://hdl.handle.net/10069/17403

Right

NAOSITE: Nagasaki University's Academic Output SITE

http://naosite.lb.nagasaki-u.ac.jp

59

Beiträge zur Kenntnis über die Agglutination von Sp. icterohaemorrhagiae.

Vorschlag einer Methode zur Abschätzung der

Agglutination mit blossem Auge.

Von

Naito, Tatsuo|Chin, Reisui (内藤, 達男|陳, 麗水)

Aus dem Bakteriologischen Institut der Nagasaki Medizinischen Fakultät (Vorstand : Prof. Dr. T. NAITO).

(Eingegangen am 21. Februar 1941.)

Seit der Entdeckung des Erregers der WEILschen Krankheit (Sp. ictero-haemorrhagiae) durch Prof. INADA und seine Schüler sind zur Diagnosestellung dieser Krankheit verschiedene Serumreaktionen von mehreren Forschern vor-geschlagen worden, z. B. Agglutination-Lysis-Versuche, Komplementbindungs-reaktion, RIECKENBERGsche Reaktion, PFEIFFERsches Phänomen usw. Sie sind zwar von grosser Bedeutung, nicht nur bei der Serodiagnose, sondern auch bei der Artbestimmung des nachgewiesenen Erregers, und nachdem heute die Vielfältigkeit der Leptospirosen nach den Erregerarten erkannt wurde und IDO, SHIOZAWA, ABE, KOTORII u. a. speziell in Japan das Auffinden des Autum-nalis-Typus gelungen ist, bestand weiteres Bedürfnis, die Krankheit oder den Erreger im klinischen Laboratorium abzugrenzen. Der Kompliziertheit des Verfahrens halber scheinen die meisten dieser Reaktionen leider den Klinikern die handliche Verwendung noch nicht gestattet zu haben.

Die Agglutination-Lysis, auf jeden Fall, ist wegen der überaus einfachen Technik überbaut den anderen voraus, und bekanntlich sind dabei zwei Arten der Ausführung angegeben.; die eine ist die Beurteilung des Auftretens des erst im Jahre 1918 Prof. OBA entdeckten Agglutinationsbildes der Spirochäten, welche man in dem betreffenden Immunserum züchtet, und die andere ist hinsichtlich der Ausführungsweise nichts anderes als die WIDAL-Reaktion bei Typhus. Die letztere Art wurde zum ersten Mal von SCHÜFFNER und auch in unserem Institut von Prof. ABE u. a. beim Studium über die „ Hasamiyami " verwendet. Bei der Agglutination muss übrigens die Ablesung der Resultate immer noch mit Hilfe des Mikroskops unter Dunkelfeldbeleuchtung ausgeführt werden. Es wird allgemein zugestimmt, dass hierbei sowohl eine geübte Hand als auch viel Zeit beansprucht werden, insbesondere bei Durchführung der Untersuchung mit zahlreichen Exemplaren.

Um diese Umständigkeit zu vermeiden, wurden neuerding mehrere Ver-

) Mitgeteilt auf der 13. Tagung der Japanischen Vereinigten Mikrobiologischen Gesellschaft am 1. Juli 1939 zu Sapporo.

60 T. NAITO und R. CHI+N:

besserungen erfunden, z. B. von PoT, SMITH-TULLOCH, NUKADA u.a. Si~: haben sich bemtiht, mit blossem Auge die Reaktion abzuschatzen, indem sie entweder die Agglutinationsmasse erhitzten oder schr~ge Beleuchtung wie bei

der Nephelometrie benutzten. Diese Bemtihung sind bisher aber in Hinsicht der praktisQhen, Anwendung noch nicht v61lig erfolgreich, und deshalb scheinen

sie nicht besonders empfehlbar zu sein.

In den letzten zwei Jahren hat einer von den Mitarbeitern, CHIN, st~ndig

die Absicht verfolgt, die Pathogenitat und Immunit~t der WEIL-Spirochaten zu verst~rken, und konnte das Ziel auch ann~hernd erreichen, indem er ftir die Ztichtung derse]ben einen neuen Weg fand. Wird die Kultivierung nach q_einer Methodik richtig ausgeftihrt, so ist die Vermehrung der Spirochaten (im Folgenden kurz ,. Sp." genannt) sehr deutlich, so dass man makroskopisch

H{* **,*{*** *f{ ,,*~ ~~* T(,,]f"*-* {,,-* ~**h IL-~ T*-*~ **** *~ -*~* "*;l -'- "-'--- ^'---"* ~-- ^'-'*-'^^'--'-"'- '^-*^^ + - ^-*-'^ -'-v-'+"' "--^**' -'^-bei Mikroskopierung betr~gt die Zahl der Sp. oft tiber 100 in jedem Feld. Nach 7-9 Tagen wird die Trtibung immer st~rker, die Zahl nimmt irnmer mehr zu, n~mlich bis 180-230 (dieses Ergebnis wird aber nur vorlaufig mit-geteilt), und scheinen die Verhaltnisse ~hnlich wie bei der gew6hnlichen Bakterienaufschwemmung zu sein. Wird diese Sp.-Kultur fdr die Agglutina-tion verwendet, so verhalt sie sich als Agglutinogen ebenburtig den gewohn-lichen lebenden Bakterienaufschwemmungen ; sie ruft makroskopische sichtbare

Agglutination hervor, wodurch wir den Reaktionsgrad nach der minimal-ables-baren Serumquantit~t und nach der Intensit~t der F]ockung abschatzen konnen,

und dabei auch die Flockungsbeschaffenheit unterschiedlich beobachten. Zum

Erreichen so]cher Verfassung haben wir zahlreiche Beobachtungen gemacht, tiber die wir im Folgenden berichten. Der experimentelle Teil dieser Arbeit zufallt in zwei Abschnitte : der erst Teil beschaftigt sich mit Untersuchungen

tiber die optima]e Bedingung unserer Reaktion, der zweite Teil tiber deren Anwendbarkeit zum Objektglasversuch und Haltbarkeitssteigerung usw., wobei

wir auch bemtiht waren, eine Unterlage zur Beurteilung des Wesens der Reaktion zu gewinnen.

Eigene Versuche.

Nahrboden : Auf KORTHOFSchem Grundmedium*) wird das von uns modifizierte leicht hamolysierte Serum im Verh~ltnis I :9 zugesetzt, an Stelle vom einfachen Kaninchenserum. Weitere einsttudige Erw~rmung der damit geftillten Rohrchen auf 56'C ist erforderlich. Das

~) Rezept des originalen KoRTHOFschen Nahrbodens (zit. n. Zbl. Bakter. I Orig., Bd 125, S. 430, 1930):

Pepton Witte. . . . . . . . . . . . .. 400mg CaC12 .. .. . ... . . ... . . ... . . 20 mg . . . . . . . 700 mg KH2P04 ' . . . . . ' . . . . . . L . . . . 90 mg

10 mg Na2HP042H20 . . . . . . . . .... 480mg 20 mg Aqua dest . . . . . . . . . . . . . . . . 500 cc

Diese Fltissigkeit wird 20 Min. im Kochapparat bei 100'C sterilisiert, kalt filtriert und nochmals 30 Min. bei 100eC sterilisiert. Vor der Verwendung wird 8 proz. steri]es Kaninchen-serum mit der sterilen Fltissigkeit, gemischt. Mit dieser Mischung werden sterile R6hrchen ge-fullt (etwa 8 cc pro Rdhrchen) und diese R6hrchen werden eine Stunde im Wasserbad auf 56'C erhitzt.

Beitrage zur Kenntnis tber die Agglutination von Sp. icterohaemorrhagiae. 61

hdmolysierte Serum wird bereitet, indem man das entfibrinierte Kaninchenserum zentrifugiert und den ilberstehenden Teil abpipettiert. Bei vergleichend schwer wachstumsf~higem Sp.-Stamm oder bei frisch isolierter, an den N~hrboden noch nicht gentigend gewohnter Kultur ist ein weiterer Zusatz von Vitamin-B unerlasslich, wobei ein Extrakt aus Vitamin-B-Pulver fur bakterio-

logische Zwecke (Firma GOTO-FUUNDO, Tokyo) oder ein kaufliches Pr~parat filr Injektion, z. B. Orysanin (Firma SANKYO, Tokyo) verwenbar ist. Der zweckmassige Gehalt an Extrakt betr~gt '0.5-5.0~~, und der an Orysanin u. a. 0.5-1.0~~.

Antigen : Die Impfung der Sp.' wird mit steriler Pipette oder mit grosser wirbelfdrmiger Platin6se angestellt. Schon nach 3-4 Tagen ian Brutschrank bei 28'C ist die Kultur so reichlich

gewachsen., dass man immer eine weisse Trabung bemerken kann. Das Wachstum wird von Tag zu Tag deutlicher, auch die Trtibung verst~rkt sich allm~hlich, wenn der Nahrboden gut her-gestellt worden ist. Nicht nur der Wachstumsgrad, wie oben, sondern auch die unwi]lktirliche Beimengung von Saprophyten-Wachstum wird durch die Trtibung leicht beurteilt. Beim letzteren Fall entsteht eine starke Trilbung - so wie es die gew6hnlichen Bakterien demonstrieren - oder

in der Trfibung auf Sp.-Wachstum flockend suspendierte Partikelchen, im Gegensatz zu reinem Sp.-Wachstum, das ein nebelhaftes Bild zeigt, oder beim Schtitteln einer schwebenden dtinnen Seide gleicht. Zum Gebrauch ist die 5-6 Tage alte Kultur geeignet, zur Wirksamkeit gelangt auch die noch ~ltere, allerh6chstens aber ein' und halbmonatige Kultur, wenn man sie weiter auf 28'C stehen lasst und den dabei entstehenden flockigen Bodensatz abtrennt. Beim Eisschrank-

aufenthalt dagegen l~sst die Wirkung des Antigens allmablich nach, und zwar schon nach 15 Tagen bleibt das Antigen vollstandig ohne Wirkung.

Reaktion : In einer Reihe 'von Rohrchen, in welchen je 0.2 cc von fortlaufend mit ver' doppeltem Nenner verdtinntem Serum eingeftillt worden ist, ftigt man je 0.4 cc, 0.2 cc oder 0.1 cc

Antigen zu. 1-3 Stunden lang im Thermostat digerieren lassen. Das Ergebnis wird makro-skopisch oder mit Hilfe der Lupe abgelesen.

Das in diesem Versuchsabschnitt verwendete Antigen ist die lebende Kultur der WEIL-Sp. und das Immunserum das im Jahre 1939 von DENKEN hergestellte Anti-WEILsp.-Pferdeserum.

Die Tabelle I (A) zeigt den Befund der Agglutination der Reaktions-komponenten, wobei die doppelte Menge der Kultur mit 0.2 cc Seruml6sung zusammengebracht wird. Die Agglutinationsmasse zeigt im allgemeinen flockige Reaktion wie die der Salmonellen und zwar wird die Reaktion 'Jon I : 150 bis

zu I : IZOO deutlich stark grobflockig, von I : 2400 zu I : 4800 m~ssig und von

1 : 9600 zu I : 19200 vielmehr schwach, aber doch sind bei letzterem Fall zerbrochene Fetzchen grober Masse ersichtlicll. Die Reaktion kann tats~chlich

bis zum Endtiter mit n~cktem Auge abgeschatzt werden, gerade so gut wie ,die gewohnliche Bakterienagglutination. Die Aufklarung der oberen fltissigen

Teile ist besonders deutlich bis zu I : 4800 und von I : 9600 bis I : 19200 sind

sie trotz m~ssiger Trtibung noch gut von der Kontrolle unterscheidbar. Dieser

Befund stimmt ganz gut mit dem oberen bei I : 9600 bzw. I : 19200 tiberein, sodass die Reaktion beiderseits als I : 19200 bewertet werden kann.

Andererseits haben' wir die Reaktion auch durch Mikroskopierung im Dunkelfe]d untersucht. Von I : 150 bis zu I : 2400 betrugen die freien Sp. in jedem Feld 5, bis I : 4800 11-12, bei I : 9600 20-30, bei 19200 30-50 und

bei der Kontrolle tiber 150 ohne Zusammenballen der Sp. Der Agglutinations-titer durch Mikroskopierung wurde deshalb auch als I : 19200 bestimmt, sodass

er auch mit der oben erwdhnten Abschdtzwag mit blossem Auge vb~lig ~'ber-

einstimmt. Bei unserem Versuch kann man die sogenannte Hemmungszone doch bemerken, sodass die Agglutjnation von I : 800 bis I : 1200 etwas st~rker

als die von I : 150 ist. Die Zusammenballung der Sp. ist ebenfalls in st~rkerer

Verdtinnung, so dass die Bewegung der einzelnen noch gut wahrnehmbar ist.

62 T. NAITO und R CHIN

Verd. d. Serums

Menge davon Antigenmenge ,wahrer Verd.-grad

Aggl.-grad ~ c'

~ ~ ~; Flockung 'g~o~'g~ E:-- beim

J~:~1 uQ q' Schutteln o~~:l

,~: c:I

~ Kl'ppe vor Schutteln

~; ~ Aggl.-grad ~s ~~~ freie ST)'

'~ ~:1 aggl. Masse

Verd. d. Serums Menge davon Antigenmenge wahrer Verd.-grad

Aggl.-grad ~ 'l'

~::

"c",* ~:! Flockung 'f~ :: beim o:: ~; ~; Schtitteln

~OQ ~':

':' Kurpe vor ~ Schutteln

~,:oco ~;~: Aggl.-grad

~5 ~~ ~Z; freie Sp.

'S en aggl. Masse

Verd. d. Serums Menge davon Antigenmenge wahrer Verd.-grad

Aggl.-grad ~ q,

~: "u)_ ~:1 Flockung

'~~ e beim 05 ~; ~S Schtitteln olLeQ

~~ ':1 Kuppe vor S Schtitteln

50 0.2 0.2 1 oo

++

1 oo

0.2 0.2 200

+~

200

0.2 0.2 4 oo

HH+

TABELLE

400 0.2 0.2 800

4+++

8 Oo

0.2 0.2 1600

+H+

I (A).

1 600

0.2 0.2 3200

+hF

3200 0.2 0.2 6400

++

6400 12800 25600 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2

12800 25600 51200

+ ~~ -

Kontr. *O . 2

0.2

fk2 Jkq fkP kl kP fk2 fk~ f~P 1~~~ P9~ Pg~ evt~f 2f ~f . ~ f ~f m~lf J J S k f k f ~ f j

¥t/'~"' "'~ ' ' ~:~:;~~!~~ ~~u-' t IJLnjl ~"~ :) ~>7"'^ ~:tf~, $~T~~:<~:k~/;~'

_~. (* : ¥*.~ -' ~~ ' ~ ' ( ~'~ "~1 *' ~';'~~~

. "~l'4 "'/ *>* :tl~l . ~llv' "f ' *ti ' *..~t .

+Hr +r+ ++ H+h 0-1 2-3 0-1 2-3 3-4 3-4 2 -3 4-5

50 0.2 0.4 150

H+h

1 OO

0.2 0.4 3UO

+~~,

200

0.2 0.4 600

~+++

~h H+h 2-5 3-4 5~6 2-6

TABELLE 400 o:~ 0.4 1200

+f+f

800 0.2 0.4

2400

H~+

I (B).

1600 '0.2

0.4 4800

++ f k~ ~ ~ ~ f ~ f kP 4rt~ f ~S ~f 4~~ ~ 4n~f ~ f

~t .~ d¥~1 rt S ~'A t¥¥tL tf L~~rll Lt'l IL tdd'lP ¥b t 1'~

~l~r 1~i~ ((~¥' *tSIV *¥t'*S"I

I Ir ,~ ,t'~tv~f "'~ t /"I~'¥}' ~~tft" "_'~;:1._*<r.

**, .~¥ " ~ ./ (.

f'L h'~

+++ +HL 4-5 3-4 0-1 1-2

50 0.2 0.1.

75

++

100 0.2 0.1 150

++

H~+

2~3 2-3

200 0.2 o. 1

300

+hh

+F+ ++ HH+

2-5 11-12 3~4

3- 4 3-6 5-6

TABELI'E I ( ).

400 0.2 0.1

600

+++

8 oo

0･2

0.1 1200

+hF

1600 0.2 0.1

2400

H+h

+h +h + ~0-30 30-50 80 iiber 150 3-5 3-6 1-2

3200 0.2 0.4

9600

+ p~r ~~ibl ~~J tt._ , , fk f f

*:'* .' +' ~* '

+ + 20-30 30-50 tiber 150 2 -5 5 -7

3200 0.2 0.1

4800

+

6400 12800 25600 Kontr' 0'2 0'2 0'2 *0'2 0'4 0'4 0'4 0'4

19200 38400 76800 -

+ - ~~i Pa~c fk fk

6400 0.2 0.1

9600

+

12800 25600 0.2 0.2 0.1 0.1

19200 38400

+ -

Kontr *0.2 O. 1

f ~ f kL j~ kP kl f kQ S ~ ~k~ ~kP S~ ' k2

4n~f '~ : t'l:~J af 9J ff ff jk ' ' fk 9f f J

¥*'1 1 ~.A t~L~~~ I'lLt [¥~L($¥'~'~'I~l~J'Jj ¥It~~!i"¥~'4 "te!~ / "i~L?¥~ f , .'' t 1'y'/'1

'ttNa t" 1+'*'~1" ~JltT*4'b~*r

' *'1'~~f :'(h'f'¥ " * :'7

, :L:':' ~"' " ~c

' Aggl.-grad +~ +H! ~,:cQ~:!

S ~ freie Sp. 2-3 3~~ ~':.~ ~q,

~ ~~ aggl. Masse 2-5 5-6 ' Es bedeutet: *. .

gf . . . .grob-fiockig, mgf . .

+H~ +HL 2-3 1 -2 3-5 3~4

. . Kochsalzlosung, kl .

+H! +hh 3-5 3-4 1 -2 3-5 .klar, f kl. .

. .massig grob･flockig, ff . .fein-flockig, fk

+h + + - -10-15 15-28 20-25 tber 100

1-3 1-2 3- 4 - -. fast klar, I getr. . . . Ieicht getrtb.t,

. . . .ein-kornig.

J

Beitr~ge zur Kenntnis uber die Agglutination von Sp. icterohaemorrhagiae. 63

In schw~cheren Verdtinnungen ist die Agglutinationsmasse so weit fest, dass

die Bewegung der Sp. nicht mehr wahrgenommen werden kann.' Nicht viel anders liegen die Verhaltnisse betreffs der Agglutinationsend-

titer bei weiteren Versuchen, in denen wir die Antigenmenge zuerst verdoppeln

(Tabelle II-B) und dann auf die H~lfte reduzieren (Ditto-C). Die Flockung-beschaffenheit wechselt mehr oder weniger ie nach der Menge des Antigens ; je geringer die Antigenmenge wird, desto feiner uud gleichzeitig dichter wird

die schwebende oder uiedergeschlagene Agglutinationslnasse, also die makro-skopische Ableswag schwieriger. In vielen Punkten aber (Ablesbarkeit, Bequem-

lichkeit bei der Verdtinnung u. a.) scheint es ratsam zu sein, dass die Ver-

wendung von 0.4 cc Mischung Antigen + Antiserum dieselben zu gleichen Teilen enthalt.

In obigen Versuchen ist die Flockungsweise so eigenartig, dass man mindestens am Vorhandensein unspezifisch reaktionsfahiger Faktoren zweifeln

oder in extremer Weise unsere Agglutination ganz und gar auf die Reaktion von N~hrbodensubstraten zurtickftihren m6chte. Um der L6Sung der auf-~eworfenen Frage n~herzukommen, erscheint es uns zun~chst notwendig, Auf-schluss zu erlangen tiber die Spezifit~t der Reaktion und den Kontrollversuch

mit dem N~hrmedium. Wir haben den Kreuzversuch ausgeftihrt, indem wir uns der Antigene

und Immunsera bedienten, die von den St~mmen des WEIL-, Hebdomadis-A-und -B-Sp. aufgenommen wurden. Es ergab sich ganz und gar spezifisch und eine Unstabilitd~ der Aufschwemmung wurde nie gesehen (Tabelle II).

TABELLE II.

Stamm

WEIL

''

Hebd.-A

Hasami

Hebd.-B

WEIL

,,

,,

Immunserum

Hebdomadis-A

Hasamiyami

Hebdomadis-B

WEIL (D. 1939)

,,

,,

WEIL (D. 1935)

WEIL (D. 1937)

Verdtinnungsgrad des Serums

150 300 600 1200 2400 4800 9600 19200 38400

+

+fF

~+

+Hi

~+

~+

tliF

iflf

Iflf

Iflf

4fl+

Iflf

+Ff

+}}

~+

++

++

++

+ + +

+

Kontrolle

Der zweite Zweifel wurde von uhs dadurch beseitigt, dass das Serum durch Verdtinnung mit der N~hrfltissigkeit anstatt mit Kocbsalzl6sung geprtift

wurde. Es wurden dadurch keine bemerkenswerten Schwankungen des Agglu-tinationswertes hervorgebracht, ausser etwa der st~rkeren Reaktion mit der N~hrfitissigkeit in der ganzen Reihe hindurch. Mit anderen Worten kann

64- T. NAITO und R. CHIN:

man das Antigen der Sp. selbst als Hauptfaktor in dieser Agglutination an-

genommen werden und die darin befindliche organische Beimengung, die unspezifisch wirken kann, ist unbedeutend ; auch in diesem Falle k6nnen wir tiberdies eine Beteiligung der verschiedenen Bestandteile des Ndhrbodens ablehoen.

TABELLE 111.

verdilnnt mit:

NaCl-L6s., (- Antigen

NaCl-L6s., <-NaCl-L6s.

KoRTHOF-M.,~-Antigen

l'LORTHOF-M.,~-1~LoRTHoF-M.

Verdfinnungsgrad des Serums

200 400 800 1600 3200 6400 12800 25600 51200

+ + + +

+ :t

++

t-

++

++

+_

~+

+F}

iflf

1#}

i#f

Iflf

++

++

+

++

Kontrolle

Es bleibt bei diesem Versuch der Eindruck - um es noch einmal zu erw~hnen - als ob die Reaktion u~rter Verwendung vom KoRTHoF-Medium als Verdtinnungsmittel etwa st~rker als die Versuchsreihe von NaCl-Medium sei, obwohl wir die sehr geringftigige Differenz zwischen ihnen in unser Protokoll schwer aufnehmen konnen. . Wesentliche Bedeutung ftir unsere Agglutinationserscheinung kommt diesem Unterschied aber kaum zu, und es hat den Anschein, dass die im KoRTHOF-Medium enthaltene kolloidartige Substanz dabei eine dominirende Rolle spielt. Erwartungsgem~ss konnten wir beim Versuch mit dem Formalin-Antigen die Agglutinabilit~t steigern, worauf

wir noch spater zurtickkommen werden. Auf obigen Ergebnissen fussend, m6chten wir im Folgenden weitere

Studien tiber die praktische Verwendung dieser Reaktion darlegen. Doch ehe wir darauf eingehen, haben wir die Vorbehandlung des Serums zu schil-dern. Bekanntlich besteht der Antikdrper gegen diese Sp.-Arten haupts~chlich

aus Lysin, man muss also stets besouders auf die Inaktivierwag des Serums achten, sonst kann Sp.-Lyse auftreten und die Aggl'dtination w~re immer verf ehl t .

Da die Flockungsmasse unserer Reaktion ziemlich gross ist, so ist die Probeagglutination auch mb~lich. Bei uns fiel dieselbe mit den 50-fach, 100-

fach und 500-fach verdtinnten Immunsera positiv aus, und zwar trat sie schneller und st~rker bei schw~cherer Serumverdtinnung, aber auch bei 500-fach verdtinntem Serum noch nach 5 bzw. 15 Minuten positiv auf. Es ist begreifiich, dass mit anderen Anti-Bakterien-Seren oder mit NaCl-L6s. dies nicht der Fall ist. Ferner bemtihten wir uns auch, die flockenden Partikelchen '

durch Zusatz von Farbstoff oder von kolloida]er Substanz gr6sser, und zwar die Reaktion leichter ablesbar zu machen. In keinem der Versuche wurde eine Vergr6ssung der Agglutinationsmasse gefunden.

Wie schon erwahnt, ist die frische Kultur als Antigen ausgezeichnet gut

verwendbar. Im Bezug auf die Erhaltbarkeit der Antigenitdt des lebenden Autigens ist sie noch leidlich gut benutztbar auch nach 40 Tagen, wenn man

Beitrage zur Kenntnis tiber die Agglutination von Sp. icterohaemorrhagiae. 65

sie in 28'C erhoZt, w~hrend sie schon nach 1 5 Tagen ganz unbenutzbar wird,

wenn man sie im Eisschrank stehen lasst (s. Tabelle IV). Mit Verlauf der Zeit vermindert sich die Zahl der Sp. und nach und nach tritt eine Tendenz zur Spontanagglutination auf. Diese Ausftihrung mit dem lebenden Antigen ist aber doch wegen der gefahrlichen Prozedur nicht immer empfehlenswert.

TABELLE IV.

aufbewahrt im :

Eisschrank nach 9 tag. Bebr. b. 28'C

28'C

5 T.

10 T.

15 T.

10 T.

15 T.

30 T.

40 T.

Verdtinnungsgrad des Serums

400 800 1600 3200 6400 12800 25600 51200 Kontrolle

+ + +

+ ++ + +

+H

++

++

+_ + +

+ +

+

++

++

+ +

++}

+Ff

++

++

{flf

4++

++

+F~

++

+}f

++

++

++

++

+

+ + +

Wir haben daher weiter noc'n die Resistenz der Antigene gegen Warme und Chemikalien untersucht. Die Temperaturen sind die folgenden ; man erh~lt die Ktiltur in 50', 52', 53', 54', 55', 56', 57', 58', 59', 60', 70', 80',

90' und 100'C 30 Minuten bis 2 Stunden lang und anderseits nach 30 Minuten

m 56'C oder 60 C dann 2 Stunden lang m 100 C. In allen Fallen scheinen uns die Sp. aufgel~st und wirkungslos zu werden. Die Sp., die bei niedrigen

Temperaturen gehalten worden sind, verlieren auch ihre Benutzbarkeit als

Antigen nach einigen Tagen. . Die Chemikalien sind : Karbol, Lysol, Aceton, Chloroform, Ather, For-

malin, Sublimat, Essigs~ure usw. Beim Zusatz dieser Chemikalien in ver-schiedenen Mengen verlieren die Antigenlosungen ihre Reaktionsfahigkeit. Die

Resultate sind im Wesentlichen g]eich mit denen der einzelnen Chemikalien

TABELLE V.

Antigen

l~ ' ~::eU) ~ CJS: ;=* Ce:: 'e ,: S~ ge)t~OO~ ~O* ~Q F~dl:~~: ~~

~~ C:lH~:

~. Ohq; O C~~~

'~

Medium ftir Serumverd.

NaCl 0.1~~

0.2~~

10~~

20 ~~

Gelatin-NaC1

,,

Bouillon'NaCl

,,

Kontr. (leb. Sp. mit NaCl)

Verdtinnungsgrad des Serums

200 400 800 1600 3200 ,64co 12800 25600 51200

+ -+ ++

+ ++

+ + ++

+ ++

++

++

+}f

+1+

++

+F

+Ff

++

#+

++

++

+ff

++

+ff

++

++

~++

++

4+f

+ + ++

+ ++

+ + ++

+ ++

+ + ++ f+ {flt ~flf ++ +

Kont･-rolle

66 T. NAITO und R. CmN: bei Zusatz von I o/o . Bemerkenswert ist, dass durch Zusatz einer geringen Menge (0.1-0.3,0/0) von Formalill alle Sp, erst nach 3-4 Tagen getblet werden,

jedoch sich ihre Reaktionsfdhigkeit woch weiter gut erhalten ho~uaen. Dabei

muss man darauf achten, dass das Formalin m6gljchst rein ist, und nach dem

Zusatz die L,6sung einer braunen Flaschen halten, um sie gegen Licht und Luft zu schtitzen.

Um die Reaktion deutlicher zu machen, haben wir zum Reaktionsmedium Gelatin oder Bouillon hinzuftigt ; wie Tabelle V zeigt, sind dadurch die Flockungsmasse etwas grbbser und leichter ablesbar geworden, besonders beim

Zusatz von 0.2~~ Gelatin oder von 20 o/o Bouillon zum Verdii7mwagsmittel.

Zusammenfassung.

(1) Bei Anwendung der Kultur im KoRTHoFSchen N~hrmedium mit Zusatz von h~molysiertem Serum a]s Antigen, kann man die Agglutination der Sp. icterohaemorrhagiae bis zum Endtiter leicht mit dem blossen Auge ablesen.

(2) Bei eigenarti*a starker Agglutination handelt es sich im Wesentlichen

um eine spezifische Reaktion mit dem Spirochatenantigen, und die Beteiligung von organischen Substanzen, die unspezifisch wirken k6nnen, ist ganz unter-geordnet, geschweige denn die der verschiedenen Bestandteile des N~hrbodens.

(3) Die Probeagglutination ist auch bei Benutzung von unserem Antigen ausf tihrbar.

(4) Das zu untersuchende Serum muss immer unbedingt inaktiviert werden.

(5) In Bezug auf die Haltbarkeit dieser Antigens ist dasselbe noch gut

benutzbar auch nach 40 Tagen, wenn man es in 28'C erh~lt, w~hrend es schon nach 15 Tagen ganz unbenutzbar wird, wenn man es im Eisschrank stehen lasst.

(6) Die Resistenz des Antigens gegen Warme und Chemikalien sehr schwach .

(7) Bei Zusatz von 0.1~~ Formalin zur Antigen]6sung kann die Reaktions-

fahigkeit relativ lange Zeit erha]ten werden, und durch Hinzuftigen von 1-2 olo

Gelatine oder 10-20 o/o Bouillon enthaltender Kochs. alzlosung zum Reaktions-

medium scheint die Flockungsmasse etwas gr6sser zu werden.

Literaturangabe.

1) BESSEMANS, A., WITTEBOLLE, P. und DEVAYST, R.: Z. Immun. forschg, Bd. 97, S. 238, 1939. 2) CmN, R. : Tokyo lji Ss., Nr. 3170, S. 221, 1940 ; Nr. 3190, S. 1284, 1940: Nagasaki lgk. Z., Bd. 18, S. 450, 1940. 3) KORTHOF, G. : Zbl.'Bakter. I Orig., Bd. 125, S. 429, 1932. 4) MoRl-SHITA, R.: Okayama lgk. Z., Bd. 51, S. 2594, 1939. 5) NUKADA, G.: Saikin Z., Nr. 511, S. 605, 1938. 6) OBA, S. : Eisei. Densen. Z., Bd. 16, S. 171, 1920. 7) PoT, A. W. : Lancet, I, 1936, S. i290. 8) SCH~FFNER, W. und MOCHTAR, A.: Zbl. Bakter. I Orig., Bd. 101, S. 405, 1927. 9) SMITH, J. and TULI'OCH, J.: Lancet, II, 1937, S. 846. 10) WALCH-SORGDRAGER, B., SCH~FFNER, W. und BOHLANDER, H.: Z. Immun, forschg, Bd. 92, S. 35, 19g8.

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