Roma, 29 maggio 2008“La diagnostica di laboratorio in sanità animale”

MycobacteriumMycobacterium aviumavium subspsubsp. . paratuberculosisparatuberculosis: caratteristiche : caratteristiche

biologiche e biologiche e genotipichegenotipiche

N. Arrigoni, R. TaddeiIstituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia e dell’Emilia RomagnaCentro di Referenza Nazionale della Paratubercolosi - Piacenza

"Mycobacterium enteritidis" Lehmann in Lehmann e Neumann 1927

"Bacterium paratuberculosis" (Bergey et al. 1923) Miessner & Berge in Kolle e Wasserman 1929

"Bacillus paratuberculosis" (Bergey et al. 1923) Krasil'nikov 1941

"Mycobacterium johnei" Francis 1943

“Mycobacterium paratuberculosis” Bergey et al. 1923 (Approved Lists 1980)

TassonomiaTassonomia

“Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis”(Bergey et al. 1923) Thorel et al. 1990

16S rDNA

“Mycobacterium enteritidis chronicae pseudotuberculosis bovis Johne” Twort e Ingram 1912

Aerobio, immobile, non produce flagelli, capsule o spore

MycobacteriumMycobacterium aviumavium subspsubsp. . paratuberculosisparatuberculosis ((MapMap))

Bacillo di piccole dimensioni (0,5 - 1 µm )

Gram positivo, Alcool-acidoresistente

Membrana plasmatica

Peptidoglicani

Arabinogalattani

Acidi micolici

Parete ricca di lipidi e

polisaccaridi

Aggregato o “clump”

SOPRAVVIVENZA NELLSOPRAVVIVENZA NELL’’AMBIENTEAMBIENTE

Map può sopravvivere

• 163 gg in acqua di fiume• 336 gg in acqua stagnante• 1.210 gg nel suolo• 330 gg nelle feci• 7 gg nelle urine

SOPRAVVIVENZA NEL LETAMESOPRAVVIVENZA NEL LETAME

98 gg a 15°C28 gg a 30°C<3 h a 55°C

SOPRAVVIVENZA DI SOPRAVVIVENZA DI MapMap NELLNELL’’AMBIENTEAMBIENTE

Resistente a:alte temperaturecomuni disinfettanti

la clorazione dell’acqua non è in grado di inattivare Map

SOPRAVVIVENZA NELLSOPRAVVIVENZA NELL’’AMBIENTEAMBIENTE

Sensibile a:formalina 5%fenolo 2,5%

Lenta crescita (4-16 settimane)

CRESCITA E SVILUPPOCRESCITA E SVILUPPO

CEPPI OVINICEPPI OVINICrescita molto lenta (fino a 40 settimane)Colonie molto piccole e a volte pigmentate

Colonie piccole (1-2 mm)lisce, lucide, solitamente non pigmentate

QUANTE FORME VITALI PUOQUANTE FORME VITALI PUO’’ ASSUMERE ASSUMERE MapMap??

Vegetativa Sferoplasto

Dormiente

Parassita obbligato

CRESCITA E SVILUPPOCRESCITA E SVILUPPO

ACQUISIZIONE DEL FERRO NEI MICOBATTERIACQUISIZIONE DEL FERRO NEI MICOBATTERI

mycobactin

Esterno Parete cellulare Interno

esocheline

Fe

Fe-esocheline Fe

mycobactinreduttasi

Fe-mycobactin

Mycobactin dipendente in vitro

……E IN E IN MapMap??

Citoplasma

Assunzione del ferro “in vitro” da parte di Map

Fe + Mycobactin

La Mycobactin dipendenza non è patognomonica per MapMeccanismo di assunzione di ferro in vivo sconosciuto

Fe

Li, Lingling et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102, 12344-12349

4,83 mbp di cui 4,54 mostrano il 96-100% di omologia con Maa

6% (289 kb) del genoma esclusivo di Map

G+C 69.3%

∼ 4.350 geni codificanti proteine

Non ci sono plasmidi

1.5% del genoma è composto da DNA ripetuto

IL GENOMA DI IL GENOMA DI MapMap

Le sequenze di inserzione (IS) sono piccoli segmenti di DNA (<2.5kb) mobili in grado di inserirsi in siti multipli del genoma.

Il genoma di Map contiene 20 diversi elementi IS

SEQUENZE DI INSERZIONESEQUENZE DI INSERZIONE

IS900IS1311ISMav2ISMpc1IS_Map01

IS_Map02IS_Map03IS_Map04IS_Map05IS_Map06

IS_Map07IS_Map08IS_Map09IS_Map10IS_Map11

Sequenze dSequenze d’’inserzione di inserzione di MapMap

IS_Map12IS_Map13IS_Map14IS_Map15IS_Map16

Presenti in NUMERO e POSIZIONI variabili nel genoma

Possono essere SPECIE SPECIFICHE

UTILIZZO DIAGNOSTICO DELLE UTILIZZO DIAGNOSTICO DELLE SEQUENZE DI INSERZIONESEQUENZE DI INSERZIONE

Sequenza d’inserzione

organismo n°copie/genoma

utilizzo tecnica

IS900 Map,ma non solo!

Map

Map

Map, Maa,M.intracellulare

17-20 Diagnosi Map PCR

ISMav2 almeno 3 Diagnosi Map PCR

IS_Map02 6 Diagnosi Map PCR

IS1311 7-10 Distinzione ceppi ovini/bovini

PCR-REA

TIPIZZAZIONE MOLECOLARE DI TIPIZZAZIONE MOLECOLARE DI MapMap: IS: IS900900 RFLPRFLP

•Separazione elettroforetica dei frammenti di restrizione

•Analisi dei fingerprint

•Digestione enzimatica

•Ibridazione con sonda •Southern blotting

Sonda marcata

1 1 2 3

a

b

a b

a b d

a

b

d

sito di restrizione Sequenza d’inserzione (IS) Sonda

COME POSSONO ESSERE SPIEGATI I DIVERSI PROFILI DI COME POSSONO ESSERE SPIEGATI I DIVERSI PROFILI DI RESTRIZIONE OSSERVATI?RESTRIZIONE OSSERVATI?

a

b

c

a b c

ISIS900900 RFLP: RISULTATIRFLP: RISULTATI

Ospite

I Ovini, Caprini, Ruminanti selvatici

S Ovini, Caprini, Ruminanti selvatici

C Bovini, Ovini, Caprini, Ruminanti selvatici, Uomo

Corsa in campo pulsato che permette la risoluzione di frammenti >20Kb

TIPIZZAZIONE MOLECOLARE DI TIPIZZAZIONE MOLECOLARE DI MapMap::PFGE (Gel Elettroforesi in Campo Pulsato)PFGE (Gel Elettroforesi in Campo Pulsato)

Digestione con enzima di restrizione“rare cutter”

PCR 1311 - REA

HinfI = cambio di base in posizione 223 presente in alcune copie di IS1311 di Map Bovino

distingue tra ceppi B/S di Map

MseI = cambio di base in posizione 442 presente in IS1311 di Maa

distingue tra Map e Maa

PCR 1311 - REAHinfI+MseI HinfI

1 2 3 4 1 2 3

Lane 1: MarkerLane 2: Map BovinoLane 3: Map Ovino

Lane 1: MarkerLane 2: M.aviumLane 3: Map BovinoLane 4: Map Ovino

Tipo ITipo I Tipo IITipo II Tipo IIITipo III

ISIS900900--RFLPRFLP S C I

CrescitaCrescita Molto lenta lenta Molto lenta

PigmentazionePigmentazione presente assente assente

Preferenza dPreferenza d’’ospiteospite pecore assente capre

Distribuzione geograficaDistribuzione geografica limitata globale Spagna

ISIS13111311--PCR REAPCR REA Ovino Bovino Ovino

Tipizzazione di Map attraverso PFGE: Tipizzazione di Map attraverso PFGE: RisultatiRisultati

Maa Tipo I Tipo III Tipo II

Mycobacterium avium subsp.paratuberculosis strainsfrom cattle and sheep can be distinguished by a PCR

test based on a novel DNA sequence difference

Prodotti PCR da ceppi bovini e ovini di Map amplificati con DMC529, DMC531, DMC533Lane 1 e 11: Marcatori di PMLane 2-3-4-5: Ceppi boviniLane 6-7-8-9: Ceppi oviniLane 10: Controllo negativo

Desmond M. Collins et All., J.Clin.Microb.(2002): 40, 12, 4760-4762

Vantaggi:Processo 1 step invece che 3 steps

Svantaggi:Minore sensibilità(1 copia invece che 17-20)

PFGE: SVANTAGGI

• Applicabile solo a ceppi coltivabili• Lento • Indaginoso• Analisi dei pattern complessa• Basso potere discriminatorio

New variable-number tandem-repeat markers for typingMycobacterium avium subsp. paratuberculosis and

M.avium strains: comparison with IS900 and IS1245 restriction fragment length polymorphism typing

Thibault at All., J.Clin.Microb.(2007): 45,8, 2404-2410

Analisi della sequenza genomica del ceppoMap K10 per la presenza di sequenze TR

minisatelliti (10-100 bp)

Identificazione di 8 loci TR e MIRU che dimostrano polimorfismi dimensionali dopo PCR

New variable-number tandem-repeat markers for typingMycobacterium avium subsp. paratuberculosis and

M.avium strains: comparison with IS900 and IS1245 restriction fragment length polymorphism typing

Thibault at All., J.Clin.Microb.(2007): 45,8, 2404-2410

Potere discriminatorio di IS900 RFLP e MIRU-VNTR

Thibault at All., J.Clin.Microb.(2007): 45,8, 2404-2410

Typing Method DiscriminatoryIndex

RFLP 0,483

MIRU-VNTR 0,751

RFLP + MIRU-VNTR 0,855