mol. cell. biol.-1991-bun-ya-3229-38

7/28/2019 Mol. Cell. Biol.-1991-Bun-Ya-3229-38

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1991, 11(6):3229. DOI: 10.1128/MCB.11.6.3229.Mol. Cell. Biol.M Bun-Ya, M Nishimura, S Harashima and Y Oshimaencodes an inorganic phosphate transporter.The PHO84 gene of Saccharomyces cerevisiae

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MOLECULAR AND CELLULAR B I O L O G Y , J u n e 1 9 9 1 , p . 3 2 2 9 - 3 2 3 8 V o l . 1 1 , N o . 60 2 7 0 - 7 3 0 6 / 9 1 / 0 6 3 2 2 9 - 1 0 $ 0 2 . 0 0 / 0C o p y r i g h t 1 9 9 1 , A m e r i c a n S o c i e t y f o r M i c r o b i o l o g y

T h e PH084 G e n e o f S a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e E n c o d e s a nI n o r g a n i c P h o s p h a t e T r a n s p o r t e rM ASANORI BUN-YA, MAMORU NISHIMURA, SATOSHI HARASHIMA, A ND YASUJI OSHIMA*D e p a r t m e n t o f B i o t e c h n o l o g y , F a c u l t y o f E n g i n e e r i n g , O s a k a U n i v e r s i t y ,2 - 1 Y a m a d a o k a , S u i t a - s h i , O s a k a 5 6 5 , J a p a n

R e c e i v e d 4 J a n u a r y 1 9 9 1 / A c c e p t e d 2 6 M a r c h 1 9 9 1T h e PH084 g e n e s p e c i f i e s P i - t r a n s p o r t i n S a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e . A DNA f r a g m e n t b e a r i n g t h e PH084g e n e w a s c l o n e d b y i t s a b i l i t y t o c o m p l e m e n t c o n s t i t u t i v e s y n t h e s i s o f r e p r e s s i b l e a c i d p h o s p h a t a s e o f p h o 8 4m u t a n t c e l l s . I t s n u c l e o t i d e s e q u e n c e p r e d i c t e d a p r o t e i n o f 5 9 6 a m i n o a c i d s w i t h a s e q u e n c e h o m o l o g o u s t o t h a to f a s u p e r f a m i l y o f s u g a r t r a n s p o r t e r s . H y d r o p a t h y a n a l y s i s s u g g e s t e d t h a t t h e s e c o n d a r y s t r u c t u r e o f t h ePH084 p r o t e i n c o n s i s t s o f t w o b l o c k s o f s i x t r a n s m e m b r a n e d o m a i n s s e p a r a t e d b y 7 4 a m i n o a c i d r e s i d u e s . T h ec l o n e d PH084 DN A r e s t o r e d t h e P i t r a n s p o r t a c t i v i t y o f p h o 8 4 m u t a n t c e l l s . T h e PH084 t r a n s c r i p t i o n w a sr e g u l a t e d b y P 1 l i k e t h o s e o f t h e P H O S , P H O 8 , a n d PHO81 g e n e s . A P H 0 8 4 - l a c Z f u s i o n g e n e p r o d u c e dj } - g a l a c t o s i d a s e a c t i v i t y u n d e r t h e r e g u l a t i o n o f P i , a n d t h e a c t i v i t y w a s s u g g e s t e d t o b e b o u n d t o a membranef r a c t i o n . G e n e d i s r u p t i o n o f PH084 w a s n o t l e t h a l . B y c o m p a r i s o n o f n uc l e o t i de s e q u e n c e s a n d b y t e t r a d

a n a l y s i s w i t h GAL80 a s a s t a n d a r d , t h e PH084 l o c u s w a s m a p p e d a t a s i t e b e s i d e t h e TUB3 l o c u s o n t h e l e f tar m o f c h r o m o s o m e X I I I .T h e r e a r e a t l e a s t t w o s y s t e m s f o r u p t a k e o f P i i n S a c c h a -r o m y c e s c e r e v i s i a e , o n e w i t h a l o w Km v a l u e ( 8 . 2 , u M ) f o re x t e r n a l P i a n d t h e o t h e r w i t h a h i g h Km v a l u e ( 7 7 0 , u M ) ( 3 6 ) .T h e l o w - K m s y s t e m i s r e p r e s s e d b y P i t h r o u g h t h e s a m es y s t e m a s f o r r e g u l a t i o n o f r e p r e s s i b l e a c i d p h o s p h a t a s e( r A P a s e ; E C 3 . 1 . 3 . 2 ) ( 5 0 ) a n d r e q u i r e s t h e PH084 g e n ep r o d u c t ( 3 6 , 4 1 ) . T h e p h o 8 4 m u t a n t c e l l s p r o d u c e r A P a s ee v e n i n m e d i u m c o n t a i n i n g a s u f f i c i e n t l y h i g h c o n c e n t r a t i o no f P i t o r e p r e s s r A P a s e s y n t h e s i s i n t h e w i l d - t y p e c e l l s . A na s s a y o f P i u p t a k e w i t h 3 2 p ; s h o w s t h a t t h e p h o 8 4 m u t a n tc e l l s h a v e s e v e r e l y r e d u c e d a c t i v i t y ( 4 1 ) . T h e s e o b s e r v a t i o n ss u g g e s t a l t e r n a t i v e p o s s i b i l i t i e s f o r t h e f u n c t i o n o f P H 0 8 4 ,

n a m e l y , t h a t i t e n c o d e s a P i t r a n s p o r t e r o r a p o s i t i v e r e g u -l a t o r y f a c t o r s p e c i f i c f o r e x p r e ss i o n o f a g e n e e n c o d i n g t h e P it r a n s p o r t e r .T h i s c o m m u n i c a t i o n r e p o r t s e v i d e n c e s u p p o r t i n g t h e f o r -m e r i d e a , t h a t PH084 e n c o d e s a P i t r a n s p o r t e r . F i r s t , t h en u c l e o t i d e s e q u e n c e o f t h e PH084 g e n e i n d i c a t e s t h a t i te n c o d e s a p r o t e i n h o m o l o g o u s t o t h e g l u c o s e t r a n s p o r t e r a n dv a r i o us o t he r s ug a r t r a n s p o r t e r s . S e c o n d , a P H O 8 4 - , B - g a l a c -t o s i d a s e f u s i o n p r o t e i n i s r e c o v e r e d i n a m e m b r a n e f r a c t i o no f S . c e r e v i s i a e c e l l s .MATERIALS AND M E TH ODS

O r g a n i s m s a n d p l a s m i d s . T h e S . c e r e v i s i a e s t r a i n s u s e d a r el i s t e d i n T a b l e 1 . A l l o f t h e s t r a i n s w e r e h e t e r o t h a l l i c , a s t h e yh a d t h e h o g e n o t y p e . A l l e x c e p t M B 1 3 7 , NBW5, M T 8 - 1 , a n dDKD-5D h a d t h e p h o 3 - 1 g e n o t y p e t o e l i m i n a t e a n o t h e r a c i dp h o s p h a t a s e a c t i v i t y s y n t h e s i z e d i n h i g h - P i m e d i u m ( 4 8 ) .E s c h e r i c h i a c o l i J A 2 2 1 ( 7 ) a n d MV1184 ( 4 3 ) w e r e u s e d f o rm a n i p u l a t i o n o f DNA. A g e n e l i b r a r y o f S . c e r e v i s i a e ,Y C p 5 0 "CEN BANK" A , c o n s t r u c t e d b y p a r t i a l d i g e s t i o no f g e n o m i c DNA o f S . c e r e v i s i a e w i t h S a u 3 A I a n d i t sl i g a t i o n w i t h Y C p 5 0 ( 3 0 ) a t t h e u n i q u e BamHI s i t e , w a so b t a i n e d f r o m t h e A m e r i c a n T y p e C u l t u r e C o l l e c t i o n ( R o c k -v i l l e , M d . ) . P l a s m i d s pUC118 a n d pUC119 ( 4 3 ) w e r e u s e d f o rp r e p a r a t i o n o f s i n g l e - s t r a n d e d DNAs f o r DNA s e q u e n c i n g* C o r r e s p o n d i n g a u t h o r .

w i t h a h e l p e r p h a g e , M13 K07 ( 4 3 ) . P l a s m i d Y C p 5 0 a n dp T I l 5 ( 4 6 ) , t h e l a t t e r o f w h i c h i s d e r i v e d f r o m Y C p 5 0c o n n e c t e d w i t h t h e E c o R I - S s t I - K p n I - S m a I - B a m H I - X b a I -S a l I p a r t o f t h e m u l t i p l e c l o n i n g s i t e o f pUC18 ( 4 7 ) a n d b o t ho f w h i c h a r e m a r k e d w i t h t h e U R A3 g e n e o f S . c e r e v i s i a e ,w e r e u s e d a s l o w - c o p y - n u m b e r v e c t o r s , a n d Y I p 5 ( 2 8 ) w a su s e d a s a n i n t e g r a t i v e v e c t o r . P l a s m i d Y I p l ( 2 8 ) was u s e d f o rp r e p a r a t i o n o f a 1 . 7 - k b p B a m HI f r a g m e n t o f t h e S . c e r e v i -s i a e H I S 3 g e n e . P l a s m i d p S H 5 3 0 , a Y E p - t y p e p l a s m i db e a r i n g t h e H I S 5 - l a c Z f u s e d g e n e ( 2 4 ) , w a s u s e d a s a c o n t r o li n s t u d i e s o n e x p r e s s i o n o f a P H 0 8 4 - l a c Z f u s e d g e n e . T h eH I S 5 DNA f r a g m e n t o f t h e f u s i o n g e n e c o n t a i n s a 0 . 6 - k b p 5 'n o n c o d i n g s e q u e n c e a n d a 1 2 1 - b p r e g i o n e n c o d i n g t h e N - t e r -m i n a l r e g i o n o f h i s t i d i n o l - p h o s p h a t e a m i n o t r a n s f e r a s e ( E C2 . 6 . 1 . 9 ) . A 1 . 0 - k b p H i n d I I l f r a g m e n t o f t h e S . c e r e v i s i a eACT] g e n e w a s p r e p a r e d f r o m p l a s m i d pYA301 ( 1 0 ) , o b -t a i n e d f r o m D . G a l l w i t z , a n d u se d a s a h y b r i d i z a t i o n p r o b e .T h e s t r u c t u r e s a n d c o n s t r u c t i o n s o f t h e o t h e r p l a s m i d s u s e di n t h i s s t u d y a r e s h o w n i n F i g . 1 .M e d i a a n d g e n e t i c a n d a n a l y t i c a l m e t h o d s . T h e n u t r i e n tm e d i u m (YPAD; i . e . , n u t r i e n t h i g h - P i m e d i u m ) , m i n i m a lh i g h - P i a n d l o w - P i m e d i a , a n d s y n t h e t i c g l u c o s e ( S D ) m e -d i u m f o r S . c e r e v i s i a e a n d t h e L B a n d M 9 m e d i a f o r E . c o l iw e r e d e sc r i b e d p r e v i o u sl y ( 4 9 ) . T h e n u t r i e n t l o w - P i mediumw a s p r e p a r e d a s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y ( 1 5 ) . F o r d e t e c t i o n o fr A P a s e a c t i v i t y o f p h o 8 4 m u t a n t s o n p l a t e s b y a s t a i n i n gm e t h o d b a s e d o n t h e d i a z o - c o u p l i n g r e a c t i o n ( 3 8 ) , YPAGlya n d S G l y m e d i a w e r e p r e p a r e d b y r e p l a c i n g 2 0 g o f g l u c o s ep e r l i t e r o f Y P A D a n d SD m e d i a , r e s p e c t i v e l y , w i t h 3 0 g o fg l y c e r o l . R e s u l t s o f t h e d e t e r m i n a t i o n o f t h e p h e n o t y p e o ft h e c o n s t i t u t i v e s y n t h e s i s o f r A P a s e b y s t a i n i n g c o l o n i e s o f ap h o 8 4 m u t a n t o n Y P A D p l a t e s a r e u s u a l l y a m b i g u o u s , b u tt h i s p h e n o t y p e c o u l d b e c l e a r l y d e t e r m i n e d b y s t a i n i n gc o l o n i e s o n YPAGly p l a t e s , f o r s o m e u n k n o w n r e a s o n . C e l l so f S . c e r e v i s i a e w e r e c u l t i v a t e d a t 3 0 C , a n d t h o s e o f E . c o l iw e r e c u l t i v a t e d a t 3 7 C . S t a n d a r d m e t h o d s ( 3 4 ) w e r e u s e df o r g e n e t i c m a n i p u l a t i o n s o f S . c e r e v i s i a e . S . c e r e v i s i a e w a st r a n s f o r m e d b y t h e l i t h i u m - a c e t a t e m e t h o d ( 1 4 ) , a n d E . c o l iw a s t r a n s f o r m e d b y t h e m e t h o d o f M o r r i s o n ( 2 1 ) . An S .c e r e v i s i a e DNA f r a g m e n t was i n t e g r a t e d i n t o a n S . c e r e v i -

3 2 2 9


3/11

3 2 3 0 BUN-YA E T AL.T A B L E 1 . S . c e r e v i s i a e s t r a i n s u s e d

S t r a i n G e n o t y p e a S o u r c eP - 2 8 - 2 4 C M A T a p h o 3 - 1 O u r s t o c k ( 3 8 )AX49-4B M A T o t p h o 3 - 1 h i s 4 O u r s t o c k ( 1 5 )NS216 MAT a p h o 3 - 1 l e u 2 - 3 , 1 1 2 t r p l u r a 3 - 5 2 p h o 8 4 - 1 O u r s t o c kN S 2 1 9 MAT a p h o 3 - 1 l e u 2 - 3 , 1 1 2 u r a 3 - 5 2 p h o 8 4 - 1 O u r s t o c kMB137 M A T a l e u 2 p h o 8 4 - 1 O u r s t o c kMB159 M A T a p h o 3 - 1 ( P HO 84 U R A3 ) p h o 8 4 - 1 l e u 2 - 3 , 1 1 2 t r p l u r a 3 - 5 2 T hi s s t u dyMB191 M ATa p ho 3 -1 a d e 2 l e u 2 - 3 , 1 1 2 h i s 3 - 5 3 2 t r p l - 2 8 9 u r a 3 - 1 , 2 c a n ] T hi s s t ud yM B 1 9 2 b M A T a p h o 3 - 1 A p h o 8 4 : : H I S 3 a d e 2 l e u 2 - 3 , 1 1 2 h i s 3 - 5 3 2 t r p l - 2 8 9 u r a 3 - 1 , 2 c a n i T h i s s t u d yN B D 2 - 1 c M A T a p h o 3 - 1 A p h o 2 : : H I S 3 a d e 2 l e u 2 - 3 , 1 1 2 h i s 3 - 5 3 2 t r p l - 2 8 9 u r a 3 - 1 , 2 c a n ] O u r s t o c kNBD4-1 M ATa p h o 3 - 1 A p h o 4 : : H I S 3 a d e 2 l e u 2 - 3 , 1 1 2 h i s 3 - 5 3 2 t r p l - 2 8 9 u r a 3 - 1 , 2 c a n i O u r s t o c k ( 2 5 )N B D 8 0 - l d M A T a p h o 3 - 1 A p h o 8 O : : H I S 3 a d e 2 l e u 2 - 3 , 1 1 2 h i s 3 - 5 3 2 t r p l - 2 8 9 u r a 3 - 1 , 2 c a n i O u r s t o c kN B D 8 1 - 6 D e M A T a p h o 3 - 1 A p h o 8 J : : H I S 3 a d e 2 l e u 2 - 3 , 1 1 2 h i s 3 - 5 3 2 t r p l - 2 8 9 u r a 3 - 1 , 2 c a n ] O u r s t o c kNBW5 M A T a t a d e 2 l e u 2 - 3 , 1 1 2 h i s 3 - 5 3 2 t r p l - 2 8 9 u r a 3 - 1 , 2 c a n ] O u r s t o c k ( 2 5 )NBW78 M A T a / M A T o t p h o 3 - J / p h o 3 - 1 a d e 2 l a d e 2 l e u 2 - 3 , 1 1 2 1 1 e u 2 - 3 , 1 1 2 h i s 3 - 5 3 2 1 h i s 3 - 5 3 2 O u r s t o c kt r p l - 2 8 9 1 t r p l - 2 8 9 u r a 3 - 1 , 2 1 u r a 3 - 1 , 2 c a n l l c a n iYAT965 M ATa p ho 3 - 1 p h o 8 5 -1 I e u 2 h i s 4 O u r s t o c k ( 4 9 , 5 0 )M T 8 - 1 M A T a a d e h i s 3 l e u 2 t r p l u r a 3 g a l 8 0 : : L E U 2 T . F u k a s a w aDKD-5D M A T a h i s 3 l e u 2 - 3 , 1 1 2 t r p l O u r s t o c k ( 1 2 )

a T h e g e n e t i c s y m b o l s u s e d a r e a s d e s c r i b e d b y M o r t i m e r e t a l . ( 2 2 ) .b S t r a i n M B 1 9 2 , a p h o 8 4 n u l l m u t a n t , i s a h a p l o i d s e g r e g a n t f r o m t h e d i p l o i d s t r a i n MB183 w i t h a n i n t e g r a t e d 5 . 4 - k b p B a m H I - E c o R I f r a g m e n t o f p M B 1 2 3( F i g . 1 ) .' S t r a i n N B D 2 - 1 , a p h o 2 n u l l m u t a n t , was c o n s t r u c t e d f r o m s t r a i n NBW7 b y g e n e r e p l a c e m e n t o f t h e 1 . 2 - k b p E c o R I s e g m e n t o f t h e P H O 2 ( i . e . , G R F O ) g e n eO R F ( 4 9 ) b y t h e 1 . 4 - k b p B a m H I - X h o I H I S 3 DNA f r a g m e n t o f S . c e r e v i s i a e d e r i v e d f r o m Y I p l .d S t r a i n N B D 8 0 - 1 , a p h o 8 O n u l l m u t a n t , w a s c o n s t r u c t e d f r o m s t r a i n NBW7 b y g e n e r e p l a c e m e n t o f t h e 0 . 5 - k b p B c I I - H i n c I I s e g m e n t o f t he PHO80 g e n e ( 3 9 )b y t he 1 . 4 - k b p BamHI-XhoI H I S 3 DNA f r a g m e n t o f S . c e r e v i s i a e .e S t r a i n N B D 8 1 - 6 D , a p h o 8 l n u l l m u t a n t , w a s a h a p l o i d s e g r e g a n t o f t h e d i p l o i d s t r a i n NBD81 c o n s t r u c t e d b y g e n e r e p l a c e m e n t o f t he 1 . 3 - k b p B a m H I - S m a Is e g m e n t o f t h e PHO81 g e n e ( 4 9 ) b y t h e 1 . 4 - k b p B a m H I - X h o I H I S 3 DNA f r a g m e n t o f S . c e r e v i s i a e .

s i a e c h r o m o s o m e a s d e s c r i b e d b y O r r - W e a v e r e t a l . ( 2 6 ) .P - G a l a c t o s i d a s e a c t i v i t i e s o f c o l o n i e s a n d o f c e l l e x t r a c t s o fS . c e r e v i s i a e w e r e m e a s u r e d a s d e s c r i b e d b e f o r e ( 4 9 ) a n de x p r e s s e d a s n a n o m o l e s o f o - n i t r o p h e n y l - p 3 - D - g a l a c t o s i d ec l e a v e d p e r m i n u t e p e r m i l l i g r a m o f p r o t e i n . P r o t e i n c o n c e n -t r a t i o n i n c e l l e x t r a c t s w a s d e te r m i ne d w i t h a p r o t e i n a s s a yk i t ( B i o - R a d L a b o r a t o r i e s , R i c h m o n d , C a l i f . ) w i t h b o v i n es e r u m a l b u m i n a s a s t a n d a r d . G e n e r a l m e t h o d s f o r t h ep r e p a r a t i o n , m o d i f i c a t i o n , a n d a n a l y s e s o f DNA a n d RNAw e r e a s d e s c r i b e d e l s e w h e r e ( 4 9 , 5 0 ) . P i u p t a k e w a s a s s a y e da s d es c r i b e d p r ev i o u s l y ( 4 1 ) .P r e p a r a t i o n o f a m e m b r a n e f r a c t i o n o f y e a s t c e l l s . C e l l s o fS . c e r e v i s i a e w e r e g r o w n t o t h e m i d - l o g p h a s e i n l o w - P imedium c o n ta i n i ng a p pr o p r ia t e n u t r i e n t s . T h e c e l l s w e r ec o l l e c t e d , w a s h e d w i t h SM b u f f e r ( 2 0 mM T r i s - h y d r o c h l o -r i d e b u f f e r [ p H 7 . 4 ] c o nt a i n i n g 8 5 mM N a C l a n d 1 mMMgSO4 7 H 2 0 ) , a n d s u s p e n d e d a t 2 x 1 0 9 c e l l s p e r m l i nl y s i s b u f f e r ( 0 . 1 M T r i s - h y d r o c h l o r i d e b u f f e r [ p H 7 . 4 ] c o n -t a i n i n g 20% [ v o l l v o l ] g l y c e r o l , 1 mM d i t h i o t h r e i t o l , a n d 1mM p h e n y l m e t h y l s u l f o n y l f l u o r i d e ) . T h e n , 0 . 5 g o f g l a s sb e a d s p e r m l w a s a d d e d a n d t h e m i x t u r e w a s v i g o r o u s l ys h a k e n i n a m i c r o t u b e m i x e r MT360 ( T o m y S e i k o , T o k y o ,J a p a n ) a t 4 C f o r 3 0 m i n . T h e c e l l e x t r a c t ( c r u d e e x t r a c t ) w a sc e n t r i f u g e d i n a n E p p e n d o r f M i c r o f u g e f o r 1 5 m i n ( 1 0 , 0 0 0 xg ) a t 4 C . T h e r e s u l t i n g s u p e r n a t a n t f r a c t i o n c o n t a i n e dw a t e r - s o l u b l e p r o t e i n , a n d t h e p e l l e t f r a c t i o n c o n t a i n e d t h et o t a l - m e m b r a n e f r a c t i o n ( 4 0 ) . T h e p e l l e t w a s s u s p e n d e d i n a na p p r o p r i a t e a m o u n t o f t h e l y s i s b u f f e r .N u c l e o t i d e s e q u e n c e a c c e s s i o n n u m b e r . T h e n u c l e o t i d es e q u e n c e r e po r t ed h a s b e e n s u b m i t t e d t o t h e DDBJ, EMB L,a n d GenBank n u c l e o t i d e s e q u e n c e d a t a b a s e s u n d e r t h ea c c e s s i o n n u m b e r D 9 0 3 4 6 .

RESULTSC l o n i n g t h e PH084 g e n e . C l o n i n g o f t h e PH084 g e n e wasp e r f o r m e d o n t h e b a s i s o f i t s a b i l i t y t o s u p p r e s s t h e p h o 8 4

m u t a n t p h e n o t y p e p r o d u c i n g r A P a s e i n h i g h - P i m e d i u m . Ap h o 8 4 m u t a n t , N S 2 1 9 ( p h o 3 p h o 8 4 u r a 3 ) , w as t r a n s f o r m e dw i t h t h e S . c e r e v i s i a e g e n o m i c DNA l i b r a r y , Y C p 5 O " C ENBANK" A , a n d U r a + t r a n s f o r m a n t s were s e l e c t e d on S G l yp l a t e s l a c k i n g u r a c i l . A t o t a l o f 1 2 , 0 0 0 U r a + c o l o n i e s t h a ta p p e a r e d o n t h e p l a t e s w e r e i s o l a t e d a n d s p o t t e d o n f r e s hS G l y p l a t e s l a c k i n g u r a c i l . T h e p l a t e s w e r e i n c u b a t e d a t 3 0 Cf o r 3 d a y s , a n d t h e 1 2 , 0 0 0 U r a + c o l o n i e s t h a t a p p e a r e d o nt h e p l a t e s were r e p l i c a t e d o n t o f r e s h S G l y p l a t e s l a c k i n gu r a c i l . T h e p l a t e s w e r e i n c u b a t e d a t 3 0 C f o r 2 d a y s , a n dt h e n t h e r A P a s e a c t i v i t i e s o f c o l o n i e s w e r e e x a m i n e d b ys t a i n i n g . F i f t y c o l o n i e s d i d n o t s h o w r A P a s e a c t i v i t y . A l l o ft h e s e c l o n e s w e r e t e s t e d f o r r A P a s e p r o d u c t i o n a f t e r t h e yw e r e c u r e d o f t h e p l a s m i d b y s u b c u l t u r i n g a n d s t r e a k i n g c e l l son Y P A G l y m e d i u m . O n e o f t h e m s e g r e g a t e d o n l y a c l a s s o fc l o n e s s h o w i n g r e d ( r A P a s e + ) U r a - p h e n o t y p e s i n t h e w h i t e( r A P a s e - ) U r a + p o p u l a t i o n , w h i l e t h e o t h e r 4 9 c l o n e s s e g -r e g a t e d r e d U r a + a n d w h i t e U r a - c l o n e s i n a d d i t i o n t o t h o s es h o w i n g t h e r e d U r a - p h e n o t y p e . DNA w a s p r e p a r e d f r o mt h e f o r m e r t r a n s f o r m a n t a n d u s e d t o t r a n s f o r m E . c o l i J A 2 2 1t o A m p r . A p l a s m i d o b t a i n e d f r o m one o f t h e A m p r t r a n s -f o r m a n t s c o n f e r r e d t h e r A P a s e - p h e n o t y p e o n y e a s t s t r a i nNS219 ( p h o 3 p h o 8 4 ) i n h i g h - P i m e d i u m . T h i s p l a s m i d , p 3 7 3( F i g . 1 ) , h a d a n i n s e r t i o n o f a 7 - k b p f r a g m e n t i n Y C p 5 O .T o d e t e r m i n e w h e t h e r t h e c l o n e d DNA f r a g m e n t c a r r i e dt h e PH084 g e n e , w e p e r f o r m e d s i t e - d i r e c t e d i n t e g r a t i o n o ft h e DNA f r a g m e n t i n t o an S . c e r e v i s i a e c h r o m o s o m e . A5 . 6 - k b p BamHI-EcoRI f r a g m e n t o f p 3 7 3 w a s s u b c l o n e d i n t ot h e BamHI-EcoRI g a p o f Y I p 5 . T h e r e s u l t a n t r e c o m b i n a n tp l a s m i d , p M B 1 3 ( F i g . 1 ) , w as l i n e a r i z e d b y r e s t r i c t i o n a t t h eu n i q u e H p a I s i t e i n t h e c l o n e d f r a g m e n t . S t r a i n N S 2 1 6 ( p h o 3p h o 8 4 u r a 3 ) w as t r a n s f o r m e d t o t he U r a + p h e n o t y p e w i t ht h i s DNA. T h e r e s u l t a n t t r a n s f o r m a n t s s h o w e d t h e w i l d - t y p ep h e n o t y p e f o r r A P a s e p r o d u c t i o n , i . e . , r A P a s e - i n h i g h - P im e d i u m a n d r A P a s e + i n l o w - P i m e d i u m . We c o n f i r m e d t h a tt h e c l o n e d f r a g m e n t w a s i n t e g r a t e d i n t o t h e e x p e c t e d s i t e o f

MOL. C E L L . B I O L .


4/11

PHOSPHATE TRANSPORTER I N YEAST C E L L S 3 2 3 1

F I G . 1 . S t r u c t u r e s a n d c o ns tr u c t io n s o f p l a s m i d s . T h e p r o c e -d u r e s f o r c o n st r u ct i o n s o f p 3 7 3 a n d pMB13 a r e d e s c r i b e d i n t h e t e x t .pMB15 was c o n s t r u c t e d b y l i g a t i o n o f a 5 . 6 - k b p BamHI-EcoRIf r a g m e n t o f PH084 DNA p r e p a r e d f r o m p 3 7 3 t o t h e BamHI-EcoRIga p o f p U C 1 1 9 . pMB93 was c o n s t r u c t e d b y l i g a t i n g a 7 . 8 - kb p B s t EI If r a g m e n t o f p M B 1 5 , a f t e r f i l l i n g i n w i t h K l e n o w f r a g m en t, w i t h a1 . 7 - k b p B a mHI f r a g m e n t c o n t a i n i n g t h e S . c e r e v i s i a e H I S 3 s e -q u e n c e o f Y I p l , w i t h f i l l i n g i n o f t h e tw o e n d s . pMB123 wasc o n s t r u c t e d b y i n s e r t i n g t h e 1 . 7 - k b p B a m HI f r a g m e n t o f t h e H I S 3ge n e i n t o t h e B g l I I s i t e o f pMB15 a f t e r e l i m i n a t i o n o f a 2 . 0 - k b pA p a I - B g l I I r e g i o n a n d was c o n n e c t e d w i t h an 8 - b p B g l I I l i n k e r( T a k a r a S h u z o C o . , K y o t o , J a p a n ) a t t h e A p a I e n d a f t e r d i g e s t i n gt h e o v e r h a n g i n g 3 ' e n d t o g e n e r a t e a b l u n t e n d w i t h T4 DNAp o l y m e r a s e . pMB142 was c o n s t r u c t e d b y i n s e r t i n g a 2 . 3 - k b p H i n c I If r a g m e n t o f PH084 DNA, p r e p a r e d f r o m pMB15 a n d c o n n e c t e dw i t h a 1 0 - b p B a mHI l i n k e r , a t t h e B a mHI s i t e o f pSH540ABp r e v i o u s l y c o n s t r u c t e d i n t h i s l a b o r a t o r y f o r a n a l y s i s o f t h e H I S 5promoter ( 2 4 ) . pMB143 was c o n s t r u c t e d b y i n s e r t i n g t he same2 . 3 - k b p H i n c I l f r a g m e n t i n t o t h e B a m HI s i t e o f pMC1587 ( 4 ) . T h er e s t r i c t i o n s i t e s on t h e p l a s m i d DNAs a r e i n d i c a t e d o n l y i n t h ec l o n e d PH084 f r a g m e n t . A b b r e v i a t i o n s o f r e s t r i c t i o n s i t e s : A , A p a I ;B , BamHI; B g , B g l I I ; B s, B s t EI I ; C , C l a I ; E , E c o R I ; H c , H i n c I I ;H p , H p a I ; N , N r u I ; S , S a u 3 A I ; X , X h o I . S / B i s t h e j u n c t i o n s i t e o fS a u 3 A I a n d BamHI.

abC0 ~ 2 0E 1 5

0 .t i oa. 5

0 0 5 1 0 0 5 1 0 0 5 1 0T i m e ( M n n )F I G . 2 . P i u p t a k e b y t h e t r a n s f o r m a n t c e l l s o f S . c e r e v i s i a eh a r b o r i n g p l a s m i d s c o n n e c t e d w i t h t h e PH084 g e n e . T h e t r a n s f o r m -a n t c e l l s w e r e s h a k e n a t 3 0 C i n s y n t h e t i c l o w - P i ( 0 ) o r h i g h - P i ( 0 )m e d i u m s u p p l e m e n t e d w i t h a p p r o p r i a t e n u t r i e n t s w i t h o u t u r a c i l .T h e c e l l s w e r e c o l l e c t e d w h e n c e l l g r o w t h r e a c h e d a n o p t i c a l d e n s i t ya t 6 6 0 n m o f 1 . 0 , w a s he d, a n d i n o c u l a t e d i n t o s y n t h e t i c l o w - P im e d i u m t o g i v e a c e l l c o n c en t ra t i o n w i t h a n o p t i c a l d e n s i t y a t 6 6 0n m o f 0 . 1 . T h e r a d i o a c t i v i t y o f t h e m e d i u m w a s a d j u s t e d t o 5 x 1 0 5c p m / m l w i t h 3 2 P i . T h e a m o u n t o f P i a b s o r b e d b y t h e c e l l s w a s

e x p r e s s e d a s c o u n t s p e r m i n u t e o f 3 2 P r a d i o a c t i v i t y p e r m i l l i l i t e r i nt h e c e l l s us pe n si o n w it h a n o p t i c a l d e n s i t y a t 6 6 0 n m o f 0 . 1 . S a m p l e sw e r e t a k e n a t a p p r o p r i a t e i n t e r v a l s a n d f i l t e r e d t h r o u g h a n i t r o c e l -l u l o s e m e m b r a n e f i l t e r . T h e t e s t s t r a i n s w e r e MB191 ( P H O 8 4 + )h a r b o r i n g p T I 1 5 ( a ) , MB192 ( A p h o 8 4 ) h a r b o r i n g p 3 7 3 ( F i g . 1 ) ( b ) ,a n d MB192 h a r b o r i n g p T I 1 5 ( c ) .

t h e chromosome a n d t h a t t h e i n t e g r a t i o n w as u n i q u e i n t h egenome o f t h r e e i n d e p e n d e n t t r a n s f o r m a n t s b y S o u t h e r nh yb r i d i z a t i o n o f g e n o m i c DNA r e s t r i c t e d w i t h B g l I I a n d w i t h3 2 P - l a b e l e d DNA o f a 0 . 5 - kb p B g l I I - Xh o I f r a g m e n t o f pMB13( F i g . 1 ) a s a p r o b e ( d a t a n o t s h o w n ) . On e o f t h e c l o n e s i nw h i c h i t was i n t e g r a t e d , MB159 (MATa p h o 3 p h o 8 4 u r a 3l e u 2 t r p l [ P H O 8 4 ' U R A 3 + ] ) , was c r o s s e d w i t h A X 4 9 - 4 B(MATa p h o 3 h i s 4 P H O 8 4 + ) , a n d t h e r e s u l t a n t d i p l o i d w ass u b j e c t e d t o t e t r a d a n a l y s i s . R e s u l t s showed a n r A P a s e + /r A P a s e - r a t i o o f 0 : 4 o n YPAD i n 2 6 o f t h e 2 8 a s c i d i s s e c t e d ,t h e o t h e r 2 a s c i s h o w i n g a n r A P a s e + / r A P a s e - r a t i o o f 1 : 3 .T h e s e o b s e r v a t i o n s i n d i c a t e t h a t p M B1 3 DNA was i n t e -g r a t e d a t o r c l o s e t o t h e p h o 8 4 l o c u s a n d t ha t t he c l o n e dDNA c a r r i ed t he PH084 g e n e .Th e e f f e c t o f t h e p l a s m i d b e a r i n g t h e PH084 g e n e o n P it r a n s p o r t w as e x a m i n e d b y m e a s u r i n g P i u p t a k e . Tw os t r a i n s , MB191 (PHO84+ u r a 3 ) a n d MB19 2 ( p h o 8 4 : : H I S 3u r a 3 ) ( s e e s e c t i o n o n g e n e d i s r u p t i o n o f PH084 f o r c o n s t r u c -t i o n o f t h e p h o 8 4 : : H I S 3 a l l e l e ) , i s o g e n i c t o e a c h o t h e r a n dh a r b o r i n g l o w - c o p y - n u m b e r v e c t o r p l a s m i d p T I 1 5 ( i n MB191a n d MB192) o r p 3 7 3 ( i n MB192) w e r e a s s a y e d f o r P i u p t a k ea c t i v i t y ( F i g . 2 ) . M B 1 9 2 c a r r y i n g p T I 1 5 d i d n o t t a k e u p P i i ne i t h e r h i g h - P i o r l o w - P i m e d i u m . Th e t r a n s f o r m a n t o f MB191w i t h p T I 1 5 a n d t h a t o f MB19 2 w i t h p 3 7 3 e x p r e ss e d P it r a n s p o r t a c t i v i t y w h e n i n c u b a t e d i n l o w - P i m e d i u m . T h u s ,t h e c l o n e d PH084 g e n e a l s o r e s t o r e d t h e P i u p t a k e a c t i v i t yo f t h e p h o 8 4 m u t a n t .N u c l e o t i d e s e q u e n c e a n d m a p p i n g o f t h e PH084 g e n e . F o rd e l i m i t a t i o n o f t h e PH084 g e n e o n t h e 5 . 6 - k b p BamHI-E c o R I f r a g m e n t o f PH084 c l o n e d on p M B 1 3 , s e v e r a l d e l e -t i o n f r a g m e n t s w e r e c o n s t r u c t e d f r o m t h e c l o n e d 7 . 0 - k b pf r a g m e n t ( F i g . 3 ) . pMB113, c o n s t r u c t e d b y s u b c l o n i n g a2 . 5 - k b p A p a I - X h o I f r a g m e n t f r o m t h e 7 . 0 - k b p f r a g m e n t i n t ot h e SmaI s i t e o f p T I 1 5 , s u p p r e s s e d t h e r A P a s e c o n s t i t u t i v ep h e n o t y p e b y t h e p h o 8 4 m u t a t i o n , a n d p M B 1 5 0 , b e a r i n g t h e4 . 7 - k b p BamHI-XhoI f r a g m e n t m o d i f i e d b y r e s t r i c t i o n a n d

V O L . 1 l , 1 9 9 1


5/11

3 2 3 2 BUN-YA E T AL.

B f I

P l a s m i dp 3 7 3

p M B 44p M B 1 0 9p M B 1 5 0p M B 1 1 3

BS2B bl Bs3 Xb2S B ScHc1DA cHp,H ,2X C 3 E , E 2 S/B( lI 2

TUB3 Comple--3 -2 -1 0 1 2 (kbp) mentation

2 - b p

pMB51F I G . 3 . R e s t r i c t i o n map o f t h e DNA f r a g m e n t c l o n e d on p 3 7 3a n d i t s d e r i v a t i v e s a n d t h e i r a b i l i t i e s t o comp lement t h e r A P a s ec o n s t i t u t i v e p h e n o t y p e o f a pho84 mutant, N S 2 1 9 . Th e open a n dc l o s e d b o x e s a t t h e to p i n di c a t e t he c l o n e d y e a s t DNA. Th e c l o s e db o x w i t h an open arrow i n di c a t es t h e r e g i o n i n w h i c h t h e n u c l e o t i d e

sequences were d e t e r m i n e d . Th e open arrow l a b e l e d PH084 i n d i -c a t e s t h e a p p r o x i m a t e p o s i t i o n a n d d i r e c t i o n o f t h e O R F o f P H 0 8 4 ,and t h e open r e g i o n l a b e l e d TUB3 i n d i c a t e s t h e N - t e r m i n a l c o d i n gr e g i o n o f t h e TUB3 gene. Two or more i d e n t i c a l r e s t r i c t i o n s i t e s i nt h e map are d i s t i n g u i s h e d b y s u b s c r i p t s . Th e l i n e s i nd i c a te t hePH084 f r a g m e n t s on t he r e l e v a n t YC p v e c t o r s . P l a s m i d p MB51c o n s i s t e d o f t h e i n d i c a t e d p o r t i o n o f t h e c l o n e d f r a g m e n t i n s e r t e d a tt h e C l a I s i t e o f Y C p 5 O , a n d p l a s m i d s pMB113, p M B 1 0 9 , a n dpMB150 are s u b c l o n e s o f t h e i n d i c a t e d p o r t i o n s i n v e c t o r p T I 1 5 .p M B4 4 was c o n s t r u c t e d b y d e l e t i n g a 1 . 4 - k b p X b a I f r a g m e n t f r o mp 3 7 3 . Th e s y m b o l s + a n d -i n d i c a t e a b i l i t y a n d i n a b i l i t y o f t h ep l a s m i d t o complement t h e p h o 8 4 m ut a nt p h e n o t y p e . A b b r e v i a t i o n so f r e s t r i c t i o n s i t e s a r e d e f i n e d i n t h e l e g e n d t o F i g . 1 , except f o r D( D r a I ) , S c ( S c a I ) , a n d X b ( X b a I ) . None o f t h e D r a l s i t e s ar ei n d i c a t e d , e x c e p t f o r t h a t a t t h e e n d o f t h e s e q u e n c e d r e g i o n o f t h ePH084 DNA. Th e r e c o g n i t i o n s i t e f o r C l a I i n d i c a t e d as C 2 o v e r l a p st h e m e t h y l a t i o n s i t e o f dam.

f i l l i n g up o f t h e C l a I s i t e , d i d not c o m p l e m e n t t h e p h o 8 4m u t a t i o n . T h e r e f o r e , we c o n c l u d e d t h a t t h e 2 . 5 - k b p A p a I -XhoI r e g i o n e n c o d e s t h e P H 0 8 4 g e n e .A 3 . 9 - k b p DraI-EcoRI f r a g m e n t b e a r i n g t h e 2 . 5 - k b p A p a I -XhoI r e g i o n ( F i g . 3 ) was s u b c l o n e d a p p r o p r i a t e l y i n t op UC1 18 o r pUC119, a n d i t s n u c l e o t i d e sequence was d e t e r -m i n e d b y t h e d i d e o x y c h a i n t e r m i n a t i o n m e t h o d . A s i n g l eopen r e a d i n g f r a m e (ORF) o f 1 , 7 8 8 b p was f o u n d i n t h e3 . 9 - k b p f r a g m e n t ( F i g . 4 ) . P u t a t i v e T A T A b o x e s were f o u n da t n u c l e o t i d e p o s i t i o n s -122 t o - 1 1 8 a n d - 9 9 t o - 9 5 i n t h e5 ' upstream r e g i o n o f t h e O R F r e l a t i v e t o t h e t r a n s l a t i o n a li n i t i a t i o n c o d o n , w h i l e no s e q u e n c e s h o m o l o g o u s t o t h et e r m i n a t o r sequence, TAG. . T A G T . . T T T , p r o p o s e d b yZ a r e t a n d Sherman ( 5 1 ) were f o u n d i n t h e 3 ' n o n c o d i n gr e g i o n .Th e GRFJO ( = PH02 a n d BAS2 [ 5 0 ] ) a n d PH04 g e n e s ar eb o t h r e q u i r e d f o r t r a n s c r i p t i o n a l r e g u l a t i o n o f t h e PH05gene ( 2 7 , 4 8 ) , a n d t h e b i n d i n g s o f PHO 2 ( 4 4 ) a n d PHO4 ( 2 5 ,4 4 ) p r o t e i n s t o t h e p r o m o t e r r e g io n o f PH05 were c o n -f i r m e d . R e c e n t l y , H a y a s h i a n d O s h i m a ( 1 3 ) f o u n d t h a t a 5 - b pm o t i f , 5 ' - C A C G T - 3 ' , o r p r e f e r a b l y a 6 - b p m o t i f , 5 ' - C A CG T G - 3 ' , i n t h e p r o m o t e r r e g i o n o f t h e PH08 ge n e , e n c o d i n gr e p r e s s i b l e a l k a l i n e p h o s p h a t a s e (EC 3 . 1 . 3 . 1 ) , i s e s s e n t i a l f o rPH08 d e r e p r e s s i o n a n d t ha t t he PHO 4 p r o t e i n b i n d s t o t h e s em o t i f s . I n t h e upstream r e g i o n o f t h e PH084 DNA, we f o u n dt h r e e c o p i e s o f t h e 5'-CACGTG-3' m o t i f a t n u c l e o t i d e p o s i -t i o n s - 8 8 0 , - 4 3 6 , a n d -414 a n d a copy o f t h e 5 ' - C A C G T T -3 ' m o t i f a t -587 ( F i g . 4 ) . No sequences h o m o l o g o u s t o t h o s ep r o p o s e d f o r b i n d i n g t h e GRF10 p r o t e i n ( 2 , 3 , 3 7 , 4 4 ) c o u l db e d e t e c t e d .

C o m p a r i s o n o f t h e f l a n k i n g r e g i o n o f t h e PHO84 O R F w i t ht h e n u c l e o t i d e s e q u e n c e d a t a o f S c h a t z e t a l . ( 3 2 ) s h o w e d ap a r t o f t h e O R F o f t h e TUB3 g e n e . T h i s r e s u l t was c o n s i s t e n tw i t h t h e r e s u l t s o f s u b s e q u e n t c o n v e n t i o n a l m a p p i n g a n a l y -s i s . T h e TUB3 g e n e i s r e p o r t e d t o show a l i n k a g e o f 6 7c e n t i m o r g a n s ( c M ) t o t h e GAL80 l o c u s ( 3 3 ) o n t h e l e f t arm o fc h r o m o s o m e X I I I . We e x a m i n e d t h i s b y c o n s t r u c t i n g ad i p l o i d b y a n MT8-1 (MATa l e u 2 g a l 8 O : : L E U 2 PHO84+) xM B1 37 ( M A T c l e u 2 GAL80 p h o 8 4 ) c r o s s . T h e t e t r a d d a t a o f9 0 a s c i f r o m t h e d i p l o i d i n d i c a t e d a s i m i l a r r e s u l t , 4 5 - c Ml i n k a g e , b e t w e e n t h e PHO84 a n d GAL80 l o c i w i t h a 3 1 : 5 : 5 4r a t i o f o r t he p a r e n t a l d i t y p e , n o n p a r e n t a l d i t y p e , a n d t e t r a -t y p e t e t r a d s . T h e PHO84 a n d TUB3 l o c i a r e a r r a n g e d i n t h es a m e o r i e n t a t i o n , a n d t h e i n i t i a t i o n c o d o n o f t h e TUB3 g e n ei s o n l y 3 5 5 b p f r o m t h e t e r m i n a t i o n c o d o n o f PHO84 ( F i g . 4 ) .T h e s e r e s u l t s i n d i c a t e t h a t t h e PHO84 a n d TUB3 l o c i a r el o c a t e d s i d e b y s i d e o n t h e l e f t a r m o f c h r o m o s o m e X I I I .S t r u c t u r e o f t h e p r e d i c t e d PHO84 p r o t e i n . T h e p r e d i c t e dp r o t e i n e n c o d e d b y t h e PHO84 O R F c o n t a i n s 5 9 6 a m i n o a c i dr e s i d u e s a n d h a s a m o l e c u l a r s i z e o f 6 5 k D a . By c o m p a r i s o nw i t h s e q u e n c e s i n t h e d a t a b a s e o f t h e E u r o p e a n M o l e c u l a rB i o l o g y L a b o r a t o r y ( R e l e a s e 1 2 . 0 ; O c t o b e r , 1 9 8 9 ) b y u s i n gt h e G E N E T Y X p r o g r a m ( S o f t w a r e D e v e l o p m e n t C o . , T o -k y o , J a p a n ) , w e d e t e c t e d s i g n i f i c a n t s i m i l a r i t i e s o f t h e p r e -d i c t e d PHO84 p r o t e i n w i t h a g l u c o s e t r a n s p o r t e r o f S .c e r e v i s i a e e n c o d e d b y SNF3 ( 5 ) . T h i s SNF3 p r o t e i n h a sb e e n s h o w n t o b e h o m o l o g o u s w i t h v a r i o u s m a m m a l i a n ,y e a s t , a n d b a c t e r i a l s u g a r t r a n s p o r t e r s ( 5 , 3 5 ) . Th e p r e d i c t e dPHO84 p r o t e i n a l s o h a s s i m i l a r i t i e s w i t h t h e s e o t h e r s u g a rt r a n s p o r t e r s ( F i g . 5 ) . H y d r o p a t h y p l o t s o f t h e d e d u c e da m i n o a c i d s e q u e n c e s o f t h e PHO84 a n d SNF3 p r o t e i n s b yt h e m e t h o d o f K y t e a n d D o o l i t t l e ( 1 7 ) a l s o i n d i c a t e d s i g n i f -i c a n t s i m i l a r i t i e s w i t h t h e s e p r o t e i n s , e a c h c o n s i s t i n g o f 1 2m e m b r a n e - s p a n n i n g s e g m e n t s c o n n e c t e d b y c h a r g e d h y d r o -p h i l i c l o o p s ( F i g . 6 ) . W i t h t h e a l g o r i t h m o f E i s e n b e r g ( 8 ) , 1 2p u t a t i v e m e m b r a n e s e g m e n t s , e a c h c o n s i s t i n g o f 2 1 a m i n oa c i d r e s i d u e s , w e r e i d e n t i f i e d i n t h e PHO84 p r o t e i n ( o v e r -l i n e d r e s i d u e s i n F i g . 5 ) . T h e s e p u t a t i v e m e m b r a n e - s p a n n i n gr e g i o n s o f t h e PHO84 p r o t e i n w e r e a r r a n g e d i n t o t w o g r o u p s ,e a c h c o n s i s t i n g o f s i x s e g m e n t s c o n t a i n i n g m a i n l y h y d r o p h o -b i c a m i n o a c i d s a n d s e p a r a t e d b y a s e g m e n t o f 7 4 a m i n o a c i dr e s i d u e s r i c h i n c h a r g e d a m i n o a c i d s ( 2 6 o f t h e 7 4 a m i n o a c i dr e s i d u e s i n PHO84 p r o t e i n a n d 2 2 o f t h e 7 0 r e s i d u e s i n t h es i m i l a r s p a c e r s e g m e n t o f SNF3 g l u c o s e t r a n s p o r t e r ) . I na d d i t i o n t o t h e a b o v e s t r u c t u r a l s i m i l a r i t i e s , a m i n o a c i dr e s i d u e s 6 3 t o 2 9 7 i n P H O 8 4 , c o v e r i n g s e g m e n t s 1 t o 6 , a n dr e s i d u e s 4 1 8 t o 5 6 6 i n s e g m e n t s 9 t o 1 2 h a v e s i g n i f i c a n th o m o l o g i e s w i t h t h e r e s i d u e s i n t h e c o r r e s p o n d i n g s e g m e n t so f S N F 3 , w i t h 25% a m i n o a c i d h o m o l o g y , a n d h a v e s i m i l a rl e v e l s o f h o m o l o g y w i t h t h o s e o f c o r r e s p o n d i n g r e g i o n s i no t h e r s u g a r t r a n s p o r t e r s , w h e r e a s t h e l o o p r e g i o n a n d s e g -m e n t s 7 a n d 8 h a v e n o s i g n i f i c a n t a m i n o a c i d h o m o l o g i e sw i t h t h o s e o f SNF3 a n d o t h e r s u g a r t r a n s p o r t e r s . T h eN - t e r m i n a l 5 5 a m i n o a c i d s m a k e u p a l a r g e h y d r o p h i l i cs e g m e n t a n d s o d o n o t a p p e a r t o c o n s t i t u t e a s i g n a l s e q u e n c ef o r i n s e r t i o n o f t h e p r o t e i n t h r o u g h t h e m e m b r a n e . T h e r e i sa p o t e n t i a l t h r e o n i n e s u b s t r a t e s i t e f o r c y c l i c A M P - d e p e n -d e n t p r o t e i n k i n a s e i n t h e PHO84 p r o t e i n a t a m i n o a c i dp o s i t i o n 5 5 8 w i t h t h e s e q u e n c e RKT. A p o t e n t i a l N - l i n k e dg l y c o s y l a t i o n s i t e ( 1 8 ) i s a l s o f o u n d a t a m i n o a c i d p o s i t i o n4 7 3 w i t h t h e s e q u e n c e N T T .E f f e c t o f g e n e d i s r u p t i o n o f P H O 8 4 . F o r e x a m i n a t i o n o f t h ee f f e c t o f d i s r u p t i o n o f t h e PHO84 g e n e , pMB93 a n d p M B 1 2 3DNAs ( F i g . 1 ) w e r e d o u b l y r e s t r i c t e d w i t h BamHI a n dE c o R I , a n d t h e r e s u l t a n t PHO84 f r a g m e n t s d i s r u p t e d b yi n s e r t i o n o f t h e H I S 3 DNA w e r e u s e d t o t r a n s f o r m c e l l s o f

3 - 2 - 1 QI2(b) ettoL -

M O L . C E L L . B I O L .


6/11

PHOSPHATETRANSPORTERIN YEASTCELLS 3233

- 9 0 0OralTTTAAAAAAGAAAAGA

~~~~~~-850G A A A A G G A A T A A A A A A G T G T C A C G T G A T A A A A A T C A C T A C C C G G A G A T G A C T T C A A A C G A C T C G G T A T A C T C T G C C T A A T A A A C C T T A A T* - 8 0 0 - 1 5 0T T T C T T A C A A A A A A A A A A A G A T T C A A T A A A A A A A G A A A T G A G A T C A A A A A A A A A A A A A A T T A A A A A A A A A A A G A A A C T A A T T T A T C A G C C*-100 - 6 5 0G C T C G T T T A T C A A C C G T T A T T A C C A A A T T A T G A A T A A A A A A A C C A T A T T A T T A T G A A A A G A C A C A A C C G G A A G G G G A G A T C A C A G A C C T T* ~~~~~~-6005 5 0G A C C A A G A A A A C A T G C C A A G A A A T G A C A G C A A T C A G T A T T A C G C A C G T T G G T G C T G T T A T A G G C G C C C T A T A C G T G C C A G C A T I TT G C T C G T IIu - 5 0 0

A A G G G C C C T T T C A A C TC A T C T A G C G G C T A T G AA G A A A A T G T T G E C C C GG C T G A A A A A C A C C C G T TC C T C T C A C T G C C G C A CC G C C C G A T G C-450 -400C A A T T T A A T A G T T C C A C G T G G A C G T G T T A T T T C C A G C A C G T G G G G C G G A A A T T A G C G A C G G C A A T T G A T T A T G G T T C G C C G C A G T C C A T C* - 3 5 0 - 3 0 0G A A A T C A G T G A G A T C G GT G C A G T T A T G C A C C A A A T G TC G T G T G A A A G G C T T T C C T T AT C C C T C T T C T C C C G T T T T GC C T G C T T A T T A G C T- 2 5 0 - 2 0 0A G A T T A A A A A CG T G C G T A T T A ET C A T T A A T T A A CC G A C C T C A T C T AT G A G C T A A T T A TT A T T C E T T T I T T G GC A G C A T G A T G E AA C C A C A T* ~ ~ ~ ~ - 1 5 0 - 1 0 0T G C A C A C E G G T A A T G C C AA E T T A G A T C C A C T T A C T A T TG T G G C T C G T A T A C G T A T A TA T A T A A G C T C A T C C T C A T E TC T T G T A T A A A G T A*~ ~ ~ ~ ~ - 5 0A A G T T C T A A G T T C A C T T C T A A A T T T T A T C T T T C C T E A T C T C G T A G A T C A C C A G G G C A E A C A A C A A A C A A A A C T E C A C G A A T A C A A T C C A A*0~~~~~sA T G A G T T E C G T C A A T A A A G A T A C T A T T C A T G TT G C T G A A A G A A G T C T T C A T A A A G A A C A E C T T A CC G A A G G T G G T A A C A T G G C C T T C C A CIOSS V NKDT I HVAERSL0KE NLTE G GNNAF1 0 0 1 5 0 C O a lA A C C A T T T G A A T G A I T T T T G C T C A T A T T G A A G A T C C T C T G G A A A G A A G A A G A T T G G E T T T G G A G T C C A T C G A T G A C G A A G G I T T T E G G T T G G3 1 0 0 1 N I F A N I E D P 1 E 0 R R 1 A I E S I I 0 E G F G N* 2 0 0 2 5 0C A A C A A G T T A A G A C E A T C TC C A T T G E T G G T G T T G G T T T CT T G A C A G A T T C T T A T G A T A TT T T T G C C A T T A A T T T G G G T AT C A C T A T G A T G6 1 0 0 V K I I S I A G V G F 1 T I 5 Y D I F A I N I G I T N N*300 3 5 0

T C C T A C G T T T A C T G G C A C G G T A G T A T G E C A G G T E C A A G T C A A A E C T T G T T G A A G G T T T ' C A C E T T C T G T T G G T A C T G T T A T T G G T C A A T T T9 1 S Y V Y N 0 6 5 P G P 5 0 1 1 1 K V S I S V G T V I G 0 F*~ ~ ~ 4 0 0 4 5 0G G T T T T G G T A C T T T A G C T G AT A T T G T T G G T C G T A A G A G AA T T T A T G G T A T G G A A C T T A TT A T C A T G A T T G T C T G T A C C AT T E T G C A A A C C1 2 1 6 G F G T I A I I 000R K 0 I Y G N E I I I N I V C T I 1 0 T*~ ~ ~~~500A E T G T T G C T C A T T E T E C T GC T A T T A A C T T E G T T G C T C A TT C T C C T G C T A T T A A C T T C GT T G C T G T T T T A A C A T T C T A CC G T A T T G T C A T G1 5 1 T V A 0 5 P A I N F V A H S P A I N F V A V L T F Y R 1 V N550 600

I81G IG I GG D Y PILS S I IT.SOF AIT TK W0060 I N G A* 6 5 0 7 0 0G T C T T T G C T A A C C A A G CT T G G G G T C A A A T C T C C G G TG G T A T C A T C G C T C T T A T E TT G G T T G E T G E T T A C A A G GG C G A A C T A G A A T A C G C A2 1 1 V F A N 0 A N G 0 I 5 G G I I A I I I V A A Y K C E I E Y A*5 0 8 0 0A A C T C T G G T G C T G A A T G T G A T G C T A G A T G T C A A A A G G C T T G T G A C E A A A T G T G G AG A A T C E T T A T T G G G T T G G G TA C C G T T C T A G G G T T G2 4 1 N 5 6 A E C D A R C 0 K A C I 0 N W R I L I G 1 G T V I G I* 0 ~ ~~~50 O j A c III.EI.0 0G C A T G T T T G T A T T T C A G A TT A A C T A T T C C A G A A T C T C C TA G A T A T C A A T T G G A T G T T AA C G C T A A G T T G G A A C T T G C TG C T G C C G C A C A A2 7 1 0 A C L Y F 0 1 1 I O ( D E G O M R Y 0 1 I V N A K I E I A A A A*~ ~ ~~~950G A A C A A G A T G G C G A A A A G A A A A T T C A C G A C A C C A G T G A T G A A G A C A T G G E A A T T A A C G G I T T T G G A A A G A G C T T C T A C T G C C G T C G A A T C T3 0 1 C 0 I 6 E K K I 0 I T S I E I N A I N 6 1 E R A 5 T A V C S1 0 0 0 1 0 5 0E T T G A C A A T C A T C C T EC A A A G G E T T C G T T E A A A G A T T T C T G C AG A C A T T T T G G T C A A T G G A A G T A E C G G T A A G A T T T T G C T A G G T A CT G C T3 3 1 L I N N P P K A S F K I F C R 0 F G 0 N K Y C K I I I G T AG G T T A C T G G T T T A CC T T A G A T G T T G C T T T CT A C G G G T T G A G T T T A AA C A G T G C T G T T A T T C TG C A A A C C A T C G G T T A TG C C G G T T C C A A A3 6 1 G Y N F T Q [ D D0 A F Y G 1 S L [ ] S A V I L 0 T I G Y A G S K*1200 1 2 5 0A A C G T T T A C A A G A A A C T G T A T G A T A C T G C T G T C G G T A A T C T G A T T T T G A T T T G T G C T G G T T C A T T A C C T G G T T A C T G G G T A T C C G T C T T C39 1N YK K L YDTA V GN L IL ICAG SL P G Y V S OF* ~~~~~~~13003 5 0A C T G T C G A T A T A A T C G G T A G A A A A C C A A T T C A A T T A G C C G G T T T C A T C A T C T T G A C C G C T T T G T T C T G T G T C A T C G G T T T C G C A T A C C A T421T VDII K PILAG F I ILTA LF CV IG F A YO s t E l l 1 4 0 0O A A A C T T G G T G A C C A T G G T C T G T T G G C T C T T T A C G T C A T T T G T C A A T T C T T C C A A A A C T T C G G T C C A A A C A C A A C C A C C T T T A T T G T T C C T

4 5 1 K L G 0 0 G L L A L Y V I C 0 F F 0 0 F G P N T T I F I V P1 4 5 0 b i l l 1 . 1 5 0 0G G T G A G T G T T T C C C A A C T C G T T A C A G A T C T A C T G C T C A T G G T A T T T C T G C T G C A T C I G G T A A G G T C G G T G C C A I T A T T G C A C A A A C C G C T481 G@ECF P T RTYR STAONG ISAA SGKVGA I I A T A* 1 5 5 0 O s t E l l 1 6 0 0T T G G G T A C T C T A A T C G A C C A T A A C T G T G C T A G A G A C G G T A A G C C A A C C A A C T G T T G G T T A C C T C A C G T C A T G G A A A T T T T C G C C T T A T T C5 1 1 1 L G I L I D H N C A R D G K P T N C N I P 0 V N E I F A L F*1650 O b a l .1100 C l a 'A T G T T G T T G G G T A T C T T C A C A A C C T T G T T G A T C C C A G A A A C T A A G A G A A A G A C T C T A G A A G A A A T T A A C G A G C T A T A C C A C G A T G A A A T C54IN L LGIFTT L LI P0OK RKTLEEINE LYDE* ~~~~~~17508 0 0 0G A T C C T G C T A C G C T A A A C T T C AG A A A C A A G A A T A A T G A C A T T G A A T CT T C C A G C C C A T C T C A A C TT C A A C A T G A A G C A T A A A A G C C T CA A5 1 1 I P A T I N F 0 N K N N D I E S S S P S 0 L 0 0 E A*~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ 1 8 5 0A G A T G C A C T A A A A C TT G T A A A C T A G A A C A AA T A A T A C A A A A A C A TT T T T A T A A A C T T A T TA T C A A A C C C C T T A C AT A A T C T A T A A A T A C T1 9 0 0 1 9 5 0G T C A G G T T A C A T A T T T A T T C G A T A A T T TC T T T T A A T T T C A T T A T TT C C T C A C A T C T C T C T G C C A TC C T G T T G C T G G T G C C A G A G C A G A G C* 2 0 0 0 X h o l 2 0 5 0A T A T C G T C C T T T C T T T T I T T A G T T C C A G A C G T T A C C C G A C A T A T C A T T T C T C G A G C C T C T G G a A A A C C A C G A A A C G T T T T A C A A A T T G C A C A*2100 2 1 5 0T C T A A A A G A A A T A T A A A C A C A G A T C A G G T A I C T C A T A A A G T A C A T T A A T C G A C T A A G C A A G C G A C T T G A G A C A A T G A G A G A G G T C A T T A GR E V 0 1 5* ~~~~~~22002 5 0T A T T A A T G G T A T G TA T G C G T T C C T T T T T TT G T T C A A T A T T C G C AA C C A A T G G C A C C T G TG G G A C A G G G A A A G A AG T T T G A T C T G A T C T GGI N * s t E l l 2 3 0 0T T T G A T T C A T T C CC A A T T G G T C A C C A T CT G G T T G A T T T A C G G CA A A T A A T T T G A C T T GT A C C A G C A C A G T T T AC T A A C 0 G T T T C T T T TT C2 3 5 0 2 4 0 0T C C A T T T T T T C T G G G C A T A C T C G G A C G A A A A A G C T C A T A A T T G A C C T C A T T A C A T G G G G A G T G A T T T T T G T G T C T T C T T C T T C G G A G G A T* 2 4 5 0 **2500T G C T G G A A C T T T T G T T A T T T T T C T T T T T T A C A A C A G T T G G T C A A G C A G G T I G T C A A A T A G G T A A T G C A T G C T G G G A A T T G T A C T C C C T A GV G O 0 A G CO C 1 N A C N W E L YSIL*2550 2 6 0 0A G C A T G G C A T C A A GG A A G A C G G C C A T T TG G A G G A T G G C T T G T CA A A A C C T A A G G G A G GT G A A G A A G G A T T T TC T A C A T T C T T C C A T GA A AE H G I 1 K E D G O IC I D G I S K P K G G E K G F S I F FONE* ~~~~~~2650 l a l 2 7 0 0C G G G G T A C G G A A A A T T C G T C C C A A G A G C A A T C T A C G T G G A T T T A G A G C C C A A T G T T A T C G A T G A A G T A C G T A C A G G A C G T T T C A A G G A G CT G O Y G K FV P RA I TOODL E C P NV I DE V R T G O F KE*~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ 2 7 5 0T T T T C C A T C C A G A A C A A T T G A T T A A C G G T A A G G A A G A T G E C G E E A A T A A E T A C G C A A G A G G C C A T T A T A C A G T G G G T A G A G A A A T A G T G GL F O N P E OL IN G K E D 0000N YA R G 0 0 Y TV GR E l I V2 8 0 0 2 8 5 0A T G A A G T T G A A G A A A G A A T T A G A A A G A T G G C C G A C E A A T G T G A E G G T T T A C A A G G G T T C T T G T T C A C C C A C T C C C T C G G T G G T G G A A C T G0 EV E E R I RK X HAlOECD GILG G F I F 1 0 5 1S G G GT* 2 9 0 0..c o O lG T T C C G G T T T A G G T TC C C T G T T A T T A G A A A AC T T A T C G T A T G A A T A C G G G A A G A A A T C C A A A T TG G A A T T CG S G L G SIL LL E N L S Y E Y G 8 K K K L E F

FIG. 4. Nucleotide sequence and deducedamino acid sequence of theORFof thePH084gene. The indicated amino acid sequence is thatof the lo n g e st ORFfound in the r e g i o n sequenced. The TUB3 gene starts from the nucleotide at p o si ti o n 2144 relative to theATGcodon ofPH084. The 808-bp TUB3 coding r e g i o n contains a298-bp i n t r o n , as described by Schatz et al . ( 3 2 ). Sequences homologous with the PH04p r o t e i n - b i n d i n g motif3'-CACGTG-5' or3'-CACGTT-5' ( 1 3) and the p u t a t i v e TATAbox are underlined. The 11 encircled amino acid r e s i d u e s ,but not the 2 residues enclosed in squares, i n the p u t a t i v e PH084p r o t e i n conform in p o s i t i o n and i d e n t it y with the 13 residues conserved in17 sugar transporters (16).

d i p l o i d strainNBW78( h is 3lh is 3 PHO84IPHO84) to h i s t i -dine prototrophy asdescribed p r e v i o u s l y (31). Weobtainedseveral His' transformants. Six of these His' transformantswereis ola te d, at random. Three of themwered i s r u p t e d withthe DNAfragment prepared from pMB93, and the otherthree wered i s r u p t e d with that of pMB123. Weconfirmedthat the PH084 locus of these clones was d i s r u p t e d bySouthern h y b r i d i z a t i o n of genomic DNA d i g e s t e d withH i n d l l l with a32P-labeled 1 . 4 - k b p H i n d I I I ( a t + 6 4 4 ) - X h o l(+2029) fragment of the PH084DNAas a probe for theclones d i s r u p t e d with the fragment of pMB93 and a1plabeled 2.0-kbp H i n c I I ( c a . - 1 4 0 0 ) - H i n d I I I (+644) PH084fragment asaprobe for those d i s r u p t e d with the fragment ofpMB123. All six of these clones were s u b j e c t e d to tetradanalysis. Results in five tosevenasci tested with each clone

showeda2+:2- ratio for the Hisphenotypes, and al l of theHis+ segregants showed the Pho84- phenotype. These find-i n g s indicate that a ll of the His+ transformants are hetero-zygous for PHO84IApho84 alleles and that gene d i s r u p t i o ni s not lethal to the c e l l . Weconfirmed that the Apho84 a l l e l ewasunable to complement the p h o 8 4 - 1 mutation by c r o s s i n goneof the Apho84 segregants having the o t mating type withNS219 (MATa p h o 8 4 - J ) .

Regulation ofPH084e x p r e s s i o n . The low-Km, P i transportsystem is known to be under the control of the samer e g u l a t o r y system as rAPase and to be derepressed by P istarvation ( 36 , 4 1) . For determination of whether t r a n s c r i p -tion of thePH084gene is controlled by the P1 concentration,Northern h y b r i d i z a t i o n s of totalRNAsprepared from cellswith d i s r u p t i o n of the pho2, pho4, pho8O, pho8l, orpho84

V O L . 1 1 , 1 9 9 1I t i t ) Cf t


7/11

3 2 3 4 BUN-YA ET A L .

5 16 186111 1

1 0 111 613 7605358

16 017 219 511 911 711 22 2 72 302 5217 618 216 62 9 32752 972 2 02 322 1035 833 43592752 812 6 242 238741 232 833 631847 445 246 838538937853 750 452 643 7448437

ESI 3 F G W Q Q 8 K T I S I _ wDaF}D.P-P K - K P M S f Y V T V S L L C L C V R G 1 - F G S GFVVQTD-FLRR1K-HIKDG-THY--S E - P P Q K Q S M M M S I C V G . F V A V - FG F Y D E T G I -HAKNN-----D--M E - P S S K - K L 7 I I L M L A N G G A V L S L Q - F I P A K V I E E Y N - - Q T W V H R Y G E S I L PM - - N T Q Y N S S - Y I F S I T - - L V A T a L - F I G T - - V E S L N - - - T - V F V A P N L S E - S A- - T P R S L R r r R R M N M F V - S V A A A G 4 L j - F G I A G A - - L P - - F I - - T D I I F V - - - - L - - - T -GP-- QG IIVTFC BTVAIPS N F-LSNV I F N 1 A I ILSKG G R KGLSIVVSVYIVGII I [ I A S I N . - - - - - - - - -SFTA I S I L T A P F I R I I F S T I F F S I G N vGAGG--------TLTTLW-S I F V N R G N S M L N U L A F V S A V L M G F S K L G K S . - - - - -AMIC_-T-P EA rorrAftA*,ArIDC P r ) n c ! r I f T A AI L - ' l t ; l Y t I I A wnvir'L-PsvTUn f nA J L - i b u r A1 UI A L A I I . b J N H I ' l E L U Z L l A A V L L U V S AWLUkrllNVUN- - S R L - Q E W X s I M i & GA}GLFN - eFRI G S g S U t A G A I L F V L G S IGSA----FATS-----4 5V A H S P A I N O V & F R I IGIGIYPS I I h Y} i G A V F A N Q GI I I A- - - - - - - - K W Y Q Y F I I I I A V W P M L I P K H L V S C Y Q L M I T B I FLCTN--------- I T L V I I G I I S A V V P L Y Q T I I K S I G A I S T Y Q W A I I L L V S S A V S- - - - - - - - - - F E I I Y T T G F V P M Y V S F V A . G G T r L 1 1 Q L G I V V G L I A Q V F GT V P V Y L A G E V I R I I A S M Q P M Y I A H I L V S F N Q F A I I F G L - L V Y C V_ _ _ _ _ _ _ _ - I IASYTAPLY E N I S M Y Q L M V T - - I V L A F6O L V & I g E L E Y A N S G A E C D A R C Q K A C D Q R I L IG C t Y F R t I PSRYQYGTKSYSNSVQ-- - - - - - - - - - - - - - - V L FA W M I G A L T L ESPRYCJK-Q G T I N D A S S - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 4G S S F L A I G M F F E S P R Y Y V - L K jO D S I M G N & - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - D L SII F I P 4 Q C I V L P F E S P R L I I NN Y F 4 4 S G D A S W L N T - - - - - - - - - - - - D c F A S E C I P 4 4 t U L L 4 P E S P R 4 M S R GS D 1F S - - Y S - G N- - - - - - - - - - - - - - - - A L L A L P A V L L I I L V V F P4A EK G7-A Q E Q D G E K K H D T ED- INC N H P P K A S F K D F C @ l F G Q W K I f l' R S I - - A K S N Y S P E P A V L I ? I E G N A S W G E L F - S T K T - - - K V F Q R [ 4 IJ S E E j J K S L S F - - - L R G V - P V H D S G L L E E L I K e D Y E A S F G S S N F I D C F I S S K S R P K Q T L R M F TE @ N 4 i S V L - K K - L R G - - - T A D - - V T I I D L I K E E S R Q M M R E K K V T I L E L F R S P A - - - - Y R n I IK Q E G I L - R K - I M G . - - - - - N T L A T Q A V I K - H S L D H G R - - K - T G G R L - - - - - - L M F G IR I I I E V L - R M - L R D - - - - T S E K A R E E L R - E S L - - - K L K Q G G W A L F K I f N - - - - V R R A V F S J8

Y rLAFYGLSL4ILI A G S K N V Y K K L Y E O A V G N f , I - S Y P G V F TF V I Q L T G N N Y F F Y Y G I K S L - - - - - - - - - - - - - D D S F E T l y IVVNFASTFI L Q a Q F S G I N F I F Y Y G V N F F N K V . - - - - - - - - - - - - - S N S f V S F I T Y A V N V V F N V P GA V V L Q L S Q Q L S G I N A V F Y Y O T S S F E K 4 V - - - - - - - - - - - - - Q Q P V Y A g p g I ( V N T A F T L i 1W V M L S I f Q F & I N V V L Y Y A P E V F E E - - - - - - - - - - - IAIIIVI I F T V L Ag i L L Q A M Q Q F T G M N I I M Y Y A P F K M 4 - - - - - - - - - F T E Q Q M I A T L V V T F M F A T F I9 _ _ _ _ _ 1 0I I I R I ---FC IHKEGD - - - - - - - 1 I L - j L Y Q N ] G P - - NE N K C L A T M M A C M V I Y A S V T R L Y P H G K S Q P S S K G A NCMIVF- I F C Y A T T W AI V I E F F & K V L V 4 4 4 V L - T I A N F I V A I - V G C C - K T V A A - - - A K V - M I A F A A T W GV RA T L I I A G M - A G C M I L M 1 L T L - j Q L P W M S Y L - - - - - S I V A A V G P GFVRK I L G M A I G M F S L G T - - F - - Y T Q A P - - - - - G I V - A I L S M - L F - Y V A A A M S W GV A R K L K I V M A L G T L V L G Y C L M Q F D N G T A S S - - - - - G L S W L S V G M - T M M I C I A G Y A M S A A

TT T EPG q R I G - J . . S A iF AIWAQTALG H N - C A R D & KC E R E SP V A W V I T F-- K S K C M A L A W G F L - - - - - I A F F P F I - - - - A I N F Y Y G Y VG V V W V I S G CT-IAANWLVN- - - C P Y I - V D T O S S L G A K I F FP I P W F I V A L ; Q G [ - - A V A G W T S N 1 - - - - V G M C F Q Y - . V V - - - - - E Q L C G & M F I IP V C W V L L S I A I L - - I Q W L A N Y F - - - - - V S W T F P M M D K N S W L V A H F H N G F S Y W IP V V W h L C I K F G I - - N W B S N f i - - - - I G A T F L T L L D S I N A A G T E 3 Y T A L i IM A - o 3 F M [ > G CETLEEIIIDEI DFLN-e N g ] - HEAG C [ L V A M F F Y V F F F E T E E I E G V K S . WIRRGNN..WGSKAsGVSVYTK3LEERIS S T G VVSPIAL r D P L Q R . .o r v g v n F FK GAs]sGaQGQ S D K T P E E L pLGAEvY.CMGV0AF E T EE - - - - - - - - - - P E T K K T Q Q T A T LA F V -G-I F L I K L M A G E K L R N I G VFIG. 5 . S e q u e n c e a n d s t r u c t u r a l h o m o l o g y o f t h e p r e d i c t e d PH084 p r o t e i n w i t h v a r i o u s s u g a r t r a n s p o r t e r s . PH084, p r e d i c t e d PH084p r o t e i n ; GAL2, g a l a c t o s e t r a n s p o r t e r o f S . c e r e v i s i a e ( 3 5 ) ; S N F 3 , h i g h - a f f i n i t y g l u c o s e t r a n s p o r t e r o f S . c e r e v i s i a e ( 5 ) ; HGT, H e p G 2 g l u c o s et r a n s p o r t e r o f h u m a n c e l l s ( 2 3 ) ; X y l E a n d A r a E , x y l o s e a n d a r a b i n o s e t r a n s p o r t e r s o f E . c o l i ( 1 9 ) . Th e a m i n o a c i d sequences o f t h e p r o t e i n s

a r e a l i g n e d t o o b t a i n m a x i m u m f i t t i n g w i t h t h e PH084 seque n ce. R e s i d u e s i d e n t i c a l i n t h e PH084 p r o t e i n a n d o t h e r p r o t e i n s a r e b o x e d . Th el i n e s above t h e PH084 sequences w i t h n u m b e r s f r o m 1 t o 1 2 i n d i c a t e p u t a t i v e m e m b r a n e - s p a n n i n g se gm e n t s w i t h 2 1 a m i n o a c i d r e s i d u e sd e d u c e d from t h e h y d r o p a t h y p l o t shown i n F i g . 6 . T h e n u m b e r s on t h e l e f t r e p r e s e n t t h e p o s i t i o n s o f t h e f i r s t a m i n o a c i d r e si d u e s o f t h ei n d i c a t e d p r o t e i n . Dashes i n d i c a t e g a ps i n t r o d u c e d t o o p t i m i z e t h e a l i g n m e n t .

P H 0 8 4G A L 2S N F 3HG TX y l EA r a EP H 0 8 4G A L 2S N F 3HG TX y l EA r a EP 1 1 0 8 4G A L 2S N F 3H G TX y l EAraEP H 0 8 4G A L 2S N F 3I I G TX y l EA r a EP 1 1 0 8 4G A L 2S N F 3H G TX y l EAraEP H 0 8 4G A L 2S N F 3I I G TX y l EA r a EP 1 1 0 8 4G A L 2S N F 3H G TX y l EA r a EP 1 1 0 8 4G A L 2S N F 3H G TX y l EAraEP H 0 8 4G A L 2S N F 3H G TX y l EA r a E



8/11

PHOSPHATE TRANSPORTER I N YEAST C E L LS 3 2 3 5

0020300 400 500 600 700 800F I G . 6 . H y d r o p h o b i c i t y p r o f i l e s o f t h e p r e d i c t e d PHO84 a n dSNF3 p r o t e i n s . H y d r o p a t h y v a l u e s f o r a window o f 2 1 a m i n o a c i dr e s i d u e s w e r e a v e r a g e d, a s si g n e d t o t h e m i d d l e r e s i d u e o f t h e span,a n d p l o t t e d w i t h r e s p e c t t o p o s i t i o n a l o n g t h e a m i n o a c i d seque n ce.T h e n u m b e r s r e f e r t o p u t a t i v e m e m b r a n e - s p a n n i n g d o m a i n s pre-d i c t e d b y t h e a l g o r i t h m o f E i s e n b e r g ( 8 ) .

g e n e a n d f r o m t h e w i l d - t y p e s t r a i n c u l t i v a t e d f o r 1 2 t o 1 6 h( s t a t i o n a r y p h a s e ) i n n u t r i e n t l o w - P 1 a n d h i g h - P i m e d i a w e r ep e r f o r m e d w i t h a 3 2 P - l a b e l e d 0 . 7 - k b p C l a I - H p a I f r a g m e nt o ft h e PH084 DNA ( F i g . 3 ) a n d a 1 . 0 - k b p X h o I - H i n d I I I f r a g -m e n t o f t h e ACT] g e n e o f S . c e r e v i s i a e ( 1 0 ) as p r o b e s . T h eRNA o f t h e w i l d - t y p e s t r a i n c u l t i v a t e d i n l o w - P i m ed i u mgave o n e h y b r i d i z a t i o n b a n d o f a p p r o x i m a t e l y 2 . 3 k b , b u tt h a t o f c e l l s c u l t i v a t e d i n h i g h - P i m ed i u m gave no b a n d ( F i g .7 ) . T h i s 2 . 3 - k b PHO84 t r a n s c r i p t i s c o n s i s t e n t i n s i z e w i t ht h e PHO84 c o d i n g r e g i o n . Th e p ho 2 , p ho 4 , a n d p h o 8 ld i s r u p t a n t s d i d n o t p r o d u c e t h e PHO84 t r a n s c r i p t , w h i l e t h ep h o 8 O d i s r u p t a n t s h o w e d t h e same l e v e l o f d e r e p r e s s i o n o fPHO84 t r a n s c r i p t s i n h i g h - P i a n d l o w - P i m e d i a . T h e p h o 8 4d i s r u p t a n t d i d n o t p r o d u c e t h e t r a n s c r i p t i n e i t h e r h i g h - P i o rl o w - P i m e d i u m . I n c o n t r a s t , c e l l s o f t h e p h o 8 4 - 1 mutantshowed a l o w b u t s i g n i f i c a n t l e v e l o f t r a n s c r i p t i o n o f t h ep h o 8 4 - 1 ge n e i n h i g h - P i m ed i u m a n d a l e v e l i n l o w - P i m ed i u ms i m i l a r t o t h a t i n t h e w i l d - t y p e c e l l s ( F i g . 7 , l a n e s 1 3 a n d 1 4 ) .T h e s e d i f f e r e n t i a l t r a n s c r i p t i o n s o f t h e p h o 8 4 - 1 g e n e i n t h ep h o 8 4 - 1 mutant i n h i g h - P i a n d l o w - P i m e d i a a r e c o m p a r a b l ew i t h t h e d i f f e r e n t i a l r A P a s e s y n t h e s i s o f t h e same mutant( 4 2 ) . L i k e t h e p h o 8 O d i s r u p t a n t , a p h o 8 5 - 1 m u t a n t , YAT965( 4 9 , 5 0 ) , t r a n sc r i b e d t he PHO84 g e n e a t s i m i l a r l e v e l s i nh i g h - P i a n d l o w - P i m e d i a ( d a t a n o t s h o w n ) . T h e s e r e s u l t sc l e a r l y i n d i c a t e t h a t PHO84 t r a n s c r i p t i o n i s u n d e r t he c o n -t r o l o f t h e PHO r e g u l a t o r y s y s t e m .To c o n f i r m t h a t PHO84 e x p r e s s i o n i s u n d e r t he c o n tr o l o fP i i n t h e m e d i u m , we e x a m i n e d t h e e x p r e s s i o n o f a PHO84-l a c Z f u s i o n g e n e w i t h pMB142 ( F i g . 1 ) . T h e 2 . 3 - k b p H i n c I lf r a g m e n t o f t h e PHO84 DNA h a s a 1 . 4 - k b p upstream r e g i o na n d a 8 6 7 - b p O R F r e g i o n e n c o d i n g t h e N - t e r m i n a l h a l f o f t h ePHO84 p r o t e i n ( F i g . 3 a n d 4 ) . T h o u g h t h e PHO84 O R F wast r u n c a t e d , t h e PHO84-lacZ f u s i o n g e n e h a s a s u f f i c i e n t

3a a < < < Q+ - 7 _ I r+ I - _ l s _ , + _ l s _

PH084- * *-2.3bA C T 1 -*** -f t - 1 . 2 k b1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2 1 3 1 4

F I G . 7 . D e t e c t i o n o f t h e PHO84 t r a n s c r i p t b y N o r t h e r n h y b r i d -i z a t i o n . T o t a l RNAs w e r e p r e p a r e d f r o m c e l l s o f s t r a i n s P - 2 8 - 2 4 C( w i l d t y p e [ W T ] ) , NBD2-1 ( A p h o 2 ) , NBD4-1 ( A p h o 4 ) , N B D 8 0 - 1( A p h o 8 O ) , NBD81-6D ( A p h o 8 J ) , MB192 ( A p h o 8 4 ) , a n d N S 2 1 9( p h o 8 4 - 1 ) g r o w n o n n u t r i e n t h i g h - P i ( + ) o r l o w - P i ( - ) m e d i u m .S a m p l e s ( 1 0 , u g ) o f t o t a l RNA w e r e u se d. A f t er e l e c t r o p h o r e s i s , t h el a n e s w e r e h y b r i d i z e d w i t h a 3 2 P - l a b e l e d 0 . 7 - k b p C l a I - H p a I f r a g -m e n t o f t h e PHO84 DNA a n d a 1 . 0 - k b p X h o I - H i n d I I I f r a g m e n t o f S .c e r e v i s i a e e n c o d i n g t h e ACTI g e n e a s p r o b e s . T h e s p e c i f i c a c t i v i t i e so f b o t h p r o b e s w e r e 1 . 0 x 1 0 8 c p m/ ,u g o f DNA. 2 5 S a n d 1 8 S rRNAsv i s u a l i z e d b y s t a i n i n g w i t h e t h i d i u m b r o m i d e w e r e u se d a s s i z em a r k e r s a s d e s c r i b e d b y P h i l i p p s e n e t a l . ( 2 9 ) .r e g i o n o f t h e PH084 p r o m o t e r , a n d t h e N - t e r m i n a l c o d i n gr e g i o n o f PH084 w as c o n n e c t e d w i t h l a c Z i n f r a m e , b e c a u s ec o l o ni es o f S . c e r e v i s i a e DKD-5D h a r b o r i n g pMB142 g a v ea n i nt en se b l u e c o l o r o n p l a t e s c o n t a i n i n g t h e l o w - P i v e r s i o no f SD m e diu m o n a d d i t i o n o f 5 - b r o m o - 4 - c h l o r o - 3 - i n d o l y l - 3 -D - g a l a c t o s i d e ( X - G a l ; W a k o P u r e C h e m i c a l I n d u s t r i e s , O s -a k a , J a p a n ) . W h e n t h e t r a n s f o r m a n t c e l l s w e r e c u l t i v a t e d o nh i g h - P i o r l o w - P i m ed i u m t o t h e s t a t i o n a r y p h a s e , t h e a c t i v i t yp r o f i l e s o f P - g a l a c t o s i d a s e s h o w e d d e r e p r e s s i o n b y P i s t a r -v a t i o n ( F i g . 8 ) . T h u s , e x p r es s i o n o f t h e PHO84 O R F i s u n d e rt h e c o n t r o l o f P 1 a n d i s d e r e p r e s s e d b y P 1 s t a r v a t i o n .C e l l u l a r l o c a l i z a t i o n o f P H O 8 4 - , - g a l a c t o s i d a s e c h i m e r i cp r o t e i n . F o r d et e r m i n a ti o n o f t h e l o c a t i o n o f PHO84 p r o t e i ni n S . c e r e v i s i a e c e l l s , a P H O 8 4 - p - g a l a c t o s i d a s e c h i m e r i cp r o t e i n w h i c h h a s 2 8 9 a m i n o a c i d r e s i d u e s c o n t a i n i n g s i xt r a n s m e m b r a n e r e g i o n s o f t h e N - t e r m i n a l h a l f o f t h e PHO84p r o t e i n c o n n e c t e d w i t h , - g a l a c t o s i d a s e w as p r o d u c e d i nc e l l s o f NBW5 h a r b o r i n g pMB143 ( F i g . 1 ) . As a c o n t r o l i nt h i s a n a l y s i s , s o l u b l e , - g a l a c t o s i d a s e a c t i v i t y was e x a m i n e di n t h e same S . c e r e v i s i a e s t r a i n , NBW5, h a r b o r i n g p l a s m i dpSH530 ( a Y E p - t y p e p l a s m i d s i m i l a r t o p M B 1 4 3 ) c a r r y i n g aH I S 5 - l a c Z f u s i o n g e n e t h a t p r o d u c e s a f u s e d p r o t e i n c o n s i s t -i n g o f t h e N - t e r m i n a l 4 0 a m i n o a c i d r e s i d u e s o f t h e HIS5p r o t e i n c o n n e c t e d w i t h , - g a l a c t o s i d a s e ( 2 4 ) . T h e t r a n s f o r m -a n t c e l l s w e r e c u l t i v a t e d i n n u t r i e n t l o w - P i medium a t 3 0 Cf o r 1 6 h a n d t h e n h a r v e s t e d , w a s h e d , a n d d i s r u p t e d , a n dt h e i r s u p e r n a t a n t a n d m e m b r a n e ( s e d i m e n t ) f r a c t i o n s w e r ep r e p a r e d . We f o u n d t h a t t h e t o t a l - m e m b r a n e f r a c t i o n p r e -p a r e d f r o m t h e t r a n s f o r m a n t w i t h pMB143 c o n t a i n e d h i g hP - g a l a c t o s i d a s e a c t i v i t y w h e r e a s m o s t o f t h e 3 - g a l a c t o s i d a s ea c t i v i t y o f c e l l s h a r b o r i n g p S H 5 3 0 w a s i n t h e s o l u b l e f r a c t i o n( T a b l e 2 ) . T h e s e r e s u l t s s u g g e s t t h a t t h e 2 8 9 N - t e r m i n a la m i n o a c i d r e s i d u e s o f t h e PHO84 p r o t e i n f u n c t i o n i n t r a n s -f e r o f t h e c h i m e r i c p r o t e i n t o t h e m e m b r a n e .

DISCUSSIONT h e PHO84 g e n e o f S . c e r e v i s i a e h a s b e e n c l o n e d b yc o m p l e m e n t a t i o n o f t h e c o n s t i t u t i v e p h e n o t y p e o f r A P a s e o ft h e p h o 8 4 m u t a n t . T h e f o l l o w i n g f i n d i n g s i n t h i s w o r k

V O L . 1 l , 1 9 9 1


9/11

3 2 3 6 BUN-YA ET A L .

0~~~~~~~~5 0

0 . 0 1 0

0 8 1 6 2 4T i m e ( h )

F I G . 8 . T i m e c o u r s e s o f c h a n g e i n , 8 - g a l a c t o s i d a s e a c t i v i t y i nt r a n s f o r m a n t h a r b o r i n g t h e P H O 8 4 - l a c Z g e n e - f u s i o n p l a s m i d ,p M B 1 4 2 . C e l l s o f t h e t r a n s f o r m a n t o f DKD-5D h a r b o r i n g p l a s m i dp M B 1 4 2 w e r e p r e c u l t i v a t e d a t 3 0 C f o r 1 d a y i n 5 m l o f s y n t h e t i ch i g h - P i m e d i u m s u p p l e m e n t e d w i t h a p p r o p r i a t e n u t r i e n t s b u t w i t h -o u t t r y p t o p h a n . T h e c e l l s w e r e h a r v e s t e d , w a s h e d w i t h s t e r i l ew a t e r , a n d i n o c u l a t e d i n t o 1 0 0 m l o f n u t r i e n t h i g h - P i ( o p e n s y m b o l s )o r l o w - P i ( c l o s e d s y m b o l s ) m e d i u m t o g i v e an o p t i c a l d e n s i t y a t 6 6 0nm ( O D 6 6 0 ) o f 0 . 0 1 . T h e c u l t u r e s w e r e s h a k e n g e n t l y a t 3 0 C a n da s s a y e d f o r , B - g a l a c t o s i d a s e a c t i v i t y ( E a n d A ) ( i n u n i t s p e r m i l l i -g r a m o f p r o t e i n ) . C e l l g r o w t h ( O a n d * ) w as m o n i t o r e d a s t h e O D . 6o f t h e c u l t u r e s .s t r o n g l y s u g g e s t t h a t PHO84 e n c o d e s a P i t r a n s p o r t p r o t e i n :t h e a m i n o a c i d s e q u e n c e d e d u c e d f r o m t h e n u c l e o t i d e s e -q u e n c e o f t h e g e n e i s h i g h l y h o m o l o g o u s w i t h t h o se o fs e v e r a l s u g a r t r a n s p o r t e r s o f m a m m a l i a n , y e a s t , a n d b a c t e -r i a l o r i g i n ( F i g . 5 ) , a n d t h e P - g a l a c t o s i d a s e a c t i v i t y e x p r e s s e db y t h e P H O 8 4 - l a c Z f u s i o n g e n e s e e m e d t o b e a s s o c i a t e dw i t h t h e m e m b r a n e ( T a b l e 2 ) .T h e g l u c o s e t r a n s p o r t e r s o f S . c e r e v i s i a e , SNF3 ( 5 ) , a n dH e p G 2 e r y t h r o c y t e s (HGT [ 2 3 ] ) , t h e x y l o s e a n d a r a b i n o s et r a n s p o r t e r s o f E . c o l i ( X y l E a n d A raE [ 1 9 ] ) , a n d t h e m a l t o s e( M A L 6 1 [ 6 ] ) a n d g a l a c t o s e ( G A L 2 [ 3 5 1 ) t r a n s p o r t e r s o f S .c e r e v i s i a e h a v e b e e n s h o w n t o b e h o m o l o g o u s , a n d a l l o ft h e s e s u g a r t r a n s p o r t e r s h a v e b e e n g r o u p e d i n t o an HG Ts u p e r f a m i l y ( 5 , 3 5 ) . T h e s e p r o t e i n s a l l h a v e 1 2 m e m b r a n e -s p a n n i n g r e g i o n s c o n s i s t i n g o f t w o b l o c k s o f s i x t r a n s m e m -b r a n e d o m a i n s s e p a r a t e d b y c h a r g e d , h y d r o p h i l i c c o n n e c t i n gl o o p s . D u p l i c a t e d G R R s e q u e n c e s a r e c o n s e r v e d i n m e m -b r a n e - s p a n n i n g s e g m e n t s 2 a n d 8 , a n d PESPR a n d PETKs e q u e n c e s a r e c o n s e r v e d i n m e m b r a n e - s p a n n i n g s e g m e n t s 6a n d 1 2 , r e s p e c t i v e l y , i n t h e HG T s u p e r f a m i l y ( 3 5 ) . T h ePHO84 p r o t e i n a l s o h a s t h e s e s e q u e n c e s s t a r t i n g a t a m i n o

T A B L E 2 . , B - G a l a c t o s i d a s e a c t i v i t y i n m e m b r a n e a n ds u p e r n a t a n t f r a c t i o n s, - G a l a c t o s i d a s e a c t i v i t y a i n :P l a s m i d G e n e f u s i o n C e l l e x t r a c t b M e m b r a n e s S u p e r n a t a n t

p S H 5 3 0 H I S 5 - l a c Z 1 , 1 3 0 + 2 6 0 6 5 + 1 7 1 , 0 9 0 + 1 5 0p M B 1 4 3 P H 0 8 4 - l a c Z 2 , 1 6 0 + 2 5 0 1 , 8 8 0 + 2 4 6 2 2 1 + 8 2

a c i d p o s i t i o n s 1 3 0 , 2 8 0 , 4 2 6 , a n d 5 5 2 ( F i g . 4 a n d 5 ) . I n humang l u c o s e t r a n s p o r t e r s , t h e p o l a r a m i n o a c i d g r o u p s i n s e g -m e n t s 7 a n d 8 h a v e b e e n s u g g e s t e d t o b e l o c a t e d o n o n es u r f a c e o f t h e c t - h e l i x a n d t h u s t o f o r m a p o l a r c h a n n e lt h r o u g h w h i c h t h e s u g a r i s t r a n s p o r t e d ( 1 1 ) . T r a n s p o r t e r s o ft h e H G T s u p e r f a m i l y s h o w h i g h c o n s e r v a t i o n o f s e g m e n t s 7a n d 8 , b u t s e g m e n t 7 o f t h e PHO84 p r o t e i n s h o w s l i t t l eh o m o l o g y w i t h t ho s e o f t h e HG T s u p e r f a m i l y . R e c e n t l y , 1 3r e s i d u e s w i t h p e r f e c t l y c o n s e r v e d h o m o l o g y a n d p o s i t i o nw e r e f o u n d i n 1 7 s u g a r t r a n s p o r t e r s o f v a r i o u s o r i g i n s ( 1 6 ) . I nt h e p u t a t i v e PHO84 p r o t e i n , 2 o f t h e s e 1 3 c o n s e r v e d r e s i d u e si n s e g m e n t 7 a r e d i f f e r e n t b u t t h e o t h e r 1 1 a r e c o n s e r v e d( F i g . 4 ) . I n a d d i t i o n , a t r y p t o p h a n r e s i d u e i n s e g m e n t 1 1( a m i n o a c i d p o s i t i o n 4 1 2 ) o f HG T i s s u g g e s t e d t o b e ap o t e n t i a l c y t o c h a l a s i n B - b i n d i n g s i t e ( 4 5 ) , a n d t h i s t r y p -t o p h a n r e s i d u e i s c o n s e r v e d i n t h e s e s u g a r t r a n s p o r t e r s b u tn o t i n t h e PHO84 p r o t e i n , i n w h i c h t h e c o r r e s p o n d i n g a m i n oa c i d r e s i d u e i s l y s i n e ( F i g . 5 ) . T h e s e d i f f e r e n c e s m i g h t b eb e c a u s e t h e PHO84 p r o t e i n i s s p e c i f i c f o r P i b u t n o t s u g a rt r a n s p o r t a t i o n . H o w e v e r , i t i s s t r a n g e t h a t t h e a m i n o a c i ds e q u e n c e a n d p r e d i c t e d s t r u c t u r e o f t h e PHO84 p r o t e i n d i f f e rs i g n i f i c a n t l y f r o m t h o s e o f t h e p u t a t i v e P i t r a n s p o r t e r o fN e u r o s p o r a c r a s s a e n c o d e d b y p h o 4 + , w h i c h h a s 12 p o s s i -b l e m e m b r a n e - s p a n n i n g s e g m e n t s w i t h a l o o p r e g i o n b e -t w e e n s e g m e n t s 8 a n d 9 ( 2 0 ) , a n d t h a t o f r a t l i v e r , w h i c h h a s6 p o s s i b l e m e m b r a n e - s p a n n i n g s e g m e n t s ( 9 ) . Ambudkar e ta l . ( 1 ) s u g g e s t e d t h a t s e c o n d a r y c a r r i e r s h a v i n g 6 m e m b r a n e -s p a n ni n g s e g m e n t s i n t h e m o l e c u l e f u n c t i o n a s d i m e r s a n dt h a t t h o s e w i t h 1 2 s e g m e n t s f u n c t i o n a s m o n o m e r s . I f t h i s i ss o , t h e PHO84 P i t r a n s p o r t e r m ay f u n c t i o n a s a m o n o m e r .p h o 8 4 d i s r u p t i o n w a s n o t l e t h a l b u t a l m o s t a b o l i s h e d P iu p t a k e ( r e f e r e n c e 4 1 a n d F i g . 2 ) . T h i s m i g h t b e d u e t o t h ef a c t t h a t t h e r e a r e a t l e a s t t w o s y s t e m s o f P i t r a n s p o r t i n S .c e r e v i s i a e : o n e h a s h i g h a f f i n i t y f o r e x t e r n a l P i a n d i sr e p r e s s e d b y P i , a n d t h e o t h e r i s c o n s t i t u t i v e a n d h a s l o wa f f i n i t y t o P i ( 3 6 ) . T h e P i t r a n s p o r t e r e n c o d e d b y PH084c o r r e s p o n d s t o t h e r e p r e s s i b l e s y s t e m . I t i s unknownw h e t h e r t h e PHO84 p r o t e i n c o n t r i b u t e s t o t h e c o n s t i t u t i v es y s t e m .N o r t h e r n b l o t h y b r i d i z a t i o n s t u d i e s s h o w e d t h a t PH084t r a n s c r i p t i o n i s r e g u l a t e d b y t h e P i c o n c e n t r a t i o n i n t h em e d i u m a n d i s u n d e r t h e s a m e t r a n s c r i p t i o n a l c o n t r o l a s t h ePH05 a n d PHO81 g e n e s ( F i g . 7 ) . F o u r c o p i e s o f t h e 5 ' -C A C G T G / T - 3 ' m o t i f , w h i c h i s e s s e n t i a l f o r d e r e p r e s s i o n o ft h e PH08 g e n e ( 1 3 ) , w e r e f o u n d a t p o s i t i o n s - 8 8 0, - 5 8 7,- 4 3 6 , a n d - 4 1 4 .

A CKNOW L ED G M ENTSWe t h a n k T . F u k a s a w a a n d Y . S u z u k i o f K e i o U n i v e r s i t y f o rp r o v i d i n g t h e g a l 8 0 d i s r u p t a n t a n d D . G a l l w i t z o f M a x - P l a n c k -I n s t i t u t e f o r t h e p Y A 3 0 1 p l a s m i d . We a l s o t ha n k H . S a i t o h o f o u rl a b o r a t o r y f o r t e c h n i c a l a s s i s t a n c e .T h i s s t u d y w a s s u p p o r t e d b y G r a n t s - i n - A i d f o r S p e c i a l P r o j e c tR e s e a r c h a n d f o r G e n e r a l S c i e n t i f i c R e s e a r c h t o Y . O . f r o m t h e

M i n i s t r y o f E d u c a t i o n , S c i e n c e , a n d C u l t u r e o f J a p a n .REFERENCES

1 . A m b u d k a r , S . V . , V . A n a n t h a r a m , a n d P . C . M a l o n e y . 1 9 9 0 .U h p T , t h e s u g a r p h o s p h a t e a n t i p o r t e r o f E s c h e r i c h i a c o l i ,f u n c t i o n s a s a m o n o m e r . J . B i o l . C h e m . 2 6 5 : 1 2 2 8 7 - 1 2 2 9 2 .2 . A r n d t , K . T . , C . S t y l e s , a n d G . R . F i n k . 1 9 8 7 . M u l t i p l e g l o b a lr e g u l a t o r s c o n t r o l HIS4 t r a n s c r i p t i o n i n y e a s t . S c i e n c e 2 3 7 : 8 7 4 -8 8 0 .3 . B r au s, G . , H . - U . M o s c h , K . V o g e l , A . H i n n e n , a n d R . H u t t e r .1 9 8 9 . I n t e r p a t h w a y r e g u l a t i o n o f t h e TRP4 g e n e o f y e a s t .EMBO J . 8 : 9 3 9 - 9 4 5 .4 . C a s a d a b a n , M. J . , A . M a r t i n e z - A r i a s , S . K . S h a p i r a , a n d J .a I n u n i t s p e r m i l l i g r a m o f p r o t e i n + s t a n d a r d d e v i a t i o n . V a l u e s a r e m e a n sf o r t r i p l i c a t e d e t e r m i n a t i o n s .b U n f r a c t i o n a t e d c e l l e x t r a c t .



10/11

PHOSPHATE TRANSPORTER IN YE AST C E L L S 3 2 3 7C h o u . 1 9 8 3 . P - G a l a c t o s i d a s e g e n e f u s i o n s f o r a n a l y z i n g g e n ee x p r e s s i o n i n E s c h e r i c h i a c o l i a n d y e a s t . M e t h o d s E nz y m o l .1 0 0 : 2 9 3 - 3 0 8 .5 . C e l e n z a , J . L . , L . M a r s h a l l - C a r l s o n , a n d M. C a r l s o n . 1 9 8 8 . T h ey e a s t SNF3 g e n e e n c o d e s a g l u c o s e t r a n s p o r t e r h o m o l o g o u s t ot h e m a m m a l i a n p r o t e i n . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U SA 8 5 : 2 1 3 0 -2 1 3 4 .6 . C h e n g , Q . , a n d C . A . M i c h e l s . 1 9 8 9 . T h e m a l t o s e p e r m e a s ee n c o d e d b y t h e MAL61 g e n e o f S a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a ee x h i b i t s b o t h s e q u e n c e a n d s t r u c t u r a l h o m o l o g y t o o t h e r s u g a rt r a n s p o r t e r s . G e n e t i c s 1 2 3 : 4 7 7 - 4 8 4 .7 . C l a r k e , L . , a n d J . C a r b o n . 1 9 7 8 . F u nc t i o n a l e x pr e ss i o n o fc l o n e d y e a s t DNA i n E s c h e r i c h i a c o l i : s p e c i f i c c o m p l e m e n t a -t i o n o f a r g i n i n o s u c c i n a t e l y a s e ( a r g H ) m u t a t i o n s . J . M o l . B i o l .1 2 0 : 5 1 7 - 5 3 2 .8 . E i s e n b e r g , D . 1 9 8 4 . T h r e e - d i m e n s i o n a l s t r u c t u r e o f m e m b r a n ea n d s u r f a c e p r o t e i n s . A n n u . R e v . B i o c h e m . 5 3 : 5 9 5 - 6 2 3 .9 . F e r r e i r a , G . C . , R . D . P r a t t , a n d P . L . P e d e r s e n . 1 9 8 9 . E n e r g y -l i n k e d a n i o n t r a n s p o r t : c l o n i n g , s e q u e n c i n g , a n d c h a r a c t e r i z a -t i o n o f a f u l l l e n g t h cDNA e n c o d i n g t h e r a t l i v e r m i t o c h o n d r i a lp r o t e i n / p h o s p h a t e s y m p o r t e r . J . B i o l . C h e m . 2 6 4 : 1 5 6 2 8 - 1 5 6 3 3 .1 0 . G a l i w i t z , D . , a n d I . S u r e s . 1 9 8 0 . S t r u c t u r e o f a s p l i t y e a s t g e n e :c o m p l e t e n u c l e o t i d e s e q u e n c e o f t h e a c t i n g e n e i n S a c c h a r o m y -c e s c e r e v i s i a e . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U SA 7 7 : 2 5 4 6 - 2 5 5 0 .1 1 . G o u l d , G . W . , a nd G . I . B e l l . 1 9 9 0 . F a c i l i t a t i v e g l u c o s e t r a n s -p o r t e r s : a n e x p a n di n g f a m i l y . T r e n d s B i o c h e m . S c i . 1 5 : 1 8 - 2 3 .1 2 . H a r a s h i m a , S . , A . T a k a g i , a n d Y . O s h i m a . 1 9 8 4 . T r a n s f o r m a t i o no f p r o t o p l a s t e d y e a s t c e l l s i s d i r e c t l y a s s o c i a t e d w i t h c e l l f u s i o n .M o l . C e l l . B i o l . 4 : 7 7 1 - 7 7 8 .1 3 . H a y a s h i , N . , a n d Y . O s h i m a . 1 9 9 1 . S p e c i f i c c i s - a c t i n g s e q u e n c ef o r PH08 e x p r e s s i o n i n t e r a c t s w i t h PHO4 p r o t e i n , a p o s i t i v er e g u l a t o r y f a c t o r , i n S a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e . M o l . C e l l . B i o l .1 1 : 7 8 5 - 7 9 4 .1 4 . I t o , H . , Y . F u k u d a , K . M u r a t a , a n d A . K i m u r a . 1 9 8 3 . T r a n s f o r -m a t i o n o f i n t a c t y e a s t c e l l s t r e a t e d w i t h a l k a l i c a t i o n s . J .B a c t e r i o l . 1 5 3 : 1 6 3 - 1 6 8 .1 5 . K a n e k o , Y . , A . T o h - e , a n d Y . O s h i m a . 1 9 8 2 . I d e n t i f i c a t i o n o f t h eg e n e t i c l o c u s f o r t h e s t r u c t u r a l g e n e a n d a n e w r e g u l a t o r y g e n ef o r t h e s y n t h e s i s o f r e p r e s s i b l e a l k a l i n e p h o s p h a t a s e i n S a c c h a -r o m y c e s c e r e v i s i a e . M o l . C e l l . B i o l . 2 : 1 2 7 - 1 3 7 .1 6 . K r u c k e b e r g , A . L . , a n d L . F . B i s s o n . 1 9 9 0 . T h e HXT2 g e n e o fS a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e i s r e q u i r e d f o r h i g h - a f f i n i t y g l u c o s et r a n s p o r t . M o l . C e l l . B i o l . 1 0 : 5 9 0 3 - 5 9 1 3 .1 7 . K y t e , J . , a n d R . F . D o o l i t t l e . 1 9 8 2 . A s i m p l e m e t h o d f o rd i s p l a y i n g t h e h y d r o p a t h i c c h a r a c t e r o f a p r o t e i n . J . M o l . B i o l .1 5 7 : 1 0 5 - 1 3 2 .1 8 . L e h l e , L . , a n d E . B a u s e . 1 9 8 4 . P r i m a r y s t r u c t u r a l r e q u i r e m e n t sf o r N - a n d O - g l y c o s y l a t i o n o f y ea st m a n n o p r o t e i n s . B i o c h i m .B i o p h y s . A c t a 7 9 9 : 2 4 6 - 2 5 1 .1 9 . M a i d e n , M. C . J . , E . 0 . D a v i s , S . A . B a l d w i n , D . C . M . M o o r e ,a n d P . J . F . H e n d e r s o n . 1 9 8 7 . M a m m a l i a n a n d b a c t e r i a l s u g a rt r a n s p o r t p r o t e i n s a r e h o m o l o g o u s . N a t u r e ( L o n d o n ) 3 2 5 : 6 4 1 -6 4 3 .2 0 . M a n n , B . J . , B . J . B o w m a n , J . G r o t e l u e s c h e n , a n d R . L .M e t z e n b e r g . 1 9 8 9 . N u c l e o t i d e s e q u e n c e o f p h o 4 + , e n c o d i n g ap h o s p h a t e - r e p r e s s i b l e p h o s p h a t e p e r m e a s e o f N e u r o s p o r ac r a s s a . G e n e 8 3 : 2 8 1 - 2 8 9 .2 1 . M o r r i s o n , D . A . 1 9 7 7 . T r a n s f o r m a t i o n i n E s c h e r i c h i a c o l i :c r y o g e n i c p r e s e r v a t i o n o f c o m p e t e n t c e l l s . J . B a c t e r i o l . 1 3 2 :3 4 9 - 3 5 1 .2 2 . M o r t i m e r , R . K . , D . S c h i l d , C . R . C o n t o p o u l o u , a n d J . A . K a n s .1 9 8 9 . G e n e t i c m ap o f S a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e , e d i t i o n 1 0 .Y e a s t 5 : 3 2 1 - 4 0 3 .2 3 . M u e c k l e r , M . , C . C a r u s o , S . A . B a l d wi n , M. P a n i c o , I . B l e n c h ,H . R . M o r r i s , W. J . A l l a r d , G . E . L i e n h a r d , a n d H . F . L o d i s h .1 9 8 5 . S e q u e n c e a n d s t r u c t u r e o f a h u m a n g l u c o s e t r a n s p o r t e r .S c i e n c e 2 2 9 : 9 4 1 - 9 4 5 .2 4 . N i s h i w a k i , K . , N . H a y a s h i , S . I r i e , D . - H . C h u n g , S . H a r a s h i m a ,a n d Y . O s h i m a . 1 9 8 7 . S t r u c t u r e o f t h e y e a s t H I S 5 g e n e r e s p o n -s i v e t o g e n e r a l c o n t r o l o f a m i n o a c i d b i o s y n t h e s i s . M o l . G e n .G e n e t . 2 0 8 : 1 5 9 - 1 6 7 .2 5 . O g a w a , N . , a n d Y . O s h i m a . 1 9 9 0 . F u n c t i o n a l d o m a i n s o f ap o s i t i v e r e g u l a t o r y p r o t e i n , P H O 4 , f o r t r a n s c r i p t i o n a l c o n t r o l o f

t h e p h o s p h a t a s e r e g u l o n i n S a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e . M o l .C e l l . B i o l . 1 0 : 2 2 2 4 - 2 2 3 6 .2 6 . O r r - W e a v e r , T . L . , J . W. S z o s t a k , a n d R . J . R o t h s t e i n . 1 9 8 1 .Y e a s t t r a n s f o r m a t i o n : a m o d e l s y s t e m f o r t h e s t u d y o f r e c o m -b i n a t i o n . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U SA 7 8 : 6 3 5 4 - 6 3 5 8 .2 7 . O s h i m a , Y . 1 9 8 2 . R e g u l a t o r y c i r c u i t s f o r g e n e e x p r e s s i o n : t h em e t a b o l i s m o f g a l a c t o s e a n d o f p h o s p h a t e , p . 1 5 9 - 1 8 0 . I n J . N .S t r a t h e r n , E . W. J o n e s , a n d J . R . B r o a c h ( e d . ) , T h e m o l e c u l a rb io l o g y o f t h e y e a s t S a c c h a r o m y c e s : m e t a b o l i s m a n d g e n ee x p r e s s i o n . C o l d S p r i n g H a r b o r L a b o r a t o r y , C o l d S p r i n g H a r -b o r , N . Y .2 8 . P a r e n t , S . A . , C . M. F e n i m o r e , a n d K . A . B o s t i a n . 1 9 8 5 . V e c t o rs y s t e m s f o r t h e e x p r e s s i o n , a n a l y s i s a n d c l o n i n g o f DNAs e q u e n c e s i n S . c e r e v i s i a e . Y e a s t 1 : 8 3 - 1 3 8 .2 9 . P h i l i p p s e n , P . , M. T h o m a s , R . A . K r a m e r , a n d R . W. D a v i s .1 9 7 8 . U n i q u e a r r a n g e m e n t o f c o d i n g s e q u e n c e s f o r S S , 5 . 8 S , 1 8 Sa n d 2 5 S r i b o s o m a l RNA i n S a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e a s d e t e r -m i n e d b y R - l o o p a n d h y b r i d i z a t i o n a n a l y s i s . J . M o l . B i o l .1 2 3 : 3 8 7 - 4 0 4 .3 0 . R o s e , M. D . , P . N o v i c k , J . H . T h o m a s , D . B o t s t e i n , a n d G . R .F i n k . 1 9 8 7 . A S a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e g e n o m i c p l a s m i d b a n kb a s ed o n a c e n t r o m e r e - c o n t a i n i n g s h u t t l e v e c t o r . Gene 6 0 : 2 3 7 -2 4 3 .3 1 . R o t h s t e i n , R . J . 1 9 8 3 . O n e - s t e p g e n e d i s r u p t i o n i n y e a s t . M e t h -o d s E n z y m o l . 1 0 1 : 2 0 2 - 2 1 1 .

3 2 . S c h a t z , P . J . , L . P i l l u s , P . G r i s a f i , F . S o l o m o n , a n d D . B o t s t e i n .1 9 8 6 . Tw o f u n c t i o n a l a - t u b u l i n g e n e s o f t he y e as t S a c c h a r o m y -c e s c e r e v i s i a e e n c o d e d i v e r g e n t p r o t e i n s . M o l . C e l l . B i o l .6 : 3 7 1 1 - 3 7 2 1 .3 3 . S c h a t z , P . J . , F . S o l o m o n , a n d D . B o t s t e i n . 1 9 8 6 . G e n e t i c a l l ye s s e n t i a l a n d n o n e s s e n t i a l a - t u b u l i n g e n e s s p e c i f y f u n c t i o n a l l yi n t e r c h a n g e a b l e p r o t e i n s . M o l . C e l l . B i o l . 6 : 3 7 2 2 - 3 7 3 3 .3 4 . S h e r m a n , F . , G . R . F i n k , a n d J . B . H ic ks . 1 9 8 6 . M e t h o d s i ny e a s t g e n e t i c s . C o l d S p r i n g H a r b o r L a b o r a t o r y , C o l d S p r i n gH a r b o r , N . Y .3 5 . S z ku t ni c ka , K . , J . F . T s c h o p p , L . A n dr e ws , a n d V . P . C i r i l l o .1 9 8 9 . S e q u e n c e a n d s t r u c t u r e o f t h e y e a s t g a l a c t o s e t r a n s p o r t e r .J . B a c t e r i o l . 1 7 1 : 4 4 8 6 - 4 4 9 3 .3 6 . T a m a i , Y . , A . T o h - e , a n d Y . O s h i m a . 1 9 8 5 . R e g u l a t i o n o fi n o r g a n i c p h o s p h a t e t r a n s p o r t s y s t e m s i n S a c c h a r o m y c e s c e r e -v i s i a e . J . B a c t e r i o l . 1 6 4 : 9 6 4 - 9 6 8 .3 7 . T i ce - Ba l d wi n , K . , G . R . F i n k , a n d K . T . A r n d t . 1 9 8 9 . BAS1 h a sa M y b m o t i f a n d a c t i v a t e s HIS4 t r a n s c r i p t i o n o n l y i n c o m b i n a -t i o n w i t h B A S 2 . S c i e n c e 2 4 6 : 9 3 1 - 9 3 5 .3 8 . T o h - e , A . , a n d Y . O s h i m a . 1 9 7 4 . C h a r a c t e r i z a t i o n o f a d o m i n a n t ,c o n s t i t u t i v e m u t a t i o n , PHO O , f o r t h e r e p r e s s i b l e a c i d p h o s -p h a t a s e s y n t h e s i s i n S a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e . J . B a c t e r i o l .1 2 0 : 6 0 8 - 6 1 7 .3 9 . T o h - e , A . , a n d T . S h i m a u c h i . 1 9 8 6 . C l o n i n g a n d s e q u e n c i n g o ft h e PHO80 g e n e a n d CEN15 o f S a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e .Y e a s t 2 : 1 2 9 - 1 3 9 .4 0 . T s c h o p p , J . F . , S . D . E m r , C . F i e l d , a n d R . S c h e k m a n . 1 9 8 6 .GAL2 c o d e s f o r a m e m b r a n e - b o u n d s u b u n i t o f t h e g a l a c t o s ep e r m e a s e i n S a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e . J . B a c t e r i o l . 1 6 6 : 3 1 3 -3 1 8 .4 1 . U e d a , Y . , a n d Y . O s h i m a . 1 9 7 5 . A c o n s t i t u t i v e m u t a t i o n , p h o T ,o f t h e r e p r e s s i b l e a c i d p h o s p h a t a s e s y n t h e s i s w i t h i n a b i l i t y t ot r a n s p o r t i n o r g a n i c p h o s p h a t e i n S a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e .M o l . G e n . G e n e t . 1 3 6 : 2 5 5 - 2 5 9 .

4 2 . U e d a , Y . , A . T o h - e , a n d Y . O s h i m a . 1 9 7 5 . I s o l a t i o n a n d c h a r a c -t e r i z a t i o n o f r e c e s s i v e , c o n s t i t u t i v e m u t a t i o n s f o r r e p r e s s i b l ea c i d p h o s p h a t a s e s y n t h e s i s i n S a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e . J .B a c t e r i o l . 1 2 2 : 9 1 1 - 9 2 2 .4 3 . V i e i r a , J . , a n d J . M e s s i n g . 1 9 8 7 . P r o d u c t i o n o f s i n g l e - s t r a n d e dp l a s m i d DNA. M e t h o d s E n z y m o l . 1 5 3 : 3 - 1 1 .4 4 . V o ge l, K ., W. H o r z , a n d A . H i n n e n . 1 9 8 9 . T h e t w o p o s i t i v e l ya c t i n g r e g u l a t o r y p r o t e i n s PHO2 a n d PHO4 p h y s i c a l l y i n t e r a c tw i t h PH05 u p s t r e a m a c t i v a t i o n r e g i o n s . M o l . C e l l . B i o l .9 : 2 0 5 0 - 2 0 5 7 .4 5 . W a l m s l e y , A . R . 1 9 8 8 . T h e d y n a m i c s o f t h e g l u c o s e t r a n s p o r t e r .T r e n d s B i o c h e m . S c i . 1 3 : 2 2 6 - 2 3 1 .4 6 . W i c k n e r , R . B . 1 9 8 7 . M K T J , a n o n e s s e n t i a l S a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e g e n e w i t h a t e m p e r a t u r e - d e p e n d e n t e f f e c t o n r e p l i c a -

V O L . 1 l , 1 9 9 1


11/11

3 2 3 8 BUN-YA E T A L . MOL. C E L L . B I O L .t i o n o f M2 d o u b l e - s t r a n d e d RNA. J . B a c t e r i o l . 1 6 9 : 4 9 4 1 - 4 9 4 5 .4 7 . Y a n i s c h - P e r r o n , C . , J . V i e i r a , a n d J . M e s s i n g . 1 9 8 5 . I m p r o v e dM13 p h a g

mol. cell. biol.-1991-bun-ya-3229-38

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