n-end rule

8/14/2019 N-end rule

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P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USAV o l . 9 3 , p p . 1 2 1 4 2 - 1 2 1 4 9 , O c t o b e r 1 9 9 6B i o c h e m i s t r y

T h i s c o n t r i b u t i o n i s p a r t o f t h e s p e c i a l s e r i e s o f I n a u g u r a l A r t i c l e s b y m e m b e r s o f t h e N a t i o n a l A c a d e m y o f S c i e n c e se l e c t e d o n A p r i l 2 5 , 1 9 9 5 .

The N-end r u l e : F u n c t i o n s , m y s t e r i e s , u s e s( u b i q u i t i n / p r o t e o l y s i s / N - d e g r o n / p e p t i d e i m p o r t / a p o p t o s i s )

ALEXANDER V A R S H A V S K Y *D i v i s i o n o f B i o l o g y , C a l i f o r n i a I n s t i t u t e o f T e c h n o l o g y , P a s a d e n a , CA 9 1 1 2 5

C o n t r i b u t e d b y A l e x a n d e r V a r s h a v s k y , A u g u s t 6 , 1 9 9 6

ABSTRACT T h e N - e n d r u l e r e l a t e s t h e i n v i v o h a l f - l i f e o fa p r o t e i n t o t h e i d e n t i t y o f i t s N - t e r m i n a l r e s i d u e . S i m i l a r b u td i s t i n c t v e r s i o n s o f t h e N - e n d r u l e o p e r a t e i n a l l o r g a n i s m se x a m i n e d , f r o m mammals t o f u n g i a n d b a c t e r i a . I n e u -k a r y o t e s , t h e N - e n d r u l e p a t h w a y i s a p a r t o f t h e u b i q u i t i ns y s t e m . I d i s c u s s t h e m e c h a n i s m s a n d f u n c t i o n s o f t h i sp a t h w a y , a n d c o n s i d e r i t s a p p l i c a t i o n s .

T h e h a l f - l i v e s o f p r o t e i n s i n a l i v i n g c e l l r a n g e f r o m a f e w s e c o n d st o m a n y d a y s . Among t h e f u n c t i o n s o f i n t r a c e l l u l a r p r o t e o l y s i s a r e

t h e e l i m i n a t i o n o f a b n o r m a l p r o t e i n s , t h e m a i n t e n a n c e o f a m i n oa c i d p o o l s i n c e l l s a f f e c t e d b y s t r e s s e s s u c h a s s t a r v a t i o n , a n d t h eg e n e r a t i o n o f p r o t e i n f r a g m e n t s t h a t a c t a s h o r m o n e s , a n t i g e n s ,o r o t h e r e f f e c t o r s . Y e t a n o t h e r f u n c t i o n o f p r o t e o l y t i c p a t h w a y si s s e l e c t i v e d e s t r u c t i o n o f p r o t e i n s w h o s e c o n c e n t r a t i o n s m u s tv a r y w it h t i m e a n d a l t e r a t i o n s i n t h e s t a t e o f a c e l l . M e t a b o l i ci n s t a b i l i t y i s a p r o p e r t y o f m a n y r e g u l a t o r y p r o t e i n s . A s h o r t i nv i v o h a l f - l i f e t o f a r e g u l a t o r p r o v i d e s a w a y t o g e n e r a t e i t s s p a t i a lg r a d i e n t s a n d a l l o w s f o r r a p i d a d j u s t m e n t s o f i t s c o n c e n t r a t i o n ( o rs u b u n i t c o m p o s i t i o n ) t h r o u g h c h a n g e s i n t h e r a t e o f i t s s y n t h e s i s .C o n d i t i o n a l l y u n s t a b l e p r o t e i n s , l o n g - l i v e d o r s h o r t - l i v e d d e p e n d -i n g o n t h e s t a t e o f a c e l l , a r e o f t e n d e p l o y e d a s c o m p o n e n t s o fc o n t r o l c i r c u i t s . One e x a m p l e i s c y c l i n s - a f a m i l y o f p r o t e i n sw h o s e d e s t r u c t i o n a t s p e c i f i c s t a g e s o f t h e c e l l c y c l e r e g u l a t e s c e l ld i v i s i o n a n d g r o w t h ( 3 ) . I n a d d i t i o n , m a n y p r o t e i n s a r e l o n g - l i v e da s c o m p o n e n t s o f l a r g e r c o m p l e x e s s u c h a s r i b o s o m e s a n d

o l i g o m e r i c p r o t e i n s b u t a r e m e t a b o l i c a l l y u n s t a b l e a s f r e e s u b -u n i t s .

F e a t u r e s o f p r o t e i n s t h a t c o n f e r m e t a b o l i c i n s t a b i l i t y a r e

c a l l e d d e g r a d a t i o n s i g n a l s , o r d e g r o n s ( 4 ) . T h e e s s e n t i a l c o m -p o n e n t o f o n e d e g r a d a t i o n s i g n a l , t h e f i r s t t o b e d i s c o v e r e d , i sa d e s t a b i l i z i n g N - t e r m i n a l r e s i d u e o f a p r o t e i n ( 5 - 7 ) . T h i ss i g n a l i s c a l l e d t h e N - d e g r o n . A s e t o f N - d e g r o n s c o n t a i n i n gd i f f e r e n t d e s t a b i l i z i n g r e s i d u e s y i e l d s a r u l e , t e r m e d t h e N - e n dr u l e , w h i c h r e l a t e s t h e i n v i v o h a l f - l i f e o f a p r o t e i n t o t h ei d e n t i t y o f i t s N - t e r m i n a l r e s i d u e ( T a b l e 1 a n d F i g . 1 ) . T h eN - e n d r u l e p a t h w a y i s p r e s e n t i n a l l o r g a n i s m s e x a m i n e d ,i n c l u d i n g t h e b a c t e r i u m E . c o l i ( 8 , 1 0 ) , t h e y e a s t ( f u n g u s ) S .c e r e v i s i a e ( 5 , 9 ) , a n d m a m m a l i a n c e l l s ( 1 , 1 1 ) ( F i g . 1 ) .

T h e N - e n d r u l e w a s e n co u n t e r e d i n e x p e r i m e n t s t h a t e x -p l o r e d t h e m e t a b o l i c f a t e o f a f u s i o n b e t w e e n u b i q u i t i n ( U b )a n d a r e p o r t e r p r o t e i n s u c h a s E . c o l i , B - g a l a c t o s i d a s e ( I 3 g a l ) i nS . c e r e v i s i a e ( 5 ) . I n y e a s t a n d o t h e r e u k a r y o t e s , U b - X - f 3 g a l i sc l e a v e d , c o t r a n s l a t i o n a l l y o r n e a r l y s o , b y U b - s p e c i f i c p r o c e s s -i n g p r o t e a s e s a t t h e U b - , 3 g a l j u n c t i o n . T h i s c l e a v a g e t a k e sp l a c e r e g a r d l e s s o f t h e i d e n t i t y o f t h e r e s i d u e X a t t h eC - t e r m i n a l s i d e o f t h e c l e a v a g e s i t e , p r o l i n e b e i n g t h e s i n g l ee x c e p t i o n . B y a l l o w i n g a b y p a s s o f t h e n o r m a l N - t e r m i n a lp r o c e s s i n g o f a n e w l y f o r m e d p r o t e i n , t h i s f i n d i n g ( F i g . 2 A )y i e l d e d a n i n v i v o m e t h o d f o r g e n e r a t i n g d i f f e r e n t r e s i d u e s a tt h e N t er m i n i o f o t h e r w i s e i d e n t i c a l p r o t e i n s - a t e c h n i c a la d v a n c e t h a t l e d t o t h e N - e n d r u l e ( 5 , 6 ) .

I n e u k a r y o t e s , t h e N - d e g r o n c o m p r i s e s a t l e a s t t w o d e t e r m i -n a n t s : a d e s t a b i l i z i n g N - t e r m i n a l r e s i d u e a n d a n i n t e r n a l l y s i n e ( o rl y s i n e s ) o f a s u b s t r a t e ( F i g . 2 B ) ( 9 , 1 2 , 1 4 , 1 5 ) . T h e L y s r e s i d u e i st h e s i t e o f f o r m a t i o n o f a m u l t i - U b c h a i n ( 1 6 , 1 7 ) . Ub i s a

7 6 - r e s i d u e p r o t e i n w h o s e c o v a l e n t c o n j u g a t i o n t o o t h e r p r o t e i n s

i s i n v o l v e d i n a m u l t i t u d e o f p r o c e s s e s - c e l l g r o w t h a n d d i f f e r -e n t i a t i o n , s i g n a l t r a n s d u c t i o n , D N A r e p a i r , t r a n s m e m b r a n e t r a f -f i c , a n d r e s p o n s e s t o s t r e s s , i n c l u d i n g t h e i m m u n e r e s p o n s e . I nm a n y o f t h e s e s e t t i n i g s , Ub a c t s t h r o u g h r o u t e s t h a t i n v o l v ep r o c e s s i v e d e g r a d a t i o n o f U b - p r o t e i n c o n j u g a t e s ( 1 8 - 2 1 ) .

T h e b i n d i n g o f a n N - e n d r u l e s u b s t r a t e b y a t a r g e t i n gc o m p l e x i s f o l l o w e d b y f o r m a t i o n o f a s u b s t r a t e - l i n k e dm u l t i - U b c h a i n ( 2 2 , 2 3 ) . T h e u b i q u i t y l a t e d s u b s t r a t e i s p r o -c e s s i v e l y d e g r a d e d b y t h e 2 6 S proteasome-an ATP-d e p e n d e n t , m u l t i s u b u n i t p r o t e a s e ( 1 8 , 2 0 , 2 4 , 2 5 ) . T h e N - e n d

r u l e p a t h w a y i s p r e s e n t i n b o t h t h e c y t o s o l ( 1 , 5 , 1 1 ) a n d t h en u c l e u s ( J . A . J o h n s t o n a n d A . V . , u n p u b l i s h e d d a t a ) . I n t h i sp a p e r , I s u m m a r i z e t h e c u r r e n t u n d e r s t a n d i n g o f t h e N - e n dr u l e . F o r a m o r e d e t a i l e d r e v i e w , s e e r e f . 2 6 .

D e f i n i t i o n s o f T e r m s

T h e N - E n d R u l e . A r e l a t i o n b e t w e e n t h e m e t a b o l i c s t a b i l i t yo f a p r o t e i n a n d t h e i d e n t i t y o f i t s N - t e r m i n a l r e s i d u e .

T h e N - D e g r o n . F o r a d e g r a d a t i o n s i g n a l t o b e t e r m e d a nN - d e g r o n , i t i s n e c e s s a r y a n d s u f f i c i e n t t h a t i t c o n t a i n a s u b s t r a t e ' si n i t i a l o r a c q u i r e d N - t e r m i n a l r e s i d u e w h o s e r e c o g n i t i o n b y t h et a r g e t i n g m a c h i n e r y i s e s s e n t i a l f o r t h e a c t i v i t y o f t h i s d e g r o n .

T h e P r e - N - D e g r o n . F e a t u r e s o f a p r o t e i n t h a t a r e n e c e s s a r ya n d s u f f i c i e n t , i n t h e c o n t e x t o f a g i v e n i n t r a c e l l u l a r c o m p a r t -m e n t , f o r t h e f o r m a t i o n o f N - d e g r o n .

T h e N - E n d R u l e P a t h w a y . A s e t o f m o l e c u l a r c o m p o n e n t s t h a t

i s n e c e s s a r y a n d s u f f i c i e n t , i n t h e c o n t e x t o f a g i v e n i n t r a c e l l u l a rc o m p a r t m e n t , f o r t h e r e c o g n i t i o n a n d d e g r a d a t i o n o f p r o t e i n sb e a r i n g N - d e g r o n s . T h i s " h a r d w a r e - c e n t r i c " d e f i n i t i o n o f t h ep a t h w a y b y p a s s e s s e m a n t i c p r o b l e m s t h a t a r i s e i f , f o r e x a m p l e ,o n e a n d t h e s a m e t a r g e t i n g c o m p l e x r e c o g n i z e s n o t o n l y N -

d e g r o n s b u t a l s o a d e g r a d a t i o n s i g n a l w h o s e e s s e n t i a l d e t e r m i -n a n t s d o n o t i n c l u d e t h e N - t e r m i n a l r e s i d u e o f a s u b s t r a t e . T h i sd e f i n i t i o n a l s o e n c o m p a s s e s a s e t t i n g w h e r e N - d e g r o n s t h a t b e a rd i f f e r e n t d e s t a b i l i z i n g N - t e r m i n a l r e s i d u e s a r e r e c o g n i z e d b yd i s t i n c t t a r g e t i n g c o m p l e x e s . A s d i s c u s s e d b e l o w , n e i t h e r o f t h e s ep o s s i b i l i t i e s i s e n t i r e l y h y p o t h e t i c a l .

P r i m a r y D e s t a b i l i z i n g R e s i d u e s . D e s t a b i l i z i n g a c t i v i t y o f t h e s eN - t e r m i n a l r e s i d u e s , d e n o t e d N - d P , r e q u i r e s t h e i r p h y s i c a l b i n d -i n g b y a p r o t e i n c a l l e d N - r e c o g n i n o r E 3 . I n e u k a r y o t e s , t h e t y p e

A b b r e v i a t i o n s : U b , u b i q u i t i n ; , 3 g a l , 1 3 - g a l a c t o s i d a s e ; DHFR, d i h y d r o -f o l a t e r e d u c t a s e ; N - d t , a t e r t i a r y d e s t a b i l i z i n g N - t e r m i n a l r e s i d u e ;N - d s , a s e c o n d a r y d e s t a b i l i z i n g N - t e r m i n a l r e s i d u e ; N - d P m a n d N - d P 2 ,t y p e 1 a n d t y p e 2 p r i m a r y d e s t a b i l i z i n g N - t e r m i n a l r e s i d u e s , r e s p e c -t i v e l y ; N t - a m i d a s e , N - t e r m i n a l a m i d o h y d r o l a s e ; N t N - a m i d a s e ,a m i d o h y d r o l a s e - s p e c i f i c f o r N - t e r m i n a l A s n ; R - t r a n s f e r a s e , A r g -t R N A - p r o t e i n t r a n s f e r a s e ; L / F - t r a n s f e r a s e , L e u / P h e - t R N A - p r o t e i nt r a n s f e r a s e ; I C E , i n t e r l e u k i n - 1 l / 3 - c o n v e r t i n g e n z y m e ; E R , e n d o p l a s m i cr e t i c u l u m ; c o m t o x i n , c o d o m i n a n c e - m e d i a t e d t o x i n ; N L S , n u c l e a r l o -c a l i z a t i o n s i g n a l .* T o whom r ep r i n t r e q u e s ts s h o u l d b e a d d r e s s e d . e - m a i l :

v a r s h a v s k y a @ s t a r b a s e l . c a l t e c h . e d u .t T h e i n v i v o d e g r a d a t i o n o f m a n y s h o r t - l i v e d p r o t e i n s , i n c l u d i n g t h e

e n g i n e e r e d N - e n d r u l e s u b s t r a t e s , d e v i a t e s f r o m f i r s t - o r d e r k i n e t i c s( 1 , 2 ) . T h e r e f o r e t h e t e r m " h a l f - l i f e , " i f a p p l i e d t o a n e n t i r e d e c a yc u r v e , i s a u s e f u l b u t o f t e n c r u d e a p p r o x i m a t i o n . A m o r e r i g o r o u st e r m i n o l o g y f o r d e s c r i b i n g n o n e xp o n e nt i a l d e c a y w a s p r o p o s e d b yL e v y e t a l . ( 1 ) .

1 2 1 4 2



P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A 9 3 ( 1 9 9 6 ) 1 2 1 4 3

T a b l e 1 . T h e N - e n d r u l e i n E . c o l i a n d S . c e r e v i s i a e

R e s i d u e Xi n X - , B g a l

A r gL y sP h eL e uT r pT y r

H i sI l eA s pG l uA s nG l nC y sA l aS e rT h rG l yV a lP r oM e t

I n v i v o h a l f - l i f e o f X - , B g a l , m i nI n E . c o l i I n S . c e r e v i s i a e

222222

> 6 0 0> 6 0 0> 6 0 0> 6 0 0> 6 0 0> 6 0 0> 6 0 0> 6 0 0> 6 0 0> 6 0 0> 6 0 0> 6 0 0

> 6 0 0

23

3

33

1 0

33 03

3 03

1 0> 1 2 0 0> 1 2 0 0> 1 2 0 0> 1 2 0 0> 1 2 0 0> 1 2 0 0

9

> 1 2 0 0

A p p r o x i m a t e i n v i v o h a l f - l i v e s o f X - , B - g a l a c t o s i d a s e ( , 3 g a l ) p r o t e i n si n E . c o l i a t 3 6 ° C ( 8 ) a n d i n S . c e r e v i s i a e a t 3 0 ° C ( 5 , 9 ) . A q u e s t i o n mark

a t P r o i n d i c a t e s i t s u n c e r t a i n s t a t u s i n t h e N - e n d r u l e ( s e e t e x t ) .

1 b i n d i n g s i t e o f N - r e c o g n i n b i n d s N - t e r m i n a l A r g , L y s , o r His-as e t o f b a s i c N - d P r e s i d u e s , w h e r e a s t h e t y p e 2 s i t e b i n d s N -

t e r m i n a l P h e , L e u , T r p , T y r , o r I l e - a s e t o f b u l k y h y d r o p h o b i c

N - d P r e s i d u e s ( F i g s . 3 a n d 5 ) . A c c o r d i n g l y , t h e N - d P r e s i d u e s a r e

s u b d i v i d e d i n t o t y p e 1 ( N - d P 1 ) a n d t y p e 2 ( N - d P 2 ) r e s i d u e s . T h eN - d P r e s i d u e s o f E . c o l i - P h e , L e u , T r p , a n d Tyr-are e x c l u s i v e l yt y p e 2 ( N - d P 2 ) r e s i d u e s ( F i g s . 4 a n d 5 C ) .

S e c o n d a r y D e s t a b i l i z i n g R e s i d u e s . T h e s e N - t e r m i n a l r e s i d u e s ,d e n o t e d N - d s , a r e Arg a n d L y s i n E . c o l i ; Asp a n d G l u i n S .c e r e v i s i a e ; a n d A s p , G l u , a n d Cy s i n mammalian c e l l s ( F i g s . 3 - 5 ) .I n e u k a r y o t e s , d e s t a b i l i z i n g a c t i v i t y o f N - d s r e s i d u e s r e q u i r e s t h e i ra c c e s s i b i l i t y t o A r g - t R N A - p r o t e i n t r a n s f e r a s e ( R - t r a n s f e r a s e ) . I n

b a c t e r i a s u c h as E . c o l i , d e s t a b i l i z i n g a c t i v i t y o f t h e N - d s r e s i d u e sArg a n d L y s r e q u i r e s t h e i r a c c e s s i b i l i t y t o L e u / P h e - t R N A -p r o t e i n t r a n s f e r a s e ( L / F - t r a n s f e r a s e ) .

T e r t i a r y D e s t a b i l i z i n g R e s i d u e s . N - t e r m i n a l Asn a n d G l n

r e s i d u e s , d e n o t e d N - d t . D e s t a b i l i z i n g a c t i v i t y o f N - d t r e s i d u e s

r e q u i r e s t h e i r a c c e s s i b i l i t y t o N - t e r m i n a l a m i d o h y d r o l a s e ( N t -

a m i d a s e ) ( F i g . 5 A a n d B ) .S t a b i l i z i n g R e s i d u e s . A s t a b i l i z i n g N - t e r m i n a l r e s i d u e i s a

" d e f a u l t " r e s i d u e , i n t h a t i t i s s t a b i l i z i n g b e c a u s e t a r g e t i n g com-

pon en ts o f an N-end r u l e p a t h w a y d o not b i n d t o i t ( o r m o d i f y i t )

e f f i c i e n t l y e n o u g h even i n t h e p r e s e n c e o f o t h e r d e t e r m i n a n t s o f

an N - d e g r o n . G l y , V a l , a n d Met a r e s t a b i l i z i n g r e s i d u e s t h a t a r e

common t o a l l o f t h e known N -en d r u l e s ( F i g . 1 ) .

Aminoacids: F L WYRKH I N Q 1 E CAS TG V PM

Bacteria 0 00000( E c o l i )- ) @ @ - @ O00000000000 ?0

( S .

c r e v i s i a e ) *0000000?

Mammallian c e l l s

rabbit.

r e t i c u t o c y t e s* l b -

0 00

mouseL* c e - ls:++ 0000

0t a b i l i z i t n g r e s i d u e s : N - d " r e s i d u e s ; 0- d p 2 r e s i d u e s ; N - d P 3 r e si du e s;

N - d ' res i dues; + N - d i r e si du e s.

F I G . 1 . Comparison o f e u k a r y o t i c an d b a c t e r i a l N-e nd r u l e s . O pen

c i r c l e s d e n o t e s t a b i l i z i n g r e s i d u e s . P u r p l e , r e d , a n d y e l l o w c i r c l e sd e n o t e , r e s p e c t i v e l y , t y p e 1 , t y p e 2 , an d t y p e 3 p r i m a r y d e s t a b i l i z i n g

r e s i d u e s ( N - d P 1 , N - d P 2 , a n d N - d P 3 ) . B l u e t r i a n g l e s d e n o t e s e c o n d a r y

d e st a bi l i zi n g r e s i d u e s ( N - d s ) . Green crosses d e n o t e t e r t i a r y d e s t a b i -

l i z i n g r e s i d u e s ( N - d t ) ( 1 , 5 - 1 1 ) . A q u e s t i o n mark a t P r o i n d i c a t e s i t su n c e r t a i n status ( s e e t h e main t e x t ) . A q u e s t i o n mark above S e r

i n d i c a t e s i t s u n c e r t a i n s t a t u s i n t h e r e t i c u l o c y t e N-e nd r u l e ( 1 ) .

A Z B I E

H i t, s p C c s s - r e c o g n s t i o ni p h d I K d ~K e

Ei u C D t r a n s - r e c o g n i t i o n

S - t . . . .

F I I f I l l

t r a n s - r e o g i t i n rcge ~? i

UL J t t s dTP

}~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ k . , F - 1 , - 2' _ _ - - S l S . . . 00 d S . S A ,, , ,, . _ _ _. _. . . . . . , . . , , _ _ _ _ _ __ _ __._._ _K

F I G . 2 . M e c h a n i c s o f t h e N - e n d r u l e . ( A ) T h e Ub f u s i o n t e c h n i q u e .L i n e a r f u s i o n s o f U b t o o t h e r p r o t e i n s a r e c l e a v e d a t t h e l a s t r e s i d u eo f U b , m a k i n g i t p o s s i b l e t o p r o d u c e d i f f e r e n t r e s i d u e s a t t h e N -t e r m i n i o f o t h e r w i s e i d e n t i c a l p r o t e i n s ( 5 , 1 1 ) . Amino a c i d r e s i d u e s i nb l u e a n d r e d a r e s t a b i l i z i n g a n d d e s t a b i l i z i n g , r e s p e c t i v e l y , i n t h e S .c e r e v i s i a e N - e n d r u l e ( 9 ) . ( B ) T h e t w o - d e t e r m i n a n t o r g a n i z a t i o n o fe u k a r y o t i c N - d e g r o n s . d , a d e s t a b i l i z i n g N - t e r m i n a l r e s i d u e . A c h a i no f b l a c k o v a l s l i n k e d t o t h e s e c o n d - d e t e r m i n a n t l y s i n e ( K) d e no t es am u l t i - U b c h a i n . ( C ) C i s r e c o g n i t i o n o f t h e N - d e g r o n i n o n e

s u b u n i t o fa d i m e r i c p r o t e i n . T h e o t h e r s u b u n i t b e a r s s , a s t a b i l i z i n g N - t e r m i n a lr e s i d u e . ( D ) T r a n s r e c o g n i t i o n , i n w h i c h t h e f i r s t ( d ) a n d s e c o n d ( K )

d e t e r m i n a n t s o f t h e N - d e g r o n r e s i d e i n d i f f e r e n t s u b u n i t s o f a d i m e r i cp r o t e i n ( 1 2 ) . ( E) T h e h a i r p i n i n s e r t i o n m o d e l . A t a r g e t e d N - e n d r u l es u b s t r a t e ( i n g r e e n ) b e a r i n g a m u l t i - U b c h a i n i s s h o w n b o u n d t o t h e2 6 S p r o t e a s o m e t h r o u g h t h e c h a i n . T h e p o s i t i o n o f a t a r g e t i n g c o m p l e xc o n t a i n i n g N - r e c o g n i n i s u n k n o w n , a n d i s l e f t u n s p e c i f i e d . O n l y t h e2 0 S c o r e c o m p o n e n t o f t h e 2 6 S p r o t e a s o m e i s s h o w n . A r e d a r r o wi n d i c a t e s t h e d i r e c t i o n o f n e t m o v e m e n t o f t h e s u b s t r a t e ' s p o l y p e p t i d ec h a i n t o w a r d a c t i v e s i t e s i n t h e i n t e r i o r o f p r o t e a s o m e . B y a n a l og y w i t ht h e a r r a n g e m e n t o f s i g n a l s e q u e n c e s d u r i n g t r a n s m e m b r a n e t r a n s l o -c a t i o n o f p r o t e i n s ( 1 3 ) , i t i s p r o p o s e d t h a t a r e g i o n o f t h e s u b s t r a t eu p s t r e a m o f i t s u b i q u i t y l a t e d l y s i n e ( K ) d oe s n o t m o v e t h r o u g h t h ep r o t e a s o m e d u r i n g t h e s u b s t r a t e ' s d e g r a d a t i o n , a n d i t m a y b e r e l e a s e di n t a c t f o l l o w i n g a c l e a v a g e i n t h e v i c i n i t y o f t h e l y s i n e . V a r i a n t s o f t h i sm o d e l m a y a l s o b e r e l e v a n t t o t h e t a r g e t i n g o f p r o t e i n s t h a t b e a r

i n t e r n a l o rC - t e r m i n a l d e g r o n s . ( F )

Am o d e l f o r

t h e r e c o g n i t i o n o fa n

N - e n d r u l e s u b s t r a t e ( 9 ) . T h e r e v e r s i b l e b i n d i n g o f N - r e c o g n i n t o ap r i m a r y d e s t a b i l i z i n g N - t e r m i n a l r e s i d u e ( d ) o f a s u b s t r a t e ( s t e p I )m u s t b e f o l l ow e d b y a c a p t u r e o f t h e s e c o n d - d e t e r m i n a n t l y s i n e ( K ) o ft h e s u b s t r a t e b y a t a r g e t i n g c o m p l e x c o n t a i n i n g a U b - c o n j u g a t i n g ( E 2 )e n z y m e ( s t e p I I ) . I t i s u n k n o w n w h e t h e r t h e l y s i n e i s c a p t u r e d b y E 2( a s s h o w n h e r e ) o r b y N - r ec o g n i n. U b i q u i t y l a t i o n o f t h e s u b s t r a t ec o m m e n c e s o n c e t h e t a r g e t i n g c o m p l e x i s b o u n d t o b o t h d e t e r m i n a n t so f t h e N - d e g r o n ( s t e p I I I ) . T h i s m o d e l d o e s n o t s p e c i f y , a m o n g o t h e rt h i n g s , t h e d e t a i l s o f Ub c o n j u g a t i o n ( s e e t h e m a i n t e x t ) .

C o m p o n e n t s a n d E v o l u t i o n o f t h e N - E n d R u l e P a t h w a y

N - R e c o g n i n ( E 3 ) . I n S . c e r e v i s i a e , N - r e c o g n i n i s a 2 2 5 - k D ap r o t e i n ( e n c o d e d b y U B R 1 ) t h a t s e l e c t s p o t e n t i a l N - e n d r u l es u b s t r a t e s t h r o u g h t h e b i n d i n g t o t h e i r N - d P r e s i d u e s P h e , L e u ,T r p , T y r , I l e , A r g , L y s , o r H i s ( 2 6 , 2 7 ) . N - r e c o g n i n h a s a t l e a s t

t w o s u b s t r a t e - b i n d i n g s i t e s . T h e t y p e 1 s i t e i s s p e c i f i c f o r t h eb a s i c N - t e r m i n a l r e s i d u e s A r g , L y s , a n d H i s . T h e t y p e 2 s i t e i ss p e c i f i c f o r t h e b u l k y h y d r o p h o b i c N - t e r m i n a l r e s i d u e s P h e ,L e u , T r p , T y r , a n d I l e ( F i g . 3 ) . A t p r e s e n t , t h e s e s i t e s a r e d e f i n e dt h r o u g h d i p e p t i d e - b a s e d c o m p e t i t i o n e x p e r i m e n t s . S p e c i f i -c a l l y , a d i p e p t i d e b e a r i n g a d e s t a b i l i z i n g N - t e r m i n a l r e s i d u ew a s f o u n d t o i n h i b i t t h e d e g r a d a t i o n o f a t e s t N - e n d r u l es u b s t r a t e i f t h a t s u b s t r a t e ' s N - t e r m i n a l r e s i d u e w a s o f t h e s a m et y p e ( 1 o r 2 ) a s t h e d i p e p t i d e ' s N - t e r m i n a l r e s i d u e ( 2 , 1 1 , 2 8 ) .A g e n e t i c d i s s e c t i o n o f t h e t y p e 1 a n d t y p e 2 s i t e s i n S .

c e r e v i s i a e N - r e c o g n i n ( U b r l p ) h a s s h o w n t h a t e i t h e r o f t h e s i t e sc a n b e m u t a t i o n a l l y i n a c t i v a t e d w i t h o u t s i g n i f i c a n t l y p e r t u r b -i n g t h e o t h e r s i t e . M u t a t i o n s t h a t s e l e c t i v e l y i n a c t i v a t e t h e t y p e1 o r t h e t y p e 2 s i t e a r e l o c a t e d w i t h i n t h e e 5 0 - k D a N - t e r m i n a lr e g i o n o f t h e 2 2 5 - k D a N - r e c o g n i n ( A . W e b s t e r , M . G h i s l a i n ,a n d A . V . , u n p u b l i s h e d d a t a ) . E 3 a , t h e m a m m a l i a n c o u n t e r -

B i o c h e m i s t r y : V a r s h a v s k y



P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 9 3 ( 1 9 9 6 )

t e r t i a r y Nd e s t a b i k l z r g 0-

r e s i d u e s Q

N t - a m i d a s e

s e c o r i d a r y Dd e s t a b 1 i l i z n g o f

r e s i d u e s E

R-IRNAR

R - t r a n s f e r a s e AT : R - t R N A

k o \ + F - 1 q 4 s y y n h e t a s e

I R N A R R

| DeT y p e I

p r i m a r y

d e s t a b a z i n gt e s i d u e s L - o ] :

Type 2 Y

w

Ubalp Ubalp-@

Ubc2p-C U b c 2 p

Z J 1 P X 4 H X A X ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ A -Ph - r e c o g n i n short

U b r i p p e p t i d e s

F I G . 3 . T h e S . c e r e v i s i a e N - e n d r u l e p a t h w a y . T y p e 1 ( N - d P i ) a n d t y p e

2 ( N - d P 2 ) p r i m a r y d e s t a b i l i z i n g N - t e r m i n a l r e s i d u e s ar e i n p u r p l e a n d r e d ,r e s p e c t i v e l y . S e c o n d a r y ( N - d s ) a n d t e r t i a r y ( N - d t ) d e s t a b i l i z i n g N -

t e r m i n a l r e s i d u e s are i n b l u e a n d green, r e s p e c t i v e l y . T h e y e l l o w o v a l sd e n o t e t h e r e s t o f a p r o t e i n s u b s t r a t e . T h e c o n v er s i o n o f N - d t r e s i d u e s Na n d Q i n t o N - d s r e s i d u e s D a n d E i s m e d i a t e d b y N - t e r m i n a l a m i d o h y -

d r o l a s e ( N t - a m i d a s e ) , e n c o d e d b y N T A I . T h e c o n j u g a t i o n o f t h e N - d P 1r e s i d u e R t o N - d s r e s i d u e s D a n d E i s m e d i a t e d b y A r g - t RN A - p r o t e i n

t r a n s f e r a s e ( R - t r a n s f e r a s e ) , e n c o d e d b y A T E 1 . A c o m p l e x o f N - r e c o g n i n

a n d t h e U b - c o n j u g a t i n g ( E 2 ) e n z y m e U b c 2 p c a t a l y z e s t h e c o n j u g a t i o n o fa c t i v a t e d U b , p r o d u c e d b y t h e U b - a c t i v a t i n g ( E l ) e n z y m e U b a l p , t o a L y s

r e s i d u e o f t h e s u b s t r a t e , y i e l d i n g a s u b s t r a t e - l i n k e d m u l t i - U b c h a i n .Ubalp-Ub a n d Ubc2p-Ub d e n o t e c o v a l e n t ( t h i o e s t e r - m e d i a t e d ) com-

p l e x e s o f t h e s e e n z y me s w i t h U b . A m u l t i u b i q u i t y l a t e d s u b s t r a t e i sd e g r a d e d b y t h e 2 6 S p r o t e a s o m e . ( I n s e t ) A m o d e l o f t h e t a r g e t i n gc o m p l e x . T h e 2 0 - k D a U b c 2 p E2 e nzyme i s d e p i c t e d c a r r y i n g a c t i v a t e d Ubl i n k e d t o C y s - 8 8 o f U b c 2 p t h r o u g h a t h i o e s t e r b o n d . B o t h t h e 5 2 - k D a

N t a l p ( N t - a m i d a s e ) a n d t h e 5 8 - k D a A t e l p ( R - t r a n s f e r a s e ) b i n d t o t h e2 2 5 - k D a U b r l p ( N - r e c o g n i n ) i n p r o x i m i t y t o t h e t y p e 1 s u b s t r a t e - b i n d i n gs i t e o f U b r l p . I n a d d i t i o n , N t a l p d i r e c t l y i n t e r a c t s w i t h A t e l p ( s e e t h em a i n t e x t ) .

p a r t o f S . c e r e v i s i a e N - r e c o g n i n , h a s b e e n c h a r a c t e r i z e d b i o -c h e m i c a l l y i n e x t r a c t s f r o m r a b b i t r e t i c u l o c y t e s ( 1 8 ) . A n o t h e rmammalian N - r e c o g n i n , t e r m e d E 3 , 3 , w h i c h a p p a r e n t l y b i n d s

t o s u b s t r a t e s b e a r i n g N - t e r m i n a l A l a a n d Th r ( a n d p o s s i b l ya l s o S e r ) ( 1 , 1 1 ) , h a s b e e n d e s c r i b e d as w e l l ( 1 8 ) .

A l l e u k a r y o t e s e x a m i n e d h a v e b o t h U b a n d t h e N - e n d r u l ep a t h w a y . S o m e , b u t n o t a l l , p r o k a r y o t e s c o n t a i n U b ( 2 9 ) . Theb a c t e r i u m E . c o l i l a c k s U b b u t d o e s h a v e a n N - e n d r u l ep a t h w a y ( F i g . 4 ) ( 8 ) . S c r e e n s f o r m u t a t i o n s t h a t i n a c t i v a t e t h i s

secondary R _ _d e s t a b i l i z i n g K

r e s i d u e s

L / F - t r a n s f e r a s e A L - I t N A

, R N A L L

E L - K

primary ATP

dest abilizing Fsho

r e s i d u e s WI l o C I p A P p e p t i d e sy pr o . s eas

F I G . 4 . T h e E . c o l i N - e n d r u l e p a t h w a y . P r i m a r y ( N - d P ) d e s t a b i l i z i n gN - t e r m i n a l r e s i d u e s L , F , W , a n d Y are i n r e d . S e c o n d a r y ( N - d s )d e s t a b i l i z i n g N - t e r m i n a l r e s i d u e s R a n d K ar e i n b l u e . T h e y e l l o w o v a l sd e n o t e t h e r e s t o f a p r o t e i n s u b s t r a t e . C o n j u g a t i o n o f t h e N - d P r e s i d u e Lt o t h e N - d s r e s i d u e s R a n d K i s m e d i a t e d b y L e u / P h e - t R N A - p r o t e i nt r a n s f e r a s e ( L / F - t r a n s f e r a s e ) , e n c o d e d b y a a t ( 8 ) . I n v i v o , L / F - t r a n s f e r a s eappears t o c o n j u g a t e p r e d o m i n a n t l y , i f n o t e x c l u s i v e l y , L ( 1 0 ) . T h e

d e g r a d a t i o n o f a s u b s t r a t e b e a r i n g a n N - d P r e s i d u e i s c a r r i e d o u t b y t h eA T P - d e p e n d e n t p r o t e a s e C l p A P , e n c o d e d b y c i p A a n d c l p P . A q u e s t i o nm a r k d e n o t e s a n a m b i g u i t y a b o u t t h e n a t u r e o f N - r e c o g n i n i n E . c o l i .

F I G . 5 . C o m p a r i s o n o f e n z y m a t i c r e a c t i o n s t h a t u n d e r l i e t h e a c t i v i t y

o f t e r t i a r y ( N - d t ) a n d s e c o n d a r y ( N - d s ) d e s t a b i l i z i n g r e s i d u e s i n d i f f e r e n to r g a n i s m s . ( A ) M o u s e ( M u s m u s c u l u s ) L - c e l l s a n d r a b b i t ( O r y c t o l a g u sc u n i c u l u s ) r e t i c u l o c y t e s ( 1 , 1 1 ) . ( B ) T h e y e a s t S . c e r e v i s i a e ( 9 ) . ( C ) T h eb a c t e r i u m E . c o l i ( 8 , 1 0 ) . T h e E . c o l i N - e n d r u l e l a c k s N - d t r e s i d u e s . T h ep o s t u l a t e d m a m m a l i a n N t Q - a m i d a s e ( i n A ) r e m a i n s t o b e i d e n t i f i e d .

p a t h w a y h a v e i d e n t i f i e d t h r e e E . c o l i g e n e s - c l p A , c l p P , a n d a a t

( 8 , 1 0 ) . A a t i s a L e u / P h e - t R N A - p r o t e i n t r a n s f e r a s e ( L / F -t r a n s f e r a s e ) . ClpA ( 8 1 k D a ) a n d C l p P ( 2 1 k D a ) f o r m a n

- 7 5 0 - k D a c o m p l e x , C l p A P , w h i c h e x h i b i t s A T P - d e p e n d e n tp r o t e a s e a c t i v i t y i n v i t r o ( 3 0 ) a n d i s a f u n c t i o n a l c o u n t e r p a r t o f

t h e e u k a r y o t i c 2 6 S p r o t e a s o m e i n t h e E . c o l i N - e n d r u l e

p a t h w a y ( F i g . 4 ) . C l p P e x h i b i t s a c h y m o t r y p s i n - l i k e p r o t e o l y t i ca c t i v i t y i n v i t r o ( 3 0 ) . ClpA i s t h e A T P - b i n d i n g component o f

C l p A P . I n v i t r o s t u d i e s h a v e s h o w n t h a t ClpA ca n a c t as a

c h a p e r o n e i n t h e a c t i v a t i o n o f R e p A , t h e r e p l i c a t i o n i n i t i a t o re n c o d e d b y t h e p l a s m i d P 1 ( 3 2 ) . I n v i v o r a m i f i c a t i o n s o f t h e s e

r e s u l t s , a n d i n p a r t i c u l a r t h e i r r e l e v a n c e t o t h e p r o t e o l y t i cf u n c t i o n o f ClpAP i n t h e E . c o l i N - e n d r u l e p a t h w a y ( F i g . 4 ) ,r e m a i n t o b e e x a m i n e d .

N - T e r m i n a l A m i d a s e s . The S . c e r e v i s i a e N - t e r m i n a l

a m i d o h y d r o l a s e ( N t - a m i d a s e ) , e n c o d e d b y N T A 1 , i s a 5 2 - k D aenzyme w h i c h d e a m i d a t e s Asn o r G l n i f t h e y a r e l o c a t e d a t t h e

N - t e r m i n u s o f a p o l y p e p t i d e ( F i g s . 3 a n d S B ) ( 3 1 , 3 3 ) .S t e w a r t e t a l . ( 3 4 ) p u r i f i e d a p o r c i n e N t - a m i d a s e t h a t d e a m i -

d a t e s N - t e r m i n a l Asn ( N ) b u t n o t G l n ( Q ) , a n d i s o l a t e d a cD N At h a t e n c o d e s t h i s enzyme. G r i g o r y e v e t a l . ( 3 3 ) i s o l a t e d a n dc h a r a c t e r i z e d a n s 1 7 - k b gene, t e r m e d N t a n l , t h a t e n c o d e s a

mouse h o m o l o g o f t h e p o rc i n e a m i da s e , t e r m e d N t N - a m i d a s e .

Th e - 1 . 4 - k b N t a n l mRNA i s e x p r e s s e d i n a l l o f t h e t e s t e d mouset i s s u e s a n d c e l l l i n e s . C o n s t r u c t i o n o f n t a n l A mouse m u t a n t s i su n d e r wa y ( Y . T . Kwon a n d A . V . , u n p u b l i s h e d d a t a ) .

A m i n o a c y l - t R N A - P r o t e i n T r a n s f e r a s e s . The S . c e r e v i s i a eA r g - t R N A - p r o t e i n t r a n s f e r a s e ( R - t r a n s f e r a s e ) , e n c o d e d b yATE1, i s a 5 8 - k D a enzyme w h i c h u t i l i z e s Arg-tRNA t o a r g i -n y l a t e N - t e r m i n i o f p o l y p e p t i d e s t h a t b e a r Asp or G l u ( F i g s . 3

a n d 5 B ) ( 3 5 ) . I n c o n t r a s t t o S . c e r e v i s i a e , w h e r e o n l y A s p a n dG l u ar e N - d s r e s i d u e s , i n mammals C y s i s a n N - d s r e s i d u e as

w e l l ( 1 1 ) ( T a b l e 1 a n d F i g . 1 ) .A n e x t r a c t p r e p a r e d - 2 h r a f t e r a c r u s h i n j u r y t o t h e r a t s c i a t i c

n e r v e f r o m a s e g m e n t o f t h e n e r v e i m m e d i a t e l y u p s t r e a m o f t h e

c r u s h s i t e wa s f o u n d t o c o n j u g a t e a n - 1 0 - f o l d h i g h e r amount o f

[ 3 H ] a r g i n i n e t o t h e N t e r m i n i o f u n i d e n t i f i e d e n d o g e n o u s pro-

t e i n s t h a n a n o t h e r w i s e i d e n t i c a l e x t r a c t f r o m t h e same r e g i o n o f

a n u n p e r t u r b e d s c i a t i c n e r v e ( 3 6 ) . T h i s f i n d i n g s u g g e s t e d a

c r u s h - i n d u c e d i n c r e a s e i n t h e l e v e l o f N - e n d r u l e s u b s t r a t e sa n d / o r a p o s t - c r u s h i n d u c t i o n o f t h e N - e n d r u l e p a t h w a y . N op o s t - c r u s h i n c r e a s e i n a r g i n y l a t i o n wa s o b s e r v e d w i t h e x t r a c t s

t e r t i a r y secondary p r i m a r yd e s t a b i l i z i n g d e s t a b i l i z i n g d e s t a b i l i z i n g

r e s i d u e s r e s i d u e s r e s i d u e s

- D

N-D N t N . a r r i d a s e T y - p EN

1 T y p e I , 1

- E R - t r a n s f e r a s e

N t ° a m i d a s e ( ? ) C- 0 T y p e 2 1 y K 1 )

A M M u s m t i s c u l u s T y p e 3 A

N t - a m i d a s e R - t r a n s f e r a s e T y p e

N DE Wp

Q ~ E L C DT y p e 2 . W

B S a c c h a r o . m y c o s c e r e v i s i a e y

K J U F - t r a n s f e r a s e JK

--o T y p e 2

W°c E s c h o e r i c h i a w o l f y

1 2 1 4 4 B i o c h e m i s t r y : V a r s h a v s k y



P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 9 3 ( 1 9 9 6 ) 1 2 1 4 5

f r o m t h e o p t i c n e r v e , w h i c h d o e s n o t r e g e n e r a t e a f t e r a c r u s hi n j u r y , i n c o n t r a s t t o t h e s c i a t i c n e r v e ( 3 6 ) .

R - t r a n s f e r a s e a p p e a r s t o b e c o n f i n e d t o e u k a r y o t e s , w h e r e a sL / F - t r a n s f e r a s e i s p r e s e n t i n b a c t e r i a s u c h a s E . c o l i b u t i sa p p a r e n t l y a b s e n t f r o m e u k a r y o t e s . E . c o l i L / F - t r a n s f e r a s e i s a2 7 - k D a e n z y m e e n c o d e d b y t h e a a t g e n e ( 1 0 ) . I n v i v o , L / F -t r a n s f e r a s e c o n j u g a t e s m a i n l y , i f n o t e x c l u s i v e l y , L e u t o N -t e r m i n a l A r g o r L y s o f a p o l y p e p t i d e s u b s t r a t e ( 1 0 ) ( F i g . 4 ) . E . c o l im u t a n t s l a c k i n g a a t a r e u n a b l e t o d e g r a d e N - e n d r u l e s u b s t r a t e s

t h a t b e a r N - t e r m i n a l A r g o r L y s . T h e s e d a t a ( 8 , 1 0 ) i d e n t i f i e dL / F - t r a n s f e r a s e a s a c o m p o n e n t o f t h e E . c o l i N - e n d r u l ep a t h w a y .

U b - C o n j u g a t i n g E n z y m e s . T h e i n i t i a l i n t e r a c t i o n b e t w e e na n N - e n d r u l e s u b s t r a t e a n d N - r e c o g n i n i s o f m o d e r a t e a f f i n i t y( t h e i n f e r r e d K d 1 0 , u M ; r e f . 2 6 ) , b u t i t b e c o m e s m u c hs t r o n g e r i f a n i n t e r n a l l y s i n e o f t h e s u b s t r a t e i s c a p t u r e d b y a

t a r g e t i n g c o m p l e x c o n t a i n i n g a U b - c o n j u g a t i n g ( E 2 ) e n z y m ea n d N - r e c o g n i n ( E 3 ) . T h i s c a p t u r e i n i t i a t e s p r o c e s s i v e s y n t h e -s i s o f a l y s i n e - l i n k e d m u l t i - U b c h a i n . T h e E 2 e n z y m e s u t i l i z ea c t i v a t e d U b , p r o d u c e d b y t h e U b - a c t i v a t i n g ( E l ) e n z y m e , t oc a t a l y z e t h e f o r m a t i o n o f i s o p e p t i d e b o n d s b e t w e e n t h e C -t e r m i n a l G l y - 7 6 o f U b a n d e - a m i n o g r o u p s o f l y s i n e s i na c c e p t o r p r o t e i n s ( F i g . 3 ) ( 1 8 , 1 9 , 3 7 ) .

I n a t l e a s t s o m e U b - d e p e n d e n t s y s t e m s ( 3 8 ) , i n c l u d i n g a p p a r -e n t l y t h e N - e n d r u l e p a t h w a y ( V . C h a u a n d A . V . , u n p u b l i s h e d

d a t a ) , t h e p a t h w a y - s p e c i f i c Ub l i g a s e - a c o m p l e x o f a r e c o g n i n( E 3 ) a n d a n E2 e n z y m e - c a t a l y z e s t h e t r a n s f e r o f t h e Ub m o i e t y( w h i c h i s i n i t i a l l y l i n k e d t o a C y s r e s i d u e o f t h e E l e n z y m e )t h r o u g h a r e l a y o f Ub t h i o e s t e r s b e f o r e c o n j u g a t i n g Ub t o a L y sr e s i d u e o f a t a r g e t e d s u b s t r a t e . I n a s u b s t r a t e - l i n k e d m u l t i - U bc h a i n , t h e C - t e r m i n a l G l y o f o n e Ub m o i e t y i s j o i n e d t o a ni n t e r n a l L y s o f t h e a d j a c e n t Ub m o i e t y , r e s u l t i n g i n a c h a i n o fU b - U b c o n j u g a t e s . I n a m u l t i - U b c h a i n l i n k e d t o a n N - e n d r u l es u b s t r a t e , o n l y L y s - 4 8 o f Ub w a s f o u n d t o b e j o i n e d t o a n o t h e r Ubm o i e t y w i t h i n a c h a i n ( 1 6 ) . R e c e n t l y , m u l t i - U b c h a i n s l i n k e dt h r o u g h L y s - 6 3 , L y s - 2 9 , L y s - 1 1 , o r L y s - 6 o f Ub h a v e b e e nd e s c r i b e d a s w e l l ( 1 6 , 1 7 , 3 9 - 4 1 ) . I t i s u n k n o w n w h e t h e r t h e s ec h a i n s p l a y a r o l e i n t h e N - e n d r u l e p a t h w a y .

T h e N-End R u l e A s a W i t n e s s o f E v o l u t i o n . T h e h i e r a r c h i co r g a n i z a t i o n o f N - e n d r u l e s , w i t h t h e i r t e r t i a r y , s e c o n d a r y , a n dp r i m a r y d e s t a b i l i z i n g r e s i d u e s , i s a f e a t u r e more c o n s e r v e d i n

e v o l u t i o n t h a n e i t h e r t h e U b d e p e n d e n c e o f a n N - e n d r u l ep a t h w a y o r t h e i d e n t i t y o f e n z y m a t i c r e a c t i o n s t h a t m e d i a t e t h ea c t i v i t y o f d e s t a b i l i z i n g r e s i d u e s . F o r e x a m p l e , i n a b a c t e r i u ms u c h a s E . c o l i , w h i c h l a c k s t h e U b s y s t e m , t h e N - e n d r u l e h a sb o t h N - d S a n d N - d P r e s i d u e s ( i t l a c k s N - d t r e s i d u e s ) ( F i g s . 1 , 4 ,a n d S C ) . T h e i d e n t i t i e s o f N - d s r e s i d u e s i n E . c o l i ( A r g a n d L y s )a r e d i f f e r e n t f r o m t h o s e i n e u k a r y o t e s ( F i g s . 1 a n d 5 ) . B a c t e r i a la n d e u k a r y o t i c e n z y m e s t h a t i m p l e m e n t t h e c o u p l i n g b e t w e e nN - d s a n d N - d P r e s i d u e s a r e a l s o d i f f e r e n t : L / F - t r a n s f e r a s e i nE . c o l i a n d R - t r a n s f e r a s e i n e u k a r y o t e s . N o t e , h o w e v e r , t h a tb a c t e r i a l L / F - t r a n s f e r a s e a n d e u k a r y o t i c R - t r a n s f e r a s e c a t a -l y z e r e a c t i o n s o f t h e s a m e t y p e ( c o n j u g a t i o n o f a n a m i n o a c i dt o a n N - t e r m i n a l r e s i d u e o f a p o l y p e p t i d e ) a n d u t i l i z e t h e s a m es o u r c e o f a c t i v a t e d a m i n o a c i d ( a m i n o a c y l - t R N A ) ( F i g . 5 ) .

T h e a p p a r e n t c o n f i n e m e n t o f R - t r a n s f e r a s e t o e u k a r y o t e sa n d o f

L / F - t r a n s f e r a s et o

p r o k a r y o t e s s u g g e s t st h a t N - d S

r e s i d u e s w e r e r e c r u i t e d l a t e i n t h e e v o l u t i o n o f N - e n d r u l e ,a f t e r t h e d i v e r g e n c e o f p r o k a r y o t i c a n d e u k a r y o t i c l i n e a g e s .T h e l a c k o f s e q u e n c e s i m i l a r i t y b e t w e e n t h e y e a s t N t - a m i d a s ea n d t h e m a m m a l i a n N t N - a m i d a s e , a s w e l l a s t h e more n a r r o w

s p e c i f i c i t y o f t h e m a m m a l i a n e n z y m e ( F i g . 5 A a n d B ) s u g g e s tt h a t t h e N - d t r e s i d u e s Asn a n d G l n b e c a m e a p a r t o f t h e N - e n dr u l e m u c h l a t e r y e t , p o s s i b l y a f t e r t h e d i v e r g e n c e o f m e t a z o a na n d f u n g a l l i n e a g e s . I f s o , t h e N - e n d r u l e p a t h w a y may b e a n

e s p e c i a l l y i n f o r m a t i v e w i t n e s s o f e v o l u t i o n : t h e a n c i e n t o r i g i n so f t h i s p r o t e o l y t i c s y s t e m , t h e s i m p l i c i t y a n d d i s c r e t e n e s s o f

c h a n g e s i n t h e r u l e b o o k s o f N - e n d r u l e s a m o n g d i f f e r e n ts p e c i e s , a n d t h e d i v e r s i t y o f p r o t e i n s t h a t e i t h e r p r o d u c e o r

t a r g e t t h e N - d e g r o n s h o u l d f a c i l i t a t e p h y l o g e n e t i c d e d u c -t i o n s - o n c e t h e c o m p o n e n t s o f t h i s p a t h w a y b e c o m e c h a r a c -

t e r i z e d a c r o s s a b r o a d r a n g e o f o r g a n i s m s .

C o d e V e r s u s H a r d w a r e . A g i v e n N - e n d r u l e i s d e f i n e do p e r a t i o n a l l y - f o r a s e t o f p r o t e i n s s u c h a s X - I 3 g a l s t h a t d i f f e re x c l u s i v e l y b y t h e i r N - t e r m i n a l r e s i d u e s . E x i s t i n g e v i d e n c e ( 9 )s t r o n g l y s u g g e s t s t h a t t h e r a n k i n g a s p e c t o f a n N - e n d r u l e - i . e . ,a n o r d e r i n g o f r e l a t i v e d e s t a b i l i z i n g a c t i v i t i e s a m o n g 2 0 f u n -d a m e n t a l a m i n o a c i d s - i s i n v a r i a n t f r o m o n e p r o t e i n r e p o r t e rt o a n o t h e r i n a g i v e n i n t r a c e l l u l a r c o m p a r t m e n t . B y c o n t r a s t ,t h e a c t u a l i n v i v o h a l f - l i v e s may d i f f e r g r e a t l y among d i f f e r e n tp r o t e i n s b e a r i n g o n e a n d t h e s a m e N - t e r m i n a l r e s i d u e ( 9 ) . T h e

c au s e o f t h e s e d i f f e r e n c e s i s t h e m u l t i c o m p o n e n t n a t u r e o fu n d e r l y i n g N - d e g r o n s ( F i g . 2 B ) .A p r i o r i , o n e a n d t h e s a m e N - e n d r u l e c a n b e i m p l e m e n t e d

t h r o u g h v a s t l y d i f f e r e n t a s s o r t m e n t s o f t a r g e t i n g h a r d w a r e . A to n e e x t r e m e , e a c h d e s t a b i l i z i n g N - t e r m i n a l r e s i d u e may b eb o u n d b y a d i s t i n c t N - r e c o g n i n . C o n v e r s e l y , a s i n g l e N -r e c o g n i n may b e r e s p o n s i b l e f o r t h e e n t i r e r u l e b o o k o fd e s t a b i l i z i n g r e s i d u e s i n a g i v e n N - e n d r u l e . T h e a c t u a l N - e n dr u l e p a t h w a y s l i e b e t w e e n t h e s e e x t r e m e s a n d h a p p e n t o h a v ea h i e r a r c h i c r a t h e r t h a n " l i n e a r " s t r u c t u r e ( F i g s . 3 - 5 ) .

T a r g e t i n g C o m p l e x o f t h e N-End R u l e P a t h w a y

T h e k n o w n c o m p o n e n t s o f t h e S . c e r e v i s i a e N - e n d r u l e p a t h w a yt h a t m e d i a t e s t e p s p r i o r t o t h e p r o c e s s i v e p r o t e o l y s i s o f at a r g e t e d s u b s t r a t e b y t h e 2 6 S p r o t e a s o m e a r e N t - a m i d a s e( N t a l p ) , R - t r a n s f e r a s e ( A t e l p ) , N - r e c o g n i n ( U b r l p ) , a U b -

c o n j u g a t i n g ( E 2 ) e n z y m e ( U b c 2 p ) , a n d t h e U b - a c t i v a t i n g ( E l )e n z y m e ( U b a l p ) ( F i g . 3 ) ( 2 2 , 2 6 , 2 7 , 3 1 , 3 5 , 4 2 ) . I n a d d i t i o n t oa d i r e c t e v i d e n c e f o r t h e p h y s i c a l a s s o c i a t i o n b e t w e e n N -r e c o g n i n a n d U b c 2 p ( 2 2 , 2 3 ) , t h e r e i s a l s o c i r c u m s t a n t i a le v i d e n c e f o r t h e e x i s t e n c e o f a c o m p l e x b e t w e e n N - r e c o g n i n ,R - t r a n s f e r a s e , a n d N t - a m i d a s e ( 3 1 ) . R e c e n t l y , a h i g h - a f f i n i t yi n t e r a c t i o n b e t w e e n N t a l p a n d A t e l p w a s d e m o n s t r a t e d d i -r e c t l y ; o t h e r e v i d e n c e s u g g e s t s t h a t b o t h N t a l p a n d A t e l pi n t e r a c t w i t h U b r l p ( M . G h i s l a i n , A . W e b s t e r , a n d A . V . ,u n p u b l i s h e d r e s u l t s ) . I n a q u a t e r n a r y U b c 2 p - U b r l p - N t a l p -A t e l p c o m p l e x s u g g e s t e d b y t h e s e d a t a , A t e l p a n d N t a l pi n t e r a c t w i t h e a c h o t h e r a n d w i t h U b r l p ( F i g . 3 ) .

E f f e c t s o f o v e r e x p r e s s i n g N t - a m i d a s e a n d / o r R - t r a n s f e r a s e i nS . c e r e v i s i a e n o t o n l y s u g g e s t e d t h e e x i s t e n c e o f N t a l p - A t e l p -U b r l p - U b c 2 p c o m p l e x b u t a l s o l e d t o t h e p r e d i c t i o n t h a t N t a l pa n d A t e l p a r e a s s o c i a t e d w i t h U b r l p i n p r o x i m i t y t o i t s t y p e 1

s u b s t r a t e - b i n d i n g s i t e ( 3 1 ) . I n F i g . 3 d i a g r a m , a p h y s i c a l p r o x i m i t yo f t h e b o u n d R - t r a n s f e r a s e t o t h e t y p e 1 s i t e o f N - r e c o g n i n i sp r e s u m e d t o d e c r e a s e t h e s t e r i c a c c e s s i b i l i t y o f t h i s s i t e t o a nN - e n d r u l e s u b s t r a t e t h a t b e a r s a n N - d P 1 r e s i d u e s u c h a s A r g a n da p p r o a c h e s t h e t y p e 1 b i n d i n g s i t e o f N - r e c o g n i n f r o m t h e b u l ks o l v e n t . B y c o n t r a s t , a s u b s t r a t e t h a t a c q u i r e d A r g t h r o u g ha r g i n y l a t i o n b y t h e N - r e c o g n i n - b o u n d R - t r a n s f e r a s e w o u l d b ea b l e t o r e a c h t h e ( n e a r b y ) t y p e 1 b i n d i n g s i t e o f N - r e c o g n i nd i r e c t l y - w i t h o u t d i s s o c i a t i n g i n t o t h e b u l k s o l v e n t f i r s t - a f e a -t u r e k n o w n a s s u b s t r a t e " c h a n n e l i n g " i n m u l t i s t a g e e n z y m a t i cr e a c t i o n s ( 4 3 ) . T h e m e c h a n i c s o f c h a n n e l i n g m a y i n v o l v e d i f f u -s i o n o f a n N - e n d r u l e s u b s t r a t e i n p r o x i m i t y t o s u r f a c e s o f t h et a r g e t i n g c o m p l e x , a n a l o g o u s t o t h e m e c h a n i s m o f a b i f u n c t i o n a le n z y m e d i h y d r o f o l a t e r e d u c t a s e ( D H F R ) - t h y m i d y l a t e s y n -t h e t a s e , w h e r e t h e c h a n n e l i n g o f d i h y d r o f o l a t e a p p a r e n t l y r e s u l t sf r o m i t s m o v e m e n t a c r o s s t h e s u r f a c e o f t h e p r o t e i n ( 4 4 ) .

T h e N - D e g r o n a n d P r e - N - D e g r o n

N a s c e n t p r o t e i n s c o n t a i n N - t e r m i n a l Me t ( f M e t i n p r o -k a r y o t e s ) , w h i c h i s a s t a b i l i z i n g r e s i d u e i n t h e k n o w n N - e n dr u l e s ( F i g . 1 ) . T h u s , t h e N - d e g r o n o f a n N - e n d r u l e s u b s t r a t em u s t b e p r o d u c e d f r o m a p r e - N - d e g r o n . I n a n e n g i n e e r e dN - e n d r u l e s u b s t r a t e , a p r e - N - d e g r o n c o n t a i n s t h e N - t e r m i n a lU b m o i e t y w h o s e r e m o v a l b y U b - s p e c i f i c p r o t e a s e s y i e l d s t h ep r o t e i n ' s N - d e g r o n ( F i g . 2 A ) . T h i s d e s i g n o f a p r e - N - d e g r o n i su n l i k e l y t o b e r e l e v a n t t o p h y s i o l o g i c a l N - e n d r u l e s u b s t r a t e s ,b e c a u s e n a t u r a l Ub f u s i o n s ( i n c l u d i n g t h e p r e c u r s o r s o f U b )e i t h e r c o n t a i n a s t a b i l i z i n g r e s i d u e a t t h e U b - p r o t e i n j u n c t i o no r b e a r a m u t a n t Ub m o i e t y t h a t i s r e t a i n e d i n v i v o ( 4 5 - 4 7 ) .T h e k n o w n M e t - a m i n o p e p t i d a s e s r e m o v e N - t e r m i n a l Me t i ft h e s e c o n d r e s i d u e o f a p r o t e i n i s s t a b i l i z i n g i n t h e y e a s t N - e n dr u l e ( F i g . 1 ) . T h e s t r u c t u r a l b a s i s o f t h i s s e l e c t i v i t y i s t h e s i z e





o f a r e s i d u e ' s s i d e c h a i n ( 4 8 - 5 0 ) . S p e c i f i c a l l y , t h e s i d e c h a i n so f t h e r e s i d u e s t h a t a r e d e s t a b i l i z i n g i n t h e y e a s t N - e n d r u l e a r el a r g e r t h a n t h os e o f s t a b i l i z i n g r e s i d u e s . T h e e x c e p t i o n i sMet -a b u l k y h y d r o p h o b i c b u t s t a b i l i z i n g r e s i d u e ( F i g . 1 ) .

C a n t h e r e b e j u s t o n e o r a f e w r e s i d u e s b e t w e e n N - t e r m i n a lM e t a n d t h e s i t e o f c l e a v a g e t h a t p r o d u c e s a n N - d e g r o n ? I f s o ,a s h o r t ( - 1 0 r e s i d u e s ) N - t e r m i n a l s e q u e n c e m i g h t c o n t a i nb o t h t h e r e c o g n i t i o n m o t i f a n d t h e c l e a v a g e s i t e ( s ) f o r ar e l e v a n t ( u n k n o w n ) p r o c e s s i n g p r o t e a s e . S c r e e n s f o r s u c hs e q u e n c e s , c a r r i e d o u t i n S . c e r e v i s i a e ( 5 1 , 5 2 ) , d i d i d e n t i f y

s h o r t ( c 1 0 r e s i d u e s ) N - t e r m i n a l r e g i o n s t h a t c o n f e r r e d U b r l p -d e p e n d e n t m e t a b o l i c i n s t a b i l i t y o n a r e p o r t e r p r o t e i n . M o s t o ft h e s e q u e n c e s i d e n t i f i e d b y t h e s e s c r e e n s w e r e n o t s i m i l a r t oe a c h o t h e r , p o s s i b l y b e c a u s e a v e r y l a r g e n u m b e r o f 1 0 - r e s i d u eN - t e r m i n a l e x t e n s i o n s c a n p r o d u c e a n N - d e g r o n i n v i v o ,a n a l o g o u s t o a l a r g e n u m b e r o f N - t e r m i n a l s e q u e n c e s t h a t c a nf u n c t i o n a s s i g n a l s f o r p r o t e i n t r a n s l o c a t i o n a c r o s s t h e e n d o -p l a s m i c r e t i cu l um ( E R ) m e m b r a n e ( 5 3 ) .

A n a l y s i s o f o n e N - t e r m i n a l e x t e n s i o n i d e n t i f i e d b y G h i s l a i ne t a l . ( 5 2 ) h a s s h o w n t h a t i t t a r g e t s a r e p o r t e r p r o t e i n f o rd e g r a d a t i o n w h i l e r e t a i n i n g i t s N - t e r m i n a l M e t ( M . G o n z a l e z ,F . L e v y , M . G h i s l a i n , a n d A . V . , u n p u b l i s h e d d a t a ) . T h i s f i n d i n gs u g g e s t s t h a t N - r e c o g n i n b i n d s n o t o n l y t o N - d e g r o n s b u t a l s ot o a d e g r o n t h a t c o n s i s t s o f a n e n t i r e l y i n t e r n a l s e q u e n c e m o t i f .B y c o n t r a s t , t w o o t h e r e x a m i n e d e x t e n s i o n s w e r e f o u n d t o b ec l e a v e d a f t e r N - t e r m i n a l M e t , y i e l d i n g d e s t a b i l i z i n g N -t e r m i n a l r e s i d u e s ( 5 1 , 5 2 ) . I n s u m , w e a r e j u s t b e g i n n i n g t ou n d e r s t a n d t h e p r o c e s s i n g r e a c t i o n s t h a t y i e l d a d e s t a b i l i z i n gN - t e r m i n a l r e s i d u e i n a n o n - p o l y p r o t e i n c o n t e x t .

M e c h a n i c s o f N - D e g r o n

S t o c h a s t i c C a p t u r e M o d e l . S t u d i e s w i t h O 3 g a l - a n d D H F R -b a s e d N - e n d r u l e s u b s t r a t e s ( 9 , 1 2 , 1 6 ) s u g g e s t e d a s t o c h a s t i cv i e w o f t h e N - d e g r o n , i n w h i c h s p e c i f i c L y s r e s i d u e s o f a nN - e n d r u l e s u b s t r a t e c a n b e a s s i g n e d a p r o b a b i l i t y o f b e i n gu t i l i z e d a s a u b i q u i t y l a t i o n s i t e . T h i s p r o b a b i l i t y d e p e n d s o nt i m e - a v e r a g e d s p a t i a l p o s i t i o n a n d m o b i l i t y o f a p r o t e i n ' s L y s .F o r s o m e , a n d o f t e n f o r m o s t , o f t h e L y s r e s i d u e s i n a n N - e n dr u l e s u b s t r a t e , t h e p r o b a b i l i t y o f s e r v i n g a s a u b i q u i t y l a t i o n s i t ew o u l d b e n e g l i g i b l e b e c a u s e o f t h e L y s ' s l a c k o f m o b i l i t ya n d / o r i t s d i s t a n c e f r o m a d e s t a b i l i z i n g N - t e r m i n a l r e s i d u e . I nt h i s " s t o c h a s t i c c a p t u r e " m o d e l ( F i g . 2 F ) , t h e f o l d e d c o n f o r -m a t i o n o f a s u b s t r a t e w o u l d b e e x p e c t e d t o s l o w d o w n o rp r e c l u d e t h e s e a r c h f o r a L y s r e s i d u e , u n l e s s i t i s o p t i m a l l yp o s i t i o n e d i n t h e f o l d e d s u b s t r a t e .

T h e b i p a r t i t e d e s i g n o f N - d e g r o n ( F i g . 2 B ) i s l i k e l y t o b e a l s oc h a r a c t e r i s t i c o f o t h e r U b - d e p e n d e n t d e g r a d a t i o n s i g n a l s -p r e s e n t i n a m u l t i t u d e o f n a t u r a l l y s h o r t - l i v e d p r o t e i n s t h a ti n c l u d e c y c l i n s ( 3 ) , I K B a ( 5 4 ) , a n d c - J u n ( 2 1 ) . T h e f i r s t c o m p o -n e n t o f t h e s e d e g r o n s i s a n i n t e r n a l r e g i o n o f a p r o t e i n ( i n s t e a do f i t s N - t e r m i n a l r e s i d u e ) t h a t i s s p e c i f i c f o r e a c h d e g r a d a t i o ns i g n a l . T h e s e c o n d c o m p o n e n t i s a n i n t e r n a l L y s r e s i d u e ( o rr e s i d u e s ) . A d e g r o n m a y a l s o c o n t a i n r e g u l a t o r y d e t e r m i n a n t sw h o s e m o d i f i c a t i o n ( e . g . , p h o s p h o r y l a t i o n / d e p h o s p h o r y l a -t i o n ) c a n m o d u l a t e t h e a c t i v i t y o f t h i s d e g r o n ( 1 4 , 2 1 ) .

C i s - T r a n s R e c o g n i t i o n a n d S u b u n i t - S p e c i f i c D e g r a d a t i o n o fO l i g o m e r i c P r o t e i n s . T h e t w o d e t e r m i n a n t s o f N - d e g r o n c a n b er e c o g n i z e d e i t h e r i n c i s o r i n t r a n s ( F i g . 2 C a n d D ) ( r e f . 1 2 ; F .L e v y a n d A . V . , u n p u b l i s h e d d a t a ) . E x p e r i m e n t s t h a t r e v e a l e d t h et r a n s - r e c o g n i t i o n h a v e a l s o b r o u g h t t o l i g h t a r e m a r k a b l e f e a t u r eo f t h e N - e n d r u l e p a t h w a y : o n l y t h o s e s u b u n i t s o f a n o l i g o m e r i cp r o t e i n t h a t c o n t a i n t h e u b i q u i t y l a t i o n s i t e ( b u t n o t n e c e s s a r i l y ad e s t a b i l i z i n g N - t e r m i n a l r e s i d u e ) a r e a c t u a l l y d e g r a d e d ( 1 2 ) .W h a t m i g h t b e t h e m e c h a n i s m o f s u b u n i t - s p e c i f i c p r o t e o l y s i s ? A" s i m p l e " m o d e l i s s u g g e s t e d b y t h e b i n d i n g o f a s u b s t r a t e - l i n k e dm u l t i - U b c h a i n t o a c o m p o n e n t o f t h e p r o t e a s o m e ( 5 5 ) . S p e c i f -i c a l l y , a s u b u n i t o f a n o l i g o m e r i c s u b s t r a t e b o u n d t o t h e p r o t e a -s o m e t h r o u g h a s u b u n i t - l i n k e d m u l t i - U b c h a i n m a y b e t h e o n l ys u b u n i t t h a t u n d e r g o e s f u r t h e r m e c h a n o c h e m i c a l p r o c e s s i n g b yA T P - d e p e n d e n t , c h a p e r o n e - l i k e c o m p o n e n t s o f t h e 2 6 S p r o t e a -s o m e . T h e s e c o m p o n e n t s m e d i a t e t h e u n f o l d i n g a n d t r a n s l o c a -t i o n s t e p s t h a t c a u s e a m o v e m e n t o f t h e s u b u n i t t o w a r d a c t i v e s i t e si n t h e p r o t e a s o m e ' s i n t e r i o r , a n d i n t h e p r o c e s s d i s s o c i a t e t h i s

s u b u n i t f r o m t h e r e s t o f o l i g o m e r i c s u b s t r a t e . I n t h i s m e c h a n i s m ,t h e i n i t i a l b i n d i n g o f N - r e c o g n i n t o a n o t h e r s u b u n i t - t h e o n e t h a tb e a r s a d e s t a b i l i z i n g N - t e r m i n a l r e s i d u e b u t n o t t h e L y s d e t e r -m i n a n t ( F i g . 2 C ) - m a y b e e i t h e r t o o t r a n s i e n t ( l a s t i n g , i n a" p r o d u c t i v e " e n g a g e m e n t , o n l y l o n g e n o u g h f o r a L y s t o b ec a p t u r e d o n a n e a r b y s u b u n i t ) o r s t e r i c a l l y u n f a v o r a b l e f o r t h ed e l i v e r y o f t h i s s u b u n i t t o t h e i n t e r i o r o f t h e p r o t e a s o m e .

S i n c e o t h e r U b - d e p e n d e n t d e g r a d a t i o n s i g n a l s a p p e a r t o b eo r g a n i z e d s i m i l a r l y t o t h e N - d e g r o n ( a " p r i m a r y " r e c o g n i t i o nd e t e r m i n a n t a n d a n i n t e r n a l l y s i n e o r l y s i n e s ) , s u b u n i t s e l e c t i v i t yi s l i k e l y t o b e a g e n e r a l f e a t u r e o f p r o t e o l y s i s b y t h e Ub s y s t e m ( 6 ) .E x a m p l e s o f p h y s i o l o g i c a l l y r e l e v a n t s u b u n i t - s e l e c t i v e p r o t e o l y s i si n c l u d e t h e d e g r a d a t i o n o f p 5 3 i n a c o m p l e x w i t h t h e p a p i l l o m a -v i r a l p r o t e i n E 6 ( 3 8 , 5 6 ) a n d t h e d e g r a d a t i o n o f a c y c l i n i n a

c o m p l e x w i t h a c y c l i n - d e p e n d e n t k i n a s e ( 3 ) .T h e H a i r p i n I n s e r t i o n M o d e l a n d t h e F u n c t i o n o f t h e M u l t i - U b

C h a i n . F o r m a t i o n o f a s u b s t r a t e - l i n k e d m u l t i - U b c h a i n p r o d u c e sa n a d d i t i o n a l b i n d i n g s i t e ( o r s i t e s ) f o r c o m p o n e n t s o f t h ep r o t e a s o m e ( 6 , 5 5 ) . T h e r e s u l t i n g i n c r e a s e i n a f f i n i t y - i . e . , a

d e c r e a s e i n t h e r a t e o f d i s s o c i a t i o n o f t h e p r o t e a s o m e - s u b s t r a t ec o m p l e x - c a n b e u s e d t o f a c i l i t a t e p r o t e o l y s i s . S u p p o s e t h a t a

r a t e - l i m i t i n g s t e p w h i c h l e a d s , s e v e r a l s t e p s l a t e r , t o t h e f i r s tp r o t e o l y t i c c l e a v a g e o f t h e p r o t e a s o m e - b o u n d s u b s t r a t e i s a nu n f o l d i n g o f a r e l e v a n t r e g i o n o f t h e s u b s t r a t e . I f s o , a n i n c r e a s ei n s t a b i l i t y o f t h e p r o t e a s o m e - s u b s t r a t e c o m p l e x , b r o u g h t a b o u tb y t h e m u l t i - U b c h a i n , s h o u l d f a c i l i t a t e s u b s t r a t e d e g r a d a t i o n ,b e c a u s e t h e l o n g e r t h e a l l o w e d " w a i t i n g " t i m e , t h e g r e a t e r t h ep r o b a b i l i t y o f a r e q u i r e d u n f o l d i n g e v e n t . A n o t h e r ( n o t m u t u a l l ye x c l u s i v e ) p o s s i b i l i t y i s t h a t a s u b s t r a t e - l i n k e d m u l t i - U b c h a i n a c t sa s a p r o x i m i t y t r a p f o r p a r t i a l l y u n f o l d e d s t a t e s o f a s u b s t r a t e . T h i sm i g h t b e a c h i e v e d t h r o u g h r e v e r s i b l e i n t e r a c t i o n s o f t h e c h a i n ' sUb m o i e t i e s w i t h r e g i o n s o f t h e s u b s t r a t e t h a t u n d e r g o l o c a lu n f o l d i n g . A p r e d i c t i o n common t o b o t h m o d e l s i s t h a t t h ed e g r a d a t i o n o f a s u b s t r a t e w h o s e c o n f o r m a t i o n p o s e s l e s s o f a

k i n e t i c i m p e d i m e n t t o t h e p r o t e a s o m e s h o u l d b e l e s s d e p e n d e n to n U b a n d u b i q u i t y l a t i o n t h a n t h e d e g r a d a t i o n o f a n o t h e r w i s es i m i l a r b u t m o r e s t a b l y f o l d e d s u b s t r a t e .Ho w i s a p r o t e a s o m e - b o u n d , u b i q u i t y l a t e d p r o t e i n d i r e c t e d

t o t h e i n t e r i o r o f t h e p r o t e a s o m e ? T h i s p r o b l e m i s a n a l o g o u st o t h e o n e i n s t u d i e s o f t r a n s m e m b r a n e c h a n n e l s f o r p r o t e i nt r a n s l o c a t i o n ( 1 3 ) . C o u l d t h e s o l u t i o n s b e s i m i l a r i n t h e s es y s t e m s , r e f l e c t i n g , p e r h a p s , a common a n c e s t r y o f t r a n s l o c a -t i o n c h a n n e l s a n d p r o t e a s o m e s ? A m o d e l i n F i g . 2E p r o p o s e s ,b y a n a l o g y w i t h t r a n s l o c a t i o n s y s t e m s , a " h a i r p i n " i n s e r t i o nm e c h a n i s m f o r t h e i n i t i a t i o n o f p r o t e o l y s i s b y t h e 2 6 S p r o t e a -s o m e . A b i a s e d r a n d o m w a l k ( " t h e r m a l r a t c h e t " ) t h a t i s l i k e l yt o u n d e r l i e t h e t r a n s l o c a t i o n o f p r o t e i n s a c r o s s m e m b r a n e s( 1 3 ) m a y a l s o b e r e s p o n s i b l e f o r t h e movement o f t h e s u b -s t r a t e ' s p o l y p e p t i d e c h a i n t h r o u g h t h e p r o t e a s o m e , w i t h c l e a v -a g e p r o d u c t s d i f f u s i n g o u t f r o m t h e p r o t e a s o m e ' s d i s t a l e n da n d t h e r e b y c o n t r i b u t i n g t o t h e n e t b i a s i n t h e c h a i n ' s b i d i -r e c t i o n a l s a l t a t i o n s t h r o u g h t h e p r o t e a s o m e c h a n n e l .Two f i n d i n g s i n d i c a t e t h a t u n f o l d i n g o f a t a r g e t e d N - e n d

r u l e s u b s t r a t e i s a p r e r e q u i s i t e f o r i t s d e g r a d a t i o n b y t h e 2 6 Sp r o t e a s o m e . M e t h o t r e x a t e - a f o l i c a c i d a n a l o g a n d h i g h -a f f i n i t y l i g a n d o f D H F R -c a n i n h i b i t t h e d e g r a d a t i o n o f a nN - e n d r u l e s u b s t r a t e s u c h a s Arg-DHFR b y t h e N - e n d r u l ep a t h w a y ( 5 7 ) . T h i s r e s u l t s u g g e s t s t h a t a c r i t i c a l p o s t -u b i q u i t y l a t i o n s t e p f a c e d b y t h e p r o t e a s o m e i n c l u d e s a " s u f -f i c i e n t " c o n f o r m a t i o n a l p e r t u r b a t i o n o f t h e p r o t e a s o m e -b o u n d s u b s t r a t e . F u r t h e r , i t w a s s h o w n t h a t t h e N - e n d r u l e -m e d i a t e d d e g r a d a t i o n o f a 1 7 - k D a N - t e r m i n a l f r a g m e n t o f t h e7 0 - k D a S i n d b i s v i r u s RNA p o l y m e r a s e i s n o t p r e c l u d e d b y t h ec o n v e r s i o n o f a l l o f t h e f r a g m e n t ' s 1 0 L y s r e s i d u e s i n t o A r gr e s i d u e s , w h i c h c a n n o t b e u b i q u i t y l a t e d ( T . R u m e n a p f , J .S t r a u s s , a n d A . V . , u n p u b l i s h e d d a t a ) . T h u s , t h e u b i q u i t y l a t i o nr e q u i r e m e n t o f p r e v i o u s l y s t u d i e d N - e n d r u l e s u b s t r a t e s mayb e a c o n s e q u e n c e o f t h e i r r e l a t i v e l y s t a b l e c o n f o r m a t i o n s . T h eb i n d i n g o f a l a r g e l y u n f o l d e d s u b s t r a t e ( s u c h a s a f r a g m e n t o fS i n d b i s v i r u s RNA p o l y m e r a s e ) b y t h e t a r g e t i n g c o m p l e x o ft h e N - e n d r u l e p a t h w a y m a y b e s u f f i c i e n t f o r d e l i v e r y o f t h es u b s t r a t e t o t h e p r o t e a s o m e ' s a c t i v e s i t e s i n t h e a b s e n c e o f a

m u l t i - U b c h a i n . I n t h e l a n g u a g e o f m o d e l s i n F i g . 2 E a n d F ,





t h e " w a i t i n g " ' t i m e f o r a b o u n d a n d c o n f o r m a t i o n a l l y u n s t a b l es u b s t r a t e m a y b e s h o r t e n o u g h n o t t o r e q u i r e t h e f o r m a t i o n o fa d i s s o c i a t i o n - s l o w i n g d e v i c e s u c h a s a m u l t i - U b c h a i n .

S u b s t r a t e s a n d F u n c t i o n s o f t h e N - E n d R u l e P a t h w a y

T h e N-End R u l e a n d O s m o r e g u l a t i o n i n Y e a s t . A s y n t h e t i cl e t h a l s c r e e n w a s u s e d t o i s o l a t e a n S . c e r e v i s i a e m u t a n t , t e r m e ds l n l ( f o r s y n t h e t i c l e t h a l o f N - e n d r u l e ) , w h o s e v i a b i l i t yr e q u i r e s t h e p r e s e n c e o f UBRI ( 5 8 ) . SLN1 h a s b e e n f o u n d t oe n c o d e a e u k a r y o t i c h o m o l o g o f t w o - c o m p o n e n t r e g u l a -t o r s - a l a r g e f a m i l y o f p r o t e i n s p r e v i o u s l y e n c o u n t e r e d o n l y i nb a c t e r i a ( 5 9 ) . T h e p r o p e r t i e s o f S . c e r e v i s i a e S l n l p a r e c o n s i s -t e n t w i t h i t b e i n g a s e n s o r c o m p o n e n t o f t h e o s m o r e g u l a t o r y(HOG) p a t h w a y ( 6 0 ) . S i n c e a n o t h e r w i s e l e t h a l h y p o m o r p h i cm u t a t i o n i n SLN1 c a n b e s u p p r e s s e d b y t h e p r e s e n c e o f U b r l p( N - r e c o g n i n ) ( 5 8 , 5 9 ) , i t i s l i k e l y t h a t o n e o r m o r e o f t h ep r o t e i n s ( e . g . , k i n a s e s ) w h o s e a c t i v i t y i s d o wn - r e g u l a t e d b yS l n l p c a n a l s o b e d o w n - r e g u l a t e d t h r o u g h t h e i r d e g r a d a t i o n b yt h e N - e n d r u l e p a t h w a y . T h e r e l e v a n t p h y s i o l o g i c a l N - e n d r u l es u b s t r a t e ( s ) r e m a i n s t o b e i d e n t i f i e d .

T h e N - E n d R u l e a n d P e p t i d e I m p o r t . A l a g r a m a m e t a l . ( 6 1 )h a v e f o u n d t h a t u b r l A y e a s t c e l l s a r e u n a b l e t o i m p o r t d i - a n dt r i p e p t i d e s . R e c e n t r e s u l t s ( C . B y r d a n d A . V . , u n p u b l i s h e dd a t a ) i n d i c a t e t h a t U b r l p ( N - r e c o g n i n ) c o n t r o l s t h e a c t i v i t y o ft h e p e p t i d e t r a n s p o r t e r P t r 2 p , a n i n t e g r a l p l a s m a m e m b r a n e

p r o t e i n , b y r e g u l a t i n g t h e s y n t h e s i s a n d / o r m e t a b o l i c s t a b i l i t yo f PTR2 m R N A . I n o n e m o d e l , a t r a n s c r i p t i o n a l r e p r e s s o r o fPTR2 i s s h o r t - l i v e d , b e i n g d e g r a d e d b y t h e N - e n d r u l e p a t h w a y .C o n s i s t e n t w i t h t h i s m e c h a n i s m , t h e c o n t r o l o f PTR2 e x p r e s -s i o n b y U b r l p w a s f o u n d t o i n v o l v e t h e U b - c o n j u g a t i n g ( E 2 )e n z y m e U b c 2 p , a k n o w n c o m p o n e n t o f t h e N - e n d r u l e p a t h w a y( F i g . 3 ) . U b c 4 p E2 e n z y m e c a n p a r t i a l l y c o m p e n s a t e f o r t h ea b s e n c e o f U b c 2 p ; a d e l e t i o n o f b o t h UBC2 a n d UBC4 r e s u l t si n c e l l s t h a t d o n o t e x p r e s s P t r 2 p a n d a r e u n a b l e t o i m p o r tp e p t i d e s , s i m i l a r l y t o u b r l A c e l l s .A s c r e e n f o r m u t a n t s t h a t a l l o w a b y p a s s o f t h e r e q u i r e m e n t f o r

U B R I i n p e p t i d e i m p o r t i d e n t i f i e d a g e n e , C U P 9 , t h a t e n c o d e s a

h o m e o d o m a i n - c o n t a i n i n g p r o t e i n . C u p 9 p i s s h o r t - l i v e d ; i t s d e g -r a d a t i o n r e q u i r e s UBRI ( C . B y r d a n d A . V . , u n p u b l i s h e d d a t a ) .C u p 9 p i s l i k e l y t o b e a t r a n s c r i p t i o n a l r e p r e s s o r o f P T R 2 . R e -m a r k a b l y , a n e a r l i e r s t u d y ( 6 2 ) i d e n t i f i e d CUP9 a s a g e n e w h o s e

i n a c t i v a t i o n d e c r e a s e s t h e r e s i s t a n c e o f S . c e r e v i s i a e t o t h e t o x i c i t yo f c o p p e r i o n s i n t h e p r e s e n c e o f a n o n f e r m e n t a b l e c a r b o n

s o u r c e , s u g g e s t i n g a r o l e f o r C u p 9 p i n d e t o x i f i c a t i o n o f c o p p e r .A l t h o u g h t h e c o n n e c t i o n b e t w e e n p e p t i d e i m p o r t a n d r e s i s t a n c et o c o p p e r t o x i c i t y r e m a i n s o b s c u r e , o u r f i n d i n g s , t a k e n t o g e t h e rw i t h t h e r e s u l t s o f K n i g h t e t a l . ( 6 2 ) , s u g g e s t t h a t t h e N - e n d r u l ep a t h w a y m a y b e i n v o l v e d i n t h e c o n t r o l o f b o t h p e p t i d e i m p o r ta n d c o p p e r h o m e o s t a s i s .O n a P o s s i b l e F u n c t i o n o f t h e N-End R u l e P a t h w a y i n

A p o p t o s i s . U n t i l r e c e n t l y , a p o p t o s i s ( " p r o g r a m m e d " c e l ld e a t h ) ( 6 3 ) w a s c o n s i d e r e d t o b e a n a t t r i b u t e o f m u l t i c e l l u l a rb u t n o t u n i c e l l u l a r o r g a n i s m s . H o w e v e r , g i v e n t h e n e a r -

i d e n t i t y o f c e l l s i n a q u a s i c l o n a l p o p u l a t i o n o f s i n g l e - c e l lo r g a n i s m s , s e l e c t i o n p r e s s u r e s may f a v o r t h e e m e r g e n c e o f a n

a p o p t o t i c r e s p o n s e , f o r i n s t a n c e t o a s t r e s s o f s t a r v a t i o n . B yk i l l i n g a f r a c t i o n o f a c e l l p o p u l a t i o n , t h i s r e s p o n s e may b e n e f i t

t h e r e s t o f i t . One e x a m p l e i s t h e mazEF o p e r o n o f E . c o l i t h a te n c o d e s a t o x i n / a n t i t o x i n p a i r ( 6 4 ) . T h e l o n g - l i v e d MazFp r o t e i n i s t o x i c ; t h e s h o r t - l i v e d MazE b i n d s t o MazF a n dc o u n t e r a c t s i t s t o x i c i t y . I f t h e e x p r e s s i o n o f t h e mazEF o p e r o nf a l l s b e l o w a c e r t a i n t h r e s h o l d , a s c a n h a p p e n d u r i n g s t a r v a t i o ni n E . c o l i , t h e l e v e l o f a n t i t o x i n MazE w o u l d d e c r e a s e m o r er a p i d l y t h a n t h e l e v e l o f t o x i n M a z F , r e s u l t i n g i n a s t a r v a t i o n -i n d u c e d p r o g r a m m e d c e l l d e a t h ( 6 4 ) . B e f o r e t h e i d e n t i f i c a t i o no f mazEF i n t h e E . c o l i c h r o m o s o m e , a n a l o g o u s p a i r s o f g e n e s( " a d d i c t i o n m o d u l e s " ) h a v e b e e n f o u n d i n a n u m b e r o f

p l a s m i d s , w h e r e t h e y e n s u r e t h e p l a s m i d s ' r e t e n t i o n i n t h e i rh o s t s . MazE i s d e g r a d e d b y t h e p r o t e a s e ClpAP ( 6 4 ) - t h e

s a m e p r o t e a s e t h a t d e g r a d e s N - e n d r u l e s u b s t r a t e s i n E . c o l i( F i g . 4 ) . I t i s u n k n o w n w h e t h e r MazE c o n t a i n s a p r e - N - d e g r o no r a n o t h e r d e g r o n r e c o g n i z e d b y C l p A P .

A n e s s e n t i a l a s p e c t o f a p o p t o s i s i n m e t a z o a n s may a l s o b ec o n t r o l l e d b y a p a i r ( o r p a i r s ! ) o f p r o t e i n s - " a p o p t o s i s m o d -u l e s " - t h a t a c t s i m i l a r l y t o b a c t e r i a l a d d i c t i o n m o d u l e s . F u r -

t h e r , we s u g g e s t t h a t t h e s h o r t - l i v e d c o m p o n e n t o f a n a p o p t o s i sm o d u l e may b e a n N - e n d r u l e s u b s t r a t e . One r e a s o n f o rc o n s i d e r i n g t h i s i d e a i s t h e f a c i l i t y ( a s i n g l e c u t ) a n d i r r e v e r s -i b i l i t y o f a p r o c e s s t h a t c a n c o n v e r t a n i n i t i a l l y l o n g - l i v e da n t i t o x i n c o m p o n e n t o f a n a p o p t o s i s m o d u l e i n t o a s h o r t - l i v e dp r o t e i n d e g r a d e d b y t h e N - e n d r u l e p a t h w a y . S p e c i f i c a l l y , wep r o p o s e t h a t t h e i n d u c t i o n o f a p o p t o s i s b y i n t e r l e u k i n - 1 f -

c o n v e r t i n g e n z y m e ( I C E ) - l i k e p r o t e a s e s ( 6 5 , 6 6 ) may p r o c e e dt h r o u g h t h e c l e a v a g e o f a n ( u n k n o w n ) a n t i t o x i n c o m p o n e n t o fa n a p o p t o s i s m o d u l e b y a n ICE o r I C E - l i k e p r o t e a s e . T h i sc l e a v a g e , w h i l e n o t n e c e s s a r i l y i n a c t i v a t i n g t h e a n t i t o x i n ' sf u n c t i o n a s s u c h , w o u l d e x p o s e a d e s t a b i l i z i n g r e s i d u e a t t h e Nt e r m i n u s o f a c l e a v a g e p r o d u c t , r e n d e r i n g i t s h o r t - l i v e d a n dt h e r e b y r e l e a s i n g a p r e v i o u s l y i n h i b i t e d , r e l a t i v e l y l o n g - l i v e dt o x i n . I m p l i c i t i n t h i s h y p o t h e s i s i s t h e a s s u m p t i o n t h a t a

c l e a v a g e o f a n t i t o x i n b y a n I C E - l i k e p r o t e a s e i s , b y i t s e l f ,i n s u f f i c i e n t ( o r n o t i m m e d i a t e l y s u f f i c i e n t ) f o r t h e d i s r u p t i o no f a n t i t o x i n ' s f u n c t i o n , a n d t h a t p r o c e s s i v e d e g r a d a t i o n o f a C -t e r m i n a l c l e a v a g e f r a g m e n t o f a n t i t o x i n b y t h e N - e n d r u l ep a t h w a y i s a r e q u i r e d p o s t - c l e a v a g e s t e p .

T h e k n o w n t a r g e t s o f I C E - f a m i l y p r o t e a s e s c o n t a i n A s p a tt h e P 1 p o s i t i o n a n d a s m a l l r e s i d u e , t y p i c a l l y A l a o r S e r , a t t h eP 1 ' p o s i t i o n - t h e f u t u r e N - t e r m i n u s o f t h e C - t e r m i n a l c l e a v -a g e f r ag m en t . A l a [ a n d p o s s i b l y a l s o S e r i n s o m e s e t t i n g s ( 2 6 ) ]i s a w e a k l y d e s t a b i l i z i n g N - d P r e s i d u e i n t h e m a m m a l i a n N - e n dr u l e ( 1 , 1 1 ) . H o w e v e r , I C E - f a m i l y p r o t e a s e s c a n a l s o c l e a v ep e p t i d e b o n d s w h o s e P 1 ' p o s i t i o n i s o c c u p i e d b y A s n - as t r o n g l y d e s t a b i l i z i n g N - d t r e s i d u e i n t h e N - e n d r u l e ( F i g . S A ) .E x a m p l e s o f p r o t e i n s c l e a v e d b y I C E - f a m i l y p r o t e a s e s a t t h eA s p - A s n b o n d i n c l u d e a c t i n ( 6 5 ) a n d p r o t e i n k i n a s e CA ( 6 6 ) .I n a d d i t i o n , t h e a c t i v a t i o n o f a t l e a s t o n e I C E - f a m i l y p r o t e a s ea l s o i n v o l v e s i t s p r o t e o l y t i c c l e a v a g e a t t h e A s p - A s n b o n d ( 6 7 ) ,s u g g e s t i n g t h a t t h e e n z y m a t i c a c t i v a t i o n o f t h i s o r a n a l o g o u sp r o t e a s e s may s i m u l t a n e o u s l y r e n d e r t h e m s h o r t - l i v e d i nv i v o - a p o s s i b l e s o u r c e o f n e g a t i v e c o n t r o l .

I n s u m , t h e h y p o t h e s i s i n v o k e s a n e f f e c t o r o f a p o p t o s i s w h i c hi s a c t i v a t e d w h e n i t s i n h i b i t o r i s c l e a v e d b y a n I C E - l i k e

p r o t e a s e , p e r h a p s a t t h e A s p - A s n b o n d , y i e l d i n g a s h o r t - l i v e dp r o t e i n d e g r a d e d b y t h e N - e n d r u l e p a t h w a y . I t i s a l s o p o s s i b l et h a t a n N - e n d r u l e s u b s t r a t e r e g u l a t e s a p o p t o s i s u p s t r e a m o f

I C E - l i k e p r o t e a s e s . One p r e d i c t i o n o f t h e f o r m e r m o d e l i s t h a tm e t a b o l i c s t a b i l i z a t i o n o f t h e p r e s u m e d A s n - b e a r i n g ( c l e a v e d )i n h i b i t o r , f o r e x a m p l e , t h r o u g h a p e r t u r b a t i o n o f t h e N - e n dr u l e p a t h w a y , may i n h i b i t t h e a p o p t o s i s . T h i s p r e d i c t i o n c a n b et e s t e d i n m o u s e c e l l s t h a t l a c k t h e A s n - s p e c i f i c N - t e r m i n a la m i d a s e ( N t N - a m i d a s e ) ( F i g . 5 A ) ( 3 3 ) . C o n s t r u c t i o n o f n t a n l Am o u s e m u t a n t s i s u n d e r w a y ( Y . T . Kwon a n d A . V . , u n p u b -l i s h e d d a t a ) .

Ge S u b u n i t o f G P r o t e i n . O v e r e x p r e s s i o n o f t h e N - e n d r u l ep a t h w a y w a s f o u n d t o i n h i b i t t h e g r o w t h o f h a p l o i d b u t n o t d i p l o i dc e l l s ( 6 8 ) . T h i s p l o i d y - d e p e n d e n t t o x i c i t y w a s t r a c e d t o t h ee n h a n c e d d e g r a d a t i o n o f G p a l p , t h e Ga s u b u n i t o f t h e G p r o t e i nt h a t r e g u l a t e s c e l l d i f f e r e n t i a t i o n i n r e s p o n s e t o m a t i n g p h e r o -m o n e . T h e h a l f - l i f e o f n e w l y f o r m e d Ga a t 3 0 ° C i s ' 5 0 m i n i nw i l d - t y p e c e l l s , ' 1 0 m i n i n c e l l s o v e r e x p r e s s i n g t h e N - e n d r u l ep a t h w a y , a n d > 1 0 h r i n c e l l s l a c k i n g t h e p a t h w a y . T h e d e g r a d a -t i o n o f Ga i s p r e c e d e d b y i t s m u l t i u b i q u i t y l a t i o n ( 6 8 ) . L i k e o t h e rG a s u b u n i t s o f G p r o t e i n s , t h e S . c e r e v i s i a e G p a l p b e a r s a

c o n j u g a t e d N - t e r m i n a l m y r i s t o y l m o i e t y , w h i c h a p p e a r s t o b er e t a i n e d d u r i n g t h e t a r g e t i n g o f G p a l p f o r d e g r a d a t i o n . Ad e l e t i o n o f t h e f i r s t 8 8 r e s i d u e s o f G p a l p g r e a t l y a c c e l e r a t e s i t sd e g r a d a t i o n b u t r e t a i n s t h e r e q u i r e m e n t f o r U b r l p ( K M a d u r a ,u n p u b l i s h e d d a t a ) . T h e s e d a t a s u g g e s t t h a t U b r l p r e c o g n i z e s a

f e a t u r e o f Ga t h a t i s d i s t i n c t f r o m t h e N - d e g r o n . A n o t h e r ,N - d e g r o n - b a s e d m o d e l i n v o k e s a t r a n s - t a r g e t i n g m e c h a n i s m ( F i g .2 C a n d D ) . A G , - t y p e Ga i s s h o r t - l i v e d i n mouse c e l l s a s w e l l ( 6 9 ) ,c o n s i s t e n t w i t h t h e p o s s i b i l i t y t h a t Ga s u b u n i t s o f o t h e r o r g a n -i s m s a r e a l s o d e g r a de d b y t h e N - e n d r u l e p a t h w a y . T h e a c t i v a t i o no f m o u s e G a s h o r t e n s i t s i n v i v o h a l f - l i f e ( 6 9 ) , s u g g e s t i n g a n

a d a p t a t i o n - r e l a t e d f u n c t i o n o f Ga d e g r a d a t i o n .





S i n d b i s V i r u s R N A P o l y m e r a s e a n d O t h e r V i r a l P r o t e i n s .T h e S i n d b i s v i r u s RNA p o l y m e r a s e , a l s o c a l l e d n s P 4 ( n o n -s t r u c t u r a l p r o t e i n 4 ) , i s p r o d u c e d b y a n e n d o p r o t e o l y t i c c l e a v -a g e o f t h e v i r a l p r e c u r s o r p o l y p r o t e i n n s P 1 2 3 4 ( 7 0 ) . T h e n s P 4p r o t e i n b e a r s N - t e r m i n a l T y r ( a n N - d P 2 r e s i d u e ; F i g s . 1 a n dS A ) , a n d i s d e g r a d e d b y t h e N - e n d r u l e p a t h w a y i n r e t i c u l o c y t ee x t r a c t ( 7 1 ) . T y r i s a n N - t e r m i n a l r e s i d u e o f o t h e r a l p h a v i r a lRNA p o l y m e r a s e s a s w e l l ( 7 0 ) , s u g g e s t i n g t h a t t h e s e h o m o l o g so f S i n d b i s v i r u s RNA p o l y m e r a s e a r e a l s o d e g r a d e d b y t h eN - e n d r u l e p a t h w a y . W h e r e a s t h e b u l k o f n e w l y f o r m e d n s P 4

i s r a p i d l y d e g r a d e d , a f r a c t i o n o f n s P 4 i n i n f e c t e d c e l l s i sl o n g - l i v e d , p r e s u m a b l y w i t h i n a r e p l i c a t i o n c o m p l e x t h a t c o n -t a i n s v i r a l a n d h o s t p r o t e i n s ( 7 0 ) .

T h e r e a r e m a n y p o t e n t i a l N - e n d r u l e s u b s t r a t e s d e r i v e df r o m v i r a l p o l y p r o t e i n s ( 7 2 ) . O ne o f t h e m i s t h e i n t e g r a s e o ft h e human i m m u n o d e f i c i e n c y v i r u s ( H I V ) , p r o d u c e d b y c l e a v -a g e s w i t h i n t h e g a g - p o l p r e c u r s o r p o l y p r o t e i n . T h e p r o c e s s e di n t e g r a s e b e a r s N - t e r m i n a l P h e ( 7 2 ) , a s t r o n g l y d e s t a b i l i z i n gN - d P 2 r e s i d u e i n t h e N - e n d r u l e ( F i g . S A ) . T h u s , i t i s p o s s i b l et h a t , s i m i l a r l y t o t h e S i n d b i s v i r u s RNA p o l y m e r a s e , a t l e a s t af r a c t i o n o f HIV i n t e g r a s e i s s h o r t - l i v e d i n v i v o .

c - M o s , a P r o t o on c o p r ot e i n . T h i s 3 9 - k D a S e r / T h r - k i n a s e i se x p r e s s e d p r e d o m i n a n t l y i n m a l e a n d f e m a l e g e r m c e l l s .S a g a t a a n d c o l l e a g u e s ( 1 4 , 7 3 ) h a v e i d e n t i f i e d c - M o s a s ap h y s i o l o g i c a l s u b s t r a t e o f t h e N - e n d r u l e p a t h w a y t h a t i st a r g e t e d f o r d e g r a d a t i o n t h r o u g h i t s N - t e r m i n a l P r o r e s i d u e .

M e t - P r o - S e r - P r o , t h e e n c o d e d N - t e r m i n a l s e q u e n c e o f X e n o -p u s c - M o s , i s c o n s e r v e d a m o n g a l l v e r t e b r a t e s e x a m i n e d ( 7 3 ) .S i n c e t h e N - t e r m i n a l M e t - P r o p e p t i d e b o n d i s r e a d i l y c l e a v e db y t h e m a j o r c y t o s o l i c M e t - a m i n o p e p t i d a s e s ( 4 8 - 5 0 ) , t h ei n i t i a l l y s e c o n d - p o s i t i o n P r o i s e x p e c t e d t o a p p e a r a t t h e Nt e r m i n u s o f n a s c e n t c - M o s c o t r a n s l a t i o n a l l y o r n e a r l y s o .

T h e a c t i v i t y o f t h e P r o - b a s e d N - d e g r o n i n c - M o s i s i n h i b i t e dt h r o u g h t h e p h o s p h o r y l a t i o n o f S e r - 2 [ S e r - 3 i n t h e c - M o s o p e nr e a d i n g f r a m e ( O R F ) ] ( 1 4 , 7 3 ) . D u r i n g t h e m a t u r a t i o n o fX e n o p u s o o c y t e s c - M o s i s p h o s p h o r y l a t e d p a r t i a l l y a n d r e v e r s -i b l y , a n d t h e r e f o r e r e m a i n s s h o r t - l i v e d . L a t e r - a t t h e t i m e o fg e r m i n a l v e s i c l e b r e a k d o w n a n d t h e a r r e s t o f m a t u r e o o c y t e s( e g g s ) a t t h e s e c o n d m e i o t i c m e t a p h a s e , c - M o s b e c o m e sl o n g - l i v e d , o w i n g t o i t s n e a r l y s t o i c h i o m e t r i c p h o s p h o r y l a t i o na t S e r - 2 ( 7 4 ) . F e r t i l i z a t i o n o r m e c h a n i c a l a c t i v a t i o n o f aX e n o p u s e g g r e l e a s e s t h e m e i o t i c a r r e s t t h r o u g h t h e i n d u c e d

d e g r a d a t i o n o f c - M o s - c a u s e d b y a n e a r l y c o m p l e t e d e p h o s -p h o r y l a t i o n o f p h o s p h o s e r i n e - 2 ( 1 4 , 7 3 ) . C o n s i s t e n t w i t h t h i sm o d e l o f t h e N - d e g r o n i n c - M o s , t h e r e p l a c e m e n t o f S e r - 2 w i t hA s p o r G l u ( w h o s e n e g a t i v e c h a r g e m i m i c s t h a t o f t h e p h o s -p h a t e g r o u p ) r e n d e r e d c - M o s l o n g - l i v e d , w h e r e a s t h e r e p l a c e -m e n t o f S e r - 2 w i t h A l a y i e l d e d a c o n s t i t u t i v e l y u n s t a b l e c - M o s( 7 3 ) . L y s - 3 3 ( L y s - 3 4 i n t h e c - M o s ORF) i s a m a j o r u b i q u i t y -l a t i o n s i t e o f t h e c - M o s N - d e g r o n ( 7 3 ) .

I n c o n t r a s t t o N - t e r m i n a l P r o i n t h e c o n t e x t o f c - M o s , t h eN - t e r m i n a l P r o f o l l o w e d b y t h e s e q u e n c e H i s - G l y - S e r - . . . [ t h i s i st h e c o n t e x t o f e n g i n e e r e d N - e n d r u l e s u b s t r a t e s s u c h a s X - f 3 g a la n d X -D H F R ( 5 , 9 ) ] d i d n o t c o n f e r a s h o r t h a l f - l i f e o n a r e p o r t e rp r o t e i n i n e i t h e r y e a s t o r m a m m a l i a n c e l l s ( F . L e v y , T . R u m e n a p f ,a n d A . V . , u n p u b l i s h e d d a t a ) . O n e i n t e r p r e t a t i o n o f t h e s e r e s u l t si s t h a t t h e N - d e g r o n o f c - M o s , w h o s e c o n s e r v e d N - t e r m i n a ls e q u e n c e i s P r o - S e r - P r o - . . . , h a s a " d e g r o n - e n a b l i n g " i n t e r n a ld e t e r m i n a n t a d d i t i o n a l t o , a n d p e r h a p s s p e c i f i c f o r , t h e N -t e r m i n a l P r o . T h e c - M o s N - d e g r o n i s t h e f i r s t e x a m p l e o fN - d e g r o n w h o s e a c t i v i t y i s r e g u l a t e d b y p h o s p h o r y l a t i o n ( 7 3 ) .

C o m p a r t m e n t a l i z e d P r o t e i n s R e t r o t r a n s p o r t e d t o t h e C y -t o s o l . I n c o n t r a s t t o c y t o s o l i c a n d n u c l e a r p r o t e i n s , t h e p r o t e i n st h a t f u n c t i o n i n ( o r p a s s t h r o u g h ) t h e E R , G o l g i , a n d r e l a t e dc o m p a r t m e n t s o f t e n b e a r d e s t a b i l i z i n g N - t e r m i n a l r e s i d u e s - t h e

c o n s e q u e n c e o f c l e a v a g e s p e c i f i c i t y o f s i g n a l p e p t i d a s e s , w h i c hr e m o v e s i g n a l s e q u e n c e s f r o m p r o t e i n s t r a n s l o c a t e d i n t o t h e E R( 5 , 6 ) . T h u s , o n e f u n c t i o n o f t h e N - e n d r u l e p a t h w a y m i g h t b e t h ed e g r a d a t i o n o f p r e v i o u s l y c o m p a r t m e n t a l i z e d p r o t e i n s t h a t" l e a k " i n t o t h e c y t o s o l f r o m c o m p a r t m e n t s s u c h a s t h e E R ( 6 ) .R e m a r k a b l y , i t h a s b e e n f o u n d t h a t a t l e a s t s o m e c o m p a r t m e n -t a l i z e d p r o t e i n s c a n b e r e t r o t r a n s p o r t e d t o t h e c y t o s o l t h r o u g h ar o u t e t h a t r e q u i r e s s p e c i f i c E R p r o t e i n s . U S 1 1 , t h e E R - r e s i d e n t

t r a n s m e m b r a n e p r o t e i n e n c o d e d b y c y t o m e g a l o v i r u s , c a u s e s t h en e w l y t r a n s l o c a t e d m a j o r h i s t o c o m p a t i b i l i t y c o m p l e x (MHC)c l a s s I h e a v y c h a i n t o b e s e l e c t i v e l y r e t r o t r a n s p o r t e d b a c k t o t h ec y t o s o l , w h e r e t h e h e a v y c h a i n i s d e g r a d e d b y a p r o t e a s o m e -d e p e n d e n t p a t h w a y ( 7 5 ) . S i m i l a r l y , C P Y * , a d e f e c t i v e v a c u o l a rc a r b o x y p e p t i d a s e o f S . c e r e v i s i a e , i s r e t r o t r a n s p o r t e d t o t h e c y -t o s o l s h o r t l y a f t e r e n t e r i n g t h e E R , a n d i s d e g r a d e d i n t h e c y t o s o lb y a U b / p r o t e a s o m e - d e p e n d e n t p a t h w a y t h a t r e q u i r e s t h e U b c 7 pU b - c o n j u g a t i n g e n z y m e ( 7 6 ) . W h e t h e r t h e N - e n d r u l e p a t h w a yp l a y s a r o l e i n t h e d e g r a d a t i o n o f r e t r o t r a n s p o r t e d p r o t e i n s

r e m a i n s t o b e d e t e r m i n e d .A p p l i c a t i o n s o f N - D e g r o n

T h e p o r t a b i l i t y a n d m o d u l a r o r g a n i z a t i o n o f N - d e g r o n s m a k ep o s s i b l e a v a r i e t y o f a p p l i c a t i o n s w h o s e common f e a t u r e i s t h ec o n f e r r i n g o f a c o n s t i t u t i v e o r c o n d i t i o n a l m e t a b o l i c i n s t a b i l i t yo n a p r o t e i n o f i n t e r e s t .

T h e N - D e g r o n a n d C o n d i t i o n a l M u t a n t s . A f r e q u e n t p r o b l e mw i t h c o n d i t i o n a l p h e n o t y p e s i s t h e i r l e a k i n e s s - i . e . , u n a c c e p t a b l yh i g h r e s i d u a l a c t i v i t y o f e i t h e r a t e m p e r a t u r e - s e n s i t i v e ( t s ) p r o t e i na t n o n p er m i s s i v e t e m p e ra t u r e o r a g e n e o f i n t e r e s t i n t h e " o f f 's t a t e o f i t s p r o m o t e r . A n o t h e r p r o b l e m i s t h e " p h e n o t y p i c l a g , "w h i c h o f t e n o c c u r s b e t w e e n t h e i m p o s i t i o n o f n o n p e r m i s s i v ec o n d i t i o n s a n d t h e e m e r g e n c e o f a r e l e v a n t n u l l p h e n o t y p e .

I n o n e a p p l i c a t i o n o f t h e N - e n d r u l e t o t h e p r o b l e m o fp h e n o t y p i c l a g , a c o n s t i t u t i v e N - d e g r o n ( p r o d u c e d a s d e -

s c r i b e d i n F i g . 2 A ) w a s f u s e d t o a p r o t e i n e x p r e s s e d f r o m a ni n d u c i b l e p r o m o t e r ( 7 7 , 7 8 ) . T h i s m e t h o d i s c o n s t r a i n e d b y t h en e c e s s i t y o f u s i n g a h e t e r o l o g o u s p r o m o t e r a n d b y a c o n s t i -t u t i v e l y s h o r t h a l f - l i f e o f a t a r g e t p r o t e i n , w h o s e l e v e l s mayt h e r e f o r e b e s u b o p t i m a l u n d e r p e r m i s s i v e c o n d i t i o n s . A na l t e r n a t i v e d e s i g n i s a p o r t a b l e , h e a t - i n d u c i b l e N - d e g r o n t h a ti s i n a c t i v e a t a l o w ( p e r m i s s i v e ) t e m p e r a t u r e b u t b e c o m e sa c t i v e a t a h i g h ( n o n p e r m i s s i v e ) t e m p e r a t u r e ( 1 5 ) . L i n k i n g t h i sd e g r o n t o p r o t e i n s o f i n t e r e s t y i e l d s a new c l a s s o f t s m u t a n t s ,c a l l e d t d ( t e m p e r a t u r e - a c t i v a t e d d e g r o n ) . T h e t d m e t h o d ( 1 5 )d o e s n o t r e q u i r e a n o f t e n u n s u c c e s s f u l s e a r c h f o r a t s m u t a t i o ni n a g e n e o f i n t e r e s t .

T h e N - D e g r o n a n d C o n d i t i o n a l T o x i n s . A m a j o r l i m i t a t i o n o ft h e c u r r e n t p h a r m a c o l o g i c a l s t r a t e g i e s s t e m s f r o m t h e a b s e n c e o fd r u g s t h a t a r e s p e c i f i c f o r t w o o r m o r e i n d e p e n d e n t m o l e c u l a rt a r g e t s . F o r r e a s o n s d i s c u s s e d e l s e w h e r e ( 7 , 7 9 ) , i t i s d e s i r a b l e t o

h a v e a t h e r a p e u t i c a g e n t t h a t r e q u i r e s t h e p r e s e n c e o f t w o o rm o r e p r e d e t e r m i n e d t a r g e t s i n a c e l l f o r i t t o b e k i l l e d , a n d t h a tw o u l d s p a r e a c e l l i f i t l a c k s e v e n o n e o f t h e s e t a r g e t s . C o m b i n i n gt w o " c o n v e n t i o n a l " d r u g s a g a i n s t t w o d i f f e r e n t t a r g e t s i n a

m u l t i d r u g r e g i m e n w o u l d n o t a t t a i n t h i s g o a l , b e c a u s e t h e t w o

d r u g s t o g e t h e r w o u l d p e r t u r b n o t o n l y c e l l s c o n t a i n i n g b o t ht a r g e t s b u t a l s o c e l l s c o n t a i n i n g j u s t o n e o f t h e t a r g e t s . M o r eg e n e r a l l y , i t i s d e s i r a b l e t o h a v e d r u g s t h a t e x h i b i t a c o m b i n a t o r i a ls e l e c t i v i t y , k i l l i n g ( o r o t h e r w i s e m o d i f y i n g ) a c e l l i f , a n d o n l y i f ,i t c o n t a i n s a p r e d e t e r m i n e d s e t o f m o l e c u l a r t a r g e t s a n d a t t h es a m e t i m e l a c k s a n o t h e r p r e d e t e r m i n e d s e t o f m o l e c u l a r t a r g e t s .T h e r a p e u t i c a g e n t s o f t h i s , c u r r e n t l y u n r e a l i s t i c , s e l e c t i v i t y a r e

l i k e l y t o b e f r e e o f s i d e e f f e c t s - t h e b a n e o f p r e s e n t - d a y t h e r a p i e sa g a i n s t d i s e a s e s s u c h a s c a n c e r .A s t r a t e g y f o r d e s i g n i n g r e a g e n t s t h a t a r e s e n s i t i v e t o t h e

p r e s e n c e o r a b s e n c e o f m o r e t h a n o n e t a r g e t a t t h e s a m e t i m e

h a s r e c e n t l y b e e n p r o p o s e d ( 7 , 7 9 ) . T h e k e y f e a t u r e o f newr e a g e n t s , t e r m e d c o m t o x i n s ( c o d o m i n a n c e - m e d i a t e d t o x i n s ) , i st h e i r a b i l i t y t o u t i l i z e c o d o m i n a n c e , a p r o p e r t y c h a r a c t e r i s t i c o fm a n y s i g n a l s i n p r o t e i n s , i n c l u d i n g d e g r o n s a n d n u c l e a r l o c a l -i z a t i o n s i g n a l s ( N L S s ) . C o d o m i n a n c e r e f e r s t o t h e f o l l o w i n gp r o p e r t y o f t h e s e s i g n a l s : e a c h d e g r o n ( o r N L S ) i n a p r o t e i nb e a r i n g t w o o r more d e g r o n s ( o r N L S s ) c a n t a r g e t t h e p r o t e i nf o r d e g r a d a t i o n ( o r t r a n s p o r t t o t h e n u c l e u s ) i n d e p e n d e n t l y o fo t h e r d e g r o n s ( o r N L S s ) i n t h e s a m e p r o t e i n . T h e c r u c i a lp r o p e r t y o f a d e g r o n - b a s e d c o m t o x i n i s t h a t i t s i n t r i n s i ct o x i c i t y i s t h e s a m e i n a l l c e l l s , w h e r e a s i t s h a l f - l i f e ( a n d ,c o n s e q u e n t l y , i t s s t e a d y - s t a t e l e v e l a n d o v e r a l l t o x i c i t y ) i n a c e l ld e p e n d s o n t h e c e l l ' s p r o t e i n c o m p o s i t i o n , s p e c i f i c a l l y o n t h ep r e s e n c e o f " t a r g e t " p r o t e i n s t h a t h a v e b e e n c h o s e n t o d e f i n et h e p r o f i l e o f a c e l l t o b e e l i m i n a t e d . T h e t a r g e t p r o t e i n s w o u l d





b i n d t o t h e i r l i g a n d s i n a c o m t o x i n m o l e c u l e , a n d e i t h e rp h y s i c a l l y o b s t r u c t t h e r e c o g n i t i o n o f d e g r o n s o r i n a c t i v a t et h e m c a t a l y t i c a l l y , f o r e x a m p l e b y p h o s p h o r y l a t i o n . T h e s e a n dr e l a t e d i d e a s a r e d e s c r i b e d e l s e w h e r e ( 7 , 7 9 ) .We a r e e x p l o r i n g t h e f e a s i b i l i t y o f c o m t o x i n s b y u s i n g t h e

N - d e g r o n a s a d e g r a d a t i o n s i g n a l a n d t h e c y t o t o x i c A - c h a i n so f r i c i n o r d i p h t h e r i a t o x i n a s e f f e c t o r d o m a i n s ( T . S u z u k i , I . V .D a v y d o v , a n d A . V . , u n p u b l i s h e d d a t a ) . O u r c u r r e n t a i m i s t od e t e r m i n e w h e t h e r t h e c o n c e p t o f c o m t o x i n s c a n b e i m p l e -m e n t e d i n t h e " e a s y " s e t t i n g o f a c e l l c u l t u r e - w i t h o u t a d -d r e s s i n g , y e t , t h e d e l i v e r y p r o b l e m , t h e i m m u n o g e n i c i t y o fp r o t e i n d r u g s , a n d r e l a t e d c o n c e r n s .

E p i l o g u e

A l t h o u g h m a n y t h i n g s h a v e b e e n l e a r n e d a b o u t t h e N - e n d r u l es i n c e i t s d i s c o v e r y 1 0 y e a r s a g o , s e v e r a l k e y q u e s t i o n s r e m a i nu n a n s w e r e d o r g l i m p s e d a t b e s t . F o r e x a m p l e , t h e d e t a i l e dm e c h a n i c s o f t a r g e t i n g i s n o t u n d e r s t o o d . B i o c h e m i c a l d i s s e c t i o no f t h e N - e n d r u l e p a t h w a y r e c o n s t i t u t e d i n v i t r o f r o m d e f i n e d( c l o n e d ) c o m p o n e n t s w i l l b e e s s e n t i a l f o r a t t a i n i n g t h i s g o a l .C r y s t a l l o g r a p h i c - q u a l i t y s t r u c t u r a l i n f o r m a t i o n a b o u t N -r e c o g n i n a n d t h e e n t i r e t a r g e t i n g c o m p l e x w i l l b e r e q u i r e d a s w e l l .T h e r e c e n t l y e m e r g e d p o s s i b i l i t y t h a t N - r e c o g n i n m a y t a r g e t n o t

o n l y N - d e g r o n s b u t a l s o o t h e r d e g r a d a t i o n s i g n a l s a d d s y e ta n o t h e r l e v e l o f c o m p l e x i t y , w h i c h w i l l h a v e t o b e a d d r e s s e d .

G e n e t i c s c r e e n s f o r p r o t e i n s d e g r a d e d b y t h e N - e n d r u l ep a t h w a y a r e o u r b e s t h o p e f o r b r i n g i n g t o l i g h t p h y s i o l o g i c a lN - e n d r u l e s u b s t r a t e s . I t i s a l r e a d y c l e a r t h a t a t l e a s t s o m e o f t h e s es u b s t r a t e s a r e c o n d i t i o n a l l y u n s t a b l e - f o r e x a m p l e , p a r t i t i o n e db e t w e e n a s h o r t - l i v e d f r e e s u b s t r a t e a n d a l o n g - l i v e d c o m p l e x o ft h e s u b s t r a t e w i t h o t h e r p r o t e i n s . I n a d d i t i o n , f o r s o m e s u b s t r a t e s ,t h e r a t e - l i m i t i n g s t e p i n t h e i r d e g r a d a t i o n m a y b e a p r o c e s s i n g( c l e a v a g e ) e v e n t t h a t p r o d u c e s a n N - d e g r o n f r o m a p r e - N -d e g r o n . I f s o , a s i g n i f i c a n t f r a c t i o n o f e x t a n t s u b s t r a t e m o l e c u l e sm a y b e a r a s t a b i l i z i n g N - t e r m i n a l r e s i d u e . G i v e n t h e s e o b s t a c l e st o i d e n t i f y i n g p h y s i o l o g i c a l N - e n d r u l e s u b s t r a t e s , t h e y a r e l i k e l yt o b e more n u m e r o u s t h a n i s a p p a r e n t a t t h e p r e s e n t t i m e .

I am g r a t e f u l t o t h e c u r r e n t a n d f o r m e r m e m b e r s o f t h e l a b o r a t o r yw h o s e w o r k o n t h e N - e n d r u l e i s d e s c r i b e d i n t h i s r e v i e w . I t h a n kc o l l e a g u e s w h o s e n a m e s a r e c i t e d i n t h e t e x t f o r t h e i r p e r m i s s i o n t o d i s c u s su n p u b l i s h e d d a t a . O u r s t u d i e s a r e s u p p o r t e d b y g r a n t s f r o m t h e N a t i o n a lI n s t i t u t e s o f H e a l t h a n d t h e A s s o c i a t i o n f o r t h e C u r e o f C a n c e r o f t h eP r o s t a t e .

1 . L e v y , F . , J o h n s s o n , N . , R u m e n a p f , T . & V a r s h a v s k y , A . ( 1 9 9 6 ) P r o c . N a t l .A c a d . S c i . USA 9 3 , 4 9 0 7 - 4 9 1 2 .

2 . B a k e r , R . T . & V a r s h a v s k y , A . ( 1 9 9 1 ) P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 8 8 ,1 0 9 0 - 1 0 9 4 .

3 . M u r r a y , A . & H u n t , T . ( 1 9 9 3 ) i n T h e C e l l C y c l e ( F r e e m a n , N Y ) , p p . 6 0 - 6 2 .4 . V a r s h a v s k y , A . ( 1 9 9 1 ) C e l l 6 4 , 1 3 - 1 5 .5 . B a c h m a i r , A . , F i n l e y , D . & V a r s h a v s k y , A . ( 1 9 8 6 ) S c i e n c e 2 3 4 , 1 7 9 - 1 8 6 .6 . V a r s h a v s k y , A . ( 1 9 9 2 ) C e l l 6 9 , 7 2 5 - 7 3 5 .7 . V a r s h a v s k y , A . ( 1 9 9 6 ) C o l d S p r i n g H a r b o r S y m p . Q u a n t . B i o L 6 0 , 4 6 1 - 4 7 8 .8 . T o b i a s , J . W . , S h r a d e r , T . E . , R o c a p , G . & V a r s h a v s k y , A . ( 1 9 9 1 ) S c i e n c e

2 5 4 , 1 3 7 4 - 1 3 7 7 .9 . B a c h m a i r , A . & V a r s h a v s k y , A . ( 1 9 8 9 ) C e l l 5 6 , 1 0 1 9 - 1 0 3 2 .

1 0 . S h r a d e r , T . E . , T o b i a s , J . W. & V a r s h a v s k y , A . ( 1 9 9 3 ) J . B a c t e r i o l . 1 7 5 ,4 3 6 4 - 4 3 7 4 .

1 1 . G o n d a , D . K . , B a c h m a i r , A . , W u n n i n g , I . , T o b i a s , J . W . , L a n e , W . S . &V a r s h a v s k y , A . ( 1 9 8 9 ) J . B i o l . C h e m . 2 6 4 , 1 6 7 0 0 - 1 6 7 1 2 .

1 2 . J o h n s o n , E . S . , G o n d a , D . K & V a r s h a v s k y , A . ( 1 9 9 0 ) N a t u r e ( L o n d o n )3 4 6 , 2 8 7 - 2 9 1 .

1 3 . S c h a t z , G . & D o b b e r s t e i n , B . ( 1 9 9 6 ) S c i e n c e 2 7 1 , 1 5 1 9 - 1 5 2 6 .1 4 . N i s h i z a w a , M . , F u r u n o , N . , O k a z a k i , K . , T a n a k a , H . , O g a w a , Y . & S a g a t a ,N . ( 1 9 9 3 ) EMBO J . 1 2 , 4 0 2 1 - 4 0 2 7 .

1 5 . D o h m e n , R. J . , W u , P . & V a r s h a v s k y , A . ( 1 9 9 4 ) S c i e n c e 2 6 3 , 1 2 7 3 - 1 2 7 6 .1 6 . C h a u , V . , T o b i a s , J . W . , B a c h m a i r , A . , M a r r i o t t , D . , E c k e r , D . , G o n d a ,

D . K & V a r s h a v s k y , A . ( 1 9 8 9 ) S c i e n c e 2 4 3 , 1 5 7 6 - 1 5 8 3 .1 7 . S p e n c e , J . , S a d i s , S . , H a a s , A . L . & F i n l e y , D . ( 1 9 9 5 ) M o l . C e l l . B i o l . 1 5 ,

1 2 6 5 - 1 2 7 3 .1 8 . H e r s h k o , A . ( 1 9 9 1 ) T r e n d s B i o c h e m . S c i . 1 6 , 2 6 5 - 2 6 8 .1 9 . J e n t s c h , S . ( 1 9 9 2 ) A n n u . R e v . G e n e t . 2 6 , 1 7 9 - 2 0 7 .2 0 . H o c h s t r a s s e r , M . ( 1 9 9 5 ) C u r r . B i o l . 7 , 2 1 5 - 2 2 3 .2 1 . P a h l , H . L . & B a e u e r l e , P . A . ( 1 9 9 6 ) C u r r . O p i n . C e l l B i o l . 8 , 3 4 0 - 3 4 7 .2 2 . D o h m e n , R . J . , M a d u r a , K . , B a r t e l , B . & V a r s h a v s k y , A . ( 1 9 9 1 ) P r o c . N a t l .

A c a d . S c i . USA 8 8 , 7 3 5 1 - 7 3 5 5 .2 3 . M a d u r a , K . , D o h m e n , R . J . & V a r s h a v s k y , A . ( 1 9 9 3 ) J . B i o l . C h e m . 2 6 8 ,

1 2 0 4 6 - 1 2 0 5 4 .

2 4 . R e c h s t e i n e r , M . , H o f f m a n , L . & D u b i e l , W. ( 1 9 9 3 ) J . B i o l . C h e m . 2 6 8 ,6 0 6 5 - 6 0 6 8 .

2 5 . H i l t , W. & W o l f , D . H . ( 1 9 9 6 ) T r e n d s . B i o c h e m . S c i . 2 1 , 9 6 - 1 0 2 .

2 6 . V a r s h a v s k y , A . , B y r d , C . , D a v y d o v , I . V . , D o h m e n , R. J . , D u , F . , e t a l . ( 1 9 9 6 )i n U b i q u i t i n a n d t h e B i o l o g y o f t h e C e l l , e d s . F i n l e y , D . & P e t e r s , J . - M .( P l e n u m , New Y o r k ) , i n p r e s s .

2 7 . B a r t e l , B . , W u n n i n g , I . & V a r s h a v s k y , A . ( 1 9 9 0 ) EMBO J . 9 , 3 1 7 9 - 3 1 8 9 .2 8 . R e i s s , Y . , K a i m , D . & H er s h ko , A . ( 1 9 8 8 ) J . B i o l . C h e m . 2 6 3 , 2 6 9 3 - 2 6 9 8 .2 9 . W o l f , S . , L o t t s p e i c h , F . & B a u m e i s t e r , W. ( 1 9 9 3 ) FEBS L e t t . 3 2 6 , 4 2 - 4 4 .3 0 . G o t t e s m a n , S . & M a u r i z i , M . R . ( 1 9 9 2 ) M i c r o b i o l . R e v . 5 6 , 5 9 2 - 6 2 1 .3 1 . B a k e r, R . T . & V a r s h a v s k y , A . ( 1 9 9 5 ) J . B i o l . C h e m . 2 7 0 , 1 2 0 6 5 - 1 2 0 7 4 .3 2 . W i c k n e r , S . , G o t t e s m a n , S . , S k o w y r a , D . , H o s k i n s , J . , M c K e n n e y , K . &

M a u r i z i , M . R. ( 1 9 9 4 ) P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 9 1 , 1 2 2 1 8 - 1 2 2 2 2 .3 3 . G r i g o r y e v , S . , S t e w a r t , A . E . , K w o n , Y . T . , A r f i n , S . M . , B r a d s h a w , R . A . ,

C o p e l a n d , N . J . & V a r s h a v s k y , A . ( 1 9 9 6 ) J . B i o l . C h e m . 2 7 1 , i n p r e s s .

3 4 . S t e w a r t , A . E . , A r f i n , S . M . & B r a d s h a w , R. A . ( 1 9 9 5 ) J . B i o l . C h e m . 2 7 0 ,2 5 - 2 8 .3 5 . B a l z i , E . , C h o d e r , M . , C h e n , W . , V a r s h a v s k y , A . & G o f f e a u , A . ( 1 9 9 0 )

J . B i o l . C h e m . 2 6 5 , 7 4 6 4 - 7 4 7 1 .3 6 . D a y a l , V . K . , C h a k r a b o r t y , G . , S t u r m a n , J . A . & I n g o g l i a , N . A . ( 1 9 9 0 )

B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 1 0 3 8 , 1 7 2 - 1 7 7 .

3 7 . P i c k a r t , C . ( 1 9 8 8 ) i n U b i q u i t i n , e d . R e c h s t e i n e r , M . ( P l e n u m , N ew Y o r k ) ,p p . 7 7 - 9 9 .

3 8 . S c h e f f n e r , M . , N u b e r, U . & H u i b r e g t s e , J . M . ( 1 9 9 5 ) N a t u r e ( L o n d o n ) 3 7 3 ,8 1 - 8 3 .

3 9 . A r n a s o n , T . A . & E l l i s o n , M . J . ( 1 9 9 4 ) Mo L C e l l . B i o l . 1 4 , 7 8 7 6 - 7 8 8 3 .4 0 . J o h n s o n , E . S . , M a , P . C . M . , O t a , I . M. & V a r s h a v s k y , A . ( 1 9 9 5 ) J . B i o l .

C h e m . 2 7 0 , 1 7 4 4 2 - 1 7 4 5 6 .4 1 . B a b o s h i n a , 0 . V . & H a a s , A . L . ( 1 9 9 6 ) J . B i o l . C h e m . 2 7 1 , 2 8 3 2 - 2 8 3 1 .4 2 . M c G r a t h , J . P . , J e n t s c h , S . & V a r s h a v s k y , A . ( 1 9 9 1 ) EMBO J . 1 0 , 2 2 7 - 2 3 7 .4 3 . N e g r u t s k i i , B . S . & D e u t s c h e r , M . P . ( 1 9 9 1 ) P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A 8 8 ,

4 9 9 1 - 4 9 9 5 .4 4 . K n i g h t o n , D . R . , K a n , C . C . , H o w l a n d , E . , J a n s o n , C . A . , H o s t o m s k a , Z . ,

W e l s h , K . M . & M a t t h e w s , D . A . ( 1 9 9 4 ) N a t . S t r u c t . B i o l . 1 , 1 8 6 - 1 9 4 .4 5 . O z k a y n a k , E . , F i n l e y , D . , S o l o m o n , M . J . & V a r s h a v s k y , A . ( 1 9 8 7 ) E M B O

J . 6 , 1 4 2 9 - 1 4 4 0 .4 6 . F i n l e y , D . , B a r t e l , B . & V a r s h a v s k y , A . ( 1 9 8 9 ) N a t u r e ( L o n d o n ) 3 3 8 ,3 9 4 - 4 0 1 .

4 7 . W a t k i n s , J . F . , S u n g , P . , P r a k a s h , L . & P r a k a s h , S . ( 1 9 9 3 ) M o l . C e l l . B i o l .1 3 , 7 7 5 7 - 7 7 6 5 .

4 8 . L i , X . & C h a n g , Y . H . ( 1 9 9 5 ) P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A 9 2 , 1 2 3 5 7 - 1 2 3 6 1 .4 9 . A r f i n , S . M . & B r a d s h a w , S . A . ( 1 9 8 8 ) B i o c h e m i s t r y 2 7 , 7 9 7 9 - 7 9 8 4 .5 0 . S h e r m a n , F . , S t e w a r t , J . W. & T s u n a s a w a , S . ( 1 9 8 5 ) B i o e s s a y s 3 , 2 7 - 3 1 .5 1 . S a d i s , S . , A t i e n z a , C . & F i n l e y , D . ( 1 9 9 5 ) M o l . C e l l . B i o l . 1 5 , 4 0 8 6 - 4 0 9 5 .5 2 . G h i s l a i n , M . , D o h m e n , R . J . , L e v y , F . & V a r s h a v s k y , A . ( 1 9 9 6 ) EMB O J . ,

i n p r e s s .5 3 . K a i s e r , C . A . , P r e u s s , D . , G r i s a f i , P . & B o t s t e i n , D . ( 1 9 8 7 ) S c i e n c e 2 3 5 ,

3 1 2 - 3 1 7 .5 4 . S c h e r e r , D . C . , B r o c k m a n , J . A . , C h e n , Z . J . , M a n i a t i s , T . & B a l l a r d , D .

( 1 9 9 5 ) P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 9 2 , 1 1 2 5 9 - 1 1 2 6 3 .5 5 . D e v e r a u x , Q . , U s t r e l l , V . , P i c k a r t , C . & R e c h s t e i n e r , M . ( 1 9 9 4 ) J . B i o l .

C h e m . 2 6 9 , 7 0 5 9 - 7 0 6 1 .5 6 . S c h e f f n e r , M . , W e m e s s , B . A . , H u i b r e g t s e , J . M . , L e v i n e , A . J . & H o w l e y ,

P . M . ( 1 9 9 0 ) C e l l 6 3 , 1 1 2 9 - 1 1 3 6 .5 7 . J o h n s t o n , J . A . , J o h n s o n , E . S . , W a l l e r , P . R . H . & V a r s h a v s k y , A . ( 1 9 9 5 )

J . B i o l . C h e m . 2 7 0 , 8 1 7 2 - 8 1 7 8 .5 8 . O t a , I . M . & V a r s h a v s k y , A . ( 1 9 9 2 ) P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 8 9 ,2 3 5 5 - 2 3 5 9 .

5 9 . O t a , I . M. & V a r s h a v s k y , A . ( 1 9 9 3 ) S c i e n c e 2 6 2 , 5 6 6 - 5 6 9 .6 0 . M a e d a , T . , W u r g l e r - M u r p h y , S . M . & S a t o , H . ( 1 9 9 4 ) N a t u r e ( L o n d o n ) 3 6 9 ,

2 4 2 - 2 4 5 .6 1 . A l a g r a m a m , K . , N a i d e r , F . & B e c k e r , J . M . ( 1 9 9 5 ) M o l . M i c r o b i o l . 1 5 ,

2 2 5 - 2 3 4 .6 2 . K n i g h t , S . A . B . , T a m a i , K T . , K o s m a n , D . J . & T h i e l e , D . J . ( 1 9 9 4 ) Mo L

C e l l . B i o l . 1 4 , 7 7 9 2 - 7 8 0 4 .6 3 . E l l i s , R . E . , Y u a n , J . & H o r v i t z , H . R . ( 1 9 9 1 ) A n n u . R e v . C e l l B i o l . 7 ,

6 6 3 - 6 9 8 .6 4 . A i z e n m a n , E . , E n g e l b e r g - K u l k a , H . & G l a s e r , G . ( 1 9 9 6 ) P r o c . N a t l . A c a d .

S c i . USA 9 3 , 6 0 5 9 - 6 0 6 3 .6 5 . K a y a l a r , C . , O r d , T . , T e s t a , M . P . , Z h o n g , L . - T . & B r e d e s e n , D . E . ( 1 9 9 6 )

P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A 9 3 , 2 2 3 4 - 2 2 3 8 .6 6 . E m o t o , Y . , M a n o m e , Y . , M e i n h a r d t , G . , K i s a k i , H . , K h a r b a n d a , S . ,

R o b e r t s o n , M . , G h a y u r , T . , W o n g , W. W . , K a m e n , R . , W e i c h s e l b a u m , R .& K u f e , D . ( 1 9 9 5 ) EMBO J . 1 4 , 6 1 4 8 - 6 1 5 6 .

6 7 . T h o r n b e r r y , N . A . , B u l l , H . G . , G a l a y c a y , J . R . , C h a p m a n , K . T . , H o w a r d ,A .

D . ,e t a l .

( 1 9 9 2 )N a t u r e

( L o n d o n ) 3 5 6 ,7 6 8 - 7 7 4 .

6 8 . M a d u r a , K . & V a r s h a v s k y , A . ( 1 9 9 4 ) S c i e n c e 2 6 5 , 1 4 5 4 - 1 4 5 8 .6 9 . L e v i s , M . J . & B o u r n e , H . R . ( 1 9 9 2 ) J . C e l l B i o l . 1 1 9 , 1 2 9 7 - 1 3 0 7 .7 0 . S t r a u s s , J . H . & S t r a u s s , E . G . ( 1 9 9 4 ) M i c r o b i o l . R e v . 5 8 , 4 9 1 - 5 6 2 .7 1 . d e G r o o t , R. J . , R u m e n a p f , T . , K u h n , R . J . , S t r a u s s , E . G . & S t r a u s s , J . H .

( 1 9 9 1 ) P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A 8 8 , 8 9 6 7 - 8 9 7 1 .7 2 . D o u g h e r t y , W. G . & S e m l e r , B . L . ( 1 9 9 3 ) M i c r o b i o l . R e v . 5 7 , 7 8 1 - 8 2 2 .7 3 . N i s h i z a w a , M . , O k a z a k i , K . , F u r u n o , N . , W a t a n a b e , N . & S a g a t a , N . ( 1 9 9 2 )

EMBO J . 1 1 , 2 4 3 3 - 2 4 4 6 .7 4 . W a t a n a b e , N . , H u n t , T . , I k a w a , Y . & S a g a t a , N . ( 1 9 9 1 ) N a t u r e ( L o n d o n )

3 5 2 , 2 4 7 - 2 4 8 .7 5 . W i e r t z , E . J . H . J . , J o n e s , T . R . , S u n , L . , B o g y o , M . , G e u z e , H . J . & P l o e g h ,

H . L . ( 1 9 9 6 ) C e l l 8 4 , 7 6 9 - 7 7 9 .7 6 . H i l l e r , M . M . , F i n g e r , A . , S c h e i g e r , M . & W o l f , D . H . ( 1 9 9 6 ) S c i e n c e 2 7 3 ,

1 7 2 5 - 1 7 2 8 .7 7 . P a r k , E . C . , F i n l e y , D . & S z o s t a k , J . W. ( 1 9 9 2 ) P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA

8 9 , 1 2 4 9 - 1 2 5 2 .7 8 . C o r m a c k , B . P . & S t r u h l , K . ( 1 9 9 2 ) C e l l 6 9 , 6 8 5 - 6 9 4 .7 9 . V a r s h a v s k y , A . ( 1 9 9 5 ) P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 9 2 , 3 6 6 3 - 3 6 6 7 .


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