modul praktikum mikrobiologi pertanian€¦ · modul praktikum ini masih jauh dari sempurna, oleh...

MODUL PRAKTIKUM

MIKROBIOLOGI PERTANIAN

Oleh:

I WAYAN DANA ATMAJA

KONSENTRASI TANAH DAN LINGKUNGAN

PS. AGROEKOTEKNOLOGI

FAKULTAS PERTANIAN

UNIVERSITAS UDAYANA

DENPASAR

2016

KATA PENGANTAR

Modul Praktikum Mikrobiologi Pertanian ini dimaksudkan sebagai pedoman kerja

mahasiswa dalam melakukan praktikum khususnya praktikum di labolatorium.Dalam upaya

meningkatkan keterampilan mahasiswa diperlukan adanya sistem kerja yang sistematis. Oleh

karena itu sebelum praktikum mahasiswa sebaiknya memahami terlebih dahulu langkah-

langkah kerja seperti yang disajikan pada Modul praktikum ini.

Dalam praktikum ini diharapkan mahasiswa dapat menyeterilkan alat-alat praktikum

dan media tumbuh beberapa mikroorganisme dalam tanah yang berperan dalam

meningkatkan produktivitas tanah, serta dapat memperbanyaknya di labolatorium.

Modul praktikum ini masih jauh dari sempurna, oleh karena itu saran dan kritik sangat

diharapkan. Akhirnya semoga penuntun praktikum ini ada manfaatnya.

Denpasar, September 2016

Penyusun

DAFTAR ISI

KATA PENGANTAR

DAFTAR ISI

I. PEMBUATAN DAN STERILISASI BEBERAPA

MEDIA MIKROBIOLOGI 1

II. SAMPLING DAN PENGHITUNGAN

MAKROORGANISME TANAH 7

III. PENGAMATAN BINTIL AKAR 12

IV.PENYIAPAN MEDIA TANAM PASIR DAN BIBIT 15

V.UJI INFEKTIVITAS DAN KESESUAIAN INANG INOKULAN

RHIZOBIUM SERTA PENGAMATAN BINTIL AKAR EFEKTIF

YANG TERBENTUK PADA TANAMAN LEGUM 17

VI.RESPON RESPIRASI TANAH TERHADAP APLIKASI PESTISIDA 19

I.PEMBUATAN DAN STERILISASI BEBERAPA

MEDIA MIKROBIOLOGI

1.1. Kompetensi Dasar

Mahasiswa mampu membuat dan mensterilkan media mikrobiologi yang diperlukan.

1.2. Pendahuluan

Dalam proses isolasi beberpa organisme tanah yang berukuran mikro dan meso

diperlukan media media tumbuh dan larutan pengenceran yang steril atau terbebas dari mikro

dan meso organisme. Walaupun mikroorganisme umumnya dapat ditumbuhkan dalam

beragam komposisi media, namun setiap jenis mikro dan meso organisme terutama dari

golongan fungsional tertentu akan memerlukan media selektif. Beberapa contoh media

selektif adalah media Pikovskaya untuk mikroba pelarut P, mikroba tanpa nitrogen untuk

mikroba penambat N, media Carboxy Methyl Cellullose untuk mikroba perombak selulose,

media agar nutrisi untuk bakteri umum, dan media agar martin untuk jamur.

Preparasi masing-masing media memerlukan komposisi yang berbeda tetapi harus

disterilkan. Sterilisasi adalah proses pembebasan suatu alat atau bahan dari mahluk hidup.

Metode sterilisasi yang umumnya dilakukan untuk media mikrobiologi adalah dengan

sterilisasi basah dalam autoklav dengan suhu 121oC selama 10 – 15 menit. Dalam proses

tersebut, mikro dan meso organisme yang terdapat di dalam media atau bahan dimatikan

dengan suhu 121oC dan tekanan 15 psi. Beberapa bahan yang tidak tahan panas seperti

antibiotik tertentu dapat disterilkan dengan metode filtrasi membran dengan ukuran pori

membran sebesar 0,45 – 0,22 µm. Dalam proses filtrasi, media atau bahan disaring dengan

membran berukuran pori di atas sehingga terbebas dari mikro dan meso organisme.

1.3. Alat dan Bahan

Alat-alat yang diperlukan adalah autoklav, kompor, neraca, gelas beaker, botol media

atau erlenmeyer, sumbat kapas, kertas aluminium, serta sendok dan kertas timbang. Bahan-

bahan yang diperlukan adalah media dengan komposisi sesuai dengan kebutuhan

mikroorganisme yang akan diisolasi. Beberapa contoh komposisi media selektif dalam

volume 1 liter adalah sebagai berikut:

1. Media agar nutrisi untuk bakteri :

Nutrient Agar : 23 gram

2. Media Agar Martin untuk Jamur :

K2HPO4 : 1 gram

MgSO4. 7H2O : 0,05 gram

Pepton : 5,0 gram

Dekstrosa : 10 gram

Agar : 20 gram

Rose Bengal : 0,035 gram

Larutan Streptomisin (300mg/100 ml air) : 10 ml

3. Media seleksi Mikroba Pelarut Fosfat (Pikovskaya)

Glukosa : 10 gram

NaCl : 0,2 gram

KCl : 0,2 gram

MgSO4. 7H2O : 2,5 gram

Mn SO4. 7H2O : 0,2 gram

FeSO4. 7H2O : 2,5 gram

Ca5(PO4)3 O4 : 5 gram

(NH4)3O4 : 0,5 gram

Agar : 15 gram

Aquadest : 1000 ml

pH : 6.8

Larutan yang umumnya digunakan untuk proses pengenceran adalah larutan fisiologis dengan

komposisi 0,85 % NaCl. Masing-masing media dilarutkan dalam akuadest atau akuabidest

untuk jenis media tertentu.

1.4. Tahapan Praktikum

Pelaksanaan praktikum diawali dengan penyiapan alat-alat yang diperlukan. Setiap

media atau larutan yang dibuat memerlukan wadah dalam bentuk gelas beaker atau

erlenmeyer atau botol penyimpan media tersendiri sehingga tidak tercampur dengan media

atau larutan lainnya. Setelah semua alat dan bahan tersedia, maka bahan-bahan ditimbang

sesuai dengan komposisi masing-masing media di atas :

1. Media agar nutrisi :

- Timbang 23 g Nutrient Agar dan larutkan dengan1 liter akuades dalam botol

media.

- Tutup setengah rapat botol media dan selubungi bagian luar tutup dan leher botol

dengan kertas aluminium dan media siap untuk diautoklaf.

2. Media Martin Agar :

- Timbang masing-masing bahan yang diperlukan (kecuali streptomisin), tempatkan

di dalam botol media kemudian larutkan dalam 1 liter akuadest.

- Tutup setengah rapat botol media dan selubungi bagian luar botol dengan kertas

aluminum. Media ini siap diautoklaf dengan menutup botol media .

- Larutkan 300 mg Streptomisin dalam 100 ml akuadest dan saring dengan

membran berukuran pori 0,45µ. Tempatkan hasil saringan dalam botol steril.

- Campurkan larutan streptomisin ke dalam media steril yang hangat.

3. Media Pikovskaya :

- Timbang masing-masing bahan yang diperlukan kecuali agar, larutkan dengan 900

ml akuadest dan aduk merata dalam botol media. Atur pH media menjadi 7

dengan menambahkan larutan HCl 0,1 N atau KOH 0,1 N.

- Tambahkan tambahkan akuadest sampai mencapai total volume 1 liter.

- Tutup setengah rapat botol media dan bungkus bagian luar tutupnya dengan kertas

aluminium. Media siap untuk diautoklaf.

4. Larutan fisiologis :

- Timbang 8,5 g NaCl dan larutkan dalam 1 liter akuadest. Pipet masing-masing 9

ml larutan tersebut ke dalam tabung reaksi atau tuangkan 90 ml ke dalam

erlenmeyer 250 ml. Jumlah larutan fisiologis dalam tabung dan erlenmeyer

tergantung kepada jumlah seri pengenceran dan sampel yang akan diencerkan.

- Tabung reaksi ditutup dengan sumbat kapas dan setiap 15 tabung reaksi

dimasukkan ke dalam kantong plastik berukuran 1 kg dan ikat bagian atas kantong

dengan kuat.

- Sumbat erlenmeyer dengan kapas dan tutupi dengan kertas aluminium.

- Larutan fisiologis dalam tabung reaksi dan erlenmeyer siap diautoklaf.

Sebelum diautoklaf, ambil masing-masing 10 ml sampel media dan tempatkan di

dalam petridish steril. Masing-masing bahan yang diautoklaf dan sampel yang tidak

diautoklaf disimpan dalam suhu ruang selama 1 minggu.

1.5. Data Pengamatan

Setelah waktu inkubasi selama 1 minggu, sampel media dan larutan fisiologis yang

diautoklaf dan tidak diautoklaf diamati. Perubahan yang terjadi pada media dicatat dalam

tabel berikut.

Data Pengamatan

No Media/Larutan Fisiologis

Jumlah koloni pada media

Diautoklaf Tidak diautoklaf

Bakteri Jamur Bakteri Jamur

1. Agar nutrisi

2. Agar Martin

3. Pikovskaya

4. Larutan Fisiologis

Pembahasan:

II.SAMPLING DAN PENGHITUNGAN

MAKROORGANISME TANAH


Mahasiswa mampu melakukan pengambilan sampel organisme tanah dan menghitung

keragaman organisme di dalam tanah

2.2. Pendahuluan

Organisme tanah adalah setiap jenis organisme dari yang berukuran mega sampai

dengan mikro yang sepanjang hidupnya atau sebagian besar waktu hidupnya berada di dalam

tanah. Beberapa jenis organisme yang dapat ditemukan di dalam tanah adalah ular tanah,

kelabang, kalajengking, cacing tanah, larva serangga, semut, bakteri, jamur, nematoda,

amoeba, dan lain-lain.

Setiap jenis atau taksa organisme tanah memiliki peranan penting di dalam ekosistem

tanah. Cacing tanah merupakan pembangun ekosistem tanah karena melalui aktivitas

fisiknya dapat membentuk lubang draenasi di dalam tanah dan melalui aktivitas biokimianya

mampu menyuburkan tanah dengan feses yang dihasilkan. Beberapa kelompok jamur dan

bakteri yang tergolong selulolitik mampu merombak bahan organik secara kimia. Jenis

cacing tanah, semut, dan rayap mampu mendegradasi serasah organik secara fisik. Jenis

bakteri tertentu misalnya rhizobium dan azospirillum dapat menambat N2 dari atmosfer,

sedangkan beberapa kelompok bakteri dan jamur mampu melarutkan P dan K di dalam tanah.

Organisme tanah umumnya hidup berkelompok. Jumlah jenis organisme tanah dalam

suatu tempat dan waktu di dalam tanah dinyatakan dengan istilah keragaman organisme

tanah. Keragaman organisme tanah yang tinggi umumnya menyebabkan kondisi ekosistem

tanah yang lebih baik. Penghitungan keragaman organisme tanah dapat dilakukan melalui

kegiatan survei dengan pengambilan sampel dari dalam monolit atau perangkap jebak.

2.3. Alat dan Bahan

Alat yang diperlukan meliputi gelas akua, empat batang lidi, sungkup plastik, pinset,

pipet tetes, cangkul, mistar, sekop, kantong atau stoples plastik, kertas label, dan alat-alat

tulis. Bahan-bahan yang diperlukan adalah alkohol 70% dan asam asetat 5 %.


Pengambilan sampel dengan perangkap jebak dilakukan untuk memperoleh

organisme yang berada di permukaan tanah yang dikerjakan dengan tahapan sebagai berikut :

1. Perangkap gelas akua diisi dengan larutan alkohol 70% dan ditambahkan larutan asam

asetat 5% sebanyak 1 tetes.

2. Perangkap dipasang di dalam tanah dengan bagian mulut gelas akua sejajar dengan

permukaan tanah.

3. Perangkap dibiarkan selama 7 hari kemudian sampel yang tertangkap dikumpulkan.

Sampling dengan monolith dilakukan untuk mengambil sampel organisme tanah yang

terdapat di dalam lapisan tanah melalui tahapan kerja berikut :

1. Monolith dibuat dengan ukuran 25 x 25 cm x 30 cm :

30

cm

Sampel

fauna

Sampel

tanah

2. Setiap monolith dibatasi dengan menancapkan empat tonggak kecil di setiap ujungnya

dengan jarak antar tonggak sebesar 25 cm. Bahan organik yang terdapat di permukaan

bidang monolith diangkat, dan makrofauna yang terdapat di dalamnya segera disortir.

3. Daerah di luar tonggak kemudian digali untuk membuat lubang dengan kedalaman 40

cm yang berjarak 40 cm dari sisi-sisi monolith.

4. Tanah dibagian terluar sisi monolith dengan tebal 5 cm kemudian diambil untuk

isolasi mikroorganisme dengan jumlah sekitar 0,5 kg.

5. Tanah sampel kemudian dikemas di dalam polybag berlabel dan dibawa ke

laboratorium.

6. Fauna yang terdapat di dalam serasah dan monolith diambil dengan teknik sortasi

(hand sorting) atau di ayak dengan ayakan 5 mm.

7. Jenis dan jumlah fauna yang ditemukan dihitung dan dicatat dalam tabel pengamatan

2.5.Data pengamatan

No Jenis Fauna Jumlah

Di atas tanah

1 Cacing tanah

2 Kelabang

3 Kalajengking

4 Rayap

5 Ulat

6 Larva

7 Semut

8 Keong

9 Jengkerik

10 dll

Di dalam tanah tanah

1 Cacing tanah

2 Kelabang

3 Kalajengking

4 Rayap

5 Ulat

6 Larva

7 Semut

8 Keong

9 Jengkerik

10 dll

Untuk mengetahui indeks keanekaragaman digunakan rumus Shannon-Wienner (Magurran,

1988) :

H’ = -ΣPi ln Pi

Pi = ni/N

Keterangan :

H = indeks keanekaragaman

ni = jumlah suku yang didapat

N = jumlah total suku yang didapat

Pembahasan:

III.PENGAMATAN BINTIL AKAR


Mahasiswa mampu mengenali bintil akar dari beberapa jenis leguminose serta mampu

membedakan bintil akar efektif dan tidak efektif.

3.2. Pendahuluan

Tanaman leguminose selain memiliki nilai ekonomis juga memberikan layanan yang

baik terhadap ekosistem tanah melalui simbiosis mutualismenya dengan bakteri rhizobium.

Rhizobium dapat melakukan penambatan N2 atmosfer dari dalam struktur bakteroid yang

terbentuk di dalam bintil akar tanaman leguminose. Tanaman legum yang terinfeksi oleh

bakteri rhizobium dicirikan oleh adanya bintil akar. Bentuk dan sebaran bintil akar dalam

sistem perakaran tanaman berbeda antar jenis tanaman legum. Tidak semua bintil akar

mampu secara efektif menambat N2. Bintil akar efektif umumnya berada di bagian akar

utama dan memiliki warna merah gelap atau pink dibagian dalam.

Kedelai Kacang panjang Kacang tanah

Gambar 3.1. Bentuk dan Sebaran Bintil Akar

Gambar 3.2. Contoh Bintil Akar Efektif dan Tidak Efektif

3.3. Alat dan Bahan

Alat-alat yang diperlukan dalam praktikum ini adalah silet, mistar, petridish dan alat-

alat tulis. Bahan yang diperlukan adalah akar tanaman legum yang berumur lebih dari 6

minggu.

Bintil Efektif

Bintil Tidak Efektif


1. Akar tanaman legum dicuci bersih

2. Potong dan hitung jumlah bintil akar dibagian akar utama dan pisahkan dengan bintil

akar yang tumbuh dari cabang akar

3. Belah masing-masing bintil akar dan amati warna di bagian dalamnya

4. Jumlah bintil akar efektif dari akar utama dan akar cabang dihitung dan dicatat terpisah


No Jenis Legum

Bintil dari akar utama Bintil dari cabang akar

Jumlah Ukuran Jumlah

efektif Jumlah Ukuran

Jumlah

efektif

1 Kacang tanah

2 Kacang panjang

3 Kedelai

Pembahasan:

IV.PENYIAPAN MEDIA TANAM PASIR DAN BIBIT


Mahasiswa mampu menyiapkan media tanam pasir dan bibit tanaman legum untuk

penelitian skala rumah kaca

4.2. Pendahuluan

Penelitian mikrobiologi tanah yang berhubungan dengan pertumbuhan tanaman

biasanya memerlukan media tanam dan bibit tanaman yang steril. Sterilisasi media tanam

dapat dilakukan dengan autoklaf, radiasi atau fumigasi, sedangkan sterilisasi benih umumnya

dilakukan secara kimiawi dengan menggunakan larutan alkohol, hipokhlorit, atau hidrogen

peroksida.

Untuk penelitian inokulasi rhizobium menggunakan tanah yang belum pernah

ditanami dengan tanaman legum, tidak diperlukan sterilisasi tanah. Inokulasi tanaman legum

dengan rhizobium untuk melihat potensi infektivitas, efektivitas dan kesesuaian inang dapat

dilakukan dengan menggunakan media tanam campuran pasir dan tanah.

4.3. Alat dan Bahan

Alat-alat yang diperlukan adalah pot plastik, bak plastik, dan alat-alat tulis. Bahan

yang akan digunakan adalah pasir sungai, tanah tegalan, dan bibit tanaman kacang-kacangan

(kedelai, kacang panjang dan kacang tanah).


Penyiapan media tanam :

1. Campur tanah pasir dengan tanah tegalan dan kompos dengan perbandingan 1: 2: 1

2. Siram campuran media tanam dengan air secukupnya dan inkubasikan selama 1

minggu

3. Masukan media tanam ke dalam polybag dengan volume 2 kg

Penyiapan bibit legum :

1. Cuci bersih benih dengan air keran.

2. Sterilisasi benih dengan mencelupkan selama 1 menit ke dalam etanol 70 %.

dilanjutkan dengan perendaman selama 3 menit dalam hidrogen peroksida 4 %.

3. Cuci bersih benih steril secara aseptik dengan air steril.

4. Semaikan benih di atas kertas tisue basah dalam cawan petri.


No Tanaman Jumlah benih tumbuh Jumlah benih tidak tumbuh

1 Kacang tanah

2 Kacang panjang

3 Kedelai

Pembahasan:

V.UJI INFEKTIVITAS DAN KESESUAIAN INANG

INOKULAN RHIZOBIUM SERTA PENGAMATAN

BINTIL AKAR EFEKTIF YANG TERBENTUK

PADA TANAMAN LEGUM


Mahasiswa mampu melakukan inokulasi rhizobium pada bibit tanaman kacang-kacangan,

menilai infektivitas dan kesesuaian inang inokulan rhizobium serta menghitung jumlah bintil

akar efektif dan tidak efektif yang terbentuk

5.2. Pendahuluan

Simbiosis mutualisme antara tanaman legum dengan rhizobium telah dikenal luas

sejak beberapa abad yang lalu. Terdapat beberapa genus dan spesies bakteri rhizobium yang

mampu menginfeksi beragam jenis tanaman legum. Namun, masing-masing spesies

rhizobium memiliki spesifikasi jenis inang yang paling disukai untuk proses simbiosis,

misalnya Rhizobium leguminosarum lebih sesuai untuk lentil dan buncis, R. Galegae sesuai

untuk gamal, Sinorhizobium fredii sesuai untuk kedelai, dan Azorhizobium caulinodans

sesuai untuk kaliandra.

5.3. Alat dan Bahan

Alat-alat yang diperlukan adalah gelas beaker, batang pengaduk kaca, polibag, dan

alat-alat tulis. Bahan-bahan yang diperlukan adalah media tanam, bibit tanaman legum, bintil

akar steril sebagai sumber inokulan dan air untuk menyiram tanaman.


1. Penyiapan inokulan :

- Sterilkan bintil akar dari kacang panjang, kedelai dan kacang tanah secara terpisah

dengan cara yang sama dengan sterilisasi benih dalam bab IX.

- Hancurkan masing-masing jenis bintil akar dengan mortar porselin.

- Larutkan masing-masing hancuran bintil akar dalam 50 ml akuadest steril.

1. Inokulasi bibit tanaman kacang-kacangan dengan inokulan rhizobium :

- Rendam akar masing-masing bibit tanaman kacang-kacangan di dalam salah satu

larutan bintil akar (inokulasi vertikal dan inokulasi silang) selama 10 menit.

- Tanam masing-masing bibit dalam media tanam secara terpisah dan pelihara selama 6

minggu.


No Tanaman Sumber inokulan

Jumlah bintil akar

Akar

utama

Cabang

akar

Total Efektif

Tidak

efektif

1 Kacang tanah

Kacang tanah

Kacang panjang

Kedelai

2 Kacang

panjang

Kacang tanah

Kacang panjang

Kedelai

3 Kedelai

Kacang tanah

Kacang panjang

Kedelai

Keterangan :

Infektif : inokulan mampu membentuk bintil akar

Inang sesuai : terbentuk bintil akar yang efektif

Inang tidak sesuai : tidak terbentuk bintil akar atau tidak terbentuk bintil akar efektif

Bintil akar efektif : bagian dalam berwarna merah atau pink

Pembahasan:

VI.RESPON RESPIRASI TANAH TERHADAP

APLIKASI PESTISIDA


Mahasiswa dapat menilai perubahan intensitas respirasi tanah akibat perlakuan

pestisda di dalam tanah.

6.2. Pendahuluan

Organisme hidup memerlukan suplai energi tetap selama hidupnya. Mikroorganisme tanah

yang sebagian besar tergolong heterotrof menggunakan bahan organik tanah sebagai sumber

energinya. Melalui proses respirasi, bahan organik dioksidasi dengan menghasilkan sejumlah

energi dan 40 % bahan organik diubah menjadi CO2. Dengan demikian, respirasi adalah

parameter biologi yang sangat sensitif menggambarkan aktivitas mikroba di dalam tanah.

Respon respirasi tanah sangat berbeda terhadap perubahan lingkungan sehingga sering

digunakan sebagai parameter dalam penelitian dampak negatif bahan kimia dan pestisida

terhadap lingkungan tanah.

6.3. Alat dan Bahan

Alat-alat yang diperlukan adalah stoples plastik, botol film, buret, pipet tetes, dan alat-

alat tulis. Bahan-bahan yang digunakan adalah tanah kapasitas lapang, insektisida (lindane

dan karbofuran), akuadest, KOH 0,01 N dan HCl 0,1 N.


Persiapan inkubasi :

1. Siapkan kontrol perlakuan dengan meletakan botol film berisi 10 ml air di dalam stoples

plastik pertama.

2. Timbang 100 g tanah kapasitas lapang dan tempatkan di dalam stoples plastik kedua dan

letakkan botol film berisi 10 ml air di sampingnya.

3. Timbang lindane sesuai dosis anjuran kemudian aduk dalam 100 g tanah kapasitas

lapang di dalam stoples ketiga, dan letakkan botol film berisi 10 ml air di sampingnya.

4. Timbang karbofuran sesuai dosis anjuran kemudian aduk dalam 100 g tanah kapasitas

lapang di dalam stoples keempat, dan letakkan botol film berisi 10 ml air di sampingnya.

5. Timbang masing-masing ½ lindane dan karbofuran kemudian aduk dalam 100 g tanah

kapasitas lapang di dalam stoples kelima, dan letakkan botol film berisi 10 ml air di

sampingnya.

6. Tutup rapat dan inkubasi semua stoples tersebut di tempat gelap selama 1 hari

7. Letakkan botol film berisi 5 ml KOH 0,01 N di setiap stoples pada hari berikutnya.

8. Inkubasi stoples dalam ruang gelap selama 6 hari dan lakukan pengukuran kadar CO2

dan larutan KOH.

Pengukuran respirasi :

1. Ambil setiap botol film yang berisi KOH dari stoples dan tambahkan 1 tetes larutan

phenolpthalein sehingga terjadi perubahan warna menjadi merah muda.

2. Titrasi masing-masing sampel dengan HCl 0,1 N sampai warna merah muda berubah

menjadi bening.

3. Tambahkan 1 tetes metil orange pada setiap sampel sehingga terjadi perubahan warna

menjadi orange.

4. Titrasi kembali dengan HCl 0,1 N sehingga terjadi perubahan warna menjadi pink yang

dimulai dari kontrol dan diikuti dengan sampel perlakuan pestisida.

5. Hitung respirasi tanah dengan rumus berikut :

(ml HCl blanko – ml HCl sampel)

mgC-CO2/g/6 hari = x 1,1

berat kering mutlak tanah


No Perlakuan Respirasi mgC-CO2/g/6 hari

1 Kontrol

2 Tanah tanpa pestisida

3 Tanah dengan lindane

4 Tanah dengan karbofuran

Pembahasan:

modul praktikum mikrobiologi pertanian€¦ · modul praktikum ini masih jauh dari sempurna, oleh...

Documents