métodos de identificación rápida 9_2017.pdf · 2017. 8. 10. · características generales de la...
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Laboratorio 9: Familia Enterobacteriaceae
Métodos de Identificación Rápida
Biol: 3725L
Objetivos
Conocer los métodos rápidos para la
identificación de bacterias (API 20E,
Enterotubo II, Biolog y Vitek).
Inocular un desconocido en varias
pruebas bioquímicas
Tomar datos de las reacciones bioquímicas
después de 24 horas de inoculación.
Características generales de
la familia Enterobacteriaceae Bacilos (o coco-bacilos)
Gram negativos
No producen esporas
Temperatura óptima entre 32°- 45.5°C.
Anaerobios facultativos.
Algunos producen cápsula.
Algunos fermentan lactosa.
Pueden ser mótiles (flagelo).
Flora normal del intestino de animales de sangre caliente.
Catalasa positivos
Oxidasa negativos
Causantes de enfermedades nosocomiales.
Patógenos humanos más comunes.
Miembros de la
Familia Enterobacteriaceae
Citrobacter sp.
Enterobacter sp.
Escherichia sp.
Klebsiella sp.
Morganella sp.
Proteus sp.
Providencia sp.
Salmonella sp.
Serratia sp.
Shigella sp.
Yersinia sp.
Salmonella typhimurium
Shigella dysenteriae
Salmonella enteritidis
Yersinia pestis
Serratia marcescens Klebsiella
pneumoniae
Los géneros patogénicos más comunes se clasifican en tres grupos
Coliformes: bacilo, Gram -, fermentan lactosa a gas y acido, microbiota normal, pueden ser patógenos oportunistas.
No coliformes oportunistas: no fermentan lactosa.
Patógenos verdaderos
Miembros de la
Familia Enterobacteriaceae
Enfermedades
Gastrointestinales
Tracto urinario
Meningitis
Septicemia
Pneumonia
Modo de Transmición
Alimentos
contaminados
Persona a Persona
Agua contaminada
Contacto con animal
Ruta Oral
Propiedades virulentas de E.coli
Enterohemorrágico
Diarrea en humanos, bovinos, gatos y perros.
Escherichia coli O157:H7
Clasificada de acuerdo a sus antígenos somáticos
(O) y flagelares (H).
Tolerancia acídica (pH bajo)
Tolerante a muchos antibióticos
Escherichia coli O157:H7
Causa principal de colitis hemorrágica o diarrea con presencia de sangre.
Puede progresar a Síndrome Urémico Hemolítico. Afecta riñones
Puede causar Púrpura Trombocitopenia Trombótica Moretones
Disminución de plaquetas (trombocitos)
Trombos (coágulos en los vasos sanguíneos
Métodos rápidos de identificación
de la Familia Enterobacteriaceae
Métodos rápidos de identificación
20 microtubos con sustratos
deshidratados (rehidratación
con suspensión de bacteria)
Se pueden identificar 127
géneros y 550 spp.
diferentes
Bacterias oxidasa-negativo
Gram-negativo de la familia
Enterobacteriaceae y otros
Gram -
API 20E (Analytical Profile Index)
Provee muchos resultados de una sola inoculación.
API 20E
Incubar a 35-37ºC
18-24 hrs
API 20E
Provee lectura de 22 pruebas
bioquímicas
Utilización
Se genera anaerobiosis con aceite
mineral estéril en pruebas cuyas siglas
están subrayadas:
Ej. ADH, LDC, ODC, etc
Las pruebas marcadas con un recuadro
inferior, se deben llenar completamente:
Ej. CIT,VP, etc.
Procedimiento de API 20E
Preparación de la suspensión
Inocule una colonia (2-3mm diámetro) del cultivo puro
de su bacteria en solución salina 0.85%
Asegúrese que la suspensión sea homogénea.
•Luego de hacer la suspensión
inocular los microtúbulos de
API 20E
•Añadir 5 ml de agua en la
bandeja de incubación para
proveer atmósfera húmeda.
Procedimiento de API 20E
Como llenar los microtúbulos
¿Como se lee el API 20E?
Aminoácidos analizados son (en orden) arginina, lisina y
ornitina.
Decarboxilación: reacción alcalina (cambio de color a
rojo)
Carbohidratos analizados son glucosa, manitol, inositol,
sorbitol, ramanosa, sacarosa, melibiosa, amygdalina y
arabinosa.
Fermentación: reacción ácida (cambio de color a
amarillo)
Producción de H2S e hidrólisis de gelatina (cambio a color
negro en todo el microtubo).
Interpretación del API 20E
Apuntar los resultados en la tabla de tabulación (1, 2, o 4 puntos para reacciones +, 0 puntos para reacciones -) .
La prueba de oxidasa debe ser negativa.
Tres pruebas son añadidas a la vez para dar un código de 7 dígitos (profile index number), el cual es interpretado en el manual de códigos.
Desventajas de API 20E
Solo para microorganismos no fastidiosos.
Cepas Gram negativas y oxidasa negativa.
Bacterias de la Fam. Enterobacteriaceae.
De encontrarse Salmonella o Shiguella spp., es necesario llevar a cabo pruebas serológicas para confirmar la identificación.
Ventajas de API 20E Rápido
Eficaz
Permite realizar numerosas pruebas a la vez
API 20E Resultados para diferentes miembros de la Familia
Enterobacteriaceae
Sistema de Enterotubo II
Identificar miembros de la familia
Enterobacteriaceae, fermentadoras de glucosa y
que son oxidasa negativa. (Salmonella, Yersinia,
Escherichia etc.)
Algunas de las pruebas usadas en este sistema
son: Simmon Citrate, Triple Sugar-iron agar,
ureasa entre otros.
Sistema de Enterotubo II Tubo con 12 compartimentos, cada uno
con un medio de cultivo sólido diferente.
15 pruebas estándar preformadas:
Aerobia y anaerobias
Se inocula con una aguja, que se pasa por el centro de los compartimentos
Incubación: 18 – 24 horas a 37ºC (oscuridad)
Desventajas
Poco preciso
Riesgos de contaminación de las pruebas
Se diagnosticaban erróneamente géneros de bacterias
Sistema Enterotubo II
Lectura
Observar cambios de
color
Identificación:
Estructurar un código de
5 dígitos (Biocode)
Consultar con el manual
ENCISE (Enterobacteriaceae
Numerical Coding and
Identification System for
Enterotube)
Sistemas Computarizados
VITEK
Identificación y/o determinación de reacción antibiótica de
bacterias y levaduras anaerobias (más de 300 especies).
30 pozos con pruebas bioquímicas deshidratadas.
Identificación en 2 a 7 hrs.
La automatización aporta mayor seguridad, suprimiendo las
manipulaciones repetitivas.
Una vez inoculada, queda herméticamente cerrada y por lo
tanto es manipulable sin riesgo de contaminación.
No es necesario añadir ningún reactivo, lo cual evita
cualquier riesgo de olvido o error.
Sistemas Computarizados Inoculador / Sellador
El cual permite la inoculación de las tarjetas en pocos minutos.
Incubador / Lector
Asegura simultáneamente la incubación y la lectura de las tarjetas
para una capacidad que varía de 32 a 480 tarjetas según el modelo.
Ordenador
Efectúa un control permanente de las operaciones en curso,
memoriza los valores, trata e interpreta los resultados.
Impresora
BIOLOG:
Identificación de 1900 bacterias, levaduras y hongos en base a su capacidad enzimática.
Sistema de microplacas de 96 fosas cada una conteniendo una fuente única de carbono, nutrientes básicos y un indicador colorimétrico.
El indicador colorimétrico que utiliza este sistema es una sal de tetrazolium que en su forma oxidada es incolora.
Cuando el organismo es introducido en la gran variedad de sustratos de carbono en la microplaca se produce una huella con un patrón característico.
Los resultados bioquímicos de la muestra son leídos y guardados en segundos automáticamente, eliminando la subjetividad visual de la interpretación.
Sistemas Computarizados
BIOLOG:
Posteriormente son comparados con la extensa base de datos para su identificación final.
Los resultados se interpretan y se registran automáticamente.
Especie identificada se exhibe en un monitor de la pc junto con su patrón de la reacción. También una lista de 10 especies con
los patrones relacionados más cercanos y otra estadística útil.
La tecnología de Biolog es tan sensible que puede detectar cultivos mezclados o contaminados.
Sistemas Computarizados
Práctica
Instrucciones
Escoja una colonia de la placa de MSA o de
MacConkey
Seguir instrucciones del instructor.
Haga las inoculaciones y actividades que le
sugieren los flujogramas.
Incubar a 37ºC/24hrs.
Observar sus resultados y anotarlos.
Recuerden traer su vaso de recolección de
orina para la próxima semana!!
MacConkey
morfología
coco bacilo
Facultativo
+ -
Neisseria
Veillonella
motil Pseudomonas
Alcaligenes
Halobacterium
Flavobacterium + -
Shigella
Klebsiella
Escherichia Enterobacter
Citrobacter Proteus
Providencia Erwinia
Salmonella Morganella
Métodos rápidos de identificación
API 20E
Enterotube
Vitek
Biolog
Lab # 9: Familia Enterobactericeae e identificación
de desconocidos
MSA
morfología
coco bacilo
Catalasa
+ - Staphylococcus 6.5% NaCl
+ Enterococcus - Streptococcus
Esporas
+ - Aeróbico
+ Bacillus - Clostridium
Acid Fast
+ Mycobacterium
-
Regular
Pleomorfo Corynebacterium
Propionibacterium
Arthrobacter
Lactobacillus
Listeria
Kurthia
Fermentación de
carbohidratos
Bile Esculin Agar
M S A
Fermentación del mannitol.
SIM
Sulfide
Indole
Motility
Urease
Recuerden traer su vaso de recolección de
orina para la próxima semana!!