myeong-sok lee and william t. garrard- positive dna supercoiling generates a chromatin conformation...

8/3/2019 Myeong-Sok Lee and William T. Garrard- Positive DNA supercoiling generates a chromatin conformation characterist

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P r o c . N a d l . A c a d . S c i . USAV o l . 8 8 , p p . 9 6 7 5 - 9 6 7 9 , N o v e m b e r 1 9 9 1B i o c h e m i s t r y

P o s i t i v e DNA s u p e r c o i l i n g g e n e r a t e s a c h r o m a t i n c o n f o r m a t i o nc h a r a c t e r i s t i c o f h i g h l y a c t i v e g e n e s( t r a n s c r i p t i o n / t o r s i o n a l s t r e s s / n u c l e o s o m e / 2 - I t m m i n i c h r o m o s o m e s / y e a s t )

MYEONG-SOK LEE AND WILLIAM T . GARRARD*D e p a r t m e n t o f B i o c h e m i s t r y , T h e U n i v e r s i t y o f T e xa s S o u t h we s te r n M e d i c al C e n t er a t D a l l a s , 5 3 2 3 H a r r y H i n e s B o u l e v a r d , D a l l a s , TX 7 5 2 3 5C o m m u n i c a t e d b y J a m e s B o n n e r , A u g u s t 5 , 1 9 9 1ABSTRACT D u r i n g t r a n s c r i p t i o n , p o s i t i v e D N A s u p e r -c o i l s g e n e r a t e d a h e a d o f R N A p o l y m e r a s e c o u l d t h e o r e t i c a l l yu n c o i l t h e n e g a t i v e D N A s u p e r c o i l s a s s o c i a t e d w i t h n u c l e o -s o m e s a n d t h e r e b y d e c o n d e n s e t h e c h r o m a t i n f i b e r i n p r e p a -r a t i o n f o r R N A p o l y m e r a s e p a s s a g e . H e r e w e e x m i n e t h e e f f e c to f p o s i t i v e D N A s u p e r c o i l i n g o n t h e s t r u c t u r e o f y e a s t 2 - p mm i n i c h r o m o s o m e s . W e u t i l i z e d a c o n d i t i o n a l t o p o i s o m e r a s em u t a n t e x p r e s s i n g E s c h e r c h i a c o l i t o p o i s o m e r a s e I t o c o n v e r tt h e D N A s u p e r c o i l i n g s t a t e f r o m n e g a t i v e t o p o s i t i v e i n v i v o .M i n i c h r o m o s o m e s c o n t a i n i n g p o s i t i v e l y s u p e r c o i l e d D N A e x -h i b i t e d a s t r i k i n g i n c r e a s e i n D N a s e I s e n s i t i v i t y . T h e y a l s od i s p l a y e d a d d i t i o n a l m i c r o c o c c a l n u c l e a s e c l e a v a g e s i t e s b u ty i e l d e d n e a r l y t y p i c a l n u c l e o s o m a l l a d d e r s a f t e r e x t e n s i v ed i g e s t i o n . U p o n i n v i t r o r e l a x a t i o n w i t h e u k a r y o t i c t o p o i s o m -e r a s e I , t h e m i n i c h r o m o s o m e s r e m a i n e d D N a s e I s e n s i t i v e b u tw e r e c o n v e r t e d t o n e g a t i v e D N A s u p e r c o i l i n g w i t h a s l i g h t l yi n c r e a s e d l i n k i n g n u m b e r c o m p a r e d t o t y p i c a l m i n i c h r o m o -s o m e s , t h u s i n d i c a t i n g t h e p r e s e n c e o f b o u n d h i s t o n e s . T h e r e -f o r e , p o s i t i v e D N A s u p e r c o i l i n g p r o v i d e s a m e c h a n i s m f o rg e n e r a t i n g , b u t i s n o t r e q u i r e d f o r m a i n t a i n i n g , a c o n f o r m a t i o ni n c h r o m a t i n c h a r a c t e r i s t i c o f h i g h l y t r a n s c r i b e d g e n e s .M e c h a n i s m s t h a t a l t e r t h e c o n f o r m a t i o n o f c h r o m o s o m e s i nl i v i n g c e l l s a r e o f c o n s i d e r a b l e i n t e r e s t a s t h e y l i k e l y d e t e r -m i n e t h e e f f i c i e n c i e s o f t r a n s c r i p t i o n , r e p l i c a t i o n , r e c o m b i -n a t i o n , m u t a g e n e s i s , a n d DNA r e p a i r . G e n e a c t i v a t i o n i sa c c o m p a n i e d b y a l t e r a t i o n s i n t h e c o n f o r m a t i o n o f c h r o m a -t i n , w h i c h f o r h i g h l y t r a n s c r i b e d g e n e s a r e m a n i f e s t e d b yi n c r e a s e d s e n s i t i v i t y t o c l e a v a g e b y DNase I ( 1 ) , a p a r t i a ld i s r u p t i o n o f n u c l e o s o m a l s t r u c t u r e a s r e v e a l e d b y m i c r o -c o c c a l n u c l e a s e ( M N a s e ) d i g e s t i o n ( 2 ) , a n d m o r p h o l o g i c a ld e c o n d e n s a t i o n ( 3 ) ( f o r r e v i e w s , s e e r e f s . 4 a n d 5 ) . P a r t i c u -l a r l y i n t r i g u i n g i s t h a t t h e s e c h a r a c t e r i s t i c s o f t e n e x t e n dc o n s i d e r a b l e d i s t a n c e s b e y o n d t h e 5 ' a n d 3 ' b o u n d a r i es o ft r a n s c r i p t i o n u n i t s ( r e f s . 6 a n d 7 a n d r e f e r e n c e s t h e r e i n ) ,m a k i n g i t u n l i k e l y t h a t s u c h a l t e r a t i o n s a r e c a u s e d b y d i r e c tc o n t a c t w i t h t r a v e r s i n g RNA p o l y m e r a s e m o l e c u l e s .O n e p o s s i b l e way t o s p r e a d a l t e r a t i o n s a l o n g a c h r o m a t i nf i b e r i s t h r o u g h t o r s i o n a l s t r e s s g e n e r a t e d d u r i n g t r a n s c r i p -

t i o n . E x p e r i m e n t a l e v i d e n c e s u p p o r t s t h e h y p o t h e s i s t h a t t h et e m p l a t e r o t a t e s r e l a t i v e t o t r a v e r s i n g RNA p o l y m e r a s em o l e c u l e s ( 8 ) , l e a d i n g t o t w i n d o m a i n s o f DNA s u p e r c o i l i n g :p o s i t i v e s u p e r c o i l i n g d o w n s t r e a m a n d n e g a t i v e s u p e r c o i l i n gu p s t r e a m o f t h e t r a n s c r i p t i o n c o m p l e x ( 9 ) . A l t h o u g h DNAt o p o i s o m e r a s e s r e l a x t h e s e s t r u c t u r e s , i t s e e m s l i k e l y t h a tt h i s r e l a x a t i o n ma y k i n e t i c a l l y l a g b e h i n d s u p e r c o i l g e n e r a -t i o n ( 8 ) .W e h a v e p r o p o s e d ( 1 0 ) t h a t p o s i t i v e DNA s u p e r c o i l i n gma y p l a y a n i m p o r t a n t r o l e i n c h r o m a t i n d e c o n d en s a t i o n a n dp a v e t h e way f o r RNA p o l y m e r a s e b y u n c o i l i n g t h e n e g a -t i v e l y s u p e r c o i l e d n u c l e o s o m a l DNA d o w n s t r e a m o f t h e

t r a n s c r i p t i o n c o m p l e x . H e r e we h a v e u t i l i z e d a n i n v i v os y s t e m t o e x a m i n e t h i s m o d e l b y s t u d y i n g t h e e f f e c t s o fp o s i t i v e DNA s u p e r c o i l i n g o n t h e s t r u c t u r e o f y e a s t 2 - , u mm i n i c h r o m o s o m e s . W e d e m o n s t r a t e t h a t p o s i t i v e DNA s u -p e r c o i l s g e n e r a t e a c h r o m a t i n c o n f o r m a t i o n s i m i l a r t o t h a te x h i b i t e d b y h i g h l y t r a n s c r i b e d g e n e s a n d t h a t t h e s e s u p e r -c o i l s a r e n o t r e q u i r e d t o m a i n t a i n t h i s c o n f o r m a t i o n .MATE R IA LS AN D M E T H O D S

Y e a s t S t r a i n a n d G r o w t h C o n d i t i o n s . Tw o 1 - l i t e r c u l t u r e s o fS a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e R S 1 9 2 ( M a t a a d e 2 u r a 3 - 1 h i s 3 -1 1 , 1 5 t r p l - J l e u 2 - 3 , 1 1 2 c a n l - 1 0 0 t o p J - 8 : : L E U 2 t o p 2 - 1 ) t r a n s -f o r m e d w i t h Y e p T o p A - p G A L ( 8 ) w e r e g r o w n i n 2% ( w t / v o l )g a l a c t o s e / 1 % y e a s t e x t r a c t / 2 % ( w t / v o l ) p e p t o n e . W h e r ei n d i c a t e d , g a l a c t o s e w a s r e p l a c e d w i t h g l u c o s e . F o r m o s te x p e r i m e n t s , o n e c u l t u r e w a s i n o c u l a t e d w i t h 3 x 1 0 6 c e l l sp e r m l a n d g r o w n a t 2 4 0 C f o r 1 6 h t o a n A 6 N o f - 0 . 5 0 ( 5 x 1 0 7c e l l s p e r m l ) a n d t h e o t h e r w a s i n o c u l a t e d w i t h 5 . 4 x 1 0 6 c e l l sp e r m l , g r o w n f o r 1 3 h a t 2 4 0 C t o a n A 6 N o f - 0 . 5 0 , a n d t h e ns h i f t e d t o 3 7 0 C f o r 3 h . To o b t a i n a s a m p l e w i t h a m i x t u r e o fD N A t o p o i s o m e r s , c e l l s w e r e s h i f t e d t o 3 7 0 C f o r o n l y 1 . 5 h .A n a l y s i s o f D NA S u p e r c o i l i n g S t a t e s . W a s h e d c e l l s w e r ei n c u b a t e d w i t h O x a l y t i c a s e ( E n z o g e n e t i c s , C o r v a l l i s , O R ) a sd e s c r i b e d ( 1 0 ) e x c e p t t h a t t h e 3 7 0 C c e l l s a m p l e w a s a l s oi n c u b a t e d a t 3 7 0 C t o i n h i b i t p o t e n t i a l r e s i d u a l t o p o i s o m e r a s eI I a c t i v i t y ( 1 1 ) . S p h e r o p l a s t s w e r e c o l l e c t e d b y c e n t r i f u g a t i o n( 5 0 0 0 x g f o r 5 m i n a t 4 0 ( ) a n d l y s e d b y s u s p e n s i o n t o a f i n a lDNA c o n c e n t r a t i o n o f 1 0 0 , u g / m l i n i c e - c o l d n u c l e a s e d i g e s -t i o n b u f f e r [ 4 0 mM HepesNaOH, p H 7 . 5 / 1 mM M g C l 2 / 0 . 2mM C a C 1 2 / 1 mM p h e n y l m e t h y l s u l f o n y l f l u o r i d e / c h y m o -s t a t i n ( 0 . 5 A g / m l ) / a p r o t i n i n ( 1 . 7 j u g / m l ) / t r a n s - e p o x y s u c c i -n y l - L - l e u c y l a m i d o ( 4 - g u a n i d i n o ) b u t a n e ( S i g m a ; 7 . 2 u g / m l ) /p h o s p h o r a m i d o n ( 1 . 1 , g / m l ) / l e u p e p t i n ( 2 . 0 , u g / m l ) / a n t i p a i n( 2 . 0 , u g / m l ) / p e p s t a t i n ( 2 . 0 t u g / m l ) / 2 mM b e n z a m i d i n e ] . F o rDNA p u r i f i c a t i o n , 4 0 0 , u l o f 5 0 mM T r i s H H C l , p H 7 . 0 / 2 0 mME D T A was a d d e d t o e a c h 1 0 0 - u l I s a m p l e . A f t e r g e n t l e m i x i n g ,5 0 , u l o f 1 0 % o ( w t / v o l ) SDS w a s a d d e d a n d s a m p l e s w e r ei n c u b a t e d a t 6 5 0 C f o r 3 0 m i n , e x t r a c t e d w i t h p h e n o l /

c h l o r o f o r m , a n d e t h a n o l - p r e c i p i t a t e d . S u s p e n d e d p e l l e t sw e r e t r e a t e d w i t h R N a s e A a n d e x t r a c t e d a s b e f o r e . T w o -d i m e n s i o n a l c h l o r o q u i n e / a g a r o s e g e l s ( 1 2 ) w e r e l o a d ed w i t h5 A g o f DNA s a m p l e s . A f t e r t r a n s f e r t o Z e t a - P r o b e mem-b r a n e s ( B i o - R a d ) ( 1 3 ) , f i l t e r s w e r e p r e h y b r i d i z e d f o r 4 h a t6 5 0 C a n d h y b r i d i z e d f o r 1 5 h a t 4 5 0 C w i t h a 3 2 P - e n d - l a b e l e d2 - p u m 4 0 - m e r p r o b e (5'-GGTAGGATCGATCCACTTG-T A T A T T T G G A T G A A T T T T T G A - 3 ' ) . F i l t e r s w e r e w a s h e do n c e a t room t e m p e r a t u r e f o r 1 0 m i n a n d f o r t h r e e 3 0 - m i np e r i o d s a t 5 3 0 C w i t h 2 x s t a n d a r d s a l i n e c i t r a t e / 2 0 mMs o d i u m p h o s p h a t e , p H 7 . 0 / 2 % S D S . A u t o r a d i o g r a m s w e r ee x p o s e d w i t h i n t e n s i f y i n g s c r e e n s a t - 7 0 0 C . W h e r e i n d i -c a t e d , s t r i p p e d f i l t e r s w e r e r e h y b r i d i z e d w i t h a p B R 3 2 2 p r o b eA b b r e v i a t i o n : M N a s e , m i c r o c o c c a l n u c l e a s e .* T o whom r e p r i n t r e q u e s t s s h o u l d b e a d d r e s s e d .

9 6 7 5

T h e p u b l i c a t i o n c o s t s o f t h i s a r t i c l e w e r e d e f r a y e d i n p a r t b y p a g e c h a r g ep a y m e n t . T h i s a r t i c l e m u s t t h e r e f o r e b e h e r e b y m a r k e d " a d v e r t i s e m e n t "i n a c c o r d a n c e w i t h 1 8 U . S . C . 1 7 3 4 s o l e l y t o i n d i c a t e t h i s f a c t .


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%76 B i o c h e m i s t r y : L e e a n d G a r r a r d( 5 ' - A A G A A T T C T C A T G T T T G A C A G C T T A T C A T C -GATAAGCTTT-3').N u c l e a s e D i g e s t i o n , C h r o m a t i n A n a l y s i s , a n d T o p o i s o m e r -a s e I T r e a t m e n t . L y s a t es w e r e d i g e s t e d a t 3 7 0 C f o r 1 0 m i nw i t h DNase I a t 0 . 1 4 o r 0 . 3 2 u n i t s / m l o r MNase ( W o r t h i n g -t o n ) a t 0 . 5 5 o r 1 . 2 u n i t s / m l ( f o o t p r i n t i n g ) o r MNase a t 5 . 8 ,1 2 . 7 , 2 8 , o r 6 2 u n i t s / m l ( s t r u c t u r a l a n a l y s i s ) . N a k e d DNAw a s d i g e s t e d w i t h 3 0 - t i m e s l e s s e n z y m e . F o o t p r i n t i n g w a s b yi n d i r e c t e n d - l a b e l i n g f r o m t h e E c o R I s i t e a n d s t r u c t u r a la n a l y s i s w a s b y p u b l i s h e d t e c h n i q u e s ( 1 0 ) w i t h t h e a b o v e2 - , u m p r o b e a n d h y b r i d i z a t i o n c o n d i t i o n s . F o r r e l a x a t i o n ,s p h e r o p l a s t s w e r e l y s e d i n n u c l e a s e d i g e s t i o n b u f f e r ( 1 mME D T A ) , a n d s a m p l e s w e r e d i l u t e d w i t h a n e q u a l v o l u m e o fn u c l e a s e d i g e s t i o n b u f f e r ( 5 0 mM N a C l / 1 mM EDTA) a n dc e n t r i f u g e d t o r e m o v e w h o l e c e l l s ( 1 0 0 0 x g f o r 3 m i n ) . F o ra 2 0 0 - / l s a m p l e ( 5 u g o f D N A ) , 1 p u g o f r e l a x e d o r n e g a t i v e l ys u p e r c o i l e d f o r m I p B R 3 2 2 DNA w a s a d d e d f o l l o w e d b yi n c u b a t i o n f o r 1 . 5 m i n a t 3 7 0 C , a d d i t i o n o f p u r i f i e d c h i c k e nt o p o i s o m e r a s e I ( 1 0 0 0 u n i t s i n 1 0 I L I ) ( 1 4 ) , a n d 8 . 5 m i n o ff u r t h e r i n c u b a t i o n . When r e q u i r e d , a n e q u a l v o l u m e o f d i -g e s t i o n b u f f e r ( 5 mM M g C 1 2 ) w a s a d d e d a n d s a m p l e s w e r ed i g e s t e d f o r 7 m i n a t 3 7 0 C w i t h DNase I a t 1 . 1 o r 2 . 5 u n i t s / m l .

RESULTSG e n e r a t i o n o f P o s i t i v e l y S u p e r c o i l e d D N A i n v i v o W i t h i nY e a s t 2 - j a m M i n i c h r o m o s o m e s . T o s t u d y t h e e f f e c t o f p o s i t i v eDNA s u p e r c o i l i n g o n c h r o m a t i n s t r u c t u r e , we u t i l i z e d a t o p ]t o p 2 - t s y e a s t s t r a i n , e x p r e s s i n g E s c h e r i c h i a c o l i t o p o i s o m e r -a s e I , i n w h i c h t h e s u p e r c o i l e d s t a t e o f D N A c a n b e m a n i p -u l a t e d i n v i v o b y a l t e r i n g t h e g r o w t h c o n d i t i o n s ( 8 ) . A t t h ep e r m i s s i v e t e m p e r a t u r e o f 2 4 0 C , DNA i s o r g a n i z e d i n t ot o p o l o g i c a l l y c o n s t r a i n e d n e g a t i v e s u p e r c o i l s b e c a u s e o f t h eh i s t o n e s a n d a f u n c t i o n a l t o p o i s o m e r a s e I I ( 8 , 1 1 ) . H o w e v e r ,w h e n t h e t o p o i s o m e r a s e I I i s i n a c t i v a t e d a t t h e n o n p e r m i s -s i v e t e m p e r a t u r e o f 3 7 0 C , p o s i t i v e s u p e r c o i l s s l o w l y a c c u -m u l a t e d u e t o p r e f e r e n t i a l r e l a x a t i o n o f t r a n s i e n t n e g a t i v eDNA s u p e r c o i l s b y E . c o l i t o p o i s o m e r a s e I ( 8 ) .W e s e l e c t e d f o r s t u d y t h e e n d o g e n o u s y e a s t m u l t i c o p y

2 - p u m p l a s m i d s i n c e t h e s e 6 . 3 - k i l o b a s e ( k b ) c i r c u l a r m o l e c u l e se x i s t i n t h e n u c l e u s a s m i n i c h r o m o s o m e s ( 1 5 ) w i t h a w e l l -d e f i n e d t y p i c a l n u c l e o s o m a l s t r u c t u r e ( 1 6 - 1 8 ) . I n a g r e e m e n tw i t h G i a e v e r a n d Wang ( 8 ) , t w o - d i m e n s i o n a l g e l e l e c t r o p h o -r e s i s r e v e a l e d t h a t t h e m a j o r i t y o f t h e 2 - p u m m i n i c h r o m o -s o m e s c o n t a i n e d p o s i t i v e l y s u p e r c o i l e d DNA w h e n i s o l a t e df r o m t h e m u t a n t c e l l s a f t e r t h e y h a d b e e n s h i f t e d t o 3 7 0 C ( F i g .1 B , s p o t d l ) . I n c o n t r a s t , 2 - p ~ m c i r c l e s c o n t a i n e d n e g a t i v es u p e r c o i l s a s e x p e c t e d w h e n a f u n c t i o n a l t o p o i s o m e r a s e I Iw a s p r e s e n t a t 2 4 0 C ( F i g . 1 A , s p o t a 1 ) ( 1 1 ) . T h e s e g e l - m o b i l i t ya s s i g n m e n t s w e r e c o n fi r me d u t i l i z i n g a s t a n d a r d c o n t a i n i n g am i x t u r e o f t o p o l o g i c a l f o r m s ( F i g . 1 C ) , i n w h i c h we c o u l dv i s u a l i z e a t l e a s t 1 5 p o s i t i v e l y s u p e r c o i l e d i n t e r m e d i a t e s p e -c i e s ( e . g . , F i g . 1 C a n d d a t a n o t s h o w n ) , y i e l d i n g a m i n i m u mo f o n e p o s i t i v e s u p e r c o i l f o r e v e r y - 0 . 4 k b o f 2 - p u m DNA f o rm o l e c u l e s m i g r a t i n g i n t h e d , p o s i t i o n .P o s i t i v e D N A S u p e r c o i l i n g E x p o s e s N u c l e a s e C l e a v a g e S i t e si n C h r o m a t i n . W e f i r s t e m p l o y e d DNase I f o o t p r i n t i n g i nw h o l e - c e l l l y s a t e s t o s t u d y t h e e f f e c t o f p o s i t i v e DNA s u p e r -c o i l i n g o n t h e s t r u c t u r e o f t h e r a r e l y t r a n s c r i b e d REP2 g e n er e g i o n w i t h i n 2 - p u m m i n i c h r o m o s o m e s ( 1 9 , 2 0 ) . A s s h o w n i nF i g . 2 A , l a n e s a a n d b , t h e REP2 l o c u s i n m i n i c h r o m o s o m e sc o n t a i n i n g n e g a t i v e l y s u p e r c o i l e d DNA was f l a n k e d b o t h 5 'a n d 3 ' b y h y p e r s e n s i t i v e s i t e s ( s o l i d b a r s ) . T h e c o d i n g r e g i o nw a s r e l a t i v e l y r e s i s t a n t t o DNase I a n d e x h i b i t e d s e v e nf o o t p r i n t s w i t h t h e i n t e r v e n i n g c u t t i n g s i t e s f o l l o w i n g n u c l e -o s o m a l p e r i o d i c i t y ( o p e n c i r c l e s ) . I n s t r i k i n g c o n t r a s t , t h ee n t i r e REP2 c o d i n g r e g i o n e x h i b i t e d h i g h D N a s e I s e n s i t i v i t yi n m i n i c h r o m o s o m e s c o n t a i n i n g p o s i t i v e l y s u p e r c o i l e d DNA( F i g . 2 A , l a n e s d a n d e ) . T h i s i n c r e a s e d s e n s i t i v i t y e x t e n d e db o t h u p s t r e a m i n t o t h e FL P g e n e c o d i n g r e g i o n a n d d o w n -

- - 2 n d D2 4 0 C 3 7 0 C M i X

a 3( / 3 -a 2 . .

c

A

b4. d 2c

a2 b e.1FF

a1 Ad a , -B c

F I G . 1 . S u p e r c o i l i n g s t a t e o f 2 - A m DNA. A y e a s t t o p ] t o p 2 - t sm u t a n t , e x p r e s s i n g E . c o l i t o p o i s o m e r a s e I , w a s g r o w n a t 2 4 0 C ( A )o r s h i f t e d t o 3 7 0 C ( B ) f o r 3 h . DNA w a s p u r i f i e d , s e p a r a t e d b yt w o - d i m e n s i o n a l e l e c t r o p h o r e s i s , b l o t t e d t o a f i l t e r , a n d h y b r i d i z e dw i t h a 2 - A m p r o b e . C d e p i c t s a m i xt u r e o f t o p o i s o m e r s . I n d i c a t e d a r en e g a t i v e l y s u p e r c o i l e d s i n g l e m o l e c u l e s a n d i n t e r l o c k e d r i n g s c o n -t a i n i n g t w o a n d t h r e e m o l e c u l e s ( a , , a 2 , a n d a 3 , r e s p e c t i v e l y ) , n i c k e dc i r c l e s ( b ) , l i n e a r m o l e c u l e s ( c ) , p o s i t i v e l y s u p e r c o i l e d s i n g l e m o l e -c u l e s a n d i n t e r l o c k e d r i n g s o f t w o m o l e c u l e s ( d 1 a n d d 2 , r e s p e c t i v e -l y ) , a n d r e l a x e d c o v a l e n t l y c l o s e d c i r c l e s ( e ) . D , d i m e n s i o n .s t r e a m i n t o d i s t a l r e g i o n s a n d w a s v e r y s i m i l a r t o t h e c u t t i n gp a t t e r n e x h i b i t e d b y n a k e d DNA ( F i g . 2 A , c o m p a r e l a n e s da n d e w i t h l a n e c ) . H o w e v e r , t h e n u c l e a s e - h y p e r s e n s i t i v es i t e s f l a n k i n g t h e REP2 l o c u s w e r e n o t d i s r u p t e d b y p o s i t i v eDNA s u p e r c o i l i n g ( F i g . 2 A , l a n e s d a n d e , s o l i d b a r s ) . T h eo v e r a l l e n h a n c e d DNase I s e n s i t i v i t y was n o t c o r r e l a t e d w i t he l e v a t e d REP2 g e n e t r a n s c r i p t i o n a s a s s e s s e d b y N o r t h e r nb l o t a n a l y s i s ( d a t a n o t s h o w n ) n o r was i t c a u s e d b y h e a ts h o c k , s i n c e c o n t r o l e x p e r i m e n t s r e v e a l e d t h a t t h e REP2l o c u s w a s n o t D N a s e I - s e n s i t i v e i n m u t a n t c e l l s s h i f t e d t o3 7 0 C i n t h e a b s e n c e o f E . c o l i t o p o i s o m e r a s e I e x p r e s s i o n ( s e eF i g . 5 , l a n e s a a n d b ) . F u r t h e r m o r e , n a k e d DNA s a m p l e sw e r e d i g e s t e d a t s i m i l a r r a t e s , w h e t h e r t h e y w e r e p o s i t i v e l yo r n e g a t i v e l y s u p e r c o i l e d ( d a t a n o t s h o w n ) . T h e r e f o r e , w ec o n c l u d e t h a t p o s i t i v e DNA s u p e r c o i l i n g i n c r e a s e s t h eD N a s e I s e n s i t i v i t y o f t h e c h r o m a t i n .W e a l s o s t u d i e d t h e p a t t e r n o f MNase c l e a v a g e w i t h i n t h eREP2 l o c u s o f t h e c o r r e s p o n d i n g s a m p l e s . As w i t h t h e DNaseI d i g e s t s , t h e c o d i n g r e g i o n e x h i b i t e d s e v e n f o o t p r i n t s w i t ht h e i n t e r v e n i n g MNa se c u t t i n g s i t e s f o l l o w i n g n u c l e o s o m a lp e r i o d i c i t y i n m i n i c h r o m o s o m e s c o n t a i n i n g n e g a t i v e l y s u p e r -c o i l e d DNA ( F i g . 2 B , l a n e s a a n d b , o p e n c i r c l e s ; s e e a l s o r e f .1 8 ) . M i n i c h r o m o s o m e s c o n t a i n i n g p o s i t i v e l y s u p e r c o i l e dDNA e x h i b i t e d t h e s e c u t t i n g s i t e s b u t i n a d d i t i o n d i s p l a y e da l l s i t e s t h a t w e r e p r e s e n t i n d i g e s t s o f n a k e d DNA ( F i g . 2 B ,c o m p a r e l a n e s d a n d e w i t h l a n e c ) . T h u s w i t h t h e DNase If o o t p r i n t i n g r e s u l t s , w e c o n c l u d e t h a t p o s i t i v e DNA s u p e r -c o i l i n g e x p o s e s n u c l e a s e c l e a v a g e s i t e s i n c h r o m a t i n .M i n i h r o m o s o m e s C o n t a i n i n g P o s i t i v e l y S u p e r c o i d D N AE x h i b i t a N e a r l y T y p c a l N u c l e o s o m a l S t r u c t u r e . N e a r l y t y p -i c a l n u c l e o s o m a l l a d d e r s w e r e g e n e r a t e d u p o n e x t e n s i v eMNase d i g e s t i o n o f m i n i c h r o m o s o m e s c o n t a i n i n g p o s i t i v e l ys u p e r c o i l e d DNA. T h e s e e x h i b i t e d a n o l i g o m e r i c DNA r e -p e a t l e n g t h o f 1 6 8 + 5 b a s e p a i r s ( F i g . 3 A , l a n e s e - h ) , a v a l u es i m i l a r t o t h a t m e a s u r e d f o r t h e n e g a t i v e l y s u p e r c o i l e d c o u n -t e r p a r t s ( F i g . 3 A , l a n e s a - d ; s e e a l s o r e f s . 1 6 a n d 1 7 ) . T h o s em i n i c h r o m o s o m e s c o n t a i n i n g p o s i t i v e l y s u p e r c o i l e d DNAw e r e d i g e s t e d - 2 t i m e s f a s t e r a n d t h e i r n u c l e o s o m a l l a d d e r se x h i b i t e d a h i g h e r i n t e r b a n d b a c k g r o u n d ( F i g . 3 A ) . S i m i l a rp a t t e r n s w e r e o b s e r v e d w h e n b u l k g e n o m i c DNA w a s p r o b e do n t h e same f i l t e r s ( F i g . 3 B ) . T h u s , g e n o m e s t h a t h a v e b e e nt o p o l o g i c a l l y c o n v e r t e d f r o m n e g a t i v e t o p o s i t i v e DNA s u -p e r c o i l i n g e x h i b i t a n e a r l y t y p i c a l n u c l e o s o m a l o r g a n i z a t i o nu p o n MNase d i g e s t i o n .

P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 8 8 ( 1 9 9 1 )


3/5

P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 8 8 ( 1 9 9 1 ) 9 6 7 7A DNase I

2 4 0 C D 3 7 0 CK b4.0-

2 . 4 -000

1 . 6 - o00

0.9-H' H A

B MNase2 4 0 C D 3 7 0 C[v I A 2 - p DNA240C 370CKb l II

202 . 0 - s1 * a~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ z1 . 0 - S *

0 . 5

B B U L K D NA2400 3700

8 N76 _

3-2 - _. . . .0,* 6

0 . 1 2 -4 . :

a b c d e f g hI

a b c d e a b c d eF I G . 2 . E f f e c t o f p o s i t i v e DNA s u p e r c o i l i n g on t h e c h r o m a t i n

s t r u c t u r e o f t h e REP2 l o c u s . C u l t u r e s we re g r o w n a t 2 4 0 C ( l a n e s a a n db ) or s h i f t e d t o 3 7 0 C ( l a n e s d a n d e ) as d e s c r i b e d i n F i g . 1 . L y s a t es a m p l e s we re e a c h d i g e s t e d w i t h tw o c o n c e n t r a t i o n s o f e i t h e r DNaseI ( A ) or MNase ( B ) ( e q u a l c o n c e n t r a t i o n s we re i n l a n e s a a n d d a n dl a n e s b a n d d ) . DNA was p u r i f i e d , c l e a v ed w i t h E c o R l , s e p a r a t e d b ye l e c t r o p h o r e s i s , b l o t t e d t o a f i l t e r , a n d h y b r i d i z e d w i t h a 2 - / A m p r o b et h a t a b u t t e d t h e E c o R l s i t e . L a n e s c ( D ) c o n t a i n t h e c o r r e s p o n d i n gn u c l e a s e d i g e s t s o f n a k e d DNA p r o c e s s e d s i m i l a r l y . C a l i b r a t i o n ont h e l e f t i s a b s o l u t e DNA l e n g t h ( k b ) a n d i n t h e c e n t e r i s n u c l e o t i d emap p o s i t i o n . T h e open v e r t i c a l a r r o w s i l l u s t r a t e open r e a d i n gf r a m e s , s o l i d v e r t i c a l b a r s d e p i c t DNase I h y p e r s e n s i t i v e r e g i o n s ,a n d open c i r c l e s r e f e r t o c l e a v a g e s i t e s w i t h a n u c l e o s o m a l p e r i o -d i c i t y . B e c a u s e two i s o m e r s o f 2 - A m DNA e x i s t ( 1 9 ) , t h e c h r o m a t i ns t r u c t u r e a b o v e 2 . 4 k b i s a m i x t u r e .

R e l a x a t i o n C o n v e r t s C h r o m a t i n C o n t a i n i n g P o s i t i v e l y S u -p e r c o i l e d DNA t o a N e g a t i v e l y S u p e r c o i l e d S t a t e . We d e t e r -m i n e d w h e t h e r m i n i c h r o m o s o m e s c o u l d b e c o n v e r t e d f r o mp o s i t i v e t o n e g a t i v e DNA s u p e r c o i l i n g b y t r e a t m e n t o f l y s a t e si n v i t r o w i t h e u k a r y o t i c t o p o i s o m e r a s e I ( a f t e r p r e i n c u b a t i n gs a m p l e s w i t h a 1 0 - f o l d excess o f n a k e d p B R 3 2 2 DNA r e l a t i v et o 2-gm DNA t o mop up a n y f r e e h i s t o n e s ) . As s h o w n i n F i g .4 , t h i s t r e a t m e n t i n d e e d c o n v e r t e d t h e m i n i c h r o m o s o m e sc o n t a i n i n g p o s i t i v e DNA s u p e r c o i l s ( F i g . 4 A ) t o n e g a t i v eDNA s u p e r c o i l i n g ( F i g . 4 B ) . T h e s e r e s u l t s p r o v i d e n o e v i -d e n c e f o r t h e presence o f n a k e d DNA i n a f r a c t i o n o f t h eo r i g i n a l p o p u l a t i o n o f 2-gm m o l e c u l e s . The h i g h e r r e s o l u t i o ne l e c t r o p h o r e s i s s h o w n i n F i g . 4E r e v e a l e d t h a t t h e s e r e l a x e dm i n i c h r o m o s o m e s ( l a n e 2 ) p o s s e s s e d a s o m e w h a t b r o a d e rt o p o i s o m e r d i s t r i b u t i o n w i t h a s l i g h t l y h i g h e r l i n k i n g n u m b e ra s c o m p a r e d t o t h e c o n t r o l ( r e l a x e d t y p i c a l m i n i c h r o m o -s o m e s ) ( l a n e 3 ) . [ S i m i l a r r e s u l t s we re o b t a i n e d i n t h e a b s e n c eo f a d d e d p B R 3 2 2 ( d a t a n o t s h o w n ) . ] S i m u l t a n e o u s l y m o n i -t o r i n g t h e e x t e n t o f c h r o m a t i n a s s e m b l y o n t o t h e a d d e d n a k e dp B R 3 2 2 DNA m o l e c u l e s r e v e a l e d t h a t l y s a t e s p r e p a r e d f r o mc o n t r o l c e l l s or l y s a t e s c o n t a i n i n g p o s i t i v e l y s u p e r c o i l e dDNA i n t r o d u c e d on average o n l y a b o u t f o u r or f i v e n e g a t i v es u p e r c o i l s i n t o p B R 3 2 2 DNA m o l e c u l e s , w h e t h e r t h e i n p u t

a b c d e f g hF I G . 3 . E f f e c t o f p o s i t i v e DNA s u p e r c o i l i n g o n n u c l e o s o m a ls t r u c t u r e . C u l t u r e s w e r e g r o w n a t 2 4 0 C o r s h i f t e d t o 3 7 0 C a s d e -s c r i b e d i n F i g . 1 . L y s a t e s w e r e d i g e s t e d w i t h v a r i o u s c o n c e n t r a t i o n so f MNase ( e q u a l c o n c e n t r a t i o n s w e r e i n l a n e s a a n d e , l a n e s b a n df , l a n e s c a n d g , a n d l a n e s d a n d h ) . DNA w a s p u r i f i e d , s e p a r a t e d b ye l e c t r o p h o r e s i s , b l o t t e d t o a f i l t e r , a n d h y b r i d i z e d w i t h 2 - g m DNA( A ) o r b u l k DNA ( B ) p r o b e s . 1 - 8 N r e p r e s e n t t h e o l i g o n u c l e o s o m a ll e n g t h o f DNA f r a g m e n t s .

p B R 3 2 2 h a d b e e n r e l a x e d ( F i g . 4 C a n d D ) o r n e g a t i v e l ys u p e r c o i l e d ( d a t a n o t s h o w n ) . T h u s , no e v i d e n c e w a s o b -t a i n e d f o r a n i n c r e a s e i n f r e e h i s t o n e s a s a c o n s e q u e n c e o fp o s i t i v e DNA s u p e r c o i l i n g o r f o r s t r i p p i n g h i s t o n e s o f f c h r o -m a t i n c o n t a i n i n g p o s i t i v e l y s u p e r c o i l e d DNA b y e x p o s u r e t on e g a t i v e l y s u p e r c o i l e d n a k e d DNA [ t h e h i s t o n e t r a n s f e rm o d e l i n t r a n s c r i p t i o n ( 2 1 ) ] . T h u s we c o n c l u d e t h a t p o s i t i v eDNA s u p e r c o i l s a r e n o t t o p o l o g i c a l l y c o n s t r a i n e d a n d i n f e r

2 n d D 1 2 38f B C C D EIr1 I n ~~~n n -~~~~~ - ~ ~ ~ 0 goCl - 4 4+-

F I G . 4 . R e l a x a t i o n o f p o s i t i v e DNA s u p e r c o i l s b y e u k a r y o t i ct o p o i s o m e r a s e I . ( A a n d B ) L y s a t e s o f a c u l t u r e s h i f t e d t o 3 7 0 C a sd e s c r i b e d i n F i g . 1 , p r e i n c u b a t e d w i t h r e l a x e d p B R 3 2 2 DNA, w e r ef u r t h e r i n c u b a t ed w i t h ( B ) o r w i t h o u t ( A ) e u k a r y o t i c t o p o i s o m e r a s eI . S a m p l e s w e r e a n a l y z e d f o r 2 - A m DNA a s i n F i g . 1 . ( C a n d D )C u l t u r e s w e r e g r o w n a t 2 4 0 C ( C ) o r s h i f t e d t o 3 7 0 C ( D ) a s d e s c r i b e di n F i g . 1 . L y s a t e s p r e i n c u b a t e d w i t h r el a xe d p B R 3 2 2 DNA c i r c l e sw e r e i n c u ba t ed f u r t h e r w i t h e u k a r y o t i c t o p o i s o m e r a s e I . S a m p l e sw e r e p r o c e s s e d a s a b o v e, b u t f i l t e r s w e r e h y b r i d i z e d w i t h a p B R 3 2 2p r o b e . ( E ) S a m p l e s i n A- C ( l a n e s 1 - 3 , r e s p e c t i v e l y , i n E ) w e r er e s o l v e d o n a c h l o r o q u i n e / a g a r o s e g e l ( 1 1 ) , b l o t t e d t o a f i l t e r , a n dh y b r i d i z e d w i t h a 2 - , u m p r o b e . I n d i c a t e d a r e n i c k e d c i r c l e s ( n ) ,p o s i t i v e l y ( + ) o r n e g a t i v e l y ( - ) s u p e r c o i l e d c i r c l e s , d i a g o n a l l i n e s( d a s h e s ) , n e g a t i v e l y s u p e r c o i l e d t o p o i s o m e r s ( 0 , - 2, - 4 , - 6 ) , l i n e a rm o l e c u l e s ( 1 ) , a n d a n u n k n o w n DNA b a n d s e e n i n some e x p e r i m e n t s( * ) ( l a n e s 1 a n d 2 ) .

B i o c h e m i s t r y : L e e a n d G a r r a r d


4/5

9 6 7 8 B i o c h e m i s t r y : L e e a n d G a r r a r dt h a t p o s i t i v e DNA s u p e r c o i l i n g d o e s n o t s i g n i f i c a n t l y d i s -p l a c e h i s t o n e s f r o m c h r o m a t i n .P o s i t i v e D N A S u p e r c o i l i n g I s N o t R e q u i r e d t o M a i n t a i nD N a s e I S e n s i t i v i t y . To d e t e r m i n e w h e t h e r p o s i t i v e t o r s i o n a ls t r e s s w a s r e s p o n s i b l e f o r t h e h e i g h t e n e d D N a s e I s e n s i t i v i t yo f 2 - E u m m i n i c h r o m o s o m e s ( F i g . 2 ) , we r e p e a t e d t h e D N a s eI f o o t p r i n t i n g e x p e r i m e n t s b e f o r e a n d a f t e r t o p o i s o m e r a s e Ir e l a x a t i o n . F i g . 5 s h o w s t h a t s u c h r e l a x a t i o n d i d n o t r e v e r s et h e DNase I s e n s i t i v i t y w i t h i n o r s u r r o u n d i n g t h e REP2 l o c u s( c o m p a r e l a n e s c a n d d w i t h l a n e s e a n d f ) . T w o - d i m e n s i o n a le l e c t r o p h o r e s i s c o n f i r m e d t h a t r e l a x a t i o n w a s c o m p l e t e ( d a t an o t s h o w n ) . F u r t h e r mo r e , a s a c o n t r o l f o r p o t e n t i a l h e a t -s h o c k e f f e c t s , we t o p o i s o m e r a s e - t r e a t e d a l y s a t e f r o m c e l l st h a t h a d b e e n g r o w n i n g l u c o s e m e d i u m a t 2 4 T C a n d s h i f t e di n p a r a l l e l t o 3 7 0 C a n d f o u n d t h a t t h e REP2 l o c u s d i d n o tb e c o m e D N a s e I - s e n s i t i v e ( F i g . 5 , l a n e s a a n d b ) [ t h e s eg r o w t h c o n d i t i o n s r e p r e s s e x p r e s s i o n o f E . c o l i t o p o i s o m e r -a s e I ( 8 ) ] . T h u s , we c a n c o n c l u d e t h a t , a l t h o u g h p o s i t i v et o r s i o n a l s t r e s s may b e r e s p o n s i b l e f o r g e n e r a t i n g D N a s e Is e n s i t i v i t y , s u c h s t r e s s i s n o t r e q u i r e d f o r i t s m a i n t e n a n c e .

DISCUSSIONC h r o m a t i n C o n t a i n i n g P o s i t i v e l y S u p e r c o i l e d D N A P o s -s e s s e s C o n f o r m a t i o n a l l y A l t e r e d N u c l e o s o m e s . C o n f o r m a t i o n -a l l y a l t e r e d n u c l e o s o m e s a p p e a r t o r e p r e s e n t t h e u n d e r l y i n g

K b4. 0

2.4-

1.6-

GLUS T O P O

GAL1-TOPO +TOPO

0

0

0 f a0 o0

I L

0 'w0

0 . 9-I.

a b c d e fF I G . 5 . E f f e c t o f p o s i t i v e t o r s i o n a l s t r e s s on t h e D N a s e I s e n s i -t i v i t y o f t h e REP2 l o c u s . C u l t u r e s g r o w n a t 2 4 0 C i n g l u c o s e ( l a n e s aa n d b ) or g a l a c t o s e ( l a n e s c - f ) we re s h i f t e d t o 3 7 0 C as d e s c r i b e d i nF i g . 1 . L y s a t e s a m p l e s we re i n c u b a t e d w i t h ( l a n e s a , b , e , a n d f ) orw i t h o u t ( l a n e s c a n d d ) e u k a r y o t i c t o p o i s o m e r a s e I a n d t h e n d i g e s t e dw i t h tw o c o n c e n t r a t i o n s o f D Na se I ( e q u a l c o n c e n t r a t i o n we re i nl a n e s a , c , a n d e a n d i n l a n e s b , d , a n d I) . S a m p l e p r o c e s s i n g andf i g u r e l a b e l s are as i n F i g . 2 .

s t r u c t u r e o f c h r o m a t i n c o n t a i n i n g p o s i t i v e l y s u p e r c o i l e dDNA. F o o t p r i n t i n g e x p e r i m e n t s d e m o n s t r a t e d n u c l e a s e c u t -t i n g w i t h i n r e g i o n s n o r m a l l y e x h i b i t i n g a n u c l e o s o m a l s t r u c -t u r e ( F i g s . 2 a n d 5 ) . H o w e v e r , n e a r l y t y p i c a l n u c l e o s o m a ll a d d e r s w e r e g e n e r a t e d a f t e r e x t e n s i v e MNase d i g e s t i o n ( F i g .3 ) . T h e s e m i n i c h r o m o s o m e s a p p a r e n t l y s t i l l h a d n e a r l y n o r -m a l a m o u n t s o f h i s t o n e s b u t c o n t a i n e d p o s i t i v e t o r s i o n a ls t r e s s s i n c e r e l a x a t i o n w i t h e u k a r y o t i c t o p o i s o m e r a s e I g e n -e r a t e d m i n i c h r o m o s o m e s w i t h a s i m i l a r ( b u t n o t i d e n t i c a l )l i n k i n g n u m b e r c o m p a r e d t o t y p i c a l m i n i c h r o m o s o m e s ( F i g .4 ) . T h e p o s i t i v e s t r e s s w a s n o t l o c a t e d e x c l u s i v e l y i n l i n k e rr e g i o n s s i n c e n u c l e o s o m a l f o o t p r i n t s w e r e d i s r u p t e d ( F i g s . 2a n d 5 ) . I n a d d i t i o n , g r o w t h c o n d i t i o n s l e a d i n g t o p o s i t i v eDNA s u p e r c o i l i n g d i d n o t r e s u l t i n a n a p p a r e n t i n c r e a s e i n t h ei n t r a c e l l u l a r f r e e h i s t o n e p o o l n o r d i d a d d e d n a k e d DNAp r e f e r e n t i a l l y s t r i p o f f h i s t o n e s f r o m t h e c h r o m a t i n ( F i g . 4 ) .T h e c o n f o r m a t i o n a l l y a l t e r e d n u c l e o s o m e s may c o r r e s p o n dt o t h e u n f o l d e d o r s p l i t n u c l e o s o m a l s t r u c t u r e s a s s o c i a t e dw i t h D N a s e I s e n s i t i v i t y i n c h r o m a t i n ( 1 0 , 2 2 ) . I n s o m ee x p e r i m e n t s , we h a v e d e t e c t e d s e v e r a l s p l i t n u c l e o s o m ef o o t p r i n t s a l o n g t h e REP2 l o c u s ( d a t a n o t s h o w n ) ; p r e s u m -a b l y i m p r e c i s e p o s i t i o n i n g a l o n g t h e s e q u e n c e h a s p r e v e n t e da c l e a r e r d e m o n s t r a t i o n o f t h e s e s t r u c t u r e s . P e r h a p s t h ep o s i t i v e t o r s i o n a l s t r e s s a c h i e v e d i n t h e g e n e t i c a l l y e n g i -n e e r e d y e a s t s y s t e m i s s o g r e a t t h a t n u c l e o s o m e s b e c o m ef l i p p e d i n s i d e o u t .U t i l i z i n g i n v i t r o r e c o n s t i t u t i o n , C l a r k a n d F e l s e n f e l d ( 2 1 )c o n c l u d e d t h a t n e a r l y t y p i c a l n u c l e o s o m e s c a n b e f o r m e d o np o s i t i v e l y s u p e r c o i l e d DNA. T h e f i n d i n g s f r o m o u r i n v i v os t u d y a r e n o t n e c e s s a r i l y i n d i s a g r e e m e n t . W e a g r e e t h a t s u c hc h r o m a t i n s t i l l p o s s e s s e s h i s t o n e s , i s c a p a b l e o f b e i n g r e l a x e db y t o p o i s o m e r a s e I t o a n e g a t i v e l y s u p e r c o i l e d s t a t e , a n dg e n e r a t e s n e a r l y t y p i c a l n u c l e o s o m e s u p o n M N ase d i g e s t i o n .A l t h o u g h m a n y i m p o r t a n t t e c h n i c a l d i f f e r e n c e s e x i s t b e -t w e e n o u r s t u d i e s i n c l u d i n g t h e h i s t o n e s o u r c e ( 1 1 , 2 3 ) , C l a r ka n d F e l s e n f e l d ( 2 1 ) c o u l d h a v e m i s s ed t h e a l t e r e d n u c l e o s o m ec o n f o r m a t i o n d e t e c t e d h e r e b e c a u s e t h e y d i d n o t p e r f o r mf o o t p r i n t i n g e x p e r i m e n t s .P o s i t i v e D N A S u p e r c o i l i n g P r o v i d e s a M e c h a n i s m f o rS p r e a d i n g a C h r o m a t i n C o n f o r m a t i o n C h a r a c t e r i s t i c o f i g h l yA c t i v e G e n e s . T h e s t r u c t u r e o f 2 - , u m m i n i c h r o m o s o m e s c o n -t a i n i n g p o s i t i v e l y s u p e r c o i l e d DNA r e s e m b l e s t h a t o f h i g h l yt r a n s c r i p t i o n a l l y a c t i v e g e n e s : b o t h a r e p r e f e r e n t i a l l y s e n s i -t i v e t o D N a s e I d i g e s t i o n a n d c o n t a i n a n u c l e o s o m a l s t r u c t u r em o r e p r o n e t o i n t e r n a l n u c l e a s e c l e a v a g e r e l a t i v e t o t h a t o fi n a c t i v e s e q u e n c e s ( F i g s . 2 , 3 , a n d 5 ; r e f s . 1 - 7 a n d 1 0 ) .P o s i t i v e t o r s i o n a l s t r e s s , t h e r e f o r e , may b e a p r i m a r y d i r e c -t i v e f o r e s t a b l i s h i n g t h e s e f e a t u r e s a n d c o u l d s i g n a l a s e r i e so f s t a b i l i z i n g i n t e r a c t i o n s m e d i a t e d b y p o s t t r a n s l a t i o n a l m o d -i f i c a t i o n s a n d / o r b y o t h e r p r o t e i n s . O n c e g e n e r a t e d , t h ea l t e r e d c h r o m a t i n c o n f o r m a t i o n a p p e a r s t o b e " m e m o r i z e d , "s i n c e r e l a x a t i o n w i t h t o p o i s o m e r a s e I d i d n o t r e v e r s e DNaseI s e n s i t i v i t y ( F i g . 5 ) . F u r t h e r m o r e , h e i g h t e n e d n u c l e a s e s e n -s i t i v i t y o f t h e a c t i v e c h i c k e n g l o b i n g e n e l o c u s , w h i c h a p p e a r st o b e a s s o c i a t e d w i t h t o r s i o n a l s t r e s s , c a n n o t b e f u l l y r e -v e r s e d b y DNA n i c k i n g ( 2 4 ) n o r c a n t h a t a s s o c i a t e d w i t h t h ey e a s t HSP82 g e n e ( 1 0 ) . T y p i c a l 2 - , u m m i n i c h r o m o s o m e s a r ee s t i m a t e d t o c o n t a i n - 3 2 n u c l e o s o m e s ( 1 6 ) . T h e s l i g h t l yi n c r e a s e d l i n k i n g n u m b e r o f t h e r e l a x e d m i n i c h r o m o s o m e s[ F i g . 4 E ; AL 4 ] ma y n o t n e c e s s a r i l y r e f l e c t ' 1 2 % f e w e rn u c l e o s o m e s b u t i n s t e a d c o u l d b e d u e t o a l t e r a t i o n s i nn u c l e o s o m e c o n f o r m a t i o n a t t h e l e v e l o f DNA w r i t h e a n d / o rt w i s t , p o s s i b l y c a u s e d b y t h e l o s s o f a n H2A-H2B d i m e r ( s e er e f s . 2 1 a n d 2 5 ) . S i m i l a r c h a n g e s i n l i n k i n g n u m b e r p e rn u c l e o s o m e c a n b e c a u s e d b y h i s t o n e a c e t y l a t i o n ( 2 6 ) .S e v e r a l e x p e r i m e n t a l l y t e s t a b l e m o d e l s c a n b e c o n s i d e r e don h o w p o s i t i v e t o r s i o n a l s t r e s s c o u l d a l t e r c h r o m a t i n s t r u c -t u r e . F i g . 6 A s c h e m a t i c a l l y i l l u s t r a t e s t h e c o n s e q u e n c e s o fI t h e t w i n d o m a i n m o d e l o f DNA s u p e r c o i l i n g o f L i u a n d W a n g( 9 ) a t t h e l e v e l o f c h r o m a t i n a s w e h a v e p r o p o s e d ( 1 0 ) . T h e

P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 8 8 ( 1 9 9 1 )


5/5

P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A 8 8 ( 1 9 9 1 ) 9 6 7 9m o l e c u l e s are t r a n s c r i p t i o n a l l y a c t i v e i n v i v o . M o r e o v e r ,c o n t r a r y t o p r e v i o u s v i e w s ( 3 3 ) , r e c e n t s t u d i e s r e v e a l t h a tn u c l e o s o m e s a re p o t e n t i n h i b i t o r s o f t r a n s c r i p t i o n a l e l o n g a -t i o n i n v i t r o ( 3 4 ) . T h u s , p o s i t i v e DNA s u p e r c o i l i n g may b er e q u i r e d t o f a c i l i t a t e t h e process o f e l o n g a t i o n b y d e c o n d e n s -i n g c h r o m a t i n .

C

F I G . 6 . C h r o m a t i n s t r u c t u r a l c h a n g e s c a u s e d b y t r a n s i e n t DNAs u p e r c o i l i n g . T h e s c h e m a t i c d i a g r a m s d e p i c t c h r o m o s o m a l l o o p sw i t h a n c h o r e d e n d s , c o m p o s e d o f p o l y n u c l eo s o m a l c h a i n s t h a t ar eb e i n g t r a v e r s e d f r o m l e f t t o r i g h t ( a r r o w ) b y RNA p o l y m e r a s e t h a ti n i t i a t e d a t t h e t r i a n g u l a r s i t e l a b e l e d I . ( A ) T w i n d o m a i n s o f DNAs u p e r c o i l i n g ( 9 ) l e a d t o p o s i t i v e s u p e r c o i l s ( + ) d o w n s t r e a m o f t h et r a n s c r i p t i o n c o m p l e x , w h i c h c o n f o r m a t i o n a l l y u n f o l d or s p l i t n u -c l e o s o m e s , a n d n e g a t i v e s u p e r c o i l s ( - ) u p s t r e a m , w h i c h t i g h t l y p a c kt h e s t r u c t u r e ( 1 0 ) . ( B ) S e l e c t i v e r e l a x a t i o n o f n e g a t i v e s u p e r c o i l ss p r e a d s p o s i t i v e t o r s i o n a l s t r e s s t h r o u g h o u t t h e l o o p . ( C ) C o n f o r -m a t i o n a l a l t e r a t i o n s i n n u c l e o s o m e s i n i t i a l l y c r e a t e d b y p o s i t i v es t r e s s d o w n s t r e a m o f t h e t r a n s c r i p t i o n c o m p l e x ar e n o t f u l l y r e v e r s e db y s u b s e q u e n t n e g a t i v e s t r e s s a f t e r t r a v e r s a l b y RNA p o l y m e r a s e .p o s i t i v e s u p e r c o i l s d o w n s t r e a m o f t r a v e r s i n g RNA p o l y m e r -a se w o u l d u n c o i l t h e n e g a t i v e l y s u p e r c o i l e d DNA a b o u th i s t o n e o c t a m e r s l e a d i n g t o n u c l e o s o m e u n f o l d i n g or s p l i t t i n g( 1 0 , 2 2 ) . I n a d d i t i o n , t h e 3 0 - n m c h r o m a t i n f i b e r , w h i c hc o n s i s t s o f a n u c l e o s o m e s u p e r h e l i x [ e v e n i n y e a s t ( 2 7 ) ] , maya l s o b e n e g a t i v e l y s u p e r c o i l e d ( 2 8 ) a n d p o s i t i v e s u p e r c o i l sc o u l d a l s o u n c o i l t h e s e s t r u c t u r e s . The m o d e l s h o w n i n F i g .6 A , h o w e v e r , c a n n o t a c c o u n t f o r t h e o b s e r v a t i o n t h a t p r e f -e r e n t i a l DNase I s e n s i t i v i t y s o m e t i m e s e x t e n d s u p s t r e a m o ft r a n s c r i p t i o n u n i t s ( e . g . , r e f . 6 ) . As s h o w n i n F i g . 6 B , a n e tp o s i t i v e s t r e s s a n d a c c o m p a n y i n g D N a se I s e n s i t i v i t y c o u l db e g e n e r a t e d t h r o u g h o u t a n e n t i r e c h r o m o s o m a l l o o p i fn e g a t i v e DNA s u p e r c o i l s a re p r e f e r e n t i a l l y r e l a x e d . A l t e r -n a t i v e l y , p o s i t i v e s u p e r c o i l s m i g h t c r e a t e a n a l t e r e d c h r o m a -t i n s t r u c t u r e t h a t i s n o t f u l l y r e v e r s e d b y n e g a t i v e s t r e s s ( e . g . ,F i g . 5 ) , l e a d i n g t o h e i g h t e n e d DNase I s e n s i t i v i t y t h r o u g h o u ta n d d o w n s t r e a m o f t h e t r a n s c r i be d gene r e g i o n b u t n o tu p s t r e a m o f t h e i n i t i a t i o n s i t e ( F i g . 6 C ) . N e t s u p e r h e l i c a ls t r e s s a p p a r e n t l y ca n even b e n e g a t i v e i f p o s i t i v e s u p e r c o i l sare p r e f e r e n t i a l l y r e l a x e d ( 2 9 ) .I m p l i c a t i o n s o f P o s i t i v e D N A S u p e r c o i l i n g f o r T r a n s c r i p -t i o n . As d e s c r i b e d a b o v e , p o s i t i v e DNA s u p e r c o i l i n g d o w n -s t r e a m o f t h e t r a n s c r i p t i o n c o m p l e x i s b e l i e v e d t o d e c o n -d e n s e t h e c h r o m a t i n f i b e r a n d p a v e t h e way f o r RNA p o l y -m e r a s e p a s s a ge ( F i g . 6 a n d r e f . 1 0 ) . ( T h e process o f t r a v e r s a li s a s e p a r a t e t o p o l o g i c a l p r o b l e m r e q u i r i n g u n w i n d i n g o f t h eDNA d o u b l e h e l i x . ) S i g n i f i c a n t l y , t h e r e s u l t s o f i n v i t r oe x p e r i m e n t s are c o n s i s t e n t w i t h t h e p o s s i b i l i t y t h a t t r a n s c r i p -t i o n - i n d u c e d p o s i t i v e s t r e s s a l t e r s n u c l e o s o m e s ( 1 4 ) a n dp r e v i o u s e l e c t r o n m i c r o s c o p i c s t u d i e s h a v e v i s u a l i z e d c h r o -m a t i n d e c o n d e n s a t i o n d o w n s t r e a m o f t r a v e r s i n g RNA p o l y -me r a s e ( 3 ) . F u r t h e r m o r e , t o r s i o n a l s t r e s s appears t o b er e q u i r e d f o r t r a n s c r i p t i o n t o occur i n l i v i n g c e l l s , s i n c ec i r c u l a r , b u t n o t l i n e a r i z e d ( 3 0 , 3 1 ) or n i c k e d ( 3 2 ) , DNA

W e are i n d e b t e d t o D r s . L . A . F r e e m a n , D . S . G r o s s , P . K .P f a f f i e , a n d K . W. T r e v o r r o w f o r a c r i t i c a l r e v i e w o f t h i s m a n u s c r i p t .W e ar e p a r t i c u l a r l y g r a t e f u l t o D r s . V . J a c k s o n , R . S t e r n g l a n z , a n dJ . C . Wang f o r t h e i r generous g i f t s o f t o p o i s o m e r a s e I, y e a s t s t r a i n s ,a n d r e c o m b i n a n t p l a s m i d s . T h i s i n v e s t i g a t i o n was s u p p o r t e d b yG r a n t s G M 2 2 2 0 1 , G M 2 9 9 3 5 , a n d GM31689 f r o m t h e N a t i o n a l I n s t i -t u t e s o f H e a l t h a n d G r a n t 1 - 8 2 3 f r o m t h e R o be r t A . W e l c h F o u n d a -t i o n .

1 . W e i n t r a u b , H . & G r o u d i n e , M . ( 1 9 7 6 ) S c i e n c e 1 9 3 , 8 4 8 - 8 5 6 .2 . L e v y , A . & N o l l , M . ( 1 9 8 1 ) N a t u r e ( L o n d o n ) 2 8 9 , 1 9 8 - 2 0 3 .3 . B j o r k r o t h , B . , E r i c s s o n , C . , L a m b , M . M. & D a n e h o l t , B .( 1 9 8 8 ) C h r o m o s o m a ( B e r l i n ) 96, 3 3 3 - 3 4 0 .4 . W e i n t r a u b , H . ( 1 9 8 5 ) C e l l 4 2 , 7 0 5 - 7 1 1 .5 . G r o s s , D . S . & G a r r a r d , W. T . ( 1 9 8 7 ) T r e n d s B i o c h e m . S c i . 1 2 ,2 9 3 - 2 9 7 .6 . J a n t z e n , K . , F r i t t o n , H . P . & I g o - K e m e n e s , T . ( 1 9 8 6 ) N u c l e i cA c i d s R e s . 1 4 , 6 0 8 5 - 6 0 9 9 .7 . X u , M . , B a r n a r d , M . B . , R o s e , S . M . , C o c k e r i l l , P . N . , H u a n g ,

S . - Y . & G a r r a r d , W. T . ( 1 9 8 6 ) J . B i o l . C h e m . 2 6 1 , 3 8 3 8 - 3 8 4 5 .8 . G i a e v e r , G . N . & W a n g , J . C . ( 1 9 8 8 ) C e l l 5 5 , 8 4 9 - 8 5 6 .9 . L i u , L . L . & W a n g , J . C . ( 1 9 8 7 ) P r o c . N a i l . A c a d . S c i . USA 8 4 ,7 0 2 4 - 7 0 2 7 .1 0 . L e e , M . - S . & G a r r a r d , W. T . ( 1 9 9 1 ) EMBO J . 1 0 , 6 0 7 - 6 1 5 .1 1 . S a a v e d r a , R . A . & H u b e r m a n , J . A . ( 1 9 8 6 ) C e l l 4 5 , 6 5 - 7 0 .1 2 . Y a n g , L . , J e s s e e , C . B . , L a u , K . , Z h a n g , H . & L i u , L . L .( 1 9 8 9 ) P r o c . N a d l . A c a d . S c i . USA 8 6 , 6 1 2 1 - 6 1 2 5 .1 3 . R e e d , K . C . & M a n n , D . A . ( 1 9 8 5 ) N u c l e i c A c i d s R e s . 1 3 ,7 2 0 7 - 7 2 2 1 .1 4 . P f a f f l e , P . , G e r l a c h , V . , B u n z e l , L . & J a c k s o n , V . ( 1 9 9 0 ) J .B i o l . C h e m . 2 6 5 , 1 6 8 3 0 - 1 6 8 4 0 .1 5 . B r o a c h , J . R . ( 1 9 8 2 ) C e l l 2 8 , 2 0 3 - 2 0 4 .

1 6 . S e l i g y , V . L . , T h o m a s , D . Y . & M i k i , B . L . A . ( 1 9 8 0 ) N u c l e i cA c i d s R e s . 8 , 3 3 7 1 - 3 3 9 1 .1 7 . F a g r e l i u s , T . J . & L i v i n g s t o n , D . M. ( 1 9 8 4 ) J . M o l . B i o l . 1 7 3 ,1 - 1 3 .1 8 . V e i t , B . C . & F a n g m a n , W. L . ( 1 9 8 5 ) M o l . C e l l . B i o l . 5 ,2 1 9 0 - 2 1 % .1 9 . V o k e r t , F . C . & B r o a c h , J . R . ( 1 9 8 6 ) C e l l 4 6 , 5 4 1 - 5 5 0 .2 0 . S u t t o n , A . & B r o a c h , J . R . ( 1 9 8 5 ) M o l . C e l l . B i o l . 5 , 2 7 7 0 - 2 7 8 0 .2 1 . C l a r k , D . J . & F e l s e n f e l d , G . ( 1 9 9 1 ) EMBO J . 1 0 , 3 8 7 - 3 9 5 .2 2 . P r i o r , C . P . , C a n t o r , C . R . , J o h n s o n , E . M . , L i t t a u , V . C . &A l l f r e y , V . G . ( 1 9 8 3 ) C e l l 3 4 , 1 0 3 3 - 1 0 4 2 .2 3 . M o r s e , R . H . , P e d er s o n , D . S . , D e a n , A . & S i m p s o n , R . T .( 1 9 8 7 ) N u c l e i c A c i d s R e s . 1 5 , 1 0 3 1 1 - 1 0 3 3 0 .2 4 . V i l l e p o n t e a u , B . , L u n d e l l , M. & a r t i n s o n , M. ( 1 9 8 4 ) C e l l 3 9 ,4 6 9 - 4 7 8 .2 5 . B a e r , B . W. & R h o d e s , D . ( 1 9 8 3 ) N a t u r e ( L o n d o n ) 3 0 1 , 4 8 2 -4 8 8 .2 6 . N o r t o n , V . G . , I m a i , B . S . , Y a u , P . & B r a d b u r y , E . M. ( 1 9 8 9 )C e l l 5 7 , 4 4 9 - 4 5 7 .2 7 . L o w a r y , P . T . & W i d o m , J . ( 1 9 8 9 ) P r o c . N a t l . A c a d . S c i . US A8 6, 8 2 6 6 - 8 2 7 0 .2 8 . W i l l i a m s , S . P . , A t h e y , B . D . , M u g l i a , L . J . , S c h a p p e , R . S . ,G o u g h , A . H . & L a n g m o r e , J . P . ( 1 9 8 6 ) B i o p h y s . J . 4 9 , 2 3 3 -2 4 8 .2 9 . B r i l l , S . J . & S t e r n g l a n z , R . ( 1 9 8 8 ) C e l l 5 4 , 4 0 3 - 4 1 1 .3 0 . H a r l a n d , R . M . , W e i n t r a u b , H . & M c K n i g h t , S . L . ( 1 9 8 3 )N a t u r e ( L o n d o n ) 3 0 2 , 3 8 - 4 3 .3 1 . W e i n t r a u b , H . , C h e n g , P . F . & C o n r a d , K . ( 1 9 8 6 ) C e l l 4 6 ,1 1 5 - 1 2 2 .3 2 . L u c h n i k , A . N . , H i s a m u t d i n o v , T . A . & G e o r g i e v , G . P . ( 1 9 8 6 )N u c l e i c A c i d s R e s . 1 6 , 5 1 7 5 - 5 1 9 0 .3 3 . R o s a , R . & B r o w n , D . D . ( 1 9 8 7 ) C e l l 5 0 , 8 0 1 - 8 0 8 .

3 4 . I z b a n , M. G . & L u s e , D . S . ( 1 9 9 1 ) G e n e s D e v . 5 . 6 8 3 - 6 9 6 .

A - V -B i o c h e m i s t r y : L e e a n d G a r r a r d

myeong-sok lee and william t. garrard- positive dna supercoiling generates a chromatin conformation...

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