NAGYHATÉKONYSÁGÚ FOLYADÉKKROMA-NAGYHATÉKONYSÁGÚ FOLYADÉKKROMA-TOGRÁFIA = NAGYNYOMÁSÚ = HPLCTOGRÁFIA = NAGYNYOMÁSÚ = HPLC

Az alkalmazott nagy nyomás (100-1000 bar) lehetővé Az alkalmazott nagy nyomás (100-1000 bar) lehetővé teszi nagyon finom szemcsézetű töltetek (2-10 teszi nagyon finom szemcsézetű töltetek (2-10 μμm)m) használatát, ami jelentősen megnöveli a módszer használatát, ami jelentősen megnöveli a módszer felbontóképességét. felbontóképességét. A hagyományos oszloptechnikánál gyorsabb A hagyományos oszloptechnikánál gyorsabb (kényszer áramlás), pontosabb és folyamatosan (kényszer áramlás), pontosabb és folyamatosan detektálható.detektálható.A gázkromatográfiával szemben hőre érzékeny- és A gázkromatográfiával szemben hőre érzékeny- és nem illó vegyületek esetében is használható. nem illó vegyületek esetében is használható. A mozgófázissal szelektív kölcsönhatások alakulnak A mozgófázissal szelektív kölcsönhatások alakulnak ki. ki.

HPLC FELÉPÍTÉSE

Ő építette meg az első nagynyomású Ő építette meg az első nagynyomású folyadékkromatográfot.folyadékkromatográfot.

Bár a szakirodalmi adatok szerint J. Bár a szakirodalmi adatok szerint J. C. Giddings, Joseph F. K. Huber és C. Giddings, Joseph F. K. Huber és Horváth Csaba egyaránt jelentős Horváth Csaba egyaránt jelentős szerepet vállaltak - egymástól szerepet vállaltak - egymástól függetlenül - a HPLC kifejlesz-függetlenül - a HPLC kifejlesz-tésében és elterjesztésében, a tésében és elterjesztésében, a HPLC HPLC atyjánakatyjának mégis egyértelműen Hor- mégis egyértelműen Hor-váth Csaba professzort ismeri el a váth Csaba professzort ismeri el a szakma, mivel elsőként ő ismerte fel szakma, mivel elsőként ő ismerte fel a HPLC egyedülálló jelentőségét a a HPLC egyedülálló jelentőségét a biokémia, a molekuláris biológia és a biokémia, a molekuláris biológia és a modern bioanalitika területein. A modern bioanalitika területein. A legelismertebb, az RP-HPLC-t meg-legelismertebb, az RP-HPLC-t meg-alapozó elméleti közleményére csak-alapozó elméleti közleményére csak-nem ezer citálást kapott, ez az nem ezer citálást kapott, ez az elvá-elvá-lasztástudomány legtöbbször idézett lasztástudomány legtöbbször idézett munkája. munkája.

Horváth CsabaHorváth Csaba1930-20041930-2004

OLDÓSZEREKOLDÓSZEREK Üveg, vagy műanyag edények.Üveg, vagy műanyag edények. Megfelelő tisztaság (oszlop védelme és a megfelelő Megfelelő tisztaság (oszlop védelme és a megfelelő

detektálás érdekében!).detektálás érdekében!). Gázmentes. Eluensben oldott gázok és főleg az OGázmentes. Eluensben oldott gázok és főleg az O22 eltá- eltá-

volítása. Zavarja a pumpa egyenletes működését és a volítása. Zavarja a pumpa egyenletes működését és a detektorban kis csúcsokat produkál.detektorban kis csúcsokat produkál.

Gázmentesítés megvalósítása:Gázmentesítés megvalósítása: - melegítés;- melegítés; - vákuum alkalmazása;- vákuum alkalmazása; - ultrahangos szonikálás (rázatás);- ultrahangos szonikálás (rázatás); - sparge = He gáz átbuborékoltatása folyamatosan - sparge = He gáz átbuborékoltatása folyamatosan

(oldott gázokat kiűzi).(oldott gázokat kiűzi). Szűrés – üvegszűrő + vákuum alkalmazása.Szűrés – üvegszűrő + vákuum alkalmazása.

SZIVATTYÚKSZIVATTYÚK

Feladatuk: egyenletes, szabályozott folyadékáramlásFeladatuk: egyenletes, szabályozott folyadékáramlás Mechanikus szivattyúk – állandó áramlási sebesség Mechanikus szivattyúk – állandó áramlási sebesség

biztosítása. Két egymással szemben működtetett biztosítása. Két egymással szemben működtetett váltakozó mozgásirányú dugattyús szivattyúk (reciprok váltakozó mozgásirányú dugattyús szivattyúk (reciprok pumpák).pumpák).

Pulzáláscsillapító Pulzáláscsillapító

Pulzáláscsillapító Pulzáláscsillapító

1, tekercs - flexibilis1, tekercs - flexibilis

2, membrán – hexánnal töltve2, membrán – hexánnal töltve

11 22

Szivattyú után nagynyomású szűrő következik (2 Szivattyú után nagynyomású szűrő következik (2 μμm-m-es saválló acél).es saválló acél).

Nyomásmérő (jelzi, ha az oszlop eltömődik, vagy a Nyomásmérő (jelzi, ha az oszlop eltömődik, vagy a szivattyú hibás).szivattyú hibás).

Összekötő csövek: saválló acél, vagy speciális műanyag Összekötő csövek: saválló acél, vagy speciális műanyag 0,2-0,3 mm belső átmérővel. Minél rövidebb utak 0,2-0,3 mm belső átmérővel. Minél rövidebb utak → → kis holttérfogat (keverőedény effektus).kis holttérfogat (keverőedény effektus).

GRADIENSKÉPZŐGRADIENSKÉPZŐ1.1. Izokratikus elúció – változatlan összetételű mozgófázisIzokratikus elúció – változatlan összetételű mozgófázis2.2. Gradiens elúció – az eluens összetételének folyamatos Gradiens elúció – az eluens összetételének folyamatos

(lineáris, exponenciális, vagy parabolikus), vagy ugrás-(lineáris, exponenciális, vagy parabolikus), vagy ugrás-szerű változtatása.szerű változtatása.

Alacsony nyomású keverő – pumpa előtti keverésAlacsony nyomású keverő – pumpa előtti keverés Nagy nyomású keverő – pumpa után, oszlop előtti Nagy nyomású keverő – pumpa után, oszlop előtti

keverés keverés

Mintainjektáló rendszerMintainjektáló rendszer

Injektált mennyiség (analitikai): 5-100 Injektált mennyiség (analitikai): 5-100 μμll Fajtái:Fajtái:

1.1. Injektálószelep - Rheodyne, cserélhető rögzített Injektálószelep - Rheodyne, cserélhető rögzített térfogatú hurkokkal (loop).térfogatú hurkokkal (loop).

2.2. Automata mintaadagolóAutomata mintaadagoló

Programozható mintamennyiség – motorizált Programozható mintamennyiség – motorizált fecskendő.fecskendő.

Automatizált mérés (100 mérés/éjszaka).Automatizált mérés (100 mérés/éjszaka).

Kézi injektálás

Automata mintaadagolóAutomata mintaadagoló

OSZLOPOSZLOP

Anyaga: saválló acél, vagy műanyag.Anyaga: saválló acél, vagy műanyag. 10 – 30 cm hosszú, d = 2-6 mm.10 – 30 cm hosszú, d = 2-6 mm. Analitikai oszlop védelmének érdekében előtét oszlopot Analitikai oszlop védelmének érdekében előtét oszlopot

használunk (védő oszlop = guard column), mely azonos használunk (védő oszlop = guard column), mely azonos töltetű, mint az analitikai oszlop (1-5 cm). töltetű, mint az analitikai oszlop (1-5 cm).

Töltetek szemcsemérete 2-10 Töltetek szemcsemérete 2-10 μμm, nagy fajlagos felület > m, nagy fajlagos felület > 100 m100 m22/g, nagy kapacitás és kellő szilárdság. /g, nagy kapacitás és kellő szilárdság.

Hatékonyan elválasztó oszlopot csak egyenletes kisátmé-Hatékonyan elválasztó oszlopot csak egyenletes kisátmé-rőjű, gömb alakú szemcsékből lehet készíteni.rőjű, gömb alakú szemcsékből lehet készíteni.

Minél kisebb a szemcseméret, annál nagyobb N (nagyobb a Minél kisebb a szemcseméret, annál nagyobb N (nagyobb a fajlagos felület), csökkentésének határt szab a növekvő fajlagos felület), csökkentésének határt szab a növekvő nyomás, amit a megnövekedett oszlopellenállás produkál nyomás, amit a megnövekedett oszlopellenállás produkál (sugárirányú hőmérséklet gradiens). (sugárirányú hőmérséklet gradiens).

van Deemter görbék különböző szemcseméretű van Deemter görbék különböző szemcseméretű állófázisok eseténállófázisok esetén

Áramlási sebesség ml/minÁramlási sebesség ml/min

NORMÁL FÁZISÚ NORMÁL FÁZISÚ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIAFOLYADÉKKROMATOGRÁFIA

Állófázis: poláris, Állófázis: poláris, mechanikailag stabil.mechanikailag stabil.1.1.SzilikagélSzilikagél2.2.Aluminium-oxidAluminium-oxid3.3.Módosított szilikagél.Módosított szilikagél.Porózus anyagok. Porózus anyagok. Szilikagélek átlagos pórusSzilikagélek átlagos pórusátmérője 6-20 nm (pl. 120 átmérője 6-20 nm (pl. 120 ÅÅ),),ez 500-1000-red része a ez 500-1000-red része a szemcseméretnek. szemcseméretnek. Víz dezaktiválja a felületet. Víz dezaktiválja a felületet. Fémszennyezések kerülése.Fémszennyezések kerülése.

Módosítot szilikagél Módosítot szilikagél

Szabad szilanol csoport Szabad szilanol csoport (gyenge sav)(gyenge sav)

Szubsztituált klórszilánnal módosítják. Szubsztituált klórszilánnal módosítják. Felvitt csoportok: fenil, amino, diol, ciano.Felvitt csoportok: fenil, amino, diol, ciano.

Poláris (dipol-dipol, dipol-indukált dipol) kölcsönhatás a Poláris (dipol-dipol, dipol-indukált dipol) kölcsönhatás a vegyületek és az állófázis poláris csoportjai között (-OH, vegyületek és az állófázis poláris csoportjai között (-OH, -NH-NH22, -CN), ami retencióhoz vezet., -CN), ami retencióhoz vezet.

Minél polárisabb egy vegyület, annál tovább tartózkodik Minél polárisabb egy vegyület, annál tovább tartózkodik az állófázisban, annál nagyobb retenciós ideje lesz.az állófázisban, annál nagyobb retenciós ideje lesz.

Módosítot szilikagél Módosítot szilikagél

MozgófázisMozgófázis Apolárisabb, mint az állófázis (lsd. Eluotróp sorok). Apolárisabb, mint az állófázis (lsd. Eluotróp sorok).

Oldószererősség. Minél apolárisabb egy oldószer annál Oldószererősség. Minél apolárisabb egy oldószer annál kisebb az oldószererőssége, vagyis a visszatartás (retenciós kisebb az oldószererőssége, vagyis a visszatartás (retenciós idő) nagy. Általában szénhidrogének alkotják a mozgófá-idő) nagy. Általában szénhidrogének alkotják a mozgófá-zist, ehhez adunk 0,1-20 V/V% poláris oldószert, módosítót zist, ehhez adunk 0,1-20 V/V% poláris oldószert, módosítót (pl. éter, észter, alkohol).(pl. éter, észter, alkohol).

Oszlop nyomásaOszlop nyomásaΔΔpp = = LLμηφμηφ

ddpp22

L = oszlop hosszaL = oszlop hosszaμμ = áramlási sebesség = áramlási sebesség

ηη = viszkozítás = viszkozításφφ = az oszlop porozitására jellemző tag = az oszlop porozitására jellemző tag

ddpp = átlagos szemcseméret = átlagos szemcseméret

ALKALMAZÁSAALKALMAZÁSA

Apoláris, vagy közepesen poláris izomer Apoláris, vagy közepesen poláris izomer vegyületek elválasztása (szénhidrogénekben jól vegyületek elválasztása (szénhidrogénekben jól oldódjanak).oldódjanak).

Sztereoizomerek elválasztása – királis állófázissalSztereoizomerek elválasztása – királis állófázissal Félpreparatív elválasztás – szerkezetazonosításra Félpreparatív elválasztás – szerkezetazonosításra

(hosszabb és nagyobb átmérőjű oszlopok)(hosszabb és nagyobb átmérőjű oszlopok)

FORDÍTOTT FÁZISÚ FORDÍTOTT FÁZISÚ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIAFOLYADÉKKROMATOGRÁFIA

Mozgófázis polárisabb, mint az állófázisMozgófázis polárisabb, mint az állófázis

1)1) Módosított szilikagél Módosított szilikagél

2)2) Szerves polimer alapú állófázisokSzerves polimer alapú állófázisok

3)3) Szén alapú állófázisokSzén alapú állófázisok

C18H37Si

CH3

SiOH

CH3

C18H37

OH

OH

Si

CH3

SiO

CH3

OH

OH

Cl+-HCl

Savas hidrolízis helye

Szabad szilanol csoportSzabad szilanol csoport

Szilikagélt aklilcsoportokat tartalmazó klórszilánnal Szilikagélt aklilcsoportokat tartalmazó klórszilánnal reagáltatjuk (mono-, di- és triklór-szilánnal).reagáltatjuk (mono-, di- és triklór-szilánnal).

Monofunkciós- és bifunkciós (pl. diklór-Monofunkciós- és bifunkciós (pl. diklór-szilánnal) módosításszilánnal) módosítás

monomermonomer

polimerpolimer

A módosítás során a szilanolcsoportok 40-60%-a reagálat-A módosítás során a szilanolcsoportok 40-60%-a reagálat-lan marad.lan marad.

Utóreakció során trimetil-klórszilánnal módosítanak. Utóreakció során trimetil-klórszilánnal módosítanak. Endcapping = utóreakció (e)Endcapping = utóreakció (e)

Használhatóság pH tartománya: 2 (alkil csoportok savas Használhatóság pH tartománya: 2 (alkil csoportok savas hidrolízise) < pH < 8-9 (szilikagél kioldódása).hidrolízise) < pH < 8-9 (szilikagél kioldódása).

Újfajta oszlopok: pH = 10-11Újfajta oszlopok: pH = 10-11 Apoláris (diszperziós) kölcsönhatás a vegyületek és az Apoláris (diszperziós) kölcsönhatás a vegyületek és az

állófázis apoláris csoportjai között (C4, C8, C18), ami állófázis apoláris csoportjai között (C4, C8, C18), ami retencióhoz vezet.retencióhoz vezet.

Minél apolárisabb egy vegyület, annál tovább tartózkodik Minél apolárisabb egy vegyület, annál tovább tartózkodik az állófázisban, annál nagyobb retenciós ideje lesz.az állófázisban, annál nagyobb retenciós ideje lesz.

Oszlophossz Oszlophossz (cm)(cm)

Részecskeméret Részecskeméret ((μμm)m)

TányérszámTányérszám

11 1010 33 11 11111 111

22 1010 55 10 52610 526

33 1515 55 13 63613 636

44 2525 55 15 62515 625

55 2525 1010 10 28010 280

MozgófázisMozgófázis

Poláris, kis viszkozitású, jó UV Poláris, kis viszkozitású, jó UV áteresztőképességű, kevéssé áteresztőképességű, kevéssé illékony és toxikus oldószerek.illékony és toxikus oldószerek.

Víz oldószer erőssége a Víz oldószer erőssége a legkisebb, alkalmazott szerves legkisebb, alkalmazott szerves módosítok, melyek a retenciót módosítok, melyek a retenciót csökkentik: csökkentik: metanol<acetonitril<eta-metanol<acetonitril<eta-nol<tetrahidrofurán.nol<tetrahidrofurán.

Ionizálható minta esetén pH Ionizálható minta esetén pH kontroll kell. Alkalmazott kontroll kell. Alkalmazott pufferek: foszfát/foszforsav, pufferek: foszfát/foszforsav, acetát/ecetsav, acetát/ecetsav, ammónia/ammónium-klorid.ammónia/ammónium-klorid.

OldószerOldószerOldószer erősség Oldószer erősség ((εε) NORMÁL!) NORMÁL!

Viszkozitás (cP)Viszkozitás (cP)UV cut-off UV cut-off

(nm)(nm)

HexánHexán 00 0,330,33 200200

SzéntetrakloridSzéntetraklorid 0,140,14 0,970,97 263263

KloroformKloroform 0,310,31 0,570,57 245245

DiklórmetánDiklórmetán 0,320,32 0,440,44 235235

TetrahidrofuránTetrahidrofurán 0,350,35 0,550,55 215215

Dietil-éterDietil-éter 0,290,29 0,230,23 215215

EtilacetátEtilacetát 0,450,45 0,450,45 260260

DioxánDioxán 0,490,49 1,541,54 215215

AcetonitrilAcetonitril 0,500,50 0,370,37 190190

2-propanol2-propanol 0,630,63 2,32,3 210210

MetanolMetanol 0,730,73 0,600,60 205205

VízVíz >1,00>1,00 11 --

Funkciós csoportok polaritása:Funkciós csoportok polaritása:

C-H < C-O-C < C-N-C < CC-H < C-O-C < C-N-C < CN < C=O < HO-C=O < OHN < C=O < HO-C=O < OH

Izokratikus elválasztásnál a 4 oldószer módszereIzokratikus elválasztásnál a 4 oldószer módszere

Gradiens elucióGradiens elució

A módszer előnyei:A módszer előnyei: Az analízis ideje lecsökken.Az analízis ideje lecsökken. A felbontóképesség javul.A felbontóképesség javul.

Keskenyebb csúcsok.Keskenyebb csúcsok. Nagyobb érzékenység. Nagyobb érzékenység.

Gradiens elucióGradiens elucióIzokratikus elucióIzokratikus elució

Gradiens programozásGradiens programozás

Szerves módosítok hatása fordított fázisú Szerves módosítok hatása fordított fázisú kromatográfiás rendszerekbenkromatográfiás rendszerekben

Termodinamikai leírása az adszorpciós jelenségeknekTermodinamikai leírása az adszorpciós jelenségeknek

VVRR = vizsgált komponens retenciós térfogata = vizsgált komponens retenciós térfogata

VV00 = holt térfogat = holt térfogat

G an. = vizsgált komponens adszorpciós energiájaG an. = vizsgált komponens adszorpciós energiájax = szerves módosító moltörtjex = szerves módosító moltörtjeG el. = eluens adszorpciós energiája (G el. = eluens adszorpciós energiája (~~ oldószererősség)oldószererősség)Ha x nő Ha x nő →V→Vrr csökken csökken

Víz nem vesz részt az adszorpcióban, csak a szerves Víz nem vesz részt az adszorpcióban, csak a szerves módosító. A komponensek és a módosító vetélkednek az módosító. A komponensek és a módosító vetélkednek az adszorpciós helyekért. Kiszorításos modell.adszorpciós helyekért. Kiszorításos modell.

Ret

enci

ós t

érfo

gat

/ ml

Ret

enci

ós t

érfo

gat

/ ml

Acetonitril v/v%-a vízbenAcetonitril v/v%-a vízben

Hidrofób rendszereknél!Hidrofób rendszereknél!

Alkil-benzolok, alkil-fenonok és alkil-parabének Alkil-benzolok, alkil-fenonok és alkil-parabének visszatartás változása a szénatomszám függvényébenvisszatartás változása a szénatomszám függvényében

Szénatom számSzénatom szám

A pH szerepe az elválasztásbanA pH szerepe az elválasztásban

1)1) Semleges vegyületek – nincs pH hatásSemleges vegyületek – nincs pH hatás

Szénhidrogének, aromás szénhidrogének (PAH), Szénhidrogének, aromás szénhidrogének (PAH), halogénezett aromások (PCB), alkoholok, éterek, halogénezett aromások (PCB), alkoholok, éterek, ketonok, aldehidek.ketonok, aldehidek.

2)2) Savak és bázisok – pH változás hatására ionizálodnakSavak és bázisok – pH változás hatására ionizálodnak

3)3) Ionos vegyületek – pH és puffer hatásaIonos vegyületek – pH és puffer hatása

2. és 3. esetben a megoldás:2. és 3. esetben a megoldás:

1)1) pH kontroll pH kontroll → szupresszió, ionos állapot visszaszorítása.→ szupresszió, ionos állapot visszaszorítása.

2)2) IonpárképzésIonpárképzés

3)3) Ioncsere kromatográfiaIoncsere kromatográfia

Savas csoportot tartalmazó szerves vegyületek Savas csoportot tartalmazó szerves vegyületek visszatartás változása a pH függvényébenvisszatartás változása a pH függvényében

RCOOHRCOOH

RCOORCOO--/RCOOH/RCOOH

RCOORCOO--

pKapKa

A pH és módosító hatása savas vegyület A pH és módosító hatása savas vegyület elválasztásáraelválasztására

tailingtailing

Bázikus csoportot tartalmazó szerves vegyületek Bázikus csoportot tartalmazó szerves vegyületek visszatartás változása a pH függvényébenvisszatartás változása a pH függvényében

R-NHR-NH33++

R-NHR-NH33++/R-NH/R-NH22

pKbpKb

R-NHR-NH22

A pH hatása bázikus vegyületek elválasztásáraA pH hatása bázikus vegyületek elválasztására

Bázikus antihisztaminok pH=11 !!!)Bázikus antihisztaminok pH=11 !!!)

Fordított fázisú ionpár-kromatográfiaFordított fázisú ionpár-kromatográfia (RP-IP-HPLC) (RP-IP-HPLC)

A retenció növelése érdekében az eluensbe 1-100 mmol/L A retenció növelése érdekében az eluensbe 1-100 mmol/L ionpárképző, hidrofób iont teszünk (felületaktív anyagok), ionpárképző, hidrofób iont teszünk (felületaktív anyagok), melynek töltése ellentétes a meghatározandó anyagéval.melynek töltése ellentétes a meghatározandó anyagéval.

Anionos ionpárképzőAnionos ionpárképző Kationos ionpárképzőKationos ionpárképző

Alkil-szulfonsavak Alkil-szulfonsavak Tetrabutil-ammónium Tetrabutil-ammónium sók sók

D- és L- kámfor szulfonátD- és L- kámfor szulfonát Cetil-trimetil-ammónium Cetil-trimetil-ammónium sóksók

Alkil-szulfátokAlkil-szulfátok Dodecil-oktil-dimetil-Dodecil-oktil-dimetil-ammónium sókammónium sók

Kationos ionpárképző és az állófázis Kationos ionpárképző és az állófázis elhelyezkedéseelhelyezkedése

C18

ál

lófá

zis

N+ [Molekula ION][Molekula ION]--

Az RP-IP-HPLC-ben fontos paraméterekAz RP-IP-HPLC-ben fontos paraméterek

Ionpárképző koncentrációja (c nő Ionpárképző koncentrációja (c nő → k nő).→ k nő).

Ionpárképző jellege (lánc hossz nő Ionpárképző jellege (lánc hossz nő → k nő, egyenes lánc – → k nő, egyenes lánc – elágazó láncelágazó lánc).).

Szerves módosító típusa és mennyisége.Szerves módosító típusa és mennyisége.

Puffer koncentrációja, pH-ja (ionos állapot biztosítása).Puffer koncentrációja, pH-ja (ionos állapot biztosítása).

Idegen só koncentrációja.Idegen só koncentrációja.

A hőmérséklet hatása az elválasztásraA hőmérséklet hatása az elválasztásra

H = 2 H = 2 λλdp + dp + 22γγDDmm + + 88 k k ddff22 uu uu ππ22 (1+k) (1+k)22 D Dss

DETEKTOROKDETEKTOROK

A detektor feladata a kiáramló eluensben mérni az A detektor feladata a kiáramló eluensben mérni az összetevő pillanatnyi koncentrációját. A közvetlenül mért összetevő pillanatnyi koncentrációját. A közvetlenül mért detektorjel általában nem maga a koncentráció, hanem detektorjel általában nem maga a koncentráció, hanem annak valamilyen függvénye. annak valamilyen függvénye.

Detektor típusokDetektor típusok

Ultraibolya/ látható fény (UV/VIS), LOD: ~ 10Ultraibolya/ látható fény (UV/VIS), LOD: ~ 10-10 -10 g g Fluoreszcenciás, LOD: 10Fluoreszcenciás, LOD: 10-12-12 g g Vezetőképességi , LOD: 10Vezetőképességi , LOD: 10-9-9 g g Törésmutató különbség mérése (RI), LOD: 10Törésmutató különbség mérése (RI), LOD: 10-8-8 g g Fényszórásmérésen alapuló (ELS), LOD: 10Fényszórásmérésen alapuló (ELS), LOD: 10-8-8 g g Tömegszelektív (LC/MS), LOD: 10Tömegszelektív (LC/MS), LOD: 10-15-15

Detektorok tulajdonságaiDetektorok tulajdonságai

Alacsony zajszint és stabil alapvonal (low drift). Alacsony zajszint és stabil alapvonal (low drift). Megfelelő érzékenység. Megfelelő érzékenység. Gyors jelképzés (12 pont/csúcs). Gyors jelképzés (12 pont/csúcs). Széles linearitási tartomány. Széles linearitási tartomány. Alacsony holttérfogat (csúcsszélesedés Alacsony holttérfogat (csúcsszélesedés

minimalizálása). minimalizálása). Könnyen kezelhető és megbízható. Könnyen kezelhető és megbízható. Működési körülmények optimalizálhatósága. Működési körülmények optimalizálhatósága.

Az elektronpályák relatív energiái és az Az elektronpályák relatív energiái és az elektrongerjesztések típusaielektrongerjesztések típusai

Spektrofotometriás detektorokSpektrofotometriás detektorok

Ezek az eluátum fényelnyelését mérik. Az ultraibolya, eset-Ezek az eluátum fényelnyelését mérik. Az ultraibolya, eset-leg az ultraibolya és a látható fény tartományban működnek. leg az ultraibolya és a látható fény tartományban működnek.

Lambert- Beer törvény:Lambert- Beer törvény:A = lg (IA = lg (Ioo/I) = /I) = εε×c×l×c×l

Io = a megvilágító fény intenzításaIo = a megvilágító fény intenzításaI = fényintenzítás az abszorpció utánI = fényintenzítás az abszorpció utánc = koncentrációc = koncentrációεε = abszorpciós együttható = abszorpciós együtthatól = optikai úthosszl = optikai úthossz

Spektrofotometriás detektorok típusaiSpektrofotometriás detektorok típusai

1, Higanygőzlámpa, 254 nm, monokromatikus 1, Higanygőzlámpa, 254 nm, monokromatikus fény, (aromás rendszerek).fény, (aromás rendszerek).

Átfolyó cella UV/VIS detektálásnálÁtfolyó cella UV/VIS detektálásnál

Funkciós csoportok moláris abszorbciós koefficiense Funkciós csoportok moláris abszorbciós koefficiense

NévNévKromofor Kromofor

csoportcsoportHullámhossz Hullámhossz

[nm][nm] ee

AldehidAldehid -CHO-CHO 210210 1,5001,500

AminAmin -NH-NH22 195195 2,8002,800

AzoAzo -N=N--N=N- 285-400285-400 3-253-25

BromidBromid -Br-Br 208208 300300

KarboxilKarboxil -COOH-COOH 200-210200-210 50 - 7050 - 70

DiszulfidDiszulfid -S-S--S-S- 194194 5,5005,500

ÉszterÉszter -COOR-COOR 205205 5050

ÉterÉter -O--O- 185185 1,0001,000

KetonKeton >C=O>C=O 195195 1,0001,000

NitrátNitrát -ONO-ONO22 270270 1212

NitrilNitril -C=N-C=N 160160 --

NitritNitrit -ONO-ONO 220 - 230220 - 230 1000-20001000-2000

nitronitro -NO-NO22 210210 15001500

Több csatornásTöbb csatornása, diszperziós – diszperziós ráccsal mono-kromatikus fény a, diszperziós – diszperziós ráccsal mono-kromatikus fény előállítása a cella előtt.előállítása a cella előtt.

benzol

b, diódasoros (PDA) – széleskörben elterjedt.b, diódasoros (PDA) – széleskörben elterjedt.A diódasoros detektorok lehetővé teszik a teljes A diódasoros detektorok lehetővé teszik a teljes

spektrum felvételét igen gyors egymásutánban. spektrum felvételét igen gyors egymásutánban. Ezekben a küvettát polikromatikus fénnyel világítják Ezekben a küvettát polikromatikus fénnyel világítják át és a felbontás a küvetta után történik. A szétterült át és a felbontás a küvetta után történik. A szétterült fénnyalábot egy (fotó)-diódasorra vetítik. fénnyalábot egy (fotó)-diódasorra vetítik.

A 200 nm széles analitikai UV tartomány befogadásához A 200 nm széles analitikai UV tartomány befogadásához 100-200 diódából álló sor szükséges (felbontás 1-2 100-200 diódából álló sor szükséges (felbontás 1-2 nm). nm).

A diódasoros detektor segít a csúcsok azonosításában és A diódasoros detektor segít a csúcsok azonosításában és tisztaságuk ellenőrzésében, mert koelució esetén a tisztaságuk ellenőrzésében, mert koelució esetén a csúcs lefutása közben a spektrum alakja változik, míg csúcs lefutása közben a spektrum alakja változik, míg egyetlen anyag csúcsa esetén a spektrum alakja egyetlen anyag csúcsa esetén a spektrum alakja állandó, csak a magassága változik. állandó, csak a magassága változik.

PDA detektorPDA detektor

Deutérium lámpaDeutérium lámpatükörtükör

erősítőerősítő

fotódiódasorfotódiódasor

Optikai rácsOptikai rács

Átfolyó cellaÁtfolyó cella

A és B vegyületek UV spektruma és két eltérő hullámhosszon A és B vegyületek UV spektruma és két eltérő hullámhosszon felvett kromatogramja.felvett kromatogramja.

AAλλ11 = = állandó viszonyszámállandó viszonyszámAAλλ22

Csúcstisztaság jellemzése.Csúcstisztaság jellemzése.

A klórtalidon gyógyszer tisztaság vizsgálataA klórtalidon gyógyszer tisztaság vizsgálata

5 % terc-butil-benzol szennyezés kimutatása 5 % terc-butil-benzol szennyezés kimutatása antracénbanantracénban

A 250/A 255A 250/A 255 antracénantracén

Csúcstisztaság vizsgálat PDA detektorralCsúcstisztaság vizsgálat PDA detektorral

aa bb

Fluoreszcenciás detektorFluoreszcenciás detektor

Szelektív, mert a szokványos szerves vegyületek Szelektív, mert a szokványos szerves vegyületek közül viszonylag kevés mutat számottevő közül viszonylag kevés mutat számottevő fluoreszcenciát.fluoreszcenciát.

Kettős „hangolás” : változtatni lehet a besugárzó Kettős „hangolás” : változtatni lehet a besugárzó fény (UV tartományban) - és a kisugárzott, fény (UV tartományban) - és a kisugárzott, fluoreszcens, fény hullámhosszát (UV/látható fluoreszcens, fény hullámhosszát (UV/látható tartományban).tartományban).

Gerjesztési spektrum (excitation)Gerjesztési spektrum (excitation)

Emissziós spektrum (emission) nyerhető.Emissziós spektrum (emission) nyerhető.

Az átfolyó küvettát itt is egy szűk Az átfolyó küvettát itt is egy szűk fénynyalábbal világítják meg és a beeső fénynyalábbal világítják meg és a beeső fényre merőleges irányból történik a fényre merőleges irányból történik a detektálás. A detektált fény intenzitása a detektálás. A detektált fény intenzitása a fluoreszkáló komponens koncentrációjá-fluoreszkáló komponens koncentrációjá-val egyenesen arányos. Ez a detektor val egyenesen arányos. Ez a detektor nagyságrendekkel kisebb koncentrációk nagyságrendekkel kisebb koncentrációk mérésére alkalmas, mint az UV detektor mérésére alkalmas, mint az UV detektor (10(10-12-12g/anyag). g/anyag).

Gerjesztési hullámhosszGerjesztési hullámhossz

3D fluoreszcenciás spektruma a Balti tengeri kőolajnak3D fluoreszcenciás spektruma a Balti tengeri kőolajnak

Fluoreszcenciás detektor felépítéseFluoreszcenciás detektor felépítése

AlKALMAZÁSAlKALMAZÁS Természetesen fluoreszkáló vegyületek (merev szerkezetű Természetesen fluoreszkáló vegyületek (merev szerkezetű

aromás vegyületek, porfin vázas vegyületek, riboflavinok, aromás vegyületek, porfin vázas vegyületek, riboflavinok, vitaminok, gyógyszerek).vitaminok, gyógyszerek).

Származékkészítési reakciók alkalmazása fluoreszkáló Származékkészítési reakciók alkalmazása fluoreszkáló vegyületek előállítására (OPA + tiol, FMOC, vegyületek előállítására (OPA + tiol, FMOC, Fluoreszkamin, stb.).Fluoreszkamin, stb.).

OPA + tiolOPA + tiol

FMOCFMOC

Idő (s)Idő (s)         λex      λem

                 0            280 nm          340 nm

             220            290 nm          320 nm

             340            250 nm          385 nm

             510            260 nm          420 nm

             720            265 nm          380 nm

           1050            290 nm          430 nm

Vezetőképességi detektorVezetőképességi detektor

Elektromos vezetést mérő (konduktometriás) de-Elektromos vezetést mérő (konduktometriás) de-tektor.tektor.

HPLC detektálásra elsősorban az ionkromatog-HPLC detektálásra elsősorban az ionkromatog-ráfiában jön szóba. ráfiában jön szóba.

Konduktometriásan jól lehet mérni az eluátum-Konduktometriásan jól lehet mérni az eluátum-ban, mert könnyű kis térfogatú mérőcellát építeni, ban, mert könnyű kis térfogatú mérőcellát építeni, a műszer egyszerű, a jel a mérendő koncentráci-a műszer egyszerű, a jel a mérendő koncentráci-óval egyenesen arányos és a detektor csak az ionos óval egyenesen arányos és a detektor csak az ionos összetevőket méri. összetevőket méri.

Refraktív index (törésmutató)Refraktív index (törésmutató) detektordetektor

o Univerzális detektor, de csak akkor alkalmazható, Univerzális detektor, de csak akkor alkalmazható, ha az elválasztott komponensek törésmutatója ha az elválasztott komponensek törésmutatója eltér az eluens törésmutatójától.eltér az eluens törésmutatójától.

o Gradiens elúcióval nem kompatibilis (0,1% eluens Gradiens elúcióval nem kompatibilis (0,1% eluens összetétel változás már a törésmutató változását összetétel változás már a törésmutató változását idézheti elő).idézheti elő).

o Hőmérséklet változás (0,001Hőmérséklet változás (0,001C –ra termosztáljuk).C –ra termosztáljuk).o Pumpa pulzálás kontroll.Pumpa pulzálás kontroll.

Fényszórás detektFényszórás detektoorrELS ELS (evaporative light scattering detector)(evaporative light scattering detector)

1.1. Porlasztás: Nitrogén gáz segítségével az oszlopot Porlasztás: Nitrogén gáz segítségével az oszlopot elhagyó eluenst elporlasztjuk.elhagyó eluenst elporlasztjuk.

2.2. Mozgó fázis elpárologtatása: Egy fűtött csőben Mozgó fázis elpárologtatása: Egy fűtött csőben áramoltatjuk át, ahol az oldószer elpárolog.áramoltatjuk át, ahol az oldószer elpárolog.

3.3. Detektálás: A száraz minta részecskéket lézer Detektálás: A száraz minta részecskéket lézer fénnyel világítjuk meg egy átfolyó cellában. A fénnyel világítjuk meg egy átfolyó cellában. A részecskék által szórt fényt detektáljuk. A detektált részecskék által szórt fényt detektáljuk. A detektált fény arányos a részecskék számával fény arányos a részecskék számával (koncentrációjával).(koncentrációjával).

Univerzális, tömeg detektor.Univerzális, tömeg detektor.

ELS detektor alkalmazásaELS detektor alkalmazása

-LipidekLipidek- zsírsavakzsírsavak- cukrokcukrok- tenzidektenzidek- polimerekpolimerek- aminosavak aminosavak

Az ACQUITY UPLC oszlopok Bridged Az ACQUITY UPLC oszlopok Bridged Ethyl Hybrid (BEH) tölteteEthyl Hybrid (BEH) töltete

Fájdalomcsillapítók gyors elválasztása Fájdalomcsillapítók gyors elválasztása Oszlop: ACQUITY UPLC BEH 2,1x50 mm, 1,7 µm, 1ml/min Oszlop: ACQUITY UPLC BEH 2,1x50 mm, 1,7 µm, 1ml/min

Komponensek: 1. acetaminofen, 2. 2-acetamidofenol, 3. koffein, Komponensek: 1. acetaminofen, 2. 2-acetamidofenol, 3. koffein, 4. acetanilid, 5. acetil-szalicilsav, 6. szalicilsav, 7. fenacetin4. acetanilid, 5. acetil-szalicilsav, 6. szalicilsav, 7. fenacetin