Multisupstratni enzimiTehnike merenja u enzimskoj kinetici

Multisupstratni sistemi

1. Neuredjeni sekvencijalni mehanizam

3. Theorell-Chance mehanizam (ternarni kompleks se ne nagomilava)

A je vrlo često koenzim (NAD+)

4. Ping-pong mehanizam

Transferaze

2. Uredjeni sekvencijalni mehanizam

Kompleks EAB: ternarni ili centralni kompleks

Uredjeni sekvencijalni bi-bi mehanizam

Koncentracija B je konstantna – rešenja kinetike sekvencijalnog uredjenog mehanizma

Koncentracija A je konstantna – rešenja kinetike sekvencijalnog uredjenog mehanizma

Kinetika sekvencijalnih bi-bi reakcijaLinearizacija

KA – Konstanta disocijacije kompleksa EAKm(A) – Mihaelisova konstanta enzima ka supstratu A u prisustvu zasićujućih koncentracija supstrata BKm(B) – Mihaelisova konstanta enzima ka supstratu B u prisustvu zasićujućih koncentracija supstrata A

Kinetika sekvencijalnih bi-bi reakcija

Neuredjeni sekvencijalni mehanizam

KA – Konstanta disocijacije binarnog kompleksa EAKm(A) – Mihaelisova konstanta enzima ka supstratu A u prisustvu zasićujućih koncentracija supstrata B, konstanta disocijacije ternarnog kompleksaKm(B) – Mihaelisova konstanta enzima ka supstratu B u prisustvu zasićujućih koncentracija supstrata A, konstanta disocijacije ternarnog kompleksa

Koncentracija A je konstantna – rešenja kinetike sekvencijalnog neuredjenog mehanizma

Koncentracija B je konstantna – rešenja kinetike sekvencijalnog neuredjenog mehanizma

Ping-pong reakcije

Konstantna konc. B- Konstantna koncentacija A

Kinetika ping-pong bi-bi reakcija

Km(A) – Mihaelisova konstanta enzima ka supstratu AKm(B) – Mihaelisova konstanta enzima ka supstratu B

Karakteristični LB plot ping-pong kinetike.

Fosfoglicerat mutaza (transfer fosforil grupe)

Acetil-koenzim A:arilamin acetiltransferaza (transfer acil grupe uz formiranje aciltioenzima)

Sekundarni grafik LB metode linearizacije za ping-pong rekacije.

Odredjivanje konstanti disocijacije za protein-ligand interakcije

Neekvilibrijumska dijaliza se koristi za brza odredjivanja, pri čemu se odredjuje brzina

difuzije kroz polupropustljivu membranu

Ekvilibrijumska dijaliza

Ekvilibrijumska gel filtracija

Primenljiva i za enzime

Ultracentrifugiranje

Filter testovi

Spektroskopske metode

Mikrokalorimetrija

Stehiometrijska titracija

Surface Plasmon Resonance BiosensorOdredjivanje konstanti disocijacije

Merenja individualnih konstanti brzina

Merenja individualnih konstanti brzina

Metoda stalnog protoka

Vrednosti za kcat su u opsegu 1 – 107 s-1

Metoda zaustavljenog protoka

Metoda zaustavljenog protoka

Metoda prekinutog protoka

Tehnika prekinutog protoka

Tehnika pulsnog prekinutog protoka

Flash fotoliza

Odgovorajući supstrati često nisu dostupni

Za enzime koji zahtevaju ATP i GTP razvijen je supstrat tzv. “caged” ATP, odnosno GTP

Time scale reda ms

Relaksacione metodeTemperature jump

Konstante brzina enzimskih reakcija i procesi koji odredjuju brzinu

Enzimi koji postižu katalitičku perfekciju