ALATI ZA VALIDACIJU

SLIJEPE

PROBE

Koriste se razliite vrste slijepih proba kako bi se procijenilo koliko je mjerni signal povezan s analitom a koliko s drugim uzorcima

SLIJEPE

REAGENSA

Probe, analiziraju se posebno reagensi da se utvrdi da li doprinose mjernom signalu, kako bi se mogao korigirati

SLIJEPE

PROBE UZORAKA

je matriks tvar uzorka ali bez onoga to odreujemo (analita) takove materijale je teko dobiti, ali su korisni da se dobije realna procjena interferencija u analizi uzorka.

OBOGAENI

MATERIJALI / OTOPINE

To su materijali ili otopine koji su obogaeni s analitom od interesa. Oni ve mogu sadravati analit. Dio analita dodan test uzorku prije analize, obogaeni i neobogaeni uzorci, %R se rauna:

%R = {(CF CU) / CA} x 100gdje je: CF konc. analita u obogaenom uzorku (ili uzorku u kojem je dodan) CA je dodana konc. analita (izmjerena vrijednost, ne odreena metodom)

REFERENTNI MATERIJAL Materijal ili supstanca poznatih svojstava tako da se koriste za kalibraciju aparatura, ocjenu mjerne metode ili za odreivanje vrijednosti materijala Termin opisuje materijale koji se esto zovu i mjerni standardi, tj. kemijske tvari koritene u svrhu kalibracije i identifikacije Svojstvo ili analit od interesa mora biti stabilan i homogen, materijal ne mora imati visok stupanj karakterizacije, sljedivost i certifikat to je svojstveno certificiranim referentnim materijalima.

Certificirani

referentni materijal je referentni materijal popraen certifikatom ije jedno ili vie svojstava su izraeni vrijednostima za koje dana mjerna nesigurnost i sljedivost karakterizacija je obavljena s vie razliitih metoda, to reducira ili eliminira pogreke

METODE / TEHNIKE KARAKTERIZACIJE

Kako odrediti karakteristike metode? Koja metoda e se upotrijebiti u postupku validacije i koliko e ona biti opsena ovisi o samoj uporabi metode U literaturi se spominje najee 5 metoda karakterizacije

1.

Sustavni pregled utjecajnih veliina na ispitni rezultatUmjeravanje / kalibracija s dodatnim ispitivanjem uinka utjecajnih veliina Usporedba rezultata ispitivane metode s rezultatima drugih ispitnih metoda Usporedbena / kolaborativna ispitivanja izmeu vie laboratorija Procjene nesigurnosti rezultata koji se temelje na znanstvenom razumijevanju teorijskih naela metode i praktinog iskustva te kombinacija gore navedenih postupaka

2.

3.

4.

5.

Podaci dobiveni karakterizacijom ispitne metode statistiki se obrauju prema ISO uputi za iskazivanje mjerne nesigurnosti Procjene nesigurnosti rezultata se dijele u dvije vrste:1.

Procjena nesigurnosti vrste A na temelju statistike obrade niza opaanja Procjena nesigurnosti vrste B ne temelji se na statistikoj obradi niza opaanja

2.

Tradicionalno

metoda se validira ocjenjivanjem provedbenih znaajki metode, dok noviji pristup zahtjeva iskazivanje mjerne nesigurnosti

1. SUSTAVNI PREGLED UTJECAJNIH VELIINA NA ISPITNI REZULTAT

Kvantificira se uinak utjecajnih veliina ili drugih imbenika na rezultat tako da se oni sustavno mijenjaju pri primjeni ispitne metode imbenici koji utjeu na ispitni rezultat su: Temperatura, tlak zraka, vlanost i oneienje zraka, oneienje uzoraka

prikladan je u sluajevima kada ne postoje pouzdane reference (u kemiji ili kod metoda koje se temelje na dogovoru) vrlo je primjenjiv, ali dobivene vrijednosti ne sadre podatke o tonosti ispitnog rezultata rezultat je rasprenje ispitnog rezultata koje je karakteristika ispitne metode

2.

UMJERAVANJE / KALIBRACIJA S DODATNIM ISPITIVANJEM UINKA UTJECAJNIH VELIINA

Metoda vrlo slina prethodnoj (sustavni pregled utjecajnih veliina na ispitni rezultat) Rezultat se usporeuje s referentnom vrijednou dobivenom pomou referencijske tvari ili etalona

3.

USPOREDBA REZULTATA ISPITIVANE METODE S REZULTATIMA DRUGIH METODA

ovom se metodom karakterizacije ispitni rezultati metode koja se ocjenjuje usporeuju s rezultatima jedne ili vie neovisnih ispitnih metoda (referencijske metode) upotrebom istog ili istovjetnog ispitnog uzorka Primjenjuje se: kad nema na raspolaganju odgovarajuih etalona ako je sustavni pregled utjecajnih veliina na ispitni rezultat skup i dugotrajan kod novorazvijenih ispitnih metoda, nesigurnost ispitnih rezultata ovisi o nesigurnosti referencijske metode

4.

USPOREDBENA ISPITIVANJA IZMEU VIE LABORATORIJA

Nazivaju se jo KOLABORATIVNE STUDIJE ILI MEULABORATORIJSKE USPOREDBE Dobiveni rezultati statistiki se obrauju i na taj nain dobije rasprenje rezultata Sudjeluju samo osposobljeni laboratoriji Skupe su, moraju biti dobro isplanirane i struno voene Mogu se koristiti za ispitivanje osposobljenosti laboratorija i za karakterizaciju svojstava materijala Dobivaju se podaci o reproducibilnosti metode, o tonosti rezultata se ne saznaje nita

U literaturi je dostupno puno podataka o metodi validacije pomou kolaborativnih studija i normiranih postupaka za validaciju Validacija metode pomou kolaborativnog ispitivanja mora prethoditi validacija unutar laboratorija koji razvija ili modificira analitike metode Kolaborativna studija nije uvijek pogodna opcija za industrijske laboratorije (primjena neke metode moe biti samo interes jednog laboratorija)

MOGU LI LABORATORIJI VALIDIRATI METODE SAMOSTALNO, UNUTAR SAMOG LABORATORIJA I KAKO? Radei samostalno neminovno se reducira koliina podataka koji se mogu dobiti Neminovno se smanjuje vrsta informacija vezana za interlaboratorijsku kompatibilnost (nije neophodno!) Ako je neophodno, moe se analizirati referentni materijal i svoje rezultate usporediti s rezultatima drugih laboratorija ili metodom za koju je validacija provedena

HOE LI TAKO VALIDIRANE METODE BITI PRIZNATE OD DRUGIH LABORATORIJA? AOAC International je uvijek samo podupirao kolaborativne studije ali nedavno su izdali program za validaciju u laboratorijima koji rade samo s jednim ili dva druga laboratorija EU

5.

SUSTAVNA PROCJENA NESIGURNOSTI REZULTATA

Ispitna procedura se dijeli na znaajne korake (module) kao npr. uzorkovanje, priprema uzoraka, mjerenje itd. Procjenjuje se nesigurnost koju oni unose u konani rezultat Procjena nesigurnosti se temelji na teorijskom poznavanju ispitne metode te praktinom iskustvu na toj ili slinoj ispitnoj metodi Korist se pri potrebi brze ocjene metode i u pravilu ne zamjenjuje pravu karakterizaciju

Koju tehniku validacije upotrijebiti? Koliko opsena mora biti? OVISI O METODI, NJENOJ UPORABI, MOGUNOSTIMA, RIZIKU !!!!! Za analizu hrane i lijekova propisana je uporaba potpuno validiranih metoda

Laboratorij koji koristi metodu duan je osigurati da je adekvatno validirana Kad god je mogue koristiti metode validirane u kolaborativnim studijama provedenim prema u skladu s meunarodnim standardom / protokolom

Ako je metoda validirana od odgovarajue organizacije (npr. AOAC) korisnik e morati samo potvrditi da li metoda zadovoljava njihove potrebe Odreeni stupanj validacije uvijek je primjeren ak i kada se koriste jasne dobro karakterizirane standardne ili publicirane metode

Kada se metode moraju validirati? Kada je razvijena nova metoda Kada je postojea metoda poboljana ili kada se proiruje njena primjena Kada kontrola kvalitete ukazuje da je s vremenom dolo do promjene postojee metode Kada se postojea metoda koristi u razliitim laboratorijima, od razliitih analitiara, na razliitim instrumentima (djelomina validacija) Da demonstrira ekvivalentnost dviju metoda, npr. nove i standardne metode

METODE ODREIVANJA PREHRAMBENIH VLAKANA

Prehrambena vlakna (PV) su heterogena skupina spojeva razliitog fiziolokog djelovanja, znanstvenici se jo nisu usaglasili koje sve komponente treba ubrojiti u PV

Neke od definicija su:

PV su: jestivi dijelovi biljaka ili odgovarajui ugljikohidrati, Rezistentni na digestiju i apsorpciju u tankom crijevu s kompletnom ili djelominom fermentacijom u debelom crijevu Ukljuuju polisaharide, oligosaharide, lignin i sline biljne supstance Promoviraju povoljne fizioloke efekte ukljuujui laksaciju i /ili smanjenje kolesterola i glukoze u krvi

PV

su:

Oligosaharidi, polisaharidi i hidrofilni derivati ljudski probavni enzimi ih ne mogu razgraditi do apsorpcijskih komponenata u gornjem probavnom traktu, a to ukljuuje i lignin koji nije ugljikohidrat

PV su: Biljni nekrobni polisaharidi (celuloza, pektin, gume, hemiceluloza, glukani) Biljni ugljikohidrati koji se ne dobivaju taloenjem s alkoholom, lignin i rezstentni krob Nedigestibilni mono i disaharidi te eerni alkoholi ne smatraju se vlaknima

Prve

metode odreivale su tzv. sirova vlakna, a istovremeno sa spoznajom o znaenju pojedinih komponenata u prehrani razvijale su se i metode

Danas

se zasnivaju na:

1. na simulaciji probave

- odreuju se komponente biljnih staninih stjenki koje ne mogu probaviti enzimi ljudskog probavnog trakta- to su nekrobni polisaharidi s rezistentnim krobom i ligninom

2. Separacija ili mjerenje nekrobnih polisaharida - predstavljaju glavni dio biljne stanine stjenke

KEMIJSKO - GRAVIMETRIJSKE METODE

Koriste razliita sredstva za digestiju uzorka Ostatak predstavlja vlakna koja se peru, sue i vau

Najstarija je WENDE METODA: Uzorak se kuha 30 minuta s razrijeenom kiselinom (1,25% H2SO4) Ostatak se ispire Zatim se kuha s razrijeenom luinom (1,25% KOH) Slijedi filtracija, ispiranje, suenje i vaganje Ovom metodom se moe odrediti: - 20% hemiceluloze, - 10 40% lignina - 50 90% celuloze

METODA PO KRSCHNER HANACKU za digestiju koristi smjesu duine i octene kiseline METODA PO SCHARRER - KRSCHNER jo i trikloroctenu kiselinu Duina kiselina oksidira i nitrira sve osim celuloze a trikloroctena kiselina pomae razaranje lignina Oksidacioni produkti se otapaju u octenoj kiselini U dobivenim sirovim vlaknima nalazi se mala koliina mineralnih, u kiselinama netopivih tvari (SiO2) pa je potrebno i njih odrediti spaljivanjem, a sadraj mineralnih tvari odbije se od koliine sirovih vlakana

Da bi se izbjegli nedostaci Wende metoda razvijene su razliite modifikacije u kojima se kiselina i baza zamijenjene detergentima Koriste se detergenti poput CTAB (cetil trimetil amonij bromid) SLS (natrij lauril sulfat), oba u kiselim otopinama (kisela detergent vlakna KDV) Kasnije i u neutralnim otopinama (neutralna detergent vlakna NDV) Dobivaju se dobri rezultatai, ali s gubicima vlakana, posebno hemiceluloze

Metodom KDV (cetil trimetil amonij bromid u kiseloj otopini 0,5M H2SO4) mogue je odrediti: celulozu i lignin,

Metodom NDV (natrijdodecil sulfat u neutralnoj otopini) moe se odrediti: - celulozu, lignin i vei dio hemiceluloza - Gube se topljiva vlakna pektini gume, sluzi i neke hemiceluloze

Ako

uzorak sadri veu koliinu kroba (krumpir i brano) upotrebom samo neutralne otopine detergenta nije mogue ukloniti sav krob je modificirao metodu, te uveo korak hidrolize kroba amilazom, pa se ova metoda naziva enzimski NDV postupak

Schaller

ENZIMSKO GRAVIMETRIJSKE METODE

Razvijaju se kako bi obuhvatile spojeve koji imaju fizioloko djelovanje Uzorak se radi razgradnje bjelanevina i kroba tretira kombinacijom enzima ( amilaza, proteaza i amiloglukozidaza izvorna AOAC metoda) Slijedi taloenje 95%-tnim etanolom i filtracija Vri se korekcija rezultata za bjelanevine i pepeo Rezultat su ukupna prehrambena vlakna