modu micro ambien -07.2013

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UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA – UNAD

Escuela de Ciencias Agrícolas, Pecuarias y del Medio Ambiente

Microbiología Ambiental

UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA – UNAD ESCUELA DE CIENCIAS AGRÍCOLAS, PECUARIAS Y DEL MEDI O

AMBIENTE

358010 - MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL

DIANA GARCÍA VARGAS. PhD. Plant physiology. (Directora Nacional)

RUTH ESPERANZA LÓPEZ MEDINA

(Acreditadora)

BOGOTA

2013

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ÍNDICE DE CONTENIDO

Pág. ASPECTOS DE PROPIEDAD INTELECTUAL Y VERSIONAMIENTO 8 INTRODUCCIÓN 9 UNIDAD 1. PRINCIPIOS DE LA MICROBIOLOGÍA Y METABOLISMO MICROBIANO 10 CAPÍTULO 1. MUNDO MICROBIANO 11 Lección 1. Etapas históricas de la microbiología 11 Lección 2. Microbiología 12 Lección 3. Microorganismos como células 14 Lección 4. Importancia de los microorganismos para el hombre 14 Lección 5. Los microorganismos y sus ambientes naturales 16 CAPÍTULO 2. PERSPECTIVA GENERAL DE LA VIDA MICROBIANA 16 Lección 6. Estructura celular en procariotas 16 Lección 7. Estructura celular en eucariotas 23 Lección 8. Estructura vírica 27 Lección 9. Morfología de bacterias 30 Lección 10. Microscopía óptica y electrónica 31 CAPÍTULO 3. METABOLISMO MICROBIANO 35 Lección 11. Reacciones metabólicas y conservación de la energía 35 Lección 12. Glucólisis 37 Lección 13. Ciclo del acido cítrico 40 Lección 14. Fotosíntesis en microorganismos 43 Lección 15. Alternativas catabólicas 46 UNIDAD 2. DIVERSIDAD MICROBIANA 47 CAPÍTULO 4. CRECIMIENTO MICROBIANO 48 Lección 16. Crecimiento celular y fisión binaria 48 Lección 17. Curva de crecimiento 50 Lección 18. Medidas directas del crecimiento microbiano 52 Lección 19. Factores físicos en el crecimiento microbiano 54 Lección 20. Oxígeno y el crecimiento microbiano 56 CAPÍTULO 5. EUCARIOTA Y PROCARIOTA 58

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Lección 21. Archeas 58 Lección 22. Hongos 62 Lección 23. Hongos mucosos 66 Lección 24. Protozoos 67 Lección 25. Algas 71 CAPÍTULO 6. SISTEMA DE VIDA ANAEROBIO 74 Lección 26. Respiración Anaerobia 74 Lección 27. Reducción del nitrato y proceso de desnitrificación 75 Lección 28. Reducción de sulfatos 77 Lección 29. Metanogénesis 79 Lección 30. Acetanogénesis 82 UNIDAD 3. ECOLOGÍA Y MICROBIOLOGÍA 84 CAPÍTULO 7. MÉTODOS PARA ESTUDIAR MICROORGANISMOS 85 Lección 31. Análisis de las comunidades microbianas basado en técnicas de cultivo 85 Lección 32. Aislamiento de cultivo axénico 88 Lección 33. Análisis molecular de las comunidades microbianas 90 Lección 34. Técnicas moleculares usadas en la microbiología y biotecnología 93 Lección 35. Medición de la actividad microbiana en la naturaleza 97 CAPÍTULO 8. RELACIONES MICROBIANAS, COMUNICACIÓN CELULAR Y CICLO DE NUTRIENTES 98 Lección 36. Ecosistemas microbianos 98 Lección 37. Comunicación celular 101 Lección 38. Ciclo del carbono y del oxígeno 104 Lección 39. Ciclo del nitrógeno 106 Lección 40. Ciclo del azufre 109 CAPÍTULO 9. APLICACIONES DE LA MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL 111 Lección 41. Tratamiento de residuos sólidos 111 Lección 42. Tratamiento de agua potable 115 Lección 43. Biorremediación 118 Lección 44. Biodegradabilidad y efectos ecológicos 122 Lección 45. Biorremediación de petróleo y otros contaminantes 125 BIBLIOGRAFÍA 130

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ÍNDICE DE CUADROS Pág.

Cuadro 1. Comparación de virus y bacterias 59 Cuadro 2. Reacciones de oxido reducción para obtención de energía

por bacterias 36 Cuadro 3. Rendimiento energético por la oxidación una molécula de

glucosa 43 Cuadro 4. Comparación de fotosíntesis en células eucariotas y

procariotas 45 Cuadro 5. Comparación de características de filos de algas 72

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ÍNDICE DE FIGURAS Pág.

Figura 1. Estructuras celulares de una procariota 17 Figura 2. Estructura flagelar en bacterias 18 Figura 3. Pared celular bacteriana 19 Figura 4. Estructura celular eucariota 23 Figura 5. Estructura del retículo endoplasmático 25 Figura 6. Aparato de golgi 26 Figura 7. Tipos de virus 29 Figura 8. Morfología de células bacterianas 30 Figura 9. Microscopio óptico compuesto 32 Figura 10. Imágenes de Paramecium con microscopía óptica 33 Figura 11. Microscopios electrónicos 34 Figura 12. Microfotografía de Paramecium con microscopía electrónica 35 Figura 13. Oxidación global de la glucosa 38 Figura 14. Fermentación para la producción de etanol y lactato 38 Figura 15. Glucólisis 39 Figura 16. Ciclo de Krebs 41 Figura 17. Cadena transportadora de electrones 42 Figura 18. Fotofosforilación cíclica 44 Figura 19. Fotofosforilación no cíclica 45 Figura 20. Clasificación nutricional de organismos vivos 46 Figura 21. Fisión binaria 48 Figura 22. Curva de crecimiento microbiano 50 Figura 23. Método de recuento en placa de células viables 52 Figura 24. Método de diluciones seriadas para recuento en placa de colonias 54 Figura 25. Efecto de la temperatura en el crecimiento microbiano 55

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Figura 26. Efecto del oxígeno en el crecimiento microbiano 57 Figura 27. Dominio Archaea 59 Figura 28. Archaeas halófilas y metanógenos 60 Figura 29. Microfotografía de Thermoplasma acidophilum 61 Figura 30. Solfulobus archaea 61 Figura 31. Ejemplo de hongo filamentoso 62 Figura 32. Ejemplo de hongo levaduriforme 63 Figura 33. Ciclo de vida del moho del pan Rhizopus stolonifer 65 Figura 34. Ciclo de vida de Basidiomycota y Ascomycota 65 Figura 35. Ciclo de vida de Dictyostelium discoideum 66 Figura 36. Hongos mucilaginosos 67 Figura 37. Conjugación del protozoo Paramecium 69 Figura 38. Phylum del reino protista 70 Figura 39. Ejemplo de Ciliophora 69 Figura 40. Ejemplo de Phaeophyta 72 Figura 41. Ejemplos de Clorophyta y Rodophyta 73 Figura 42. Ejemplos de Bacillariophyta y Pyrrophyta 73 Figura 43. Ejemplos de respiración anaerobia 74 Figura 44. Posible transporte de electrones en Pseudomonas stutzeri durante la desnitrificación 76 Figura 45. Reducción del sulfato 77 Figura 46. Transporte de electrones en bacterias reductoras de sulfato 78 Figura 47. Proceso de metanogénesis a partir de dióxido de carbono 81 Figura 48. Producción de acetato a partir de la vía acetil coenzima A 82 Figura 49. Medio de enriquecimiento 87 Figura 50. Columna de Winogradsky 87 Figura 51. Método de siembra por estría o agotamiento 89 Figura 52. Pinzas láser 89 Figura 53. Tinciones fluorescentes de células 90 Figura 54. Tinción con anticuerpos fluorescentes y con FISH 91 Figura 55. Reacción en cadena de la polimerasa 94

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Figura 56. Electroforesis de proteínas y gel de corrido 96 Figura 57. Ejemplo de micorriza 101 Figura 58. Biopelícula microbiana 103 Figura 59. Modelo de interferencia de mecanismos de QS dependiente de AHL 103 Figura 60. Ciclo de óxido reducción del carbono 105 Figura 61. Ciclo del nitrógeno 106 Figura 62. Ciclo del azufre 109 Figura 63. Ciclo de oxido reducción del azufre 110 Figura 64. Pila de compost 113 Figura 65. Sistema de fitorremediación 120 Figura 66. Biorremediación de petróleo en suelos 126

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ASPECTOS DE PROPIEDAD INTELECTUAL Y VERSIONAMIENTO

Este material didáctico del módulo Microbiología Ambiental fue desarrollado por Carmen Julia Pedroza Padilla, Microbióloga y Magíster en Ciencias - Biotecnología. Tiene un perfil profesional investigativo y docente; con desempeño laboral como investigadora en la Corporación para Investigaciones Biológicas (CIB) y la Universidad de Santander (UDES), y como docente catedrática de la Universidad de Antioquia (UdeA). También tuvo formación académica en el Instituto de Investigaciones Marinas y Costeras (INVEMAR). Actualmente se desempeña como instructora en el Centro Biotecnológico del Caribe SENA-Regional Cesar. Para citar este documento por favor hacerlo de la siguiente manera: Pedroza Padilla, C. (2011). Microbiología ambiental. Módulo didáctico. Valledupar: Universidad Nacional Abierta y a Distancia – UNAD., p.p._ (escribir páginas consultadas por el estudiante). Algunas correcciones de forma del lenguaje español fueron realizadas por la Directora Nacional de Curso, Dra. Diana García Vargas. Doctora en biología animal, vegetal y ecología, línea de investigación fisiología vegetal; magistra en Gestión ambiental para el Desarrollo Sostenible; microbióloga y bióloga.

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INTRODUCCIÓN En los últimos años la microbiología ambiental se ha convertido en una innovadora ciencia biológica, que además de estudiar la función y diversidad de los microorganismos en sus ambientes naturales y artificiales, se propone como una alternativa fortalecida con la biotecnología que puede dar solución a muchos problemas ambientales causados por las actividades humanas (agricultura, minería, industria, deforestación, urbanización, etc.). Gracias al desarrollo de técnicas moleculares dejó de ser una disciplina dedicada exclusivamente a la evolución, ecología, fisiología y taxonomía de los microorganismos y se transformó en una ciencia clave para el desarrollo de soluciones limpias y amigables al medio ambiente ante los crecientes problemas de contaminación en el planeta. Este material didáctico se desarrolló con el fin de proporcionarle a los futuros profesionales de programas ambientales de la Universidad Nacional Abierta y a Distancia (UNAD) la información básica, conceptual y actual de la microbiología ambiental así como también las diferentes aplicaciones que le permitan a los estudiantes dar posibles soluciones a problemas ambientales usando mecanismos con participación microbiana. Este módulo consta de tres unidades, nueve capítulos y cuarenta y cinco lecciones y tiene el objetivo que al finalizar el curso el estudiante tenga la capacidad de conceptualizar, diferenciar tipos de microorganismos, mecanismos microbianos naturales en sus procesos biológicos, métodos de análisis microbianos y su aplicabilidad en diferentes áreas. En su orden en la primera unidad, el estudiante tendrá la información sobre la historia de la microbiología, el impacto de los microorganismos en las actividades humanas, las diferentes estructuras celulares y por último, parte de los procesos metabólicos que realizan los microorganismos para sobrevivir. La segunda unidad, se enfoca en el estudio de las condiciones para el crecimiento microbiano, diversidad microbiana y procesos metabólicos del sistema de vida anaerobio, claves para el desarrollo de técnicas y metodologías que ayuden a la comprensión y aplicabilidad de estos procesos en el ambiente. Por último en la tercera y última unidad, el estudiante encontrará los elementos y algunos métodos usados en la ecología microbiana así como también parte de los procedimientos biotecnológicos empleados actualmente para solucionar problemas ambientales a través de mecanismos responsables, efectivos, y amigables al medio ambiente donde participan activamente los microorganismos. ¡Bienvenidos todos a conocer sobre la microbiología ambiental!

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UNIDAD 1. PRINCIPIOS DE LA MICROBIOLOGÍA Y METABOLI SMO MICROBIANO

CAPÍTULO 1. MUNDO MICROBIANO Lección 1. Etapas históricas de la microbiología Lección 2. Microbiología Lección 3. Microorganismos como células Lección 4. Importancia de los microorganismos para el hombre Lección 5. Los microorganismos y sus ambientes naturales CAPÍTULO 2. PERSPECTIVA GENERAL DE LA VIDA MICROBI ANA Lección 6. Estructura celular en procariotas Lección 7. Estructura celular en eucariotas Lección 8. Estructura celular vírica Lección 9. Morfología de bacterias Lección 10. Microscopía óptica y electrónica CAPÍTULO 3. METABOLISMO MICROBIANO Lección 11. Reacciones metabólicas y conservación de energía Lección 12. Glucólisis Lección 13. Ciclo del acido cítrico Lección 14. Fotosíntesis en microorganismos Lección 15. Alternativas catabólicas

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UNIDAD 1 PRINCIPIOS DE LA MICROBIOLOGÍA Y METABOLISMO

MICROBIANO

CAPÍTULO 1. Mundo microbiano Lección 1. Etapas históricas de la microbiología Durante muchos siglos el hombre desconoció la existencia de microorganismos, su ecología e interacciones con otros seres vivos y mucho menos su relación con las enfermedades, la mayoría de ellas asociadas a castigos divinos individuales o colectivos por causa de pecados, crímenes y delitos. La historia de la microbiología inició en 1665 cuando Robert Hooke descubrió con la ayuda de un microscopio rudimentario la existencia de pequeñas celdas en una rodaja de corcho “celdillas” y la presencia de cuerpos fructíferos de mohos en un objeto de cuero. Aunque es posible que el primero en observar bacterias haya sido el reservado comerciante telas y científico aficionado, el holandés Anton Van Leeuwenhoek quien con microscopios fabricados por él pudo observar pequeños organismos “animálculos”, obtenidos de heces y raspado de dientes, espermatozoides y microorganismos que hoy conocemos como algas y protozoos; todas sus anotaciones y descubrimientos fueron escritas y enviadas a la Royal Society de Londres la cual también recibió varios microscopios fabricados por este científico aficionado. La teoría de la generación espontánea era la más aceptada por la mayoría de los científicos de la época, muchos creían que sapos podían nacer del suelo húmedo y gusanos de materia en descomposición. Pero otros, como los italianos Francesco Redi (1668) y Lazzaro Spallanzani (1765) respectivamente, afirmaban que los gusanos aparecían porque eran depositados por moscas y que los caldos nutritivos se contaminaban por acción de microorganismos presentes en el aire. Sólo hasta 1861 el científico francés Louis Pasteur desaprobó la generación espontánea y demostró a través de una serie de experimentos empleando matraces que contenían caldo de carne a los que les dobló el cuello en forma de S y posteriormente hirvió, probó que al transcurrir del tiempo en la solución fría y estéril no aparecían microorganismos, mientras que el matraz sin cuello doblado estaba lleno de microorganismos. Con esto demostró que a pesar de tener

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contacto con el aire el matraz del cuello doblado los microorganismos quedaban atrapados en éste y por lo tanto los microorganismos están presentes en el aire pero que el aire per se no creaba los microbios. Pasteur tuvo otros descubrimientos como la fermentación de levaduras, modo en que actúan las vacunas, la pasteurización, proceso muy empleado actualmente para la esterilización o disminución de carga microbiana en muchos tipos de alimentos y la relación de microorganismos en la causa de enfermedades (Tortora, Funke y Case, 2007). Aunque en 1796 el físico inglés Edward Jenner desarrolló la primera vacuna contra la viruela y el médico inglés Joseph Lister en 1860 practicó técnicas asépticas en cirugías para contrarrestar las enfermedades causadas por los microorganismos, sólo hasta 1876 el físico alemán Robert Koch demostró pasos experimentales que relacionaban enfermedades con microorganismos específicos, conocidos como postulados de Koch (Tortora et al. 2007). Desde los años de observaciones de Hooke y descubrimientos al azar como el de los antibióticos por el escocés Alexander Fleming en 1928, la microbiología sigue teniendo vertiginosos avances para contrarrestar no sólo enfermedades en el hombre si no también patógenos en plantas y animales; además de aprovechar todos aquellos microorganismos benéficos los cuales superan número en la población microbiana.

NOTA: En los siguientes enlaces encontrará videos sobre historia de la microbiología: http://www.youtube.com/watch?v=vPGcszfMZjM&feature=related http://www.youtube.com/watch?v=GBIw1qAOBjA&feature=related

Lección 2. Microbiología Es la ciencia que trata el estudio de los microorganismos. La palabra microbiología deriva de las voces griegas mikros , pequeño; bios , vida y logos , estudio, es decir etimológicamente estudia organismos demasiado pequeños para ser observados a simple vista. También llamados microbios. El objeto de estudio de la microbiología incluye bacterias, hongos, protozoos y virus, estos últimos a pesar de no ser entidades celulares definidas pueden afectar a su huésped (Llop, Valdés-Dapena y Zuazo, 2001; Tortora et al. 2007)

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La microbiología ambiental es una subdisciplina que estudia la función, diversidad de los microorganismos y su papel en la realización de procesos tanto en sistemas naturales como artificiales. Esta área de la microbiología es especialmente interdisciplinaria (Madsen, 2008). Todos los seres vivos tienen características estructurales en común que permite a los taxónomos agruparlos y clasificarlos para poder asignarles un nombre científico. La sistemática o filogenia estudia la clasificación de las especies considerando su historia evolutiva. La mayor categoría taxonómica que divide a los organismos vivos es el Dominio, propuesta por el científico estadounidense Carl Woese, existen tres dominios: Eukarya, Bacteria y Archaea. En Eukarya se encuentran los hongos, plantas, animales y protistas. En Bacteria, las procariotas patógenas y no patógenas presentes en aire, suelo y agua, las procariotas fotoautótrofos. Y por último en el dominio Arquea se agrupan todas las células procariotas que no tienen peptidoglicano en su pared celular, las cuales en su mayoría viven en ambientes extremos o tienen actividades metabólicas poco comunes (Tortora et al. 2007). La unidad fundamental de la clasificación es la especie, son el grupo más estrechamente relacionado que tiene la capacidad de reproducirse entre si. Las especie pueden agruparse y formar géneros, los géneros relacionados forman una familia y las familias similares un orden y el grupo de órdenes constituyen una clase y las clases relacionadas forman un filo y éstos un reino y los reinos relacionados se agrupan en dominios (Tortora et al. 2007). Los virus no están considerados como seres vivos por lo tanto no se ubican en ninguno de los dominios descritos anteriormente.

NOTA: Para mayor información: Leer la sección 1.1 Microbiología en: Madigan, M., Martinko, J & Parker, J. (2003). Brock biología de los microorganismos. (10 Ed). Madrid: Pearson Prentice Hall.

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Lección 3. Microorganismos como células La célula es la unidad estructural y funcional de todos los seres vivos. Existen microorganismos unicelulares, es decir, aquellos que constan de una sola célula como es el caso de las bacterias, levaduras, protozoos y muchas algas; y los multicelulares, que están constituidos por muchas células como la mayoría de los hongos. Las células como entidades estructurales poseen una membrana celular o plasmática que las separa del entorno, algunas también tienen pared celular, la cual siempre está al exterior de la membrana celular, un citoplasma que es donde se realizan la mayoría de las actividades funcionales y un núcleo o nucleoide (procarión), para las que no tienen un núcleo definido que contiene la información genética. La célula es un sistema abierto que intercambia materia y energía con el entorno para realizar todas sus reacciones bioquímicas y físico-químicas, es decir, su metabolismo, éste le permite el crecimiento o reproducción donde a partir de una célula se genera otra célula hija gracias a las actividades de síntesis celular, el movimiento le permite desplazamiento y la comunicación celular capacidad para interactuar con otras células y activar así ciertos genes indispensables en la supervivencia de la especie, todos ellos importantes en la continuidad de la misma (Madigan, Martinko y Parker, 2003).

NOTA: Leer la sección 1.2 en: Madigan, M., Martinko, J & Parker, J. (2003). Brock biología de los microorganismos. (10 Ed). Madrid: Pearson Prentice Hall.

Lección 4. Importancia de los microorganismos para el hombre Si le diéramos la opción a un grupo de personas para mencionar una palabra que asocie con microorganismos posiblemente la mayoría diría enfermedad, porque desconocen que sólo unos pocos respecto a la población son patógenos (producen enfermedades); la mayoría de los ellos cumplen un papel fundamental e irremplazable en el ecosistema como veremos en la próxima lección. Aunque gracias a la aparición de enfermedades y pestes en tiempos atrás se desarrollaron las primeras teorías de la microbiología, hoy después de muchos avances científicos los microorganismos son utilizados en diferentes áreas que benefician al ser humano. Entre ellas tenemos: La industria alimentaria, no sólo se han diseñado nuevas estrategias para combatir a los microorganismos que contaminan los alimentos y causan enfermedades

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alimentarias sino que muchos de ellos son básicos en la producción de alimentos como los lácteos (quesos, yogur, mantequilla), carnes (carnes maduradas), vegetales enlatados o encurtidos (coles, pepinillos, pimentones, cebollas, zanahorias etc), bebidas alcohólicas (vinos, cerveza, sidra, etc), vinagre, o en la producción del pan donde se usan cepas microbianas que ayudan al proceso de fermentación, acidificación y/o maduración; e incluso el consumo de hongos como es el caso de los champiñones que tienen alto valor nutricional. En la industria farmacéutica y biotecnológica los microorganismos son clave para la obtención a bajo costo y en grandes cantidades de metabolitos (aminoácidos, vitaminas, enzimas, antibióticos, compuestos orgánicos, promotores de crecimiento vegetal), producción de organismos transgénicos y en el desarrollo de técnicas con DNA recombinante e ingeniería genética. En la agricultura no sólo causan enfermedades en plantas (fitopatógenos) sino que también a través de las interacciones procariota-eucariota o procariota-procariota pueden beneficiar a las plantas gracias a procesos simbióticos que le permiten a éstas tomar los nutrientes presentes en el medio con mayor facilidad o el control de plagas gracias al uso de bacterias. También gracias a los microorganismos se han desarrollado a través de ingeniería genética plantas transgénicas resistentes a enfermedades y con niveles de producción elevados respecto a las plantas silvestres (esto todavía requiere muchos estudios de efectos secundarios y tiene implicaciones éticas). Con el aumento de la población y el desarrollo tecnológico también se elevan los niveles de contaminación en fuentes de aguas y suelos, derrames de crudo y compuestos recalcitrantes o metales pesados los cuales son muy difíciles de remover y degradar pero gracias a la amplia actividad metabólica microbiana muchos microorganismos usan esos compuestos como sustrato ofreciéndole al hombre otra aplicación vital para la conservación y restauración del medio ambiente, la biorremediación.

NOTA: Para mayor información leer los siguientes artículos: http://bibliotecadigital.ilce.edu.mx/sites/ciencia/volumen1/ciencia2/43/html/sec_8.html http://www.musalit.org/pdf/IN060651_es.pdf

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Lección 5. Los microorganismos y sus ambientes natu rales La ecología microbiana estudia las relaciones entre el microorganismo y su ambiente natural. Estos organismos viven en ambientes competitivos y en ocasiones extremos (agua de termales) pero gracias a las asociaciones de células o individuos se forman conjuntos llamados poblaciones, donde éstas a su vez pueden agruparse para establecer comunidades microbianas e interactuar dentro de un lugar determinado llamado nicho. Dentro de un ecosistema se establecen relaciones simbióticas, es decir, las interacciones entre organismos y poblaciones coexistentes donde se puede o no obtener beneficios, por ejemplo, las micorrizas (myco = hongo; rhiza = raíz) participan en el desarrollo de las plantas ya que sirven como pelos de las raíces y absorben nutrientes que a la planta sola le sería dificultoso y luego los libera de forma gradual para que los pueda asimilar, otro ejemplo sería la producción de vitamina K por bacterias intestinales en los seres humanos. Además de este tipo de asociaciones gracias a los microorganismos se puede mantener el equilibrio entre lo biótico y abiótico, por ejemplo, las bacterias que participan en el ciclo de nitrógeno ayudan a degradar residuos e incorporan el nitrógeno presente del aire en compuestos orgánicos. También participan en los ciclos biogeoquímicos del carbono y azufre.

NOTA: Leer la sección 1.3 en: Madigan, M., Martinko, J & Parker, J. (2003). Brock biología de los microorganismos. (10 Ed). Madrid: Pearson Prentice Hall.

CAPÍTULO 2. Perspectiva general de la vida microbia na Lección 6. Estructura celular en procariotas Aunque las células eucariotas y procariotas tienen una complejidad que les permite realizar todas las funciones metabólicas para su mantenimiento y supervivencia existen características estructurales que ayudan a diferenciarlas, a continuación describiremos la composición estructural y funcional de células procariotas, eucariotas y la de los virus.

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Células procariotas Son organismos unicelulares que carecen de un núcleo definido, su nombre se deriva del griego pro = antes de; karion = núcleo. El material genético de estas células, al contrario de las eucariotas se encuentra en el citoplasma y no en el núcleo. Este es un grupo muy diverso y con diferencias estructurales que nos permiten su clasificación. Está conformado por bacterias y archaea, dividas en base a la composición de la pared celular (figura 1).

Figura 1 . Estructuras celulares de una procariota (tomado de Tortora et al. 2007).

• Glicocálix Es una capa gelatinosa de polisacáridos y/o polipéptidos secretados por las células al exterior de la pared celular que está relacionada con la virulencia (capacidad de producir enfermedad), adherencia a superficies, reservas de energía, protección a la deshidratación, lesiones y salida de nutrientes. Cuando la capa está firmemente unida y de manera organizada a la pared celular se le llama cápsula de lo contrario se considera una capa mucilaginosa (Tortora et al. 2007). • Flagelos Son apéndices largos y finos que se proyectan hacia el exterior y propulsan a las bacterias permitiéndoles el movimiento y desplazamiento. El flagelo consta de tres partes: el filamento, que es la parte más larga y externa compuesto por

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una proteína globular llamada flagelina, el gancho y por último el cuerpo basal que está compuesto por anillos que lo fijan a la pared y membrana celular (figura 2). No todas las bacterias tienen flagelos (átricas), peros las que los tienen pueden adoptar diferentes disposiciones alrededor de la célula. Entonces las bacterias pueden ser monotricas (un solo flagelo polar), lofotricas (dos o más flagelos en uno o ambos extremos de la célula), anfitricas (un flagelo en cada extremo de la célula) y perítricas (muchos falgelos alrededor de la celula). Los flagelos no pueden verse a simple vista en el microscopio óptico con la ayuda de tinciones o en el microscopio electrónico.

Figura 2. Estructura flagelar en bacterias. (a) Bacterias gramnegativas, (b) bacterias grampositivas (tomado de Tortora et al. 2007).

• Fimbrias y pili Son apéndices más cortos, rectos y finos que los flagelos compuestos por subunidades proteicas de pilina. Las fimbrias pueden estar en los polos o distribuidas en toda la superficie celular y cumple funciones de fijación, mientras que el pili que es más largo que las fimbrias y sólo se encuentran uno o dos por célula; cumple funciones de transferencia intercelular de ADN en el proceso de conjugación, también es llamado pili sexual.

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• Pared celular Es una estructura compleja y rígida que delimita, da forma y brinda protección ante la lisis celular dada la fragilidad de la membrana citoplasmática y la presión osmótica a la que está sometida por el entorno extracelular, también juega un papel importante en la división celular y en su propia biosíntesis. Está compuesta por peptidoglucano (mureína) un heteropolímero constituido por N-acetilmurámico (NAM) y N-acetilglucosamina (NAG), aminoácidos de cadena lateral y puentes transversales de aminoácidos. Las bacterias se clasifican según la composición de la pared celular en grampositivas y gramnegativas (figura 3); las grampositivas además de una capa gruesa de peptidoglucano tienen elevadas concentraciones de ácidos teicoicos mientras que las gramnegativas no, pero éstas en cambio están formadas por una capa más delgada de peptidoglucano que a su vez está cubierta por una membrana externa de lipopolisacáridos (LPS), lipoproteínas, porinas y fosfolípidos (Llop et al. 2001; Madigan et al. 2003; Tortora et al. 2007).

Figura 3. Pared celular bacteriana. Arriba se muestra la estructura de células grampositivas y debajo de células gramnegativas (tomado de Tortora et al. 2007).

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Existen células procariotas que no tienen pared celular o algunas son muy escasas como es el caso del género Mycoplasma pero en cambio tienen una membrana plasmática con esteroles. Las procariotas del dominio archaea no constan de pared celular con peptidoglucano, siendo esta la principal característica de este dominio (Tortora et al 2007). • Membrana plasmática, citoplasmática o celular Es una estructura delgada que rodea al citoplasma y actúa como una barrera semipermeable y selectiva entre el interior y exterior de la célula controlando así el ingreso y salida de sustancias; también gracias a la presencia de diferentes enzimas participa en la degradación de nutrientes, la generación de energía (ATP) y fotosíntesis. Está compuesta por una bicapa lipídica constituida en su mayoría por fosfolípidos y proteínas, éstas últimas pueden ser de superficie (periféricas) o transmembranales (integrales) que facilitan la catálisis y transporte de sustancias. Los iones divalentes de calcio y magnesio contribuyen a la estabilidad iónica de la membrana celular. A diferencia de las células eucariotas y con excepción de los Mycoplasmas la membrana de las procariotas no contiene esteroles (Tortora et al 2007). • Citoplasma Es la sustancia semifluida (citosol) al interior de la célula donde se encuentra el cromosoma (material genético), ribosomas y depósitos de reserva o inclusiones. Está constituido es su mayoría por agua y otras sustancias (carbohidratos, iones, lípidos, enzimas y compuestos de bajo peso molecular) A diferencia de las células eucariotas no tiene citoesqueleto ni flujo citoplasmático (Llop et al. 2001; Tortora et al 2007). • Nucleoide o procarión Es la zona que contiene el material genético conformado por un cromosoma (molécula de ADN bicatenario), unido a la membrana celular pero que a diferencia de las células eucariotas no está delimitado por una envoltura o membrana nuclear. Muchas bacterias contienen pequeñas moléculas de ADN circular que no están unidas al cromosoma bacteriano y que se replican independientemente de éste, llamados plásmidos (muy útiles en la biotecnología); los cuales le otorgan propiedades especiales como resistencia a antibióticos, tolerancia a sustancias tóxicas, entre otras (Llop et al. 2001; Madigan et al. 2003; Tortora et al. 2007).

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• Ribosomas Son estructuras celulares que constan de dos subunidades compuestas por acido ribonucleico ribosomal (ARNr o rRNA por siglas en inglés) y proteínas, se encuentran por millares en el citoplasma dada su función vital en la síntesis de proteínas. Cuando se están agrupados en cadenas se les llama polirribosomas. Los ribosomas procariotas son más pequeños que los eucariotas y se les conoce como ribosomas 70S.

• Inclusiones El citoplasma de las células procariotas contiene diversas estructuras de almacenamiento, reserva o depósito de nutrientes llamadas inclusiones, que pueden ser utilizados cuando está expuesta a medios adversos o en condiciones de inanición. Entre ellas tenemos:

� Gránulos metacromáticos o volutina Son estructuras conformadas por reservas de fosfato inorgánico utilizados para la síntesis de ATP, se les llama así por el color rojo que toman cuando son expuestos a colorantes azules como es el caso del azul de metileno o azul de toluidina. Además de las bacterias, las algas, hongos o protozoos los pueden tener (Tortora et al. 2007). � Gránulos polisacáridos Son reservas de almidón y glucógeno que la bacteria almacena cuando crece en un medio pobre en nitrógeno pero rico en carbono; al exponerse al yoduro de potasio el glucógeno toma un color rojo y el almidón azul. � Inclusiones lipídicas Son acúmulos de poli-beta hidroxibutíricos (PHB) que en especies como Bacillus constituyen reservas de carbono y energía durante la esporulación. También hay bacterias que reservan poli-beta-hidroxialcanoatos (PHA), los cuales hoy son utilizados para fabricar plásticos bacterianos biodegradables y disminuir a la contaminación ambiental. Se tiñen con colorantes como el Negro-Sudán.

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� Gránulos de azufre Se forman cuando en el medio hay compuestos de azufre reducido para usarlos como reservas de energía. Aparece en las bacterias que utilizan sulfuro de hidrógeno (SH2) como el género de Thiobacillus. � Carboxisomas Son inclusiones compuestas por una monocapa proteínica que contiene la enzima ribulosa-bifosfato carboxilasa; utilizada por las bacterias fotosintéticas y nitrificantes. � Vacuolas de gas Son vesículas con una monocapa proteínica impermeable al agua pero que acumulan gas dependiendo de la concentración de éste en el exterior. Estas estructuras confieren la flotabilidad óptima que les permite alcanzar luz, oxígeno u otros elementos. Están presentes en cianobacterias, halobacterias y anoxigénicas. � Magnetosomas Son partículas cristalinas de hierro magnetita (Fe3O4), sensores del campo magnético terrestre ya que permiten la orientación de las bacterias magnetotácticas (Aquaspirillum magnetotacticum y Magnetospurillum magnetotacticum); en el campo industrial se desarrollan métodos para obtener magnetita para la fabricación de cintas magnéticas para audio y datos.

• Endosporas Son células en “reposo” que se forman intracelularmente por la carencia de nutrientes en ciertas bacterias (Bacillus, Clostridium, Sporosarcina). Estas estructuras pueden vivir en ambientes adversos como calor extremo, falta de nutrientes, radiaciones, desecación, presencia de agentes químicos o bactericidas etc. El proceso de formación de endosporas se conoce como esporulación o esporogénesis e implica la invaginación de la membrana celular junto con material genético en una célula vegetativa o progenitora que después de lisarse libera la endospora y puede permanecer en latencia por millones de años, hasta que por un estímulo químico o físico se desencadena la germinación (recuperación del estado vegetativo). Este no es considerado un proceso de reproducción.

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NOTA: En este enlace encontrará un video sobre bacterias: http://www.youtube.com/watch?v=PPmZ5Q78Xhk

Lección 7. Estructura celular en eucariotas

Célula eucariota Está conformada por células unicelulares y pluricelulares de mayor tamaño y complejidad que tienen un núcleo definido; comprende algas, protozoos, plantas y animales. A continuación se describirá de una forma general de las estructuras en las eucariotas (figura 4).

Figura 4. Estructura celular eucariota (tomado de Tortora et al. 2007).

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• Flagelos y cilios Al igual que en las procariotas sirven para la locomoción y desplazamiento, pueden estar recubiertas de citoplasma y membrana plasmática; están conformados por microtúbulos compuestos de tubulina y dideína. Si son largos se les llama flagelos y si son escasos y numerosos cilios. Son frecuentes en protozoos y algas.

• Pared celular y glicocálix Son una estructura más simple que en las células procariotas está compuesta por celulosa (en plantas y algunos hongos) y quitina, glucano y manano en la mayoría de los hongos. No todas las eucariotas tienen pared, las células animales están desprovistas de ella pero en cambio constan de una cubierta de carbohidratos llamada glicocálix. • Membrana celular Está conformada por una bicapa lipídica, pero a diferencia de las procariotas contiene carbohidratos (actúan como receptores), esteroles (colesterol en animales) y ergosterol (en hongos). • Citoplasma Al contrario de las procariotas tiene un citoesqueleto que le da soporte y contribuye al transporte de las sustancias gracias al flujo citoplasmático, las enzimas no están disueltas en el citosol sino que están confinadas en las organelas. • Ribosomas Son estructuras más grandes y densas que en procariotas, conocidas como 80S, compuestos por ARNr y proteínas, se encuentran en el retículo endoplasmático rugoso y libres en el citoplasma. Los cloroplastos y mitocondrias contienen ribosomas de 70S. Pueden formar polirribosomas y su función es la síntesis de proteínas para todas las actividades celulares (Tortora et al. 2007). • Núcleo Es el orgánulo más grande de la célula, con forma esférica u ovalada rodeado por una doble membrana nuclear con poros nucleares que controlan el

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intercambio de sustancias (ARNr, ARNmensajero y enzimas) entre el núcleo y el citoplasma. El nucleolo está inmerso en la membrana nuclear y se encarga de sintetizar ARNr. El núcleo contiene el material genético (ADN y ARN). El ADN está rodeado por proteínas llamadas histonas y contiene múltiples cromosomas.

• Retículo endoplasmático

Existen dos tipos: el retículo endoplasmático rugoso que es una red de canales o sacos membranosos (cisternas) que se extiende desde la membrana nuclear y están recubiertos de ribosomas; su función es sintetizar proteínas y catalizar las unión entres éstas y otros compuestos como carbohidratos o lípidos que luego son secretados a la membrana. El retículo endoplasmático liso, no tiene ribosomas (de allí su nombre) pero tiene enzimas que sintetizan fosfolípidos, grasas, esteroides (estrógenos, tetosterona y colesterol), además de fagocitar sustancias tóxicas como el alcohol y drogas (figura 5).

Figura 5. Estructura del retículo endoplasmático. Se observa el retículo endoplasmático liso (RE liso) y el retículo endoplasmático rugoso (RE rugoso) con ribosomas en su interior (tomado de Tortora et al. 2007).

• Aparato de golgi Es una red de canales o cisternas que recibe vesículas (con proteínas) que vienen del retículo endoplasmático rugoso y después de reacciones enzimáticas las proteínas sufren modificaciones para generar glicoproteínas,

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glucolípidos y lipoproteínas las cuales pueden ser secretadas y transportadas hasta la membrana celular (figura 6).

• Lisosomas Son estructuras esféricas rodeadas de membrana, formados a partir del aparato de golgi, contienen enzimas capaces de degradar diversas sustancias e incluso bacterias.

• Vacuolas Son cavidades derivadas del aparato de golgi rodeadas de una membrana llamada tonoplasto, presentes en su mayoría en células vegetales. Sus funciones están relacionadas con almacenamiento de nutrientes, desechos y agua.

Figura 6. Aparato de golgi. Se observan vesículas que llegan desde el RE rugoso (tomado de Tortora et al. 2007).

• Mitocondrias Son organelas esféricas o bastoniformes compuestas por una doble membrana (interna y externa) que forma pliegues llamadas crestas y con un interior semilíquido conocido como matriz. Las mitocondrias contienen ADN y ribosomas 70S indispensables para la producción de enzimas que participan en varias actividades metabólicas exclusivas de esta organela. Sus funciones están relacionadas con la respiración celular y producción de ATP. También pueden dividirse para generar nuevas mitocondrias en la misma célula.

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• Cloroplastos

Son estructuras grandes de doble membrana que contienen la clorofila necesaria para la fotosíntesis. También contienen ADN, ribosomas 70S y enzimas que participan en la síntesis de proteínas; además de poder “reproducirse” dentro de la misma célula. Los cloroplastos contienen granas , las cuales son agrupaciones de sacos aplanados llamados tilacoides donde se encuentra el pigmento de la clorofila. Están presentes en algas y plantas.

• Peroxisomas

Son orgánulos pequeños rodeados de membranas con enzimas que oxidan sustancias orgánicas (aminoácidos, ácidos grasos) y tóxicas (alcohol, peróxido de hidrógeno). La catalasa se encuentra en esta organela.

• Centrosomas

Está formado por material pericentriolar (zona del densa citosol de fibras proteínicas) y centriolos (nueve tripletes de microtúbulos). Sus funciones están relacionadas con la división celular en la formación del huso mitótico.

NOTA: En este enlace encontrará un video sobre estructura y función celular: http://www.youtube.com/watch?v=395B4JZg6I0&feature=related http://www.youtube.com/watch?v=f9TA7-sypXs&feature=related

Lección 8. Estructura vírica Los virus (del latín virus = veneno) son entidades infecciosas o elementos genéticos de ADN o ARN que se replican indispensablemente dentro de una célula huésped utilizando su maquinaría celular y enzimática; pero tienen formas extracelulares que facilitan su transmisión entre células. Muchos autores no los consideran seres vivos porque sin la célula huésped que infectan éstos no podrían replicarse y por lo tanto no existirían. A diferencia de las células eucariotas y procariotas los virus no tienen estructuras celulares (membrana celular, pared celular, citoplasma, núcleo) y pocas o ninguna enzima que le permita realizar actividades metabólicas.

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Los virus son entidades muy pequeñas (20 - 1000 nm) que sólo pueden observarse con la ayuda de microscopios electrónicos y tienen la capacidad de atravesar filtros bacteriológicos. Su espectro de células huésped es amplio (plantas, animales) y los que infectan a bacterias conocidos como bacteriófagos . Cuando los virus están libres de manera extracelular se le conoce como virión, están compuestos por ácidos nucleicos (ADN o ARN pero nunca ambos) y una cubierta o cápside. Los virus no son susceptibles a antibióticos por lo tanto su empleo en enfermedades virales es inocuo es innecesario, sólo aumenta la posibilidad de resistencia bacteriana (cuadro 1). Entre las partes víricas están:

• Acido nucleico Está constituido por ADN o RNA y éstos pueden ser monocatenario (una cadena o cadena sencilla) o bicatenario (dos cadenas o cadena doble) o dividido en varios segmentos. Por lo general el material genético viral es mucho más pequeño que en bacterias (5000 bases – 230.000 pared de bases). Los ácidos nucleicos tienen la información necesaria para sintetizar proteínas y enzimas virales indispensables para la replicación viral. • Cápside y envoltura La cápside es la cubierta proteínica que envuelve al material genético y está constituido por subunidades estructurales proteicas llamados capsómeros, la composición química de éstos puede ser de una o varias proteínas y varía de acuerdo al virus. La cápside es la que determina la forma del virus. La envoltura es una membrana constituida por lípidos, proteínas y carbohidratos, se forma durante la maduración viral mediante un proceso de gemación a través de la membrana celular de la célula huésped. Algunos virus tienen prolongaciones por fuera de la envoltura conocidas como peplómeros; usualmente están conformados por glucoproteínas virales. También tienen proteínas no glucosiladas por debajo de la envoltura. Es importante aclarar que el carbohidrato que se añade a las proteínas no es de origen viral si no que es aportado por la célula huésped mientras que la proteína si es codificada por el virus (Llop et al. 2001). Existen virus sin envoltura o virus desnudos, en este tipo de virus la cápside protege al material genético de la degradación por parte de nucleadas (DNasa y RNasa). Los virus se clasifican morfológicamente con base a la simetría o arquitectura de su cápside mediante estudios de microscopía electrónica, crioelectrónica y

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cristalografía de rayos X. Los principales grupos son: virus helicoidales (virus de la rabia, virus mosaico del tabaco, TMV), virus poliédricos (virus del papiloma humano, HPV), virus con envoltura (virus de la gripe, VIH) y virus complejos como el caso de los bacteriófagos (Fago T4), ver algunos en la figura 7.

Cuadro 1. Comparación de virus y bacterias (tomado de Tortora et al. 2007).

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Figura 7 . Tipos de virus (tomado de Tortora et al. 2007).

NOTA: En este enlace encontrará un video sobre virus : http://www.youtube.com/watch?v=L9kwsj9h2Hg

Lección 9. Morfología de bacterias Las bacterias tienen diversidad de formas y tamaños y se clasifican de acuerdo a su forma en varios grupos (Figura 8):

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Figura 8. Morfología de células bacterianas (tomado de www.oocities.org).

• Cocos

Bacterias de forma esférica, redonda u ovalada. Cuando se dividen pueden agruparse entre si de varias formas: diplococos (cocos en pares), tetracocos (grupos de cuatro), estreptococos (cocos unidos en forma de cadena) y estafilococos (en agrupaciones amplias semejantes a racimos). • Bacilos Bacterias en forma cilíndrica o de bastón. Después de la división celular pueden agruparse de diversas formas: diplobacilos (bacilos unidos en pares), estreptobacilos (unidos en cadenas) y cocobacilos (bacilos ovalados). • Espirilos Bacterias en forma helicoidal o de espiral, son relativamente rígidos. • Espiroquetas Bacterias en forma de espiral, sacacorchos o helicoidal pero flexibles. • Otras formas menos comunes como las bacterias en forma de estrella,

rectangular y triangular.

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NOTA: En este enlace un documento para ampliar esta lección y las anteriores: http://www.higiene.edu.uy/cefa/2008/MorfologiayEstructuraBacteriana.pdf

Lección 10. Microscopía óptica y electrónica La gran mayoría de los microorganismos no se pueden observar a simple vista y por lo tanto se requiere el uso de un equipo o instrumento muy conocido, el microscopio (micro = pequeño; scopio = observar) el cual permite visualizar objetos de estudios que a simple vista sería imposibles de percibir por el ojo humano. El primer microscopio simple fue diseñado por Anton Van Leeuwenhoek e inicialmente tenía una sola lente; al transcurrir de los años muchos investigadores mejoraron las técnicas hasta llegar a la microscopía moderna.

• Microscopía óptica (MO) Se refiere al uso de microscopios que usen luz visible con el fin de visualizar u observar muestras. Existen varios tipos de microscopía óptica: Microscopio óptico compuesto Tiene varias lentes y usan luz visible como fuente de iluminación. Con sus lentes talladas permite aumentar muchas veces el tamaño de la muestra real gracias a los rayos luminosos que vienen de la fuente de luz y pasan por el condensador hasta llegar a la muestra, luego los rayos pasan a través de la lente del objetivo (lentes de 10X, 40 X y 100X) y puede finalmente observarse la muestra en el ocular (monocular o binocular), mirar la figura 9. Es usado para observar microorganismos vivos o teñidos. Microscopio de campo oscuro El condensador tiene un disco que bloquea los rayos de luz directa que llegaría a los objetivos, al no tener una luz de fondo directa, la muestra se observa iluminada en los bordes pero con un fondo o campo oscuro; es una técnica muy usada para observar estructuras muy pequeñas como flagelos y espiroquetas por la alta resolución (capacidad de distinguir entre dos puntos) de este tipo de microscopio. Ver figura 10.

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Figura 9. Microscopio óptico compuesto. A la izquierda partes y funciones del microscopio. A la derecha trayecto de la luz de abajo hacia arriba hasta el ojo humano.

Microscopio de contraste de fase Con la ayuda de un diafragma anular los rayos de luz de una fuente se reflejan o se difractan en la muestra, mientras que otros rayos la atraviesan, cuando ambos rayos se unen en los oculares se pueden detectar muestras con mayor diferenciación de estructuras internas de células vivas. (Figura 10) Microscopio de fluorescencia Se utilizan en muestras que fluorescen al exponerse a la luz ultravioleta. Algunas células lo hacen de forma natural como las que contienen clorofila; en las que no fluorescen naturalmente se puede usar fluorocromos (colorantes fluorescentes que tiñen las células) que absorben la longitud de onda corta (luz U.V) y emiten luz visible, que es de mayor longitud de onda. Con este tipo de microscopio la muestra se observa brillante o fluorescente contra un fondo oscuro (figura 10). Usado para diagnóstico de microorganismos, ecología microbiana o técnicas de inmunofluorescencia (se tiñen anticuerpos para reaccionar con antígenos).

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Figura 10. Imágenes de Paramecium por microscopia óptica (MO). A la izquierda fotografía con microscopio de campo claro, en el centro con MO de campo oscuro y a la derecha con MO de contraste de fase (Tomado de Tortora et al. 2007).

• Microscopía electrónica (ME) El microscopio electrónico se ha convertido en una valiosa herramienta para el estudio detallado de estructuras muy pequeñas, virus e incluso moléculas que serían imposibles de ver con microscopía óptica. Aunque la finalidad es la misma existen varias diferencias entre ambos microscopios; los microscopios electrónicos no usa una fuente de luz o fotones sino un haz de electrones que viajan en forma ondulatoria en longitudes de onda mucho menores que la luz blanca lo que aumenta notablemente el poder de resolución. También se diferencia en el uso de lentes electromagnéticas para enforcar la luz en la muestra deshidratada en lugar de lentes de vidrio; no se usan portaobjetos de vidrio sino una rejilla de cobre (Tortora et al. 2007). Las imágenes obtenidas son a blanco y negro pero se les puede dar color desde el ordenador. No se puede trabajar con organismos vivos. Hay dos tipos de microscopía electrónica:

Microscopio electrónico de transmisión (MET) Un haz o rayo de electrones enfocado por un lente condensador electromagnético se dirige sobre una muestra ultra delgada que es atravesada por los electrones dirigidos hacia lentes electromagnéticas del objetivo, éste se encarga de ampliar la imagen y por último enfocarlos en las lentes electromagnéticas proyectoras sobre una pantalla que fluoresce cuando recibe el impacto de los electrones (figuras 11 y 12). Se pueden usar sales de metales pesados para “teñir” las muestras (Llop et al. 2001; Tortora et al. 2007). Como desventajas se destaca que los cortes deben ser ultradelgados, fijados y deshidratados en vacío. No genera imágenes tridimensionales. Las microfotografías por ME son a blanco y negro pero son coloreadas desde un ordenador.

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Figura 11. Microscopios electrónicos. A la izquierda microscopio electrónico de transmisión (MET) y a la derecha microscopio electrónico de barrido (MEB) (tomado de Tortora et al. 2007).

Microscopio electrónico de barrido (MEB) Un haz de electrones (haz primario) producido por un cañón pasa las lentes electromagnéticas y la muestra que a su vez libera electrones secundarios de la superficie de ésta que pueden ser capturados, detectados y ampliados para producir una imagen tridimensional en una pantalla. A pesar de tener menor resolución que el MET es muy útil para producir imágenes tridimensionales de superficies de células o virus (Llop et al. 2001) ver las figuras 11 y 12.

Figura 12. Microfotografías de Paramecium con microscopía electrónica. A la derecha imagen desde un microscopio electrónico de transmisión (MET) y a la derecha desde un microscopio electrónico de barrido (MEB).

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NOTA: En este enlace encontrará un video de microscopía: http://www.youtube.com/watch?v=gA3V7N6E6LA&feature=related http://www.youtube.com/watch?v=gA3V7N6E6LA&feature=related http://www.youtube.com/watch?v=9-qps2KU7WM&feature=related

CAPÍTULO 3. Metabolismo microbiano Lección 11. Reacciones metabólicas y conservación d e energía Para que un organismo pueda cumplir con todas las funciones celulares y crecimiento realiza un conjunto de reacciones y transformaciones bioquímicas que liberan o consumen energía, proceso conocido como metabolismo . Cuando la célula degrada compuestos orgánicos en moléculas más simples y lleva a cabo reacciones químicas que producen energía (exergónicas) se le conoce como catabolismo o metabolismo degradativo; un ejemplo de ésto es la glucólisis donde se degrada el azúcar para obtener o liberar energía y otros compuestos. Esta energía liberada se usa en el anabolismo o biosíntesis, el cual tiene como finalidad la construcción de macromoléculas a partir de moléculas simples, éste es un proceso endergónico; por ejemplo la construcción de proteínas a partir de sus monómeros (aminoácidos). Todas las reacciones catabólicas y anabólicas están mediadas por enzimas y ambas se complementan, es decir, para la supervivencia de una célula deben presentarse ambos procesos acoplados. La forma química más usual de energía es la molécula de adenosín-trifosfato (ATP) conocida como la moneda energética del metabolismo, éste se forma en procesos de fotosíntesis o en la degradación de compuestos orgánicos o inorgánicos. Las reacciones catabólicas están acopladas a liberar o sintetizar ATP mientras que las anabólicas lo degradan o consumen. Es importante mencionar que aunque las células mantienen el equilibrio metabólico para todas sus funciones celulares con el ATP, la mayor proporción de energía aportada por esa molécula es liberada en forma de calor. Ejemplo, la mayor cantidad de energía en el ser humano es liberada en forma de calor para

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mantener la temperatura corporal y la restante para las actividades metabólicas. Dentro del metabolismo generador de ATP existen dos mecanismos a nivel de membrana para sintetizarlo, la fosforilación a nivel de sustrato y el transporte de electrones (también conocido como fosforilación oxidativa) y dentro de esos mecanismos hay dos modos para generar ATP: la oxidación biológica (fermentación o respiración) y la fotosíntesis. La fermentación y la respiración son dos mecanismos para la conservación de la energía , la cual establece que la energía no puede crearse ni destruirse, solo se transforma (cuadro 2).

Cuadro 2. Reacciones de oxido reducción para obtención de energía por bacterias (tomado de Llop et al. 2001).

Fermentación Es un proceso catabólico generador de ATP a partir de compuestos orgánicos en el que éstos sirven como donadores y aceptores de electrones. Aquí no existe un aceptor final de electrones como lo es el O2 en la respiración. Los microorganismos pueden usar como sustrato en la fermentación carbohidratos, ácidos orgánicos, aminoácidos y nucleótidos. La fermentación es un proceso anaeróbico que sólo puede generar ATP a través de la fosforilación a nivel sustrato. Por ejemplo la producción de ácido láctico a partir de glucosa por Streptococcus. Este proceso es propio de microorganismos anaerobios estrictos, facultativos y anaerobios aerotolerantes.

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Respiración Es un proceso metabólico generador de ATP a través de la fosforilación oxidativa donde el oxígeno u otro aceptor de electrones pueden actuar como aceptor final de electrones. En la respiración compuestos orgánicos (en heterótrofos) e inorgánicos (bacterias litótrofas) pueden donar y aceptar electrones. La respiración puede ser aerobia, donde el oxígeno es el aceptor final de electrones y anaerobia, donde el aceptor final de electrones puede ser sulfatos, nitratos y carbonatos (Llop et al 2001) ver cuadro 2. La respiración aerobia produce mucha más energía que la fermentación. La respiración aerobia consta de tres pasos: formación de piruvato a partir de sustancias orgánicas, ciclo de Krebs y cadena de transporte de electrones. La respiración aerobia produce mucha más energía que la anaerobia.

Fotosíntesis Esta actividad metabólica la veremos más adelante en la lección 14. Lección 12. Glucólisis Es un proceso metabólico catalizado por enzimas que oxidan una molécula de glucosa en dos moléculas de piruvato, produce 2 ATP por fosforilación a nivel de sustrato y 2 NADH+. Este proceso de degradación de azúcares se da en el citosol de las células y el destino de los productos finales varía de acuerdo a las necesidades fisiológicas del organismo (figura 13). En presencia de oxígeno el piruvato puede pasar al ciclo de Krebs (ciclo del ácido cítrico o tricarboxílico) en las mitocontrias, el ATP puede usarse como fuente de energía y el NADH puede pasar a la cadena transportadora de electrones en las mitocondrias para generar más ATP (figura 13). En ausencia de oxígeno el piruvato puede usarse como sustrato para la fermentación y producir lactato, etanol y CO2. El NADH se usa en la reducción del piruvato en la fermentación (figura 14).

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Figura 13. Oxidación global de la glucosa (tomado del enlace: http://iescarin.educa.aragon.es/estatica/depart/biogeo/varios/BiologiaCurtis/Seccion%202/2%20-%20Capitulo%208.htm).

Figura 14. Fermentación para la producción de etanol y lactato (tomado del enlace:http://iescarin.educa.aragon.es/estatica/depart/biogeo/varios/BiologiaCurtis/Seccion%202/2%20-%20Capitulo%208.htm).

En honor a sus descubridores la glucólisis (figura 15) también es conocida como la vía de Embden-Meyerhof. La glucólisis se divide en dos etapas, algunos autores la dividen en tres cuando se refieren a la fermentación del piruvato en ausencia de oxígeno.

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Figura 15 . Glucólisis

En la primera etapa preparatoria no se incluyen reacciones de oxido-reducción, se invierten dos moléculas de ATP pero no se genera energía, al terminar esta fase a partir de una molécula de glucosa se forman dos moléculas de gliceraldehido 3-fosfato. Una de ellas obtenida por la catálisis de una aldolasa y la otra para la actividad enzimática de una triosa fosfato isomerasa. Por lo tanto en lo sucesivo ocurre el mismo proceso degradativo para ambas moléculas de gliceraldehido 3-fosfato. La segunda etapa es la fase de oxido reducción o conversión de energía, en ella por la acción de la gliceraldehido 3-fosfato deshidrogenasa de forman dos equivalentes reductores (NADH + H+) y por la fosfoglicerato quinasa se generan las dos primeras moléculas de ATP. Luego por la actividad de la

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enzima piruvato quinasa sobre el fosfoenolpiruvato se forman los dos ATP restantes y dos piruvatos. En la glucólisis se generan 4 moléculas de ATP, pero el valor neto es de 2 ATP dada a inversión de ATP que se hizo en la primera etapa. La etapa fermentativa de la glucólisis en ausencia de oxígeno no genera energía, sino etanol, lactato, acetato o CO2 dependiendo de la enzima que realice la actividad degradativa, aunque estos productos son muy útiles en la industria alimentaria no se tiene claro la importancia de estos metabolitos en los microorganismos que los producen (bacterias, levaduras). La fermentación que forma el lactato también se da en células humanas (células musculares y eritrocitos).

NOTA: Favor ver el siguiente enlace para profundizar en la lección: https://www.youtube.com/watch?v=xQccszInm6U

Lección 13. Ciclo del ácido cítrico También conocido como ciclo de Krebs o ciclo de ácidos tricarboxílicos, es una serie de reacciones bioquímicas de oxido reducción de gran energía que hacen parte de la respiración de células aerobias, en las procariotas este proceso se realiza en el citosol mientras que en la células eucariotas en las mitocondrias. En este ciclo el piruvato proveniente de la glucólisis sufre una descarboxilación por la acción de la enzima piruvato deshidrogenasa para generar aceltil-CoA, NADH y CO2 antes de ingresar al ciclo de Krebs en la mitocondria. Allí el grupo acetilo se integra con el oxalacetato para formar citrato (un compuesto de 6 carbonos), luego se dan una serie de reacciones químicas (deshidratación, hidratación, descarboxilación, fosforilación, oxido-reducción, etc) donde a partir de una molécula de piruvato se forma: 1 molécula oxalacetato, 2 moléculas de CO2, 3 equivalentes reductores de NADH+, 1 FADH y una molécula de GTP (figura 16).

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Cada equivalente reductor de NADH al ingresar a la cadena de fosforilación oxidativa genera 2.5 ó 3 moléculas de ATP; cada FADH produce 1.5 ó 2 moléculas de ATP. Ambas cantidades son usadas. Si usamos la primera entonces a partir de una molécula de glucosa en la respiración aerobia se pueden generar 38 moléculas de ATP o 32 ATP en la segunda (cuadro 3).

Figura 16. Ciclo de Krebs o del ácido cítrico (tomado del enlace: http://iescarin.educa.aragon.es/estatica/depart/biogeo/varios/BiologiaCurtis/Seccion%202/2%20-%20Capitulo%208.htm).

En la cadena transportadora de electrones o fosforilación oxidativa, las moléculas transportadoras (flavoproteínas, citocromos, ubiquinona y coenzima

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Q) producen reacciones de oxido reducción que liberan energía para generar ATP. En las células eucariotas la cadena transportadora se encuentra en la membrana interna mitocondrial mientras que en las procariotas en la membrana celular (figura 17).

Figura 17. Cadena transportadora de electrones en (tomado del enlace:http://iescarin.educa.aragon.es/estatica/depart/biogeo/varios/BiologiaCurtis/Seccion%202/2%20-%20Capitulo%208.htm).

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Cuadro 3. Rendimiento energético por la oxidación de una molécula de glucosa. Tomado del enlace:(http://iescarin.educa.aragon.es/estatica/depart/biogeo/varios/BiologiaCurtis/Seccion%202/2%20-%20Capitulo%208.htm).

NOTA: Favor ver este video en el siguiente enlace: https://www.youtube.com/watch?v=OVP54YmShzE

Lección 14. Fotosíntesis en microorganismos La fotosíntesis es el proceso de conversión de energía lumínica en energía química, donde a partir de sustancias inorgánicas simples (CO2) se pueden obtener compuestos orgánicos de mayor complejidad (azúcares) indispensables para la vida de los organismos heterótrofos. La molécula de ATP se produce por transferencia de energía de fotones de luz absorbidos por pigmentos fotosintéticos (clorofilas o bacterioclorofilas) donde los electrones se transfieren de átomos de hidrógeno a moléculas de azúcar. Este proceso es realizados por una diversidad de organismos: plantas, algas, cianobacterias, bacterias sulfurosas verdes y púrpuras. En la fotosíntesis el CO2 sirve como fuente de carbono y el hidrógeno como aceptor final de electrones, el cual se oxida y forma agua, las bacterias fotosintéticas usan compuestos inorgánicos como el hidrógeno o ácido sulfúrico como aceptor final de electrones. Las plantas, algas y cianobacterias usan el agua como fuente de hidrógeno y liberan el oxígeno:

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6CO2 + 12H2O + Luz → C6H12O6 + 6H2O + 6O2

Las bacterias rojas, sulfurosas y verdes usan el H2S como fuente de hidrógeno y producen gránulos de azufre:

6CO2 + 12H2S → C6H12O6 + 6H2O + 12S

La fotosíntesis se da en dos fases. Fase lumínica (fotofosforilación) o reacciones dependientes de luz, donde la energía aportada por fotones es absorbida por la clorofila y excita sus electrones, éstos al excitarse pasan a una cadena transportadora de electrones donde bombean protones y el ADP se convierte en ATP, cuando la fotofosforilación es cíclica los electrones retornan a la clorofila pero cuando no lo es (no cíclica ) reducen el NADP en NADPH y los electrones perdidos en este procesos son devueltos a las fotofosforilación cíclica por moléculas de agua (figura 18 y 19). En la fase lumínica de forma entonces: oxígeno, ATP y NADPH. En la fase oscura (ciclo de Calvin) o reacciones independientes de luz los electrones derivados de la fase lumínica, NADPH y el ATP son empleados para la reducir el CO2 a azúcar.

Figura 18. Fotofosforilación cíclica (tomado de Tortora et al. 2007).

Cuando las plantas, algas y cianobacterias utilizan protones (átomos de hidrógeno) provenientes del agua para reducir el CO2 y producir oxígeno molecular se dice que hay una fotosíntesis oxigénica, pero existen bacterias (bacterias verdes y púrpuras) que no pueden usar el agua para reducir el dióxido de carbono y al no generar oxígeno se le conoce como fotosíntesis anoxigénica. Estas bacterias no utilizan la clorofila a sino bacterioclorofila, un pigmento que absorbe la luz en longitudes de onda superior a la clorofila a; la

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localización de la bacterioclorofila en los microorganismos es variable (en clorosomas, en la superficie, inmersas o en invaginaciones de la membrana celular). El cuadro 4 compara la fotosíntesis en procariotas y eucariotas.

Figura 19. Fotofosforilación no cíclica (tomado de Tortora et al. 2007). Cuadro 4. Comparación de fotosíntesis en células eucariotas y procariotas (tomado de Tortora et al. 2007).

NOTA: Leer en el siguiente enlace para mayor información: http://web.usal.es/~jmcsil/biblioteca/biofisica/unizar/FOTO.htm

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Lección 15. Alternativas catabólicas Así como los microorganismos son diversos, de la misma manera su comportamiento nutricional donde las fuentes de carbono y energía varían, la figura 20 sintetiza de forma clara los tipos de nutriciones. Según la fuente de energía que usen los microorganismos pueden ser fotótrofos o quimiótrofos. Los fotótrofos utilizan la luz como fuente de energía mientras que los otros usan compuestos orgánicos a través de reacciones de oxido reducción. Según la capacidad para producir alimento pueden ser: autótrofos , fabrican su propio alimento y usan el CO2 como fuente de carbono, los heterótrofos requieren una fuente de carbono orgánica. Entonces si combinamos la fuente de energía y carbono los microorganismos se pueden clasificar en otras categorías: fotoautótrofos, fotoheterótrofos, quimioautótrofos y quimioheterótrofos.

Figura 20 . Clasificación nutricional de organismos vivos. Se realiza de acuerdo a la fuente de energía y carbono (tomado de Tortora et al. 2007).

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UNIDAD 2. DIVERSIDAD MICROBIANA CAPÍTULO 4. CRECIMIENTO MICROBIANO Lección 16. Crecimiento celular y fisión binaria Lección 17. Curva de crecimiento microbiano Lección 18. Medidas directas del crecimiento microbiano Lección 19. Factores físicos en el crecimiento microbiano Lección 20. Oxígeno y el crecimiento microbiano CAPÍTULO 5. EUCARIOTA Y PROCARIOTA Lección 21. Archaea Lección 22. Hongos Lección 23. Hongos mucosos Lección 24. Protozoos Lección 25. Algas CAPÍTULO 6. SISTEMA DE VIDA ANAEROBIO Lección 26. Respiración anaerobia Lección 27. reducción del nitrato y proceso de desnitrificación Lección 28. Reducción de sulfatos Lección 29. Metanogénesis Lección 30. Acetogénesis

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UNIDAD 2 DIVERSIDAD MICROBIANA

CAPITULO 4. Crecimiento microbiano Lección 16. Crecimiento celular y fisión binaria El crecimiento celular de las bacterias contrario a lo que podemos inferir no está relacionado con el aumento de tamaño de las bacterias si no con incremento del número de células, las cuales incluso pueden ser observadas a simple vista cuando éstas se agrupan y forman colonias. Pero para que una bacteria sea capaz de dividirse tiene requerimientos energéticos y nutricionales (disponibilidad de nutrientes, condiciones ambientales químicas y físicas) que le ayuden a realizar todas las actividades de síntesis que permitirán conformar su estructura física, es decir, pared celular, membrana, material genético, cuerpos de inclusión, etc. La mayoría de las bacterias se reproducen asexualmente por fisión binaria (figura 21), donde una célula se divide para producir dos células hijas con la misma información genética (con altas tasas de mutaciones) que su progenitora. Durante el crecimiento celular se duplican los componentes que constituyen a la célula (macromoléculas, monómeros, sustancias orgánicas) e incluso el ADN donde éste en su origen de replicación (Ori) inicia la síntesis de una molécula de ADN a partir de una preexistente; permitiendo que la célula hija reciba todo el componente genético y estructural de manera que pueda realizar todas las funciones metabólicas.

Figura 21 . Fisión binaria. Tomado del enlace: http://elprofedebiolo.blogspot.com/2010/01/la-celula-procariota.html

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Además de las bacterias, también las levaduras, algas unicelulares, protozoos y archaeas se reproducen por fisión binaria. Para el crecimiento celular se necesitan varias condiciones o requerimientos físicos (pH, temperatura, presión osmótica) y químicos (fuentes de carbono, nitrógeno, azufre, fósforo, elementos traza, oxígeno, vitaminas, etc). En esta lección describiremos los requerimientos químicos o nutricionales y en las próximas lecciones los físicos. • Fuente de carbono Es la principal fuente para la obtención de energía, y composición de elementos o estructuras celulares. Los organismos fotosintéticos (autótrofos) obtienen el carbono a partir del CO2 y lo convierten en glucosa, mientras que los heterótrofos lo obtienen de fuentes orgánicas como carbohidratos, proteínas, y lípidos. El carbono constituye casi la mitad de peso seco de una célula. • Fuente de nitrógeno Sirve para la síntesis de proteínas, ácidos nucleicos (ADN, ARN) y enzimas. Los microorganismos lo pueden asimilar a partir de fuentes inorgánicas o de compuestos que lo contengan como es el caso de las proteínas. Unas bacterias utilizan el nitrógeno en la forma reducida proveniente del amonio (NH4+), otras a partir de nitratos (NO3-) o nitritos (NO2-) y las fijadoras de nitrógeno o las simbióticas a parir de nitrógeno molecular o libre (N2). • Fuentes de azufre y fósforo El azufre es útil para la síntesis de ciertos aminoácidos, coenzimas y vitaminas que contienen este elemento es su composición estructural (indispensable para la formación de enlaces disulfuro en proteínas). Se puede obtener en la naturaleza partir del ión sulfato (SO4-2), sulfuro de hidrógeno (H2S) y aminoácidos que lo contengan. El fósforo es un elemento indispensable para la síntesis de ATP, ácidos nucleicos y fosfolípidos y se encuentra principalmente en iones de fosfato inorgánico (PO43-).

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• Elementos traza y vitaminas Existen otros elementos que si bien no se requieren en grandes cantidades son importantes para la actividad metabólica o composición celular, donde alguno de ellos actúa como cofactores o facilita la producción, degradación de ciertos sustratos o sustancias y en la formación de esporas, entre ellos tenemos al calcio, hierro, cobre, magnesio, manganeso, potasio, zinc, sodio y cloro. Estos últimos se requieren en grandes cantidades (NaCl) para el crecimiento de bacterias halófilas.

NOTA: libro Por favor ver el siguiente enlace las páginas 168 hasta 183 y 188 hasta 208: http://books.google.com.sv/books?id=Nxb3iETuwpIC&printsec=frontcover&dq=introducci%C3%B3n+a+la+microbi%C3%B3logia+tortora&hl=es&ei=15w9TuzyHuPX0QH3v7DDBw&sa=X&oi=book_result&ct=book-thumbnail&resnum=1&ved=0CCsQ6wEwAA#v=onepage&q&f=false

Lección 17. Curva de crecimiento microbiano Durante el ciclo de crecimiento el comportamiento de las poblaciones bacterianas puede estudiarse mediante el crecimiento de las células en función del tiempo. Cuando inoculamos bacterias en un medio de cultivo líquido y fresco se dan cuatro fases en las que se puede dividir el crecimiento microbiano (figura 22).

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Figura 22 . Curva de crecimiento microbiano. Ver detalle en el texto. (Tomado http://www.facmed.unam.mx/deptos/microbiologia/bacteriologia/generalidades.html)

• Fase de adaptación, retraso o latencia Es un periodo de adaptación al medio donde las bacterias comienzan a prepararse metabólicamente sintetizando enzimas y moléculas importantes para la reanimación del crecimiento. En esta fase la división celular es escasa o nula con velocidad de crecimiento Vc = 0. Este periodo puede durar entre 1 hora o varios días dependiendo del microorganismo, las condiciones de crecimiento y la edad del cultivo del que se tomó el inóculo. • Logarítmica o exponencial Es la fase de máximo crecimiento celular y actividad metabólica donde las células comienzan a dividirse activamente a velocidad constante Vc = constante. En este periodo los microorganismos aprovechan al máximo los nutrientes presentes en el medio de cultivo y cuando se le aportan todas las condiciones óptimas puede generar productos de interés industrial; aunque es la fase de mayor sensibilidad a antimicrobianos. • Fase estacionaria Cuando de agotan los nutrientes, aumentan las toxinas, cambia el pH y disminuye el oxígeno la velocidad de crecimiento comienza a decrecer hasta llegar a cero Vc = 0, ya que el número de células que se dividen es igual al número de células que mueren. • Fase de declinación o muerte En esta fase el número de células de células que se dividen comienzan a disminuir notablemente mientras que aumentan de una forma sostenida las que mueren, Vc = negativa, en esta etapa las células pierden casi completamente toda sus actividad metabólica y comienzan a lisarse mientras que unas pocas, las más resistentes pueden sobrevivir con los nutrientes de las que mueren.

NOTA: Leer en el siguiente enlace para mayor información:

http://www.youtube.com/watch?v=-rNT_kkG5vc

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Lección 18. Medidas directas del crecimiento microb iano Existen varios métodos para medir el crecimiento de las poblaciones microbianas: • Recuentos en placa o de colonias Es el método más usado para medir poblaciones bacterianas, ya que a diferencia de otros permite contabilizar el crecimiento de células viables, es decir células que pueden dar una descendencia. Su principal desventaja es que requiere mínimo 24 horas para conocer los resultados del recuento y en la industria a veces se requieren resultados más rápidos. Es muy usado en la microbiología de alimentos, pero puede ser impreciso cuando se toman muestras naturales, como por ejemplo el suelo; donde no todos los microorganismos a pesar de estar presentes en la misma muestra podrán crecer en el medio de cultivo seleccionado dado a la diferencia de requerimientos nutricionales. Esta técnica se fundamenta en que cada colonia está compuesta por un solo tipo de bacteria. Los recuentos se informan en unidades formadoras de colonias (UFC). Existen dos métodos para realizar el recuento en placa: el método de placa vertida o el método de extensión en placa (figura 23). Cuando el número de colonias en placa supera el de 300 UFC es recomendable realizar diluciones seriadas para diluir el inóculo original y facilitar el conteo.

Figura 23 . Métodos de recuento en placa de células viables (tomado de Madigan et al. 2003).

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� Método de extensión en placa Se coloca un volumen de inóculo no superior a 0.1 ml (100 µl) sobre la superficie de un medio de cultivo y se extiende uniformemente por toda la placa con un asa o varilla de vidrio estéril hasta que el medio lo absorba por completo, posteriormente se incuba a una temperatura determinada hasta que aparezcan las colonias y así realizar el recuento. Ver figura 23. � Método de placa vertida Sobre una placa estéril sin medio de cultivo se agrega cierto volumen del inóculo (0.1 – 1.0 ml) al que se añade el medio de cultivo con una temperatura de 45 o 50 °C, luego se agita suavemente la placa para mezclar, después que el agar se solidifica y se incuba las colonias crecerán y en la superficie del agar. El principal inconveniente de este método es que ciertos microorganismos sensibles al calor pueden verse dañados por la temperatura del agar fundido. Ver figura 23.

� Método de diluciones seriadas Cuando una muestra contenga muchos microorganismos que superen las 300 UFC se recomienda realizar diluciones seriadas que faciliten el conteo y permita obtener resultados confiables; luego de las diluciones se siembran las placas y se procede a hacer el conteo del número de colonias que debe ser multiplicado por el factor de dilución para obtener las UFC por mililitro de muestra original (figura 24).

• Filtración Es un método muy usado en microbiología de aguas cuando la concentración de bacterias presentes en la muestra es muy baja. Para la filtración por membranas 100 ml de agua atraviesan un filtro con poros muy pequeños que no pueden pasar las bacterias, las cuales se quedan en la superficie del filtro, éste se transfiere a una almohadilla con medio de cultivo donde las colonias pueden crecer y con una incubación previa hacer el recuento. Es una técnica muy usada para detectar y cuantificar bacterias de contaminación fecal (coliformes fecales).

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NOTA: Leer las secciones 6.5, 28.1 y 20.3 en: Madigan, M., Martinko, J & Parker, J. (2003). Brock biología de los microorganismos. (10 Ed). Madrid: Pearson Prentice Hall

Figura 24 . Método de diluciones seriadas para recuento en placa de colonias (tomado de Tortora et al. 2007).

• Recuento microscópico directo En esta técnica un volumen definido se coloca en un portaobjetos para luego ser observado al microscopio. El método de recuento de Breed es muy usado en la industria láctea, en éste se colocan 0.01 ml de muestra sobre un portaobjetos con un recuadro de 1 cm2 que se tiñe con un colorante para luego contar las células observadas con el objetivo de 100X, al final el número de bacterias contadas se multiplica por 100. Los recuentos microscópicos también se realizan usando la cámara de Petroff-Hausser; estos métodos no requieren tiempo de incubación (Tortora et al. 2007).

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Entre las principales desventajas del recuento directo tenemos: se pueden contar células muertas y vivas, dificulta el conteo de bacterias móviles, se requieren concentraciones de bacterias adecuadas. Lección 19. Factores físicos en el crecimiento micr obiano • Temperatura Es uno de los aspectos más importantes en el crecimiento microbiano porque influencia las reacciones bioquímicas de la célula, donde para muchas enzimas a medida que aumenta la temperatura se incrementan las reacciones catalíticas y por tanto el crecimiento se acelera, pero aumenta demasiado las enzimas se desnaturalizan y se inactivan además de lisarse las membranas; si son muy bajas las membranas se congelan y las actividades metabólicas prácticamente se anulan. Los microorganismos pueden crecer a temperaturas mínimas, óptimas y máxima. La temperatura mínima es la más baja donde puede crecer la especie, por debajo de ésta no hay crecimiento. La temperatura óptima es la temperatura donde crece más rápido y mejor. La temperatura máxima, es la temperatura más elevada que puede soportar el microorganismo para crecer. Los microorganismos también se clasifican de acuerdo al rango de su temperatura óptima (sicrófilos, mesófilas y termófilos) y están subclasificadas como obligadas o facultativas. Las obligadas deben tener condiciones ambientales específicas y las facultativas son capaces de tolerar condiciones ambientales (figura 25).

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Figura 25 . Efecto de la temperatura en el crecimiento microbiano. (Tomado de Madigan et al. 2003).

� Sicrófilos Son aquellos microorganismos afines al frío o con temperaturas de crecimiento bajas (0 – 20 °C). Existen sicrófilos estrictos que crecen a 0 °C pero con una T óptima de 15°C; mientras que los sicrotrofos o sicrofilos facultativos pueden crecer a 0 °C pero tienen temperaturas óptimas entre 20 y 30°C. Este grupo se encuentran en océanos, zonas polares y contaminando alimentos refrigerados. Las algas (Chlamydomonas Nivalis) están dentro de los sicrófilos más estudiados las cuales crecen en zonas nevadas dando tonalidad roja o verde a la superficie (Madigan et al. 2003). � Mesófilos Aquellos microorganismos con afinidad a temperaturas moderadas y con temperatura óptima de crecimiento entre 25 y 40 °C. En este grupo encontramos a la mayoría de los microorganismos ambientales y patógenos. � Termófilos La mayoría de las eucariotas están por fuera de este grupo, son aquellos microorganismos capaces de crecer a temperaturas elevadas y con afinidad por el calor. Tienen temperaturas óptimas entre 50 y 60 °C. Los hipertermófilos o termófilos extremos tienen temperaturas óptimas de crecimiento de 80 °C o más, cierto miembros del dominio Archaea hacen parte de este grupo. La mayoría se encuentran en compost, aguas termales y fumarolas hidrotermales de volcanes.

• pH Los microorganismos se clasifican según su tolerancia al pH en acidófilos, con rangos de pH desde 0 hasta 5.4 (hongos levaduras, ciertas bacterias quimioautotrofas); neutrófilos, con pH óptimo de crecimiento de 6.5 a 7.5 (la mayoría de bacterias ambientales y patógenas) y alcalófilos, con pH óptimo de 9 y 10 (microorganismos productores de lipasas, Archaea).

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NOTA: Ver en el siguiente enlace para mayor información (desde la página 8): http://www.higiene.edu.uy/cefa/2008/FisiologiayMetabolismoBacteriano.pdf

Lección 20. Oxígeno y el crecimiento microbiano Los microorganismos tienen diferentes exigencias respecto a la concentración o disponibilidad de oxígeno para cumplir con todas sus funciones metabólicas (figura 26). Los microorganismos aerobios producen más energía a partir del nutriente respecto a los que no usan el oxígeno. Se clasifican en relación al oxígeno como:

• Aerobios estrictos Son aquellos que necesariamente requieren el oxígeno para vivir, su metabolismo es de respiración aerobia es decir que el oxígeno es el aceptor final de electrones. La enzima catalasa y superóxido dismutasa (SOD) permite que contrarreste las formas tóxicas del oxígeno como es el caso de los radicales libres, anión peróxido, radical hidroxilo, etc. Existen aerobios facultativos, los cuales pueden crecer en presencia o ausencia de oxígeno. • Anaerobios facultativos Utilizan el oxígeno cuando está presente pero cuando no hay pueden continuar su crecimiento a través de la fermentación o respiración anaerobia. Aunque su crecimiento es mayor en presencia de oxígeno así como su producción de energía. Ejemplo, Escherichia coli.

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Figura 26. Efecto del oxígeno en el crecimiento microbiano. (a) Microorganismos aerobios; (b) anaerobios estrictos; (c) anaerobios o aerobios facultativos (c); (d) microaerófilos y (e) anaerobios aerotolerantes. (Tomado de Madigan et al. 2003).

• Anaerobios estrictos No pueden usar el oxígeno molecular (O2) como aceptor de electrones para la producción de energía ni para su crecimiento. No tienen enzimas para neutralizar las formas tóxicas del oxígeno y por esto dada su extrema sensibilidad pueden morir cuando este elemento está presente en el medio. Ejemplo, especies de Clostridium. • Anaerobios aerotolerantes Toleran el oxígeno porque tiene una enzima (SOD), que neutraliza las formas tóxicas del oxígeno pero no lo usan para su crecimiento ni para la obtención de energía. Los de este grupo fermentan los carbohidratos para formar ácido láctico. Ejemplo, los lactobacilos usados en la producción de quesos, yogures y alimentos fermentados. • Microaerófilos Son aerobios que requieren oxígeno pero no en concentraciones elevadas. Son sensibles a radicales libres y peróxidos. Su tipo de respiración es aerobia. Ejemplo, bacterias de aguas negras, Methanobacterium formicicum.

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NOTA: Leer la sección 6.13 oxígeno y crecimiento microbiano en: Madigan, M., Martinko, J & Parker, J. (2003). Brock biología de los microorganismos. (10 Ed). Madrid: Pearson Prentice Hall.

CAPITULO 5. Eucariota y procariota Lección 21. Archaea Son microorganismos procariotas unicelulares con morfología similar a las bacterias (cocos, bacilos) y con otras formas diferentes (células rectangulares, cuadradas y planas). Una característica importante es que la pared celular no contiene peptidoglucano como las bacterias sino proteínas, los lípidos de la membrana celular se unen mediante enlaces éter los cuales le dan una mayor resistencia para sobrevivir en ambientes extremos (salinidad, acidez, alcalinidad), utilizan isoprenoides para sintetizar fosfolípidos de membrana que impidan la fusión de éstas a altas temperaturas, en algunas archaeas la membrana celular está constituida por una monocapa lipídica. Su locomoción o desplazamiento se da con la ayuda de flagelo, a diferencia de otras células no forman esporas, se reproducen asexualmente y se dividen por fisión binaria, fragmentación o brotación. Viven en ambientes extremos como aguas termales, lagos salados, alta presión, bajas temperaturas y en ambientes habituales: océanos, suelos, humedales. Aunque pueden establecer relaciones simbióticas con otros organismos (comensalismo y mutualismo) todavía no se conocen archaeas patógenas humanas. Nutrición Su metabolismo es muy diverso; algunos son fotótrofos (usan la luz como fuente de energía) pero no producen oxígeno como las plantas o las cianobacterias, otras archaeas son litótrofas (compuestos inorgánicos como fuente de energía y carbono) y también pueden tener una nutrición organotrófa (compuestos orgánicos como fuente de energía y carbono). Aunque también existen especies que fijan el CO2 (autótrofos). Sus necesidades fisiológicas de oxígeno varían entre aerobios, anaerobios facultativos o aerobios estrictos. La figura 27 muestra algunas divisiones del dominio Archaea.

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Figura 27 . Dominio Archaea. (Tomado del enlace: http://universe-review.ca/F10-multicell.htm).

Algunos grupos fisiológicos

• Halófilos extremos Viven en ambientes de elevada salinidad (incluso cercanos a la saturación) como lagos salados y salinas. Cuando un ambiente salino se acerca a una concentración mínima de sales las archaeas comienzan a crecer y forman una tonalidad rojiza producida por carotenoides y otros pigmentos. Algunos géneros crecen en ambientes muy alcalinos (pH de 9 – 11) pero la mayoría, entre ellos el género Holobacterium lo hace en medios ácidos, pueden ser gramnegativos, inmóviles aunque algunas tienes flagelos, tienen una gran proporción de plásmidos y casi todas son aerobias estrictas. Una característica particular de este grupo frente a otras archaeas es que los ribosomas requieren altas concentraciones de potasio (Madigan et al 2003) (figura 28).

• Metanógenos Estos microorganismos producen metano como producto de desecho a partir de la respiración (metanogénesis). Son anaerobios estrictos, existen algunos termófilos aunque la mayoría son mesófilas. Los sustratos utilizados para la producción de metanol son diversos (CO2, CO, formato, metílicos y acetotróficos). Su hábitat está en ambientes anóxicos (fangos pantanosos, sedimentos de lagos, tracto digestivo de mamíferos e insectos, fuentes hidrotermales, etc. En este grupo está el género Methanobacterium y Methanococcus (Madigan et al 2003) (figura 28).

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Figura 28. Archaeas halófilas y metanógenas. A la izquierda Halococcus archaea y a la derecha Methanobacterium formicicum. Imágenes tomadas de los enlaces: http://www.sciencephoto.com/images/download_lo_res.html?id=662440039 y http://www.lookfordiagnosis.com/mesh_info.php?term=Methanobacterium&lang=2

• Thermoplasmatales Contiene tres géneros que además de ser termófilos son acidófilos extremos. El género Thermoplasma, es aerobio facultativo, crece a pH 2.0, no tienen pared celular pero si flagelos, es quimioorganotrofo; se pueden encontrar en restos orgánicos del carbón. El género Ferroplasma, es quimiolitótrofo y autótrofo, obtiene la energía a partir del ión férrico y usa el CO2, crece a 35 °C, tampoco tiene pared celular. Por último el género Picrophilus, puede crecer en pH de 0.06, tiene pared celular a pH moderados de 4.0 las células se desintegran (Madigan et al 2003) (figura 29).

Figura 29. Microfotografía de Thermoplasma acidophilum. Tomado del enlace: http://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Thermoplasma

• Hipertermófilos de volcanes terrestres Pueden vivir a temperaturas de 100 °C, en este grupo está el género Sulfolobus, que crece en manantiales ricos en azufre y a pH ácidos, es quimiolitotrófico aeróbico, este microorganismo se adhiere a los cristales de

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azufre pero también puede usar iones de hierro y cobre (Madigan et al 2003) (figura 30).

Figura 30. Solfulobus archaea. Microfotografía tomada del enlace: http://www.sciencephoto.com/media/13222/enlarge

NOTA: Leer el capítulo 13 Diversidad procariota Archaea en: Madigan, M., Martinko, J & Parker, J. (2003). Brock biología de los microorganismos. (10 Ed). Madrid: Pearson Prentice Hall.

Lección 22. Hongos Son microorganismos eucariotas pertenecientes al reino Fungi, pueden ser unicelulares (levaduras) o pluricelulares (setas). Es uno de los grupos más heterogéneos. A diferencia de las plantas la pared celular está compuesta en su mayoría por quitina. Su hábitat es muy diverso, pueden estar presentes en la materia orgánica en descomposición del suelo, en ambientes acuáticos (agua dulce o salada), en desiertos, sedimentos marinos, o infectando otros organismos como las plantas y animales (incluido el hombre). No poseen cloroplastos por lo tanto son heterótrofos, incapaces de fabricar su alimento, a diferencia de células animales vierten enzimas hidrolíticas al medio extracelular para facilitar la absorción de nutrientes. Su reproducción puede ser sexual o asexual. De acuerdo a su morfología macroscópica y microscópica se dividen en hongos filamentosos, levaduriformes y carnosos.

• Hongos filamentosos (mohos) y carnosos Están compuestos por hifas o filamentos que se pueden unir y entrelazar de forma abundante hasta formar el micelio que puede verse a simple vista. Las hifas pueden estar divididas por tabiques llamados septos, con la presencia de

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un núcleo o también pueden ser aseptadas o cenocíticas (con muchos núcleos). Tienen pequeños poros que permiten el intercambio. El micelio se clasifica en aéreo (o reproductivo), éste crece en la superficie del medio de cultivo y contiene las estructuras reproductivas (conidias o esporas) y el micelio vegetativo, que está dentro del medio de cultivo para absorber y obtener los nutrientes (figura 31).

Figura 31. Ejemplos de hongos filamentosos. A la derecha Aspergillus sp. (Tomado del enlace: http://www.emlab.com/s/sampling/env-report-09-2006.html) y a la izquierda cultivo en agar de Aspergillus fumigatus tomado del enlace: http://es.wikipedia.org/wiki/Aspergillus_fumigatus.

• Hongos levaduriformes Son microorganismos unicelulares, de forma ovalada más grandes que las bacterias, se dividen por gemación o brotación (figura 32), su hábitat es generalmente en ambientes con azúcares: frutos, cortezas, flores; también pueden infectar insectos o animales. Es importante aclarar que no todas son patógenas, por ejemplo, Saccharomyces es muy usada en procesos fermentativos en la industria alimentaria.

Figura 32 . Ejemplo de hongo levaduriforme. Microfotografía de Saccharomyces cerevisiae. Tomado de http://www.microbiologyonline.org.uk/about-microbiology/introducing-microbes/fungi

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Reproducción Los hongos tienen reproducción sexual y asexual a través de esporas, las cuales no podemos confundir con las endosporas de las bacterias que son estructuras de resistencia y no reproductiva. Son dos los tipos de esporas (esporas sexuales y conidias o esporas asexuales). Las esporas asexuales (conidias) se desprenden de una hifa, y cuando germinan se convierten en un individuo idéntico al parental; mientras que, las esporas sexuales fusionan núcleos e intercambian material genético de tal manera que la célula hija tendrá características de ambas cepas parentales (Tortora et al. 2007). Nutrición y aplicaciones ambientales Los hongos son heterótrofos (quimioorganotrofos que necesitan compuestos orgánicos como fuente de energía y carbono), crecen en ambientes con pH ácidos (alrededor de 4 y 5) y altas concentraciones de azúcares porque su requerimiento de carbohidratos es más alto que el de las bacterias, mientras que el del nitrógeno es menor, los hongos filamentosos son aerobios entretanto las levaduras son anaerobias facultativas, no existen hongos anaerobios estrictos. Los hongos tienen la capacidad de degradar carbohidratos complejos como la lignina y celulosa en sus actividades metabólicas, compuestos que se encuentra en grandes cantidades en las plantas, por lo tanto tienen un papel beneficioso en la descomposición de material vegetal muerto, leñoso o de desecho en los bosques. También establecen relaciones simbióticas con las plantas (micorrizas) y le ayudan a la absorción y asimilación de minerales que serían muy difíciles de captar por la planta individualmente. Los hongos también producen sustancias de interés industrial y farmacológico (etanol, bebidas, antibióticos, etc), además de utilizarse como fuente de alimentos ya que mucho de ellos son comestibles (champiñones) y tienen importantes calidades nutricionales de carbohidratos, proteínas y vitaminas. Algunos filos de importancia

• Zygomycota Son hongos filamentosos que crecen en materia orgánica en descomposición (saprofitos), también infectando insectos, tienen hifas cenocíticas. Sus esporas

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sexuales (zigosporas), son grandes y cubiertas por una pared gruesa, se que se producen por meiosis; las esporas asexuales se conocen como esporangiosporas. Entre los hongos más conocidos tenemos al moho de pan, Rhizopus stonolifer y el Mucor sp. Ver la figura 33. • Basidiomycota Tienen hifas septadas, se encuentran en el suelo o material vegetal, las basidiosporas son sus esporas sexuales que se forman por meiosis, y las conidias sus esporas asexuales. Dentro de este grupo encontramos a las setas u hongos macroscópicos. Ver figura 34. • Ascomycota Es el grupo más grande, también llamados hongos en sacos, crecen en diversos ambientes (suelos, vegetales, cuero, tela, vidrios, madera, etc). Sus esporas asexuales son los conidios y la sexuales las ascosporas. También hay levaduriformes entre ellos Saccharomyces cerevisiae (ampliamente usada en procesos fermentativos), la mayoría de los líquenes, muchos actúan como micorrizas u hongos endófitos. Ver figura 34.

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Figura 33. Ciclo de vida del moho del pan Rhizopus stolonifer. (a) Reproducción asexual y (b) reproducción sexual del hongo Rhizopus stolonifer. Tomado del enlace: http://iescarin.educa.aragon.es/estatica/depart/biogeo/varios/BiologiaCurtis/Seccion%205/5%20-%20Capitulo%2029.htm

Figura 34 . Ciclo de vida de Basidiomycota y Ascomycota. A la izquierda y derecha respectivamente.http://iescarin.educa.aragon.es/estatica/depart/biogeo/varios/BiologiaCurtis/Seccion%205/5%20-%20Capitulo%2029.htm

NOTA: Leer la sección 14.9 sobre hongos en: Madigan, M., Martinko, J & Parker, J. (2003). Brock biología de los microorganismos. (10 Ed). Madrid: Pearson Prentice Hall.

Lección 23. Hongos mucosos Son organismos eucariotas, que producen esporas y tienen movimientos ameboides, se encuentran en material vegetal en descomposición, suelo, en ambientes húmedos o acuáticos y se alimentan de principalmente de bacterias que ingieren por fagocitosis. Existen dos grupos:

• Hongos mucosos celulares Se originan de la germinación de una espora en condiciones favorables que genera amebas individuales que pueden agregarse gracias a la señal de adenosinmonofosfato cíclico (cAMP) para posteriormente formar otro cuerpo fructífero que produzca esporas. Son conocidos como hongos acelulares.

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Pueden tener reproducción sexual o asexual. Ejemplo, el género Dictyostelium (figura 35).

Figura 35 . Ciclo de vida de Dictyostelium discoideum. (Tomado de Kessin, 2000).

• Hongos mucosos plasmodiales Son una masa protoplasmática multinucleada llamada plasmodio, con movilidad ameboide, tienen microfilamentos debajo de la membrana plasmática que favorecen el desplazamiento. Pueden tener reproducción sexual u asexual. Ejemplo el género Physarum (figura 36).

Figura 36 . Hongos mucilaginosos. A la izquierda imagen de un plasmodio reticulado y a la derecha imagen de cuerpos fructíferos. Tomado del enlace:

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http://cnho.wordpress.com/2010/05/28/%C2%ABhongos-mucilaginosos%C2%BB %C2%BFreinventando-la-pluricelularidad/

NOTA: Leer la sección 14.10 sobre hongos mucosos en: Madigan, M., Martinko, J & Parker, J. (2003). Brock biología de los microorganismos. (10 Ed). Madrid: Pearson Prentice Hall.

Lección 24. Protozoos Son organismos unicelulares eucariotas, sin pared celular, se mueven a través de flagelos, cilios o seudópodos (pies falsos), son mucho más grandes que las bacterias, algunos tienen cloroplastos (dinoflagelados y euglenoides), presentes en ambientes acuáticos (agua dulce o salada), suelo, árboles, ambientes húmedos, viven como entidades libres o como parásitos. Pueden reproducirse sexual (conjugación) o asexualmente (fisión). Forman estructuras en medios adversos llamados quistes. Nutrición Son quimioheterótrofos, principalmente aerobios, saprofitos (alimentación de materia orgánica en descomposición), los ciliados se nutren por fagocitosis donde el alimento (bacterias, resto de células, pequeñas células eucariotas) entra por una abertura semejante a una boca llamada (citostoma) hacen la digestión en las vacuolas y los desechos salen por un poro anal. Al estadio de alimentación o crecimiento se le conoce como trofozoito. Al ser depredadores que cazan bacterias, hongos pequeños y algas juegan un papel muy importante en la cadena alimentaria y en el equilibrio de la biomasa y poblaciones de la microbiota. Unos pocos son patógenos humanos pero lo que están en este grupo tienen una gran repercusión en la salud pública. Reproducción Su reproducción en forma asexual es por fisión o esquizogonia (el núcleo sufre múltiples divisiones para formar varios núcleos que luego son rodeados por citoplasma para formar nuevas células hijas). En la reproducción sexual (conjugación) de algunos ciliados como el Paramecium como lo muestra la figura 37, dos células con núcleos haploides se fusionan donde un núcleo migra hacia el otro y al separarse las dos células cada una queda fecundada donde luego de la división producirán células hijas con ADN recombinante (Tortora et al 2007).

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Clasificación Basados en el tipo de locomoción o movimiento podemos clasificarlos en varios grupos:

• Mastigophora: flagelados Son protozoos flagelados (uno o más flagelos) de vida libre, están presentes en ambientes acuáticos y pueden ser patógenos de animales (incluido el hombre). En este grupo encontramos a los euglenoides los cuales tienen cloroplastos que le permiten tener un tipo de nutrición fotoautótrofa, pero cuando no tiene luz disponible puede crecer como un quimioorganotrofo (figura 38). Dentro de los flagelados se encuentran los hemoflagelados (parásitos de la sangre) como el género Trypanosoma que son transmitidos por insectos hematófagos. • Ciliophora Poseen filamentos cortos y numerosos (cilios) alrededor de la célula que le permiten el desplazamiento, el ciliado más conocido es Paramecium (figura 39). Pueden estar presentes en agua dulce o salada además de infectar animales.

Figura 37. Conjugación del protozoo Paramecium. Tomado del enlace: http://www.geocities.ws/batxillerat_biologia/reprosex.htm

• Sarcodina Se desplazan por medio de proyecciones o extensiones del citoplasma llamadas seudópodos, pueden estar presentes en ambientes acuáticos y

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parasitar animales. En este grupo se encuentra las amebas como Entamoeba histolytica que causa enfermedades como la disentería. (Figura 38) • Esporozoos Son parásitos obligados e inmóviles en estado adulto. El ejemplo más importante es el género Plasmodium causante de la malaria (figura 38).

Figura 39 . Ejemplo de ciliophora. Paramecium y sus partes. Tomado del enlace: http://www.geocities.ws/batxillerat_biologia/reprosex.htm

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Figura 38 . Phylum del reino protista. Este reino incluye hongos mucosos, protozoos y algas. En el cuadro se describen algunas características y ejemplos. (Tomado del enlace: http://cnho.wordpress.com/2010/05/28/%C2%ABhongos-mucilaginosos%C2%BB-%C2%BFreinventando-la-pluricelularidad/).

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NOTA: Leer por favor las páginas 8 hasta la 11 del siguiente enlace: http://docencia.udea.edu.co/bacteriologia/MicrobiologiaAmbiental/microbiologia_7.pdf

Lección 25. Algas Son organismos eucariotas, unicelulares o pluricelulares, forman agregados, tienen cloroplastos que le permiten realizar procesos de fotosíntesis, la mayoría son verdes pero pueden presentar coloraciones rojizas o marrones gracias a las xantofilas, viven en ambientes acuáticos y en el suelo. Cuentan con varios tipos de clorofila y polímeros de reserva que incluso sirven para su identificación, existen formas microscópicas y macroscópicas. Las algas multicelulares tienen un cuerpo conocido como tallo. Tienen reproducción sexual y asexual. La composición química de sus paredes celulares es variable en algunas está formada por celulosa modificada por polisacáridos (xilano, peptina, ácido algínico, etc), en otras por carbonato de calcio, quitina o silicio (diatomeas). Las paredes celulares tienen poros que le permiten el ingreso de moléculas pequeñas, iones y sustancias nutritivas para su metabolismo (Madigan et al 2003). Son habitantes cosmopolitas de la tierra, productores de oxígeno, la mayoría se encuentran en aguas oceánicas pero es muy común observarlas en ríos, rocas, vegetales, plancton, cortezas, paredes y formando asociaciones simbióticas mutualistas con hongos (líquenes), animales y helechos. Aunque también existen algas parásitas. Tienen una gran importancia ecológica porque fijan el dióxido de carbono en moléculas orgánicas que puedan ser asimiladas por organismos quimioheterótrofos, convierten el CO2 en carbohidratos y producen oxígeno. Son indicadores de contaminación y equilibrio ambiental (Tortora et al 2007). La ficología es la ciencia que estudia las algas. Las figuras 38, 40, 41 y 42 muestran ejemplos de los grupos de algas. Las figuras 40 y 41 fueron tomadas del enlace virtual: http://www.tutorvista.com/content/biology/biology-iii/kingdoms-living-world/algae.php

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Algunos filos de algas Cuadro 5 . Comparación de características de filos de algas.

Phylum Nombre Pared Celular

Morfología Pigmentos Reserva Aplicación/característica

Phaeophyta Algas pardas Celulosa o

alginato

Multicelulares con filamentos

o ramificaciones semejantes a

plantas

Clorofilas a c y

xantófilas

Carbohidratos (laminaria)

El alginato se usa en la industria de alimentos (helados, repostería), neumáticos, lociones. viven en ambientes marinos

Rhodophyta Algas rojas Celulosa Unicelulares y multicelulares, filamentosas

con ramificaciones

Clorofilas a y d,

ficocianina y ficoeritrina

Polímeros de glucosa, floridean

Obtención de agar y carragenina / algunas algas producen toxinas mortales. Viven en ambientes marinos

Chlorophyta Algas verdes Celulosa Unicelular y multicelular

Clorofilas a y b

Almidón Forman el verde en estanques. Viven en agua dulce y suelo

Bacillariophyta Diatomeas Pectina y sílice

Unicelulares Clorofilas a y c,

carotenos y xantófila

Lípidos o aceite

Algunas pueden causar intoxicaciones por el ácido domoico. Presentes en agua dulce y marina

Pyrrophyta Dinoflagelados o plancton

Celulosa Unicelulares Clorofila a y ce,

carotenos y xantinas

Almidón Algunas algas producen neurotoxinas, producen la marea roja. Viven en ambientes marinos.

Figura 40 . Ejemplos de Phaeophyta.

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A B Figura 41. Ejemplos de Clorophyta y Rodophyta. A, algas pertenecientes Clorophyta y B pertenecientes a Rodophyta.

A B Figura 42. Ejemplos de Bacillariophyta y Pyrrophyta. Izquierda, varios tipos de diatomeas. A la derecha Gonyaulax verior (A) una célula viva; (b) tecas en vista dorsal y ventral; (C) un quiste. Tomadas de http://www.flickr.com/photos/52345239@N05/sets/72157625392836753/detail/ http://www.nordicmicroalgae.org/taxon/Gonyaulax

NOTA: Leer por favor el siguiente enlace para mayor información: http://docencia.udea.edu.co/bacteriologia/MicrobiologiaAmbiental/microbiologia_7.pdf

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CAPÍTULO 6. Sistema de vida anaerobio Lección 26. Respiración anaerobia Es un proceso de generación de energía (ATP) a través de reacciones de oxido reducción similar a la respiración aerobia pero se caracteriza porque el aceptor final de electrones no es el oxígeno molecular (O2) sino sustancias inorgánicas como nitratos (NO3-), iones de hierro (Fe3+), sulfatos (SO42-), carbonatos y en algunas o pocas ocasiones compuestos orgánicos (figura 43). En este tipo de respiración se obtiene menos energía que en la respiración aerobia pero es vital para la supervivencia y metabolismo de microorganismos anaerobios estrictos, aunque también puede presentarse en anaerobios facultativos los cuales en ausencia de oxígeno recurren a esta vía.

Figura 43. Ejemplos de respiración anaerobia. (Tomado de Madigan et al. 2003).

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Al igual que en la respiración aerobia también hay una cadena transportadora de electrones análoga (con citocromos, quinonas, ferrosulfoproteínas y otras proteínas transportadoras de electrones), presentes en la membrana celular. Entre los microorganismos que utilizan esta vía tenemos: Pseudomonas, Bacillus, Desulfovibrio, Thermoplasma, Methanococcus, etc. La fermentación y la respiración anaerobia son dos procesos diferentes, porque aunque la fermentación es anaeróbica en ésta no participa una cadena transportadora de electrones y el aceptor final es una sustancia orgánica. Es importante resaltar que los microorganismos que emplean este tipo de respiración tienen un crecimiento más lento respecto a los que usan la respiración aerobia. Metabolismo asimilador y desasimilador Muchos microorganismos usan compuestos inorgánicos como fuentes de nitrógeno, carbono, hierro, azufre, etc donde estos grupos se reducen, pero no podemos confundir la asimilación con el uso de iones inorgánicos como aceptores finales de electrones. Para esto se emplean dos términos: asimilación y desasimilación. En la asimilación sólo se reducen los compuestos suficientes para cumplir las necesidades nutritivas del microorganismo y formar macromoléculas (frecuente en bacterias, hongos, plantas superiores, etc), mientras que, en el metabolismo desasimilador se reduce una cantidad mayor de compuestos orgánicos para ser aceptores de electrones, esto sólo ocurre en ciertas procariotas (Madigan et al 2003).

NOTA: Leer la sección 17.13 sobre respiración anaerobia en: Madigan, M., Martinko, J & Parker, J. (2003). Brock biología de los microorganismos. (10 Ed). Madrid: Pearson Prentice Hall.

Lección 27. Reducción del nitrato y proceso de desn itrificación El nitrato (NO3-) y el amoniaco (NH3) son fuentes de nitrógeno inorgánico que pueden usarse como aceptores de electrones en la cadena respiratoria anaerobia. Uno de los más comunes y estudiados es el NO3-, el cual puede ser reducido con la participación de enzimas (nitrato reductasa, nitrito reductasa, óxido nítrico reductasa, y óxido nitroso reductasa) todas ellas presentes en la membrana celular, las dos primeras se encuentran inmersas en la membrana mientras que

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las restantes sólo en la superficie. Ellas sólo se activan en ausencia de oxígeno y cuando el nitrato está presente antes de expresarse completamente las enzimas. Cuando el aceptor de electrones nitrato es reducido a productos gaseosos que pasan a las atmósfera se le conoce como desnitrificación.

NO3- → NO2- → NO → N2O → N2

Cada reacción es catalizada por las cuatro enzimas descritas arriba en su orden. La nitrato reductasa (que contiene molibdeno) inicia la reducción del nitrato a nitrito y la nitrito reductasa lo reduce a óxido nítrico y así sucesivamente hasta obtener nitrógeno gaseoso. Al ser el nitrato una forma de nitrógeno accesible para las plantas las desnitrificación es considerada una pérdida para la agricultura porque este pasa a la atmósfera como N2. Este proceso puede presentarse cuando los suelos están anegados y la concentración de oxígeno disminuye. Pero puede convertirse en un beneficio para le tratamiento de aguas residuales porque la reducción de nitrato desfavorece el crecimiento de algas. En bacterias como Escherichia coli el nitrato sólo se reduce a nitrito mientras que el las bacterias Paracoccus denitrificans y Pseudomonas stutzeri es reducido hasta nitrógeno molecular además durante el transporte de electrones en la cadena respiratoria anaerobia se genera un fuerza motriz protónica que produce ATP (figura 44).

Figura 44 . Posible transporte de electrones en Pseudomonas stutzeri durante la desnitrificación. Note que hay enzimas inmersas en la membrana celular y periplásmicas. Fp = flavoproteinas, Q= ubiquinona y Cyt= citocromos. (Tomado de Madigan et al. 2003).

Es importante mencionar que la mayoría de las procariotas desnitrificantes en presencia de oxígeno realizan respiración aerobia ya que ella les proporciona más energía aunque esté presente el nitrato (Madigan et al 2003).

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NOTA: Leer por favor el siguiente artículo para mayor información: http://www.unicolmayor.edu.co/invest_nova/NOVA/NOVA6_ARTORIG4.pdf

Lección 28. Reducción de sulfatos En los sistemas anaeróbicos el sulfato (SO4-), la forma más oxidada del azufre, se usa como aceptor de electrones para generar energía y reducirlo finalmente a sulfuro (H2S) para luego excretarlo. El sulfuro de hidrógeno es un compuesto importante en procesos biogeoquímicos. El proceso más favorable energéticamente es la respiración aeróbica, pero entre la reducción de nitrato y sulfato esta última es menos favorable. Entre los compuestos donadores de electrones más usados por las bacterias sulfato reductoras para reducir el sulfato están el acetato, lactato, piruvato, etanol, fumarato, fosfitos, etc. Para que el sulfato se reduzca a sulfuro deben ocurrir varias etapas. Primero la activación del sulfato , como el sulfato es una sustancia estable éste debe activarse con ATP por medio de la enzima ATP sulfurilasa la cual une el sulfato a un fosfato del ATP para formar adenosina fosfosulfato (APS), el APS puede reducirse a sulfito (SO3-2 + AMP) por la actividad de la enzima APS reductasa y por último el sulfito se reduce al sulfuro (H2S) por la acción de la sulfito reductasa (figura 45).

Figura 45. Reducción del sulfato. Esquema de reducción asimiladora y desasimiladora del sulfato (tomado de Madigan et al. 2003).

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Durante la reducción del sulfato el transporte de electrones genera una fuerza motriz protónica útil para la producción de ATP por la acción de una enzima APT asa. En este transporte de electrones participan varias proteínas periplásmicas (enzima hidrogenasa, citocromo c3, complejo de citocromo Hmc). Primero los electrones donados por el sustrato citoplasmático son recibidos por la enzima hidrogenasa las cual los transfiere al citocromo c3 y éste a su vez al complejo Hmc el cual finalmente los transporta por la membrana celular hasta el citoplasma donde los recibe la molécula de APS que finalmente puede reducirse por la acción de la sulfato reductasa hasta formar sulfuro. Entonces finalmente, un sulfato reducido a sulfuro genera fuerza motriz protónica que produce una molécula de ATP. Pero cuando el lactato o piruvato es el donador de electrones se genera otra molécula de ATP producida por la oxidación del piruvato a acetato (Madigan et al 2003) ver figura 46. Este es un proceso típico en Desulfovibrio desulfuricans.

Figura 46. Transporte de electrones en bacterias reductoras de sulfato. Para mayor detalle leer el texto (tomado de Madigan et al. 2003).

En el metabolismo asimilador del sulfato, es decir el que tiene como finalidad la formación de compuestos orgánicos de azufre o biosíntesis, la enzima APS quinasa añade otro grupo fosfato a la molécula de APS para formar fosfoadenosina fosfosulfato (PAPS) el cual puede continuar sus etapas hasta la formación de sulfuro.

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Todos los microorganismos reductores de sulfato son anaerobios obligados. El acetato también es usado por muchas bacterias como donador de electrones para la reducción del sulfato. Otras bacterias sulfato reductoras usan compuestos de azufre en estado de oxidación intermedio para reducir desproporcionadamente compuestos de azufre. También se ha aislado una bacteria autótrofa y anaerobia estricta (Desulfotignum phosphitoxidans) que acopla la reducción del sulfato a la oxidación del fosfito (HPO3-) obteniendo como productos fosfatos y sulfuro. Como el fosfito se oxida espontáneamente en el aire todavía no se conoce el sustrato que usa para obtenerlo pero se asume que puede estar presente en ambientes anaeróbicos (Madigan et al 2003).

NOTA: Leer por favor el siguiente artículo para mayor información: http://www.youtube.com/watch?v=9kUNmx4JBkA

Lección 29. Metanogénesis Es un proceso que realizan microorganismos conocidos como metanógenos (archaeas anaerobias estrictas) que usan el carbono (dióxido de carbono) como aceptor final de electrones para producir metano.

CO2 + 4 H2 → CH4 + 2H2O Coenzimas que participan en la metanogénesis Según Madigan et al. (2003) pueden dividirse en las transportadoras de carbono y en las que suministran electrones en la reacciones de óxido reducción:

• Coenzima metanofurano (MF) Transportan la unidad de carbono desde el sustrato inicial que puede ser CO2

hasta el sustrato final CH4. Participa en la primera etapa de la metanogénesis. • Coenzima metanopterina (MP) Porta la unidad de carbono en las etapas intermedias de la conversión del dióxido de carbono a metano.

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• Coenzima M (CoM) Participa en la etapa final de la metanogénesis, convierte el metilo (CH3) a metano (CH4). Es la coenzima más pequeña de todas. • Coenzima F430 Su estructura está formada con un tetrapirrol con níquel, participa en el paso final de la metanogénesis como un complejo enzimático de metilreductasa. A diferencia de las anteriores no porta la unidad de carbono. • Coenzima F420 Es un derivado de flavina que participa como donador de electrones en la reducción del dióxido de carbono. Esta coenzima fluoresce a 420 nm y puede se usada para identificar metanógenos. • Coenzima B (CoB) Participa al finalizar la metanogénesis con el complejo enzimático de la metilreductasa.

Proceso de metanogénesis

Aunque la reducción del dióxido de carbono a metano usualmente depende del hidrógeno molecular (H2), otros compuestos (acetato, formiato, monóxido de carbono, alcoholes, etc) también pueden actuar como donadores de electrones para la reducción del CO2.

En la metanogénesis el CO2 es activado por la enzima que contiene metanofurano (MF) y reducido a formilo, luego éste se transfiere a la enzima que tiene metanopterina (MP), aquí se produce una molécula de agua y lo reduce a metileno, posteriormente lo vuelve a reducir a metilo. El grupo metilo es transferido a la enzima CoM para formar metil-CoM y reducirse finalmente a metano por la acción del complejo enzimático metil reductasa donde participan activamente F430 y CoB. La F430 quita el CH3 del CH3-CoM y forma el complejo Ni2+-CH3 que es reducido por los electrones aportados por el complejo unido por puentes disulfuro CoM-S-S-CoB; para mayor ilustración ver la figura 47. (Madigan et al 2003). La enzima que contiene F430 genera una fuerza motriz protónica capaz de generar ATP, además de las reducciones asociadas a la enzima heterodisulfuro reductasa

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que generan reacciones exergónicas y extrusiones a través de la membrana celular (Madigan et al 2003). Los microorganismos metanógenos (Methanosarcina barkeri, Methanobacterim formicicum, Methanopyurus, etc) pueden encontrarse en materias orgánica en descomposición, zonas pantanosos, sedimentos, hidrotermales, reservas de petróleo y ambientes anoxigénicos con materias orgánica, aunque también pueden estar presentes en el trato digestivo de animales.

Figura 47. Proceso de metanogénesis a partir de dióxido de carbono. El átomo de carbono aparece en amarillo y la fuente de electrones en marrón. Los electrones para la reducción del CO2 provienen del H2. Para mayor detalle leer el texto. (Tomado de Madigan et al. 2003).

NOTA: Por favor algún artículo de los siguientes: http://www.redalyc.org/BuscadorTextoCompleto.oa?q=metanogenesis

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Lección 30. Acetogénesis La Acetogénesis es un proceso que realizan microorganismos conocidos como homoacetógenos (son anaerobios estrictos), que usan el CO2 (compuesto abundante en la naturaleza y ambientes anoxigénicos) como aceptor de electrones para la generación de energía y al hidrógeno (H2) u otras sustancias (azúcares, aminoácidos, ácidos orgánicos, alcoholes, etc) como donadores de electrones para producción de acetato:

4H2 + H+ + 2HCO3- CH3COO2 + 4H2O

C6H12O6 3CH3COO- + 3H+

2 piruvato + 4H 3CH3COO- + H+

Los homoacetógenos convierten el dióxido de carbono en acetato a través de la vía acetil-CoA o vía Ljungdahl-Wood en honor a sus descubridores (figura 48).

Figura 48. Producción de acetato a través de la vía acetil coenzima A. (Tomado de Madigan et al. 2003).

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La mayoría de homoacetógenos que excretan el acetato como producto del metabolismo energético son bacterias Gram positivas (Clostridium, Acetobacterium, etc). Vía de la acetil-CoA La vía de la acetil-Coenzima-A no es un ciclo, sino que reduce el dióxido de carbono y produce el acetato por medio de dos vías lineales. En la primera una molécula de CO2 se reduce al grupo metilo que hará parte del acetato y en la segunda otra molécula de dióxido de carbono se reduce para formar el grupo carbonilo, ambos se ensamblan y forman la coenzima A, precursor del acetato (figura 48). Entonces en mayor detalle, para obtener el acetato participa una enzima que usa como cofactores iones de níquel, zinc e hierro, conocida como la monóxido de carbono deshidrogenasa (CO deshidrogenasa), la cual cataliza la formación de CO que terminará en la posición carbonilo del acetato (-COO-). El grupo metilo se forma porque una segunda molécula de CO2 se reduce por la coenzima tetrahidrofolato donde ésta lo transfiere a una enzima que contiene B12; finalmente por acción de la CO deshidrogenasa se combina el grupo metil y CO, donde el Ni de la enzima interacciona con el grupo metilo y el Fe de la enzima con el CO, además de la coenzima A para formar acetil coenzima A; en este paso se genera una fuerza motriz protónica que sirve para la síntesis de ATP. Posteriormente el acetil coenzima A se convierte a acetato y se genera otro ATP. Por lo tanto un ATP se forma por la fuerza motriz protónica mientras que el otro por fosforilación a nivel de sustrato.

NOTA: Por favor leer el siguiente texto: http://www.ingenieroambiental.com/4014/tratamiento545.pdf

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UNIDAD 3. ECOLOGÍA Y MICROBIOLOGÍA

CAPÍTULO 7. METODOS PARA ESTUDIAR MICROORGANISMOS Lección 31. Análisis de comunidades microbianas basado en técnicas de cultivo Lección 32. Aislamiento de cultivo axénico Lección 33. Análisis molecular de comunidades microbianas Lección 34. Técnicas moleculares usadas en la microbiología y biotecnología Lección 35. Medición de la actividad microbiana en la naturaleza CAPÍTULO 8. RELACIONES MICROBIANAS, COMUNICACIÓN C ELULAR Y

CICLO DE NUTRIENTES Lección 36. Ecosistemas microbianos Lección 37. Comunicación celular Lección 38. Ciclo del carbono y oxígeno Lección 39. Ciclo del nitrógeno Lección 40. Ciclo del azufre CAPÍTULO 9. APLICACIONES DE LA MICROBIOLOGÍA AMBIEN TAL Lección 41. Tratamiento de residuos sólidos Lección 42. Tratamiento de agua potable Lección 43. Biorremediación Lección 44. Biodegradabilidad y efectos ecológicos Lección 45. Biorremediación de petróleo y otros contaminantes

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UNIDAD 3 ECOLOGÍA Y MICROBIOLOGÍA

CAPÍTULO 7. Métodos para estudiar microorganismos Lección 31. Análisis de comunidades microbianas bas ado en técnicas de cultivo En las muestras ambientales es casi imposible encontrar un solo tipo de microorganismo, pero cuando queremos aislar o conocer la microbiota de determinada muestra es muy importante darles las condiciones que reflejen el medio en el que los microorganismos deseados se encuentran, es decir, se debe tener en cuenta la temperatura, humedad, pH, tipo de nutrientes, consistencia adecuada del medio, presencia o ausencia de gases, luz, etc., de tal manera que las condiciones de laboratorio imiten el estado ideal del microorganismo en la naturaleza y limite el crecimiento de aquellas especies que no queremos estudiar. Uno de los métodos más usados para aislar microorganismos ambientales son los medios de cultivo, éstos pueden ser sólidos, semi-sólidos o líquidos y deben otorgarle todas las condiciones nutricionales y ambientales para que se de el crecimiento microbiano. Es importante resaltar que no todos los microorganismos pueden cultivarse en el laboratorio, por ejemplo, archaeas presentes en ambientes con temperaturas extremas. En estos casos los conocimientos de la biología molecular y la biotecnología han sido clave para poder conocer parte de este tipo de organismos extremófilos. Existen varios tipos de medios de cultivo, entre ellos tenemos:

• Medios definidos Son aquellos medios de cultivo a los que se les conoce la composición química y concentración de todos sus componentes, es decir fuente de carbono, nitrógeno, sales, etc., o sustancias particulares como vitaminas, factores de crecimiento. Estos medios suelen usarse para trabajos experimentales o para cultivar microorganismos quimioheterótrofos o autótrofos. • Medios complejos Son aquellos medios a los que no se les conoce la composición química exacta de sus componentes, como los que contienen extracto de levadura, peptona,

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extracto de carne, etc. Son muy usados en el laboratorio para microorganismos ambientales y patógenos. • Medios selectivos Contiene sustancias que favorecen el desarrollo y crecimiento de microorganismos deseados pero inhiben el crecimiento de los indeseados. Suele usarse tanto para hongos como para bacterias. Es muy útil cuando se parte de inóculos con poblaciones microbianas heterogéneas o mixtas. • Medios diferenciales Permiten diferenciar microorganismos de acuerdo a sus propiedades y reacciones de crecimiento en el medio. Ejemplo, en el agar sangre se diferencian microorganismos hemolíticos y no hemolíticos. También se usan para aislar microorganismos dentro de una mezcla. • Cultivo de enriquecimiento Se usa cuando el/los microorganismo (s) deseado está en pequeñas cantidades mientras que los indeseados están presentes en altas proporciones de tal manera que con los sustratos selectivos aportados se promueva el crecimiento de los microorganismos de interés hasta obtener concentraciones detectables. Por ejemplo, si queremos aislar de una muestra de sedimento bacterias que degraden o metabolicen lípidos a través de lipasas, lo ideal es sembrar el inóculo directamente en un medio enriquecimiento líquido que contenga lípidos (como el aceite de oliva) como única fuente de carbono y energía, de tal manera que sólo los microorganismos que tengan estas enzimas puedan crecer en él. Es muy práctico realizar pases sucesivos a medios enriquecidos frescos con el sustrato limitante para asegurar que toda la población que se obtuvo tiene lipasas (figura 49). Pero si en el estudio queremos no sólo detectar y aislar cepas lipolíticas sino también termofílicas lo indicado sería además de usar aceite de oliva como fuente de carbono y energía usar condiciones de incubación a altas temperaturas; de esta manera sólo lo lipolíticos termofílicos podrían sobrevivir en estas condiciones. Otro ejemplo de cultivo de enriquecimiento es la columna de Winogradsky, en honor al investigador que la diseñó. Esta columna es un sistema anaerobio para el enriquecimiento y aislamiento de bacterias fototróficas (rojas y verdes), sulfato reductoras, anaerobias, algas o cianobacterias; la columna de Winogradsky se realiza en un cilindro que contiene material orgánico, lodo y agua de lagos, charchos o acequia; donde los microorganismos se van

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desarrollando estratificadamente de acuerdo a sus actividades metabólicas y requerimientos ambientales (figura 50).

Figura 49 . Medio de enriquecimiento. Medio de enriquecimiento FAM + aceite de oliva al 1% (izquierda) para aislar microorganismos lipolíticos a partir de muestras de sedimentos (a la derecha). Fuente Carmen Julia Pedroza.

Figura 50 . Columna de Winogradsky. Imágenes tomadas del enlace: http://biosonia.blogspot.com/2008/12/webquest-la-columna-de-winogradsky.html

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NOTA: En el siguiente enlace encontrará mayor información: http://www.unavarra.es/genmic/microgral/Tema%2002.-%20Cultivo%20de%20microorganismos.pdf

Lección 32. Aislamiento de cultivo axénico Consiste en la obtención de colonias puras, es decir, grupo o aglomeración de microorganismos de la misma especie originados a partir de una espora o célula vegetativa; esta colonias tienes características distintivas que les permite diferenciarlas de otras. Si consideramos el ejemplo anterior de enriquecimiento de bacterias lipolíticas, pero ahora con el objetivo de aislar por aparte cada especie de bacterias (clones), es decir, obtener un cultivo puro, existen varias técnicas que puede ser muy útiles, entre ellas: diluciones seriadas, siembre en superficie, siembra en profundidad (vistas en la lección 18), siembra por estrías o agotamiento y pinzas ópticas de láser. • Siembra por estrías Se toma el inóculo de un cultivo mixto con un asa y se extiende sobre la superficie del medio de cultivo sólido contenido en una caja de petri, luego se hacen estrías en forma de zigzag, posteriormente debe esterilizarse el asa con calor, girar la caja e iniciar en la última línea que se sembró para trazar de nuevo la líneas en formar de zigzag, se esteriliza de nuevo el asa y se repite el procedimiento de tal manera que el inóculo se va agotando y las colonias que crecerán después del periodo y temperatura de incubación tendrán una distribución aislada unas de otras, de tal manera que cada colonia pueda aislarse de nuevo por agotamiento y comprobar por medio de otras técnicas que el microorganismo está puro (figura 51). Las colonias tienen características específicas que ayuda a diferenciarlas (color, borde, elevación, brillo, etc); pero además de estos detalles es muy importante apoyarse con tinciones y observaciones microscópicas para determinar morfologías o estructuras.

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Figura 51 . Método de siembra por estrías o agotamiento. (Tomado de Tortora et al. 2007).

• Pinzar de láser En esta técnica se usa un microscopio óptico invertido, con un láser infrarrojo y un instrumento de micromanipulación, donde un rayo láser se enfoca sobre una célula (puede ser una bacteria, espora, etc) de forma individual y crea fuerzas de radiación sobre ella que permite su desplazamiento controlado en cualquier dirección mientras esté sometida a la fuerza por el haz del láser. Este experimento se realiza en un tubo capilar donde está contenida la muestra mixta o población, de tal manera que cuando el láser separe la célula o bacteria de interés de la mezcla o cultivo, se corte el capilar y quede completamente aislada del resto. Luego puede transferirse a un cultivo fresco para obtener el cultivo puro o clones (figura 52) (Madigan et al 2003).

Figura 52 . Pinzas láser. También conocidas como pinzas ópticas láser (tomado de Madigan et al. 2003).

NOTA: Para mayor ilustración por favor ver este enlace: http://www.science.oas.org/Simbio/mbio_ind/cap3_mi.pdf

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Lección 33 . Análisis molecular de comunidades microbianas Existen varias técnicas que permiten cuantificar, detectar y conocer los microorganismos presentes en determinado hábitat microbiano, Madigan et al. (2003) expone varias de ellas como se describirán a continuación: Tinción fluorescente con DAPI

Es empleado para teñir microorganismos de ambientes opacos, la tinción se realizan con el colorante fluorescente 4’,6-diamino-2-fenilindol, el cual se une a los pares de bases adenina: timina (A:T) del ADN (o también al ARN) del microorganismo . Las células teñidas con DAPI muestran una fluorescencia azul brillante que facilita su detección y conteo con un microscopio de fluorescencia con luz ultravioleta. Esta es una tinción que es muy específica porque se une al ADN y no a material inerte pero no discrimina células muertas ni microorganismos específicos, de tal manera que permite la cuantificación total de la población. Se usa para cuantificar microorganismos de muestras clínicas y alimentos (figura 53).

A B Figura 53 . Tinciones fluorescentes de células. (A) Tinción con DAPI, los núcleos de las células se ve en azul. (B) Tinción de células viables, las células vivas se observan verdes mientras que las muertas rojas.

Tinción de viables A diferencia de la anterior esta técnica permite diferenciar y contabilizar células vivas y muertas. En este método se usan dos colorantes fluorescentes, verde y rojo, el verde puede penetrar todas las células muertas o vivas (viables); mientras que el rojo (yoduro de propidio) sólo penetra las células cuya membrana está dañada, es decir células muertas. Por lo tanto las células viables al teñirse de verde pueden cuantificarse. Esta técnica puede ser

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inespecífica con materiales inertes por lo tanto no se recomienda su uso en ambientes naturales si no en cultivos de laboratorio (figura 53). Anticuerpos fluorescentes Esta tinción no se realiza sobre los microorganismos sino en anticuerpos; entre los colorantes útiles para teñir anticuerpos está la Rodamina B y el isotiocianato de fluorescencia, los cuales emiten una fluorescencia roja o amarillo verdosa respectivamente. Esta técnica es muy específica porque permite la detección de anticuerpos unidos a la célula o antígenos de la superficie celular, por la emisión de fluorescencia del colorante que puede ser detectada con un microscopio. Es muy útil en estudios de ecología microbiana porque permite identificar microorganismos en ambientes naturales sin tener que aislarlos o cultivarlos además de rastrearlos en hábitats complejos. Su desventaja radica en que la preparación de anticuerpos específicos para microorganismos puede ser larga y laboriosa. Para diagnósticos clínicos es una técnica muy común por la mayor disponibilidad comercial (figura 54).

Figura 54 . Tinción con anticuerpos fluorescentes y con FISH. A la izquierda identificación de Yersinia pestis con anticuerpos fluorescentes CDC y a la derecha FISH múltiple para identificar bacterias nitrificantes de aguas residuales. En rojo oxidadotas de amoniaco y en verde oxidadotas de nitritos. (Tomado de Brock et al. 2003)

Proteína fluorescente verde Por medio de la tecnología del DNA recombinante se puede insertar un gen que codifica una proteína fluorescente verde (GFP siglas en inglés) en el genoma de una célula, de tal manera que cuando la proteína se exprese en la célula pueda observarse la coloración verde con la ayuda de un microscopio de de luz ultravioleta. Cómo sólo las células recombinantes pueden emitir el color verde no es adecuada para el estudio de poblaciones naturales (las células nativas en ambientes naturales no emiten color) pero si para observar el

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comportamiento in situ de la célula modificada genéticamente frente a las cepas nativas. Todas la técnicas descritas anteriormente requieren el uso de un microscopio para poder observar a los microorganismos, pero no representa una ayuda para estudiar la diversidad genética en los ambientes naturales porque es muy difícil diferenciar células con morfologías o tamaño, por lo tanto el uso de técnicas moleculares permite estudiar la información genética y así dilucidar funciones de genes, interacciones de microorganismos y funciones dentro de un ecosistema. Tinciones genéticas Es un método muy útil para identificar y cuantificar microorganismos en la naturaleza, se realiza con la ayuda de fragmentos u oligonucleótidos de ADN o ARN complementario a una secuencia del gen diana (blanco o de estudio) llamada sonda, donde ésta puede teñirse con colorantes fluorescentes; esta técnica se conoce como hibridación fluorescente in situ (FISH por sus siglas en inglés). • Tinción filogenética con FISH Para esta técnica se usan colorantes filogenéticos, llamados así porque la soda empleada es complementaria a una región del rRNA 16S (en procariotas) o al rRNA 18S (en eucariotas); se caracteriza porque el colorante penetra la célula directamente hasta llegar al ribosoma donde la sonda hibrida con su secuencia complementaria. Se han diseñado sondas filogenéticas para especies e incluso dominios de tal manera que se puede estudiar, identificar o rastrear organismos particulares o relacionados. La muestras naturales pueden analizarse con sondas filogenéticas múltiples por FISH donde cada sonda tendría un colorante que emita un color diferente, así se puede estudiar un hábitat completo y además de buscar organismos específicos permite establecer relaciones filogenéticas (figura 54). • Tinción de cromosomas y transcripción inversa in situ La tinción de cromosomas se usa para identificar genes específicos de ambientes naturales, por ejemplo el gen de la nitrogenasa. En este método se pueden usar varios tipos de sonda (oligonucleótidos, genes completos, conjunto de genes o incluso genomas completos fragmentados) donde la sonda marcada se unirá a la secuencia complementaria del gen o genes de

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interés y así se conoce que microorganismo presente en la muestra contiene el gen de interés. En la transcripción inversa in situ (ISRT siglas en inglés) la sonda hibrida con moléculas de mRNA, luego se da la transcripción inversa para originar ADN complementaria (cDNA) que es amplificado por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR siglas en inglés) donde finalmente el ADN amplificado hibrida con una sonda fluorescente. Esta técnica permite explorar los factores que afectan la expresión génica y transcripción de genes específicos.

NOTA: Leer la sección 18.3 y 18.4 en: Madigan, M., Martinko, J & Parker, J. (2003). Brock biología de los microorganismos. (10 Ed). Madrid: Pearson Prentice Hall.

Lección 34. Técnicas moleculares usadas en la Micro biología y Biotecnología

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) La PCR fue desarrollada en 1986 por el científico Kary Mullis, es una de las técnicas más importantes de la biología molecular y gracias a ella se han obtenido muchos avances en la biotecnología (entre ellos secuenciación y clonación). Este método amplifica una región selectiva del ADN, es decir, permite obtener muchas copias de ese fragmento simulando el proceso de replicación que se da en las células naturalmente. La técnica depende de la capacidad del ADN para desnaturalizarse e hibridar con alineadores o primers que sirven como cebadores para que la enzima Taq polimerasa (una enzima termoestable aislada del microorganismo Termus aquaticus) sintetice una nueva hebra de ADN usando una cadena de ADN como molde. Para realizar la PCR no se necesita conocer la secuencia del ADN a amplificar pero si los bordes que flanquean el ADN de interés, indispensable ésto para el diseño de los primers o cebadores (figura 55). La reacción en cadena de la polimerasa tiene varios componentes que permiten obtener muchas copias de una región del ADN, todos ellos deben estar presentes en el tubo de reacción para que tener una amplificación exitosa. Se realiza en un equipo llamado termociclador. Los componentes son: • ADN molde

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Contiene la región del ADN que se quiere amplificar, se puede usar segmentos de ADN o incluso genomas completos.

Figura 55 . Reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Tomado del enlace: http://es.wikipedia.org/wiki/Reacci%C3%B3n_en_cadena_de_la_polimerasa.

• Desoxirribonucleosidos-trifosfato (dNTP) Son los nucleótidos que componen el ADN (adenina, timina, guanina y citosina) y los que la enzima DNA polimerasa (taq polimerasa) usará para polimerizar y sintetizar nuevas copias de ADN. • Cebadores o iniciadores (primers en inglés) Son fragmentos u oligonucleótidos complementarios a cada cadena del ADN molde, los cuales apuntan entre si en direcciones opuestas. Flanquean la región a amplificar. Usualmente se usan primers de 17-20 nucleótidos (merts). El uso de primers muy pequeños o grandes genera limitantes para la PCR. • Iones Usualmente se usan el ión de magnesio divalente (MgCl2) ya que este actúa como cofactor de la enzima DNA polimerasa (taq polimerasa) para aumentar su procesividad. • Buffer

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Es una solución que mantiene el pH adecuado para la actividad de la enzima y amplificación del ADN. • DNA polimerasa Usualmente se emplea la taq polimerasa, es la enzima que se encarga de unir los dNTPs al ADN molde para sintetizar una nueva cadena de ADN que a su vez servirá como molde.

La PCR se desarrolla básicamente en tres etapas que se repiten aproximadamente 30 veces, llamados ciclos. Estas son: • Desnaturalización La molécula de ADN molde se desnaturaliza (separación de las cadenas) a altas temperaturas (usualmente a 94- 95 °C). Ver círculo 1 de la figura 55. • Alineación La mezcla de reacción se enfría a 50-60 °C para que se de la hibridación o unión de los cebadores o primers a su secuencia complementaria (alineación). Círculo 2 de la figura 55. • Extensión De nuevo se aumenta la temperatura (usualmente a 47 °C) para que la enzima Taq polimerasa sintetice una nueva cadena de ADN usando los dNTP. Círculo 3 de la figura 55. Luego de la primera extensión o elongación se vuelve al repetir de nuevo el ciclo de desnaturalización de tal manera que la cadenas de DNA nuevas puedan servir como molde para generar nuevo ADN (círculo 4 de la figura 55). Los tres ciclos se repiten aproximadamente 30 veces así que se obtienen millones de fragmentos del ADN que se quería amplificar. Los productos de PCR pueden tener varias finalidades: gel de electroforesis, clonación o secuenciación. Todas estas técnicas son indispensables para el desarrollo de microorganismos recombinantes que tengan características especiales como degradación de contaminantes ambientales, transgénicos, resistentes, etc.

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Electroforesis en gel Permite separar moléculas a través de una matriz porosa (gel de agarosa o poliacrilamida) donde la muestra (ácidos nucleicos o proteínas) migra por un campo eléctrico con base a su carga, forma, masa o tamaño. Después de terminado el corrido las muestras menos pesadas migrarán más rápido y quedarán en la parte de abajo del gel mientras que las más grandes en la parte superior. Para conocer el tamaño se usan marcadores de peso molecular conocido y programas informáticos. Comúnmente los fragmentos se pueden observar con tinciones del ADN (bromuro de etidio, con la ayuda de una cámara de luz U.V) o proteínas (con colorantes como el azul de Coomassie) (figura 56).

Figura 56 . Electroforesis de proteínas y gel de corrido. A la izquierda electroforesis en gel de poliacrilamida de proteínas (lipasas) y a la derecha corrido electroforético de producto de PCR. Fuente Carmen Julia Pedroza.

Secuenciación de ADN Es una técnica que permite conocer el orden exacto de los nucleótidos en una muestra de ADN (ADN genómico, mitocondrial o de cloroplastos, producto de PCR, plásmidos, etc); existen varios métodos para la secuenciación, entre ellos el método de terminación en cadena o el de degradación química. Clonación La clonación permite obtener muchas copias de un gen determinado, por ejemplo, se quiere estudiar un producto de PCR éste se puede introducir con la ayuda de enzimas de restricción a un vector (plásmido o fago) para obtener muchas copias del gen de interés el cual puede tener alguna característica especial (como la producción de proteínas o resistencia). Esta información genética puede llevarse hasta organismos vivos pero son varios los

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procedimientos que se realizan para lograr transformaciones o expresiones génicas.

NOTA: Leer la sección 10.14 en el libro: Madigan, M., Martinko, J & Parker, J. (2003). Brock biología de los microorganismos. (10 Ed). Madrid: Pearson Prentice Hall. Los fundamentos de técnicas como Southern y Northern blot y RFLP aparecen en este enlace: http://seqcore.brcf.med.umich.edu/doc/educ/dnapr/mbglossary/mbgloss.html Leer temas relacionados en los libros de Lodish o Brown (ver la bibliografía del módulo para mayor detalle).

Lección 35. Medición de la actividad microbiana en la naturaleza En muchos casos se estudia la actividad microbiana in situ para observar la actividad metabólica y biodiversidad en el hábitat. Madigan et al. (2003) describen varios métodos, entre ellos: • Radioisótopos Se usan las transformaciones químicas que sufren los compuestos por la actividad metabólica de los microorganismos para evaluar lo que se da en el ambiente, marcando los productos de esas transformaciones con radioisótopos, éstos son isótopos radiactivos. • Microelectrodos Son pequeños electrodos (dispositivos de oro, vidrio y platino) de cristal para medir pH, oxígeno, NO2, CO2, H2, H2S o salinidad. Son muy útiles para cuantificar la actividad de los microorganismos en la naturaleza y se puede usar para estudiar diversos microorganismos en muchos ambientes, zonas intermareales, fuentes termales, suelos, etc. • Isótopos estables

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Son isótopos que no se destruyen como resultado de la degradación radiactiva, los más usados en la ecología microbiana son los isótopos de carbono (12C) y azufre (32S) y los menos abundantes en la naturaleza son el carbono 13 y el azufre 34. Cuando el carbono y el azufre son metabolizados en las actividades celulares las reacciones bioquímicas favorecen al isótopo más liviano es decir al 12 y al 13. De tal manera que cuando el dióxido de carbono es usado por un microorganismo fotótrofo el carbono celular se enriquece en 12C y se empobrece en 13C, esto se conoce como fraccionamiento isotópico (Madigan et al 2003).

NOTA: Leer la sección 18.6 y 18.7 en: Madigan, M., Martinko, J & Parker, J. (2003). Brock biología de los microorganismos. (10 Ed). Madrid: Pearson Prentice Hall.

CAPÍTULO 8. Relaciones microbianas, comunicación ce lular y ciclo de nutrientes

Lección 36. Ecosistemas microbianos Los microorganismos están presentes en todas partes e interactúan constante mente con otros organismos estableciendo incluso relaciones intraespecíficas (dentro de la misma especie) o interespecíficas (entre diferentes especies), pero no sólo la relación con otros organismos es importante en la ecología microbiana sino también su interacción con el medio abiótico en el que están contenidos. Dado el tamaño microscópico de los microorganismos y su “incapacidad para recorrer largas distancias” éstos han desarrollado la capacidad de establecer su hábitat en muchos ambientes y para facilitar el estudio de ellos los ecólogos microbianos han definido como microambiente al lugar del hábitat en el que el microorganismo vive y desarrolla todas sus actividades metabólicas; de tal manera que un entorno tan pequeño para nosotros como una matera y tan grande para una bacteria representa millones de microambientes donde pueden desarrollarse microorganismos diferentes genética y metabolitamente, por ejemplo, los microorganismos aerobios siempre estarán en superficie mientras que los anaerobios en lo más profundo.

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A continuación se definirán una serie de términos importantes en la ecología microbiana, el orden y algunas definiciones fueron descritas por Llop et al. (2001). • Biomasa Es el conjunto de seres vivos u organismos que viven en un lugar determinado. • Biotopo Es el lugar o sitio donde se encuentra la biomasa, se caracteriza por tener condiciones ambientales uniformes. • Biocenosis Es el conjunto de seres vivos de todas las especies que coexisten en un biotopo. • Ecosistema Es una biocenosis en un biotopo determinado. En el ecosistema hay flujo de materia y energía entre sus componentes. Existen varios tipos de ecosistemas: terrestre, acuáticos y aéreos • Biosfera Es el conjunto de ecosistemas de la tierra. Se puede decir que la biosfera es el ecosistema global del planeta. • Hábitat Es el sitio o ambiente donde vive una especie o población. Debe tener las condiciones adecuadas para que los organismos que la conforman realicen todas sus actividades celulares y reproductivas que permita la supervivencia de la especie. • Nicho Es la función que realiza un organismo o población dentro de un ecosistema e incluye a los factores bióticos y abióticos con los cuales el organismo se relaciona. No debe confundirse con hábitat.

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Relaciones entre seres vivos • Neutralismo Es una relación en la que dos microorganismos tienen un comportamiento completamente independiente del otro donde ningún organismo afecta al otro; usualmente no hay interacción directa por separación física o temporal. Se relaciona más con la baja densidad celular que con la alta densidad celular. • Comensalismo Es una relación donde un solo microorganismo recibe beneficios de la interacción, sin que el otro se vea afectado. Por ejemplo, las algas fotosintéticas producen el oxígeno que puede ser usado por bacterias u organismos aerobios. Ciertos microorganismos excretan componentes que ayudan al crecimiento de otro. Otros disuelven minerales y liberan nutrientes que pueden ser usados por otros. • Amensalismo Es una relación opuesta al comensalismo donde una especie es perjudicada mientras que la otra no se afecta. Por ejemplo los antibióticos producidos por hongos matan a las bacterias presentes en el medio. • Mutualismo Implica una relación entre microorganismos que reciben beneficios mutuos; esta relación puede ser o no obligada. Ejemplo, los líquenes que están conformados por hongos y algas donde el alga proporciona nutrientes mientras que el hongo anclaje y protección. El sinergismo, simbiosis y protocooperación hacen parte del mutualismo En el sinergismo la cooperación de mutuo beneficio no es obligatoria; por ejemplo la degradación de herbicidas, un microorganismo degrada una parte del herbicida mientras que el otro degrada lo restante. La simbiosis es una relación estrecha, persistente y obligada. Por ejemplo las micorrizas (figura 57) o los protozoos con las termitas. En la protocooperación los dos microorganismos o poblaciones se benefician mutuamente pero no son necesarios para la vida de ambos ya que pueden vivir separados.

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Figura 57 . Ejemplo de micorriza. Relación simbiótica entre hongo y planta. Enlaces:http://www.forestales.net/archivos/forestal/pdfs%2024/ecologia_hongos_2.html y http://greis-micorrizas.blogspot.com/

• Competencia Es una relación en la que ambos organismos se ven perjudicados donde uno suprime al otro, usualmente compiten nutrientes, territorio, etc. Puede ser intra o interespecífica. • Parasitismo Una especie se beneficia mientras perjudica a otra. Se presente entre especies diferentes. Por ejemplo, virus que infectan a bacterias u hongos que enferman a nemátodos.

NOTA: Por favor ver el siguiente video: http://www.youtube.com/watch?v=dn5Q4eBQ2vc

Lección 37. Comunicación celular

En los últimos años se han iniciado investigaciones que permitan conocer los diferentes mecanismos que usan los microorganismos para comunicarse, éstos para “colonizar o infectar su huésped, dependen y usan el sistema de quórum sensing (QS) o sensación de quórum, descubierto inicialmente en la bacteria

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marina Vibrio fischeri en 1970, quien lo utiliza para regular la expresión de bioluminiscencia (Nealson et al. 1970). El QS bacteriano es una estrategia de comunicación célular que permite liberar y detectar pequeñas moléculas de señal que se acumulan a medida que aumenta la densidad poblacional y así, poder responder de forma individual y colectiva a cambios ambientales, además de coordinar sincronizadamente la expresión de algunos genes; por ejemplo, aparte de de la regulación de la bioluminiscencia en V. fisheri y V. harvey, se ha descubierto que este tipo de moléculas intervienen en la regulación de otros procesos biológicos en muchos organismos, entre ellos, el intercambio genético en la conjugación de Enterobacter faecalis, expresión de factores de virulencia y formación de biopelículas en Pseudomonas aeruginosa, producción de antibióticos por Streptommyces sp. etc (Oh et al. 2001; Hornby et al. 2001; Dong y Zhang, 2005)” Pedroza, 2010. Este mecanismo de regulación celular es el mismo que coordina la formación de biopelículas o biofilms, sistemas biológicos o microlonias de células bacterianas que excretan polisacáridos en la superficie conde se desarrollan y están adheridas; las biopelículas forman capas de microorganismos que facilitan la obtención de nutrientes y protección. Pseudomonas aeruginosa es una bacteria gramnegativa que tiene la capacidad de secretar pequeñas moléculas de señal conocidas como acilhomoserina lactonas (AHL) las cuales favorecen el aumento de la densidad poblacional y por lo tanto la formación del biofilm. Existen muchos tipos de moléculas autoinductores además de las AHL entre ellas: derivados de ácidos grasos, oligopéptidos, furanonas, tiolactona cíclica (AIP), éster metílico del ácido palmítico (PAME), furanosylborato (AI-2), methyl dodecenoic acid (DSF), muchas de ellas vinculadas en la regulación de la virulencia bacteriana (Dong y Zhang, 2005; Dong et al., 2007); estas señales son producidas por microorganismos ambientales no patógenos, fitopatógenos, patógenos humanos y de animales, es decir están ampliamente extendidas en los microorganismos. La formación de biopelículas puede darse en el ser humano, por ejemplo, la placa dental o causando enfermedades de importancia como la fibrosis quística entre otras; en la medicina representan un problema porque los microorganismos son más difíciles de combatir y desarrollan resistencia ante los tratamientos con antibióticos siendo un problema mayor en pacientes inmunocomprometidos (como aquellos que tienen SIDA). Los fitopatógenos usan este mecanismo para activar la expresión de genes de virulencia y causar enfermedades en plantas como es el caso de la pudrición de la papa por Pectobacteium carotovorum, ésto representa millones en la economía agrícola. En la industria las biopelículas reducen el flujo de agua, aceite, petróleo u otras sustancias líquidas que se muevan por tuberías donde los microorganismos crecen y además de contaminar pueden corroer la superficie y deteriorar las

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tuberías (figura 58). La calidad del agua potable también puede verse muy afectada porque a pesar que muchas de las bacterias que se desarrollan en las tuberías no son patógenas algunas como la Vibrion cholera pueden causar graves enfermedades en la población cuando parte de la biopelícula de microorganismo se desprenden de las tuberías y llegan hasta los consumidores. En las aguas residuales también se forman biopelículas o floc.

Figura 58 . Biopelícula microbiana. A la izquierda flujo de la corriente de agua a través de la Biopelícula y a la derecha Biopelícula bacteriana sobre una superficie de acero de un sistema de provisión de agua vista desde MEB. Los óvalos grandes son diatomeas. (Tomado de Tortora et al. 2007).

Para el control de biofilm se han propuesto investigaciones en nuevos antibióticos pero esta sería una solución costosa y quizá después de un tiempo los microorganismos desarrollarían resistencia teniendo al final cepas poderosamente patógenas y multiresistentes. Por eso se han comenzado a dilucidar mecanismos para poder contrarrestar las biopelículas interrumpiendo la comunicación celular, es decir, no matar a los microorganismos sino impedir que lleguen las “órdenes” que promuevan la formación de la biopelícula, por ejemplo hidrolizando los autoinduntores de las AHL con enzimas; este mecanismo es conocido como Quorum quenching (Q-Q) o inhibición de la comunicación celular (figura 59).

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Figura 59 . Modelo de interferencia de mecanismo de QS dependiente de AHL, (tomado de Zhang y Dong (2004).

Lección 38. Ciclo del carbono y oxígeno Son una serie de transformaciones químicas de sustancias que contienen carbono, realizada por macroorganismos y microorganismos el cual se puede dar en dos fases: aerobia y anaerobia (figura 60). El carbono está presente como constituyente de material abiótico y en organismos vivos, siendo las rocas y sedimentos marinos los mayores reservorios de carbono; otro gran portador del carbono es el humus, una mezcla compleja de materia orgánica que resulta de los organismos vivos, los mayores contenedores de carbono son las plantas terrestres las cuales a su vez juegan un papel clave en el ciclo del carbono y oxígeno, ambos muy relacionados e indispensables para el equilibro ambiental y la vida aerobia sobre la tierra.

El dióxido de carbono (CO2) es el medio más rápido de transferencia del carbono de la tierra presente en un 0.03% (Seoánez, 2002) pero en los últimos años a aumentado como resultado de las actividades antrópicas según Madigan et al. (2001) a niveles del 12%. El CO2 es el sustrato indispensable para la fotosíntesis, en este primer paso del ciclo del carbono los organismos fotoautótrofos (plantas, cianobacterias, algas y bacterias sulfurosas verdes y púrpuras) fijan o integran el CO2 en sustancias orgánicas en presencia de luz solar. De la misma manera los microorganismos quimioautótrofos fijan el dióxido de carbono en sustancias orgánicas como producto de sus actividades metabólicas para la obtención de energía pero no requieren la luz solar. El material orgánico, polisacáridos o carbohidratos formados en la fotosíntesis se usan a su vez como sustrato durante el proceso de respiración para obtener energía y producir nuevamente CO2, esta es una actividad propia de de fototróficos y quimioheterótrofos como animales, protozoos y algunos microorganismos de tal manera que el CO2 se transfiere de diversas maneras de un organismo a otro en la cadena alimentaria.

CO2 + H2O → (CH2O) + O2 (luz)

CH2O + O2 → CO2 + 2H2O (luz u oscuridad) El carbono también retorna a la atmósfera cuando los organismos mueren y bacterias y hongos descomponedores oxidan los compuestos orgánicos retornando el CO2 al ciclo. Durante esta descomposición se observan dos estados de oxidación del carbono (CH4 y CO2) donde el metano lo producen

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las bacterias metanogénicas y el dióxido de carbono quimioorganotrofos en los procesos metabólicos de fermentación o respiración aerobia y anaerobia. En ambientes anaerobios el metano puede ser sintetizado por metanógenos usando como sustrato el CO2 y a su vez sirve como alimento para microorganismos metanotrofos que lo oxidan nuevamente a CO2; de tal manera que todo el carbono orgánico se convierte nuevamente en dióxido de carbono que retorna a la atmósfera para que inicie el ciclo.

Figura 60 . Ciclo de oxido reducción del carbono. Las flecha amarillas indican oxidaciones y las rojas reducciones. Tomado de Madigan et al. 2003.

El ciclo del carbono es un equilibrio entre la fotosíntesis y la respiración y está estrechamente ligado al ciclo del oxígeno, porque este elemento indispensable para el metabolismo aerobio es producido durante la fotosíntesis de microorganismos fotoautótrofos. Con la extensión masiva de las actividades humanas y explotaciones mineras todo el equilibrio ecológico del ciclo del carbono puede verse gravemente afectado con el uso de combustibles, emisiones de CO2 y deforestación indiscriminada de bosques que trae como consecuencia menos fotoautótrofos que usen el dióxido de carbono y produzcan oxígeno de tal manera que en su conjunto todos llevan a la misma consecuencia negativa: el aumento de CO2 en la atmósfera terrestre que provoca el efecto invernadero y el calentamiento global.

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NOTA: Por favor leer el artículo del siguiente enlace: http://www.scielo.org.bo/pdf/reb/v41n3/v41n3a06.pdf

Lección 39. Ciclo del nitrógeno El nitrógeno (N) es un elemento indispensable para la vida celular y las actividades metabólicas, hace parte de los componentes de proteínas, ácidos nucleicos y otras sustancias orgánicas. A continuación veremos las etapas que sufre este elemento en la naturaleza durante su ciclo (figura 61).

Figura 61 . Ciclo del nitrógeno (tomado de Tortora et al. 2007). • Fijación del nitrógeno Termodinámicamente el nitrógeno gaseoso o molecular (N2) es el más estable en la naturaleza pero a pesar que constituye un 79 % del aire que respiramos no podemos asimilarlo directamente en esa forma para que haga parte de nuestros componentes celulares sino que sólo unos microorganismos específicos tienen la capacidad de tomarlo y transformarlo.

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La fijación del nitrógeno es un proceso que requiere gran cantidad de energía mediante el cual algunas especies de bacterias o cianobacterias fijadoras de nitrógeno convierten el nitrógeno gaseoso en amoniaco (NH3), usando una enzima inestable a la presencia de oxígeno conocida como nitrogenasa.

N2 + 8H+ + 8e− + 16 ATP → 2NH3 + H2 + 16ADP + 16 Pi

Los microorganismos fijadores de nitrógeno (N2) pueden ser de vida libre o simbiótica. Las bacterias de vida libre fijadoras de nitrógeno están en altas concentraciones en la rizósfera, entre ellas la bacteria aerobia Azotobacter, este género que tiene gran demanda de oxígeno disminuye la difusión de este elemento al interior de la célula puesto que la nitrogenasa es anaerobia. Beijerinckia es otra bacteria aerobia de vida libre fijadora de nitrógeno. Las cianobacterias aerobias fotosintéticas también fijan el nitrógeno con la ayuda de estructuras especializadas llamadas heteroquistes donde se encuentra contenida la enzima nitrogenasa en condiciones anaerobias. El nitrógeno molecular también puede ser fijado a amoniaco por bacterias anaerobias de vida libre como Clostridium pasteurianum y bacterias fototróficas rojas y verdes. Las bacterias simbióticas fijadoras de nitrógeno tienen un papel vital en los cultivos donde especies como Rhizobium, Bradyrhizobium y Frankia establecen relaciones con leguminosas otorgándole el nitrógeno para que las plantas puedan asimilarlo e incorporarlo a proteínas, ácidos nucleicos y demás necesidades celulares. • Amonificación Es la actividad hidrolítica de microorganismos descomponedores (bacterias y hongos) que permite degradar proteínas (a través de proteasas) en aminoácidos para eliminar el grupo amino presente en los monómeros de las proteínas y convertirlos en amoniaco (NH3).

Proteínas de células muertas → aminoácidos (descomposición microbiana)

Aminoácidos → NH3 (Amonificación microbiana)

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El amoniaco es un gas que en suelos secos se evapora y desaparece pero en ambientes húmedos es soluble y forma iones de amonio (NH4+) el cual puede ser usado por otras bacterias y plantas para sintetizar aminoácidos.

NH3 + H2O → NH4+ OH → NH4+ + OH-

• Nitrificación Es la oxidación del amonio a nitrato (NO3-) por bacterias nitrificantes del suelo. Se realiza en dos etapas, en la primera fase especies de Nitrosomonas oxidan el nitrato y lo convierten a nitrito (NO2-).

NH4+ → NO2-

Luego en la segunda etapa bacterias de Nitrobacter oxidan el nitrito a nitrato, una fuente de nitrógeno móvil y asimilable para la síntesis de proteínas. El amonio es un ión que requiere menos energía para hacer parte de la constitución de las proteínas pero al tener una carga positiva es atrapado por las partículas de arcilla con carga negativa, mientras que los iones de nitrato están libres en el suelo y dispuestos para ser asimilados.

NO2- → NO3-

• Desnitrificación Como vimos en lecciones anteriores ciertos microorganismos (Pseudomonas, Bacillus) usan el nitrato (NO3-) como aceptor final de electrones en su metabolismo o respiración anaerobia, éstos tienen la capacidad de revertir el proceso de nitrificación, es decir reducen el nitrato a nitrógeno molecular o gaseoso que se libera a la atmosfera.

NO3- → NO2- → N2O → N2

A pesar que para la agricultura no representa un beneficio cuando los campos fertilizados con nitratos son inundados por las lluvias, porque el agua crea ambientes anóxicos que favorece la desnitrificación; sino existiera este proceso biológico todo el nitrógeno gaseoso de la tierra se habría disuelto en los océanos dejando sin fuente de N a la vida continental. Las desnitrificación es un proceso biológico útil para el tratamiento de aguas residuales porque la reducción del nitrato desfavorece en crecimiento de algas cuando el agua se descarga en otras fuentes de agua y la eutrofización.

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NOTA: Por favor leer el siguiente artículo: http://www.elementos.buap.mx/num38/pdf/43.pdf

Lección 40. Ciclo del azufre Es un proceso donde el azufre (S) sufre una serie de conversiones en su estado de oxidación, permitiéndole a ciertos microorganismos obtener energía de sustancias inorgánicas, es similar al del nitrógeno porque también pasa por varios estados de oxidación. La forma más reducida del azufre es sulfuro de hidrógeno (H2S), una fuente de energía para bacterias anaerobias autótrofas que lo convierten en azufre elemental (S0) o en sulfatos (SO4-2), ver la figura 62. El azufre presente mayoritariamente en los mares está en forma de sulfato inorgánico, en sedimentos y rocas (como el yeso, CaSO4 .2H2O) o en minerales de sulfuro (como la pirita FeS2).

Figura 62 . Ciclo del azufre. Tomado del enlace: http://microgaia.blogspot.com/2009/11/micro-cazadores-segunda-parte.html

El ciclo del azufre se presenta en condiciones aerobias y anaerobias. Primero el sulfuro de hidrógeno (H2S) un gas muy volátil es reducido a sulfato por bacterias reductoras de sulfato (Beggiatoa, Thiobacillus). Las bacterias reductoras usan compuestos con azufre o el azufre elemental como aceptor final de electrones en la cadena transportadora durante el proceso de respiración anaerobia para la obtención de ATP. Muchas de estas bacterias

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viven en ambientes anaeróbicos como los lodos, donde el H2S produce el color oscuro y el olor a huevo podrido.

H2S → S0 → SO4-2

La conversión del H2S a SO4-2 está mediada por dos tipos de bacterias. Las quimioautótrofas, generan ATP oxidando los compuestos que contienen azufre para obtener como producto final el sulfato pero también un intermediario conocido como azufre elemental. Las bacterias fotótrofas realizan las mismas reacciones anaeróbicamente e incluso pueden oxidar también el azufre elemental. Beggiatoa usa el sulfuro de hidrógeno para reducir el dióxido de carbono, mientras que Thiobacillus lo usa como fuente de energía para producir sulfato y ácido sulfúrico.

En condiciones anaerobias y preferiblemente en materia orgánica se produce la misma reacción pero por bacterias fototróficas rojas y verdes. La forma en la que está presente el sulfuro en la naturaleza depende del pH, es decir, en pH = 7.0 predomina H2S, mientras a pH > 7.0 predominan las formas HS- y S2-. Estas reacciones están implicadas cuando se vierten al mar lodos, basuras y aguas residuales los cuales aumentan la cantidad de materia orgánica de los sedimentos favoreciendo la contaminación (Madigan et al. 2001). El sulfato (SO4-2) puede ser utilizado por plantas y bacterias para incorporarlo a los aminoácidos o proteínas que tienen los puentes disulfuro (asimilación ), luego tras la muerte celular microorganismos descomponedores degradan las proteínas y permiten que el azufre se libere como H2S (desasimilación o desulfurilación ) para volver de nuevo al ciclo (figura 63). Estos procesos pueden darse en condiciones aerobias o anaerobias.

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Figura 63 . Ciclo de oxido reducción del azufre. Flechas amarillas reacciones de oxidación y rojas de reducción. DMSO: dimetilsulfóxido y DMS: dimetilsulfuro. (Tomado de Madigan et al. 2003). Luego el sulfato también puede reducirse por la acción de bacterias (Desulfovibrio o Desulfobacter) en condiciones anoxigénicas a sulfuro de hidrógeno. El azufre elemental se reduce u oxida por Desulfuromonas o archaeas en condiciones anaerobias o se usa como fuente de energía inorgánica por bacterias como Beggiatoa.

SO4-2 → H2S

S0 → H2S

Todas las reacciones del ciclo del azufre son aprovechadas para el tratamiento de aguas residuales, lodos o incluso cultivos donde a suelos muy alcalinos se les añade azufre de tal manera que las bacterias puedan bajar el pH mediante la oxidación del azufre que genera ácido sulfúrico (H2SO4).

S + 11/2 O + H2O → H2SO4

El azufre elemental también es un producto con valor comercial usado como materia prima en la industria química para la producción de H2SO4.

NOTA: Por favor ver el siguiente video: http://www.youtube.com/watch?v=9kUNmx4JBkA

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CAPÍTULO 9. Aplicaciones de la microbiología ambien tal Lección 41. Tratamiento de residuos sólidos Como resultado de las actividades antrópicas en distintas áreas (industria, agricultura, doméstica, etc) se generan una serie de excedentes “no útiles” conocidos como residuos, los cuales según el estado de agregación de la materia o estado predominante pueden dividirse en aguas residuales, emisiones a la atmósfera y residuos sólidos. Los residuos sólidos pueden tener varios estados de agregación, es decir, pueden contener gases o líquidos contenidos en ellos (Rodríguez y Córdova, 2006). Según Campos, (2000) los residuos sólidos pueden clasificarse en municipales o urbanos, industriales y peligrosos. • Residuos sólidos municipales Su composición varía de acuerdo a la zona, época del año, población, etc. Entre este tipo de residuos podemos encontrar: residuos de construcción y demoliciones, residuos especiales (de calles, jardines, etc), desperdicios (papel, cartón, plástico, vidrio, etc) y residuos orgánicos (provenientes de comida como frutas, verduras, cereales, etc), cenizas y residuos (material sobrante de quema de combustibles). • Residuos Industriales Son aquellos que generan las actividades industriales y pueden incluir las clasificaciones descritas arriba. • Residuos peligrosos Son aquellos que por su naturaleza producen daño a seres humanos, animales o plantas. Este tipo de residuos pueden ser corrosivos, reactivos, tóxicos o incandescentes. Para minimizar el impacto de este los residuos en el ecosistema y en la salud pública los desechos sólidos son tratados con un conjunto de operaciones físicas, químicas, biológicas o térmicas que tienen como finalidad disminuir o eliminar su potencial peligroso, reutilizar desechos o adaptar sus propiedades físicas, químicas o biológicas a los requerimientos de su disposición final (Campos, 2000).

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La disposición de residuos sólidos tiene varias alternativas, entre ellas el relleno sanitario, el compostaje y la incineración. En este módulo nos enfocaremos en el proceso de compostaje donde los microorganismos tienen un papel protagónico e indispensable. Compostaje o compost Los residuos sólidos usualmente se disponen en grandes terrenos donde se forman “montañas de basura” generando condiciones anaerobias que afectan la biodegradación de compuestos orgánicos, sin embargo en estas condiciones se pueden desarrollar microorganismos metanógenos que producen metano (este compuesto puede utilizarse como fuente de energía para industrias y hogares); los metanógenos también descomponen el lodo de aguas residuales. Pero, aunque produce ciertos beneficios el objetivo primordial es disminuir la cantidad de residuos sólidos, en este sentido y para lograr un mejor manejo la cantidad de compuestos orgánicos pueden disminuir si se separan de la sustancias biodegradables para formar composta o composta (figura 64). Mark Coyne (1999), propone varias definiciones para compostaje: Es una aceleración de los procesos de mineralización de la materia orgánica. Desde un punto de vista práctico es un proceso que convierte los residuos orgánicos en formas adecuadas para aplicaciones al suelo. O una última definición relacionada directamente con la microbiología donde dice que es un proceso microbiano en el cual el residuo orgánico nocivo se convierte en un compuesto estable similar al humus. El compostaje tiene varias ventajas, entre ellas: • Reduce el volumen de los residuos. • Disminuye la demanda biológica de oxígeno (DBO). • Mejora las características físicas y hace más fácil el manejo. • Reduce los patógenos de humanos, animales y plantas además de eliminar

semillas de malas hiervas • Reduce el uso de la tierra para rellenos sanitarios y para la aplicación

superficial de residuos.

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Figura 64 . Pila de compost. Formada a partir de residuos municipales (tomado de Tortora et al. 2007).

Para realizar el compostaje primero hay que separar la materia orgánica de la inorgánica y se forman pilas de compostaje para facilitar el proceso biológico de los organismos presentes en ella. El proceso de compostaje se inicia con quimioheterótrofos mesófilos (bacterias y hongos) que oxidan aeróbicamente los residuos y como resultado de este metabolismo aumentan la temperatura en pila, permitiendo entonces el desarrollo de microorganismos termofilicos (actinomicetos); eventualmente la temperatura del compost disminuye de tal manera que se reestablecen los mesófilos (hongos y actinomicetos) para que consuman los sustratos disponibles. La temperatura de una pila puede subir de 76-80 °C, este incremento permite la muerte de muchos microorganismos patógenos pero usualmente se trabaja con temperaturas de 60 y 65 °C, por ésto para prevenir el exceso de calor se emplea la aireación o el riego. Dentro de las bacterias importantes del compostaje están, Bacillus stearothermophilus, Clostridium thermocellum, Thermomonospora y Thermoactinomyces. Entre los hongos, Geotrichum, Aspergillus y Mucur. Coyne, (1999) menciona que para un proceso de compostaje óptimo es importante que se tengan las siguientes consideraciones: • Tipo y composición de materia orgánica

En este aspecto se considera el tamaño de la partícula, hidrofobicidad y tipos de enlaces químicos. La descomposición en el compostaje es proporcional al área de superficie e inversamente proporcional al tamaño de la partícula, de tal manera que en partículas más pequeñas se incrementa la tasa de

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descomposición; el tamaño óptimo está entre 0.65-2.54 cm, porque partículas más pequeñas intervienen con la aireación y más grandes no son reactivas.

Los compuestos insolubles e hidrofóbicos son más resistentes a la descomposición que los solubles e hidrofílicos. Otros elementos como los metales pesados o tóxicos también pueden afectar el compostaje.

• Disponibilidad de microorganismos

El proceso de compostaje puede beneficiarse si el compost se inocula con una mezcla de microorganismos (bacterias, hongos y actinomicetos mesófilos y termófilos) y con esto se garantiza una mezcla o cantidad representativa.

• Aireación

La descomposición de compuestos orgánicos se facilita en condiciones aerobias.

• La proporción de carbono, nitrógeno y fósforo La proporción adecuada de C:N para iniciar el material de compostaje es de 30:1 ó 40:1, aunque también se usan proporciones bajas 20:1. Proporciones muy altas pueden inmovilizar el nitrógeno mientras que más bajas causan una pérdida del nitrógeno por volatilización. La proporción recomendada de C:P es de 100:1 a 150:1.

• Temperatura El proceso de compostaje se da en dos rangos de temperatura, un rango mesófilo desde 10 a 45°C y un rango termófilo de 55 – 60°C. La temperatura es un aspecto crítico durante el compostaje ya que ella regula el crecimiento y metabolismo de microorganismos benéficos y no benéficos. El aumento de temperatura es muy útil para matar a microorganismos patógenos, con este fin usualmente se pueden trabajar a 70 °C por 2 horas. La temperatura óptima para mantener el equilibrio de la microbiota termofílica es de 60 a 65 °C. La aireación y el riego ayudan a mantener la temperatura óptima.

• pH

El pH ideal es de 6.5 -7.2 para el desarrollo y metabolismo de la mayoría de los microorganismos benéficos para el compostaje.

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NOTA: Por favor leer los siguientes artículos: http://ojs.uo.edu.cu/index.php/cq/article/viewFile/2648/2178 http://www.scielo.cl/pdf/infotec/v18n6/art10.pdf

Lección 42. Tratamiento de agua potable

El agua es vital para la sostenibilidad en todos los seres vivos y puede constituirse en una fuente de enfermedades para plantas, animales y el hombre; por ésto se constituye en un objetivo importante de la salud pública. En la actualidad para lograr la potabilización del agua se han desarrollado varios métodos o tratamientos microbiológicos, químicos y físicos que eviten al máximo muchas enfermedades. Para determinar la pureza del agua no es práctica la búsqueda de microorganismos patógenos porque si estos están presentes en pequeñas cantidades es posible que no sean detectados en las muestras analizadas. Por este motivo los estudios de microbiología de aguas están concentrados en la detección de microorganismos indicadores, especialmente de aquellos presentes en grandes cantidades en las heces humanas, de tal manera que puedan sobrevivir del mismo modo que los patógenos y se relacione su detección en la muestra con la presencia de patógenos humanos que ponen en riesgo la salud pública. Los microorganismos indicadores asociados al tracto gastrointestinal son los coliformes.

Los coliformes son bacterias gramnegativas, bacilares, no esporuladas, muchas de ellas entéricas, aerobias o anaerobias facultativas capaces de fermentar la lactosa con la producción de gas (CO2) a 35 °C. Para evitar la confusión con coliformes no entéricas, en las pruebas de potabilización del agua se buscan las coliformes fecales. Entre estos microorganismos se destaca uno de los más estudiados, la bacteria Escherichia coli (bacteria intestinal frecuente) y Klebsiella pneumoniae (patógenos intestinal), entre otras. En general cuando en una muestra se detectan coliformes esto indica que hay contaminación fecal y por lo tanto no es acta para el consumo humano, de tal manera que el agua requiere un tratamiento para su consumo. Métodos para la detección de coliformes

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Los métodos más usados para detectar la presencia de coliformes fecales en el agua se basa en la capacidad de este tipo de bacterias para fermentar la lactosa.

El método de filtración por membrana (descrito en lecciones anteriores) es un método directo y seguro donde el agua (unos 100 ml de muestra) se hace pasar a través de un filtro o membrana estéril que tienen el tamaño de poro indicado para retener bacterias. Luego la membrana se coloca sobre la superficie de un medio de cultivo (eosina-azul de metileno, por las siglas en inglés EMB) que es selectivo para coliformes, terminado el periodo de incubación se cuentan las colonias y se calculan el número de coliformes presentes en el agua. En los sistemas de abastecimiento de agua esta prueba debe ser negativa pero cuando se detectan indica que hubo una falla en el sistema de filtración, cloración, o en las tuberías de distribución (Madigan 2003).

En el método del número más probable (NMP, siglas en inglés) se emplean tubos de ensayo con medios de cultivo líquido al que se le añade la muestra de agua. Si después del tiempo de incubación del cultivo se observa turbidez indica que hay contaminación fecal en el agua. Actualmente se han propuesto otros métodos para detectar la presencia de coliformes o E. coli utilizando medios de cultivo con o-nitrofenil-β-D-galactopiranosida (ONPG, siglas en inglés) y 4-metilumbeliferil-β-D-glucoronida (MUG), estos son métodos muy útiles porque las bacterias coliformes producen la enzima β-galactosidasa capaz de hidrolizar el ONPG y producir un color amarillo que indica la presencia de coliformes en la muestra. La prueba con el MUG se basa en la actividad que tiene la enzima β-glucuronidasa de E. coli sobre este sustrato para formar un compuesto fluorescente de color azul cuando se expone a la luz ultravioleta (Tortora et al. 2007).

Potabilización del agua Por todas las implicaciones que tiene en la salud pública la calidad del agua, se han desarrollado varias estrategias en los procesos de potabilización. El tipo de proceso depende de la fuente de abastecimiento de agua es decir, arroyos montañosos, ríos cristalinos, pozos, o ríos que reciben residuos municipales o industriales como es el caso del río Magdalena en Barranquilla. La potabilización del agua no busca obtener agua estéril sino agua libre de microorganismos patógenos, además con parámetros físicos y químicos establecidos por cada legislación como aceptables o tolerables.

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Acosta, (2008) propone varias etapas o pasos para el tratamiento de agua, entre ellos están: • Captación

Aunque es preferible elegir una fuente de agua que requiera un mínimo tratamiento, la captación del agua se escoge de acuerdo a las fuentes disponibles (meteóricas, superficiales o subterráneas).

• Sedimentación Consiste en la precipitación de partículas sólidas o suspendidas por la acción de gravedad después de un tiempo determinado. La sedimentación ayuda a reducir la turbiedad, el contenido bacteriano, el color y la producción de algas (para este fin se usa el sulfato de cobre). • Coagulación y floculación Consiste en la aglutinación de partículas no eliminadas en la sedimentación con la ayuda de sustancias químicas floculantes (sulfato de potasio, cloruro férrico y sulfato de aluminio o alumbre) que forma agregados conocidos como floc. Durante este proceso se realiza una agitación lenta por medios mecánicos y además acidifica el agua. • Decantación Los floc se precipitan en el fondo o base del recipiente decantador eliminando así un gran número de virus y bacterias.

• Alcalinización Busca disminuir la acidez (aumentar el pH) lograda en la floculación, para ésto se usa la cal, el carbonato o hidróxido de sodio. • Filtración Consiste en el flujo del agua a través de lechos constituidos por arena fina o carbón de antracita triturado, de tal manera que muchos microorganismos quedan atrapados en la arena por adsorción superficial. Este proceso ayuda a disminuir la turbiedad, los microorganismos, quistes u ovoquistes de protozoos. Algunos sistemas también usan carbón activado para eliminar sustancias químicas tóxicas disueltas. • Desinfección

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Consiste en la eliminación o reducción de bacterias patógenas. Para este fin existen varios métodos: entre los físicos tenemos al calor, la radiación con luz ultra violeta, ultrafiltrado con membranas; entre los químicos, la cloración, el ozono, el permanganato de potasio, el exceso de cal, y la oligodinamia.

NOTA: Por favor leer desde la página 55 hasta la 66 en el siguiente enlace: http://books.google.com.sv/books?id=g7YIShB-SXsC&printsec=frontcover&dq=saneamiento+ambiental+e+higiene+de+los+alimentos&hl=es&ei=oFGUTqDsCMy1twfOxZmABw&sa=X&oi=book_result&ct=result&resnum=1&ved=0CCkQ6AEwAA#v=onepage&q&f=false

Lección 43. Biorremediación El desarrollo industrial y las actividades humanas (como las agrícolas, mineras, petroleras, manufactureras, químicas, etc) han aumentado considerablemente la contaminación en el planeta poniendo en grave riesgo la vida de muchas especies en los ecosistemas afectados por los contaminantes; con los avances de la biotecnología microbiana existen nuevos procesos que ayuden a restaurar los ambientes y minimizar en muchos casos los daños causados, uno de ellos es la biorremediación. En esta lección nos enfocaremos en las definiciones de los diferentes procesos que hacen parte de este mecanismo de recuperación ambiental. Biodegradación En estudios de microbiología ambiental se propone varias definiciones que profundizan en este proceso:

Madsen, (2008), asocia el término biodegradación como un “sinónimo” del metabolismo microbiano sobre compuestos orgánicos en el que se rompen los enlaces intramoleculares o de carbono en moléculas contaminantes orgánicas para simplificarlas y generar compuestos inofensivos al ambiente, este proceso microbiano está gobernado por principios termodinámicos y bioquímicos. Como lo notará Madsen, (2008) no incluye moléculas o sustancias inorgánicas como sustrato para los microorganismos, para ésto incluye el termino biotransformación, definiéndolo como la alteración de la estructura molecular

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de una sustancia química (puede ser de compuestos orgánicos o inorgánicos) usualmente por la catálisis enzimática microbiana. Las reacciones incluyen aquellas que aumentan (condensación) o disminuyen (mineralización) el número o complejidad de enlaces intramoleculares. Estas reacciones pueden darse de manera intracelular o extracelularmente. Coyne, (1998), considera que la biodegradación se refiere a el proceso de la biorremediación en el cual los xenobióticos (compuestos químicos sintéticos que no existen de manera natural, ejemplo, plaguicidas, plásticos, etc) son transformados a sustancias menos tóxicas, porque el hecho que un compuesto sea biodegradable no significada que los productos de degradación son menos tóxicos o indeseables; por ésto lo más deseado es la mineralización donde los compuestos tóxicos u orgánicos contaminantes se descomponen en iones orgánicos y CO2. Como se describió arriba y aunque algunos autores establezcan diferencia en este tipo de terminología ambos son aceptables por la comunidad científica y la selección de uno u otro en realidad dependen del área de estudio del investigador. Biorremediación La biorremediación es el proceso de limpieza de ambientes contaminados (Coyne, 1998) o también, es el proceso de biodegradación y biotransformación controlado o espontáneo que busca eliminar o atenuar los contaminantes ambientales a través de la actividad biológica en los sitios afectados (Madsen, 2008); de acuerdo al tipo de organismo que realiza la biorremediación esta puede llamarse:

• Fitorremediación Es la descontaminación de suelos, agua o aire de sustancias orgánicas o inorgánicas con la actividad biológica/metabólica de plantas (arbóreas, arbustivas, herbáceas, etc) actuando solas o en simbiosis con algas (ficorremediación) u hongos (micorremediación) para almacenar, absorber, reducir movilidad, modificar, degradar o eliminar las sustancias tóxicas. Entre los elementos contaminantes más utilizados con este conjunto de tecnologías están los metales pesados, hidrocarburos, pesticidas y herbicidas (figura 65).

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Figura 65. Sistema de fitorremediación. Para este sistema se usan 75 hectáreas de sauces en Suecia Central: en primer plano planta de tratamiento de aguas residuales, al fondo las albercas para aguas en invierno y campos de sauces regados con efluentes de fangos. Tomado del enlace: http://www.fao.org/docrep/008/a0026s/a0026s11.htm

• Remediación microbiana Es la limpieza de sitios contaminados utilizando microorganismos que a través de actividades metabólicas degradar, eliminan, acumulan o atenúan sustancias orgánicas o inorgánicas. Para este tipo de biorremediación Gómez, (2004) describe dos enfoques, la bioestimulación o la bioaumentación. En la bioestimulación se emplean microorganismos nativos (es decir, cepas propias del sitio contaminado) a las que se les estimula el crecimiento y actividad metabólica con la adición de nutrientes (como el nitrógeno, fósforo o materia orgánica) o mejora de condiciones ambientales como la circulación de oxígeno a través del bioventeo. Este enfoque es muy útil porque por un proceso de selección natural las cepas nativas ya están adaptadas a las condiciones ambientales. Pero en algunas situaciones las poblaciones de cepas nativas son escasas o no realizan actividades metabólicas que puedan actuar sobre el contaminante, como es el caso de los suelos pobres en nutrientes, desiertos o terrenos muy contaminados; en estas condiciones también puede biorremediarse el ambiente contaminado con la bioaumentación. La bioaumentación es la inoculación o adición de cepas alóctonas (foráneas) que tengan la capacidad comprobada de degradar el contaminante. Estas pueden ser cepas “naturales” o modificadas genéticamente para tal fin. Este tipo de microorganismos deben tener características específicas que aseguren la descontaminación y minimicen

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el impacto negativo en el ecosistema contaminado, entre ellas tenemos: no puede ser patógeno, estabilidad genética, crecimiento rápido, alta producción de enzimas, capacidad de competencia frente a las cepas nativas y no generar sustancias tóxicas como producto de su metabolismo. En la actualidad es muy común el uso de bacterias y hongos para degradar compuestos como petróleo y sus derivados, sustancias químicas (benceno, acetona, éteres, alcoholes, etc), xenobióticos (pesticidas, herbicidas, etc); otros compuestos químicos como el PBC, cromo, pueden ser parcialmente degradados y algunos como el uranio, mercurio o cadmio no pueden ser biodegradados pero si almacenados y concentrados por los microorganismos de tal manera que se puedan aislar fácilmente del ambiente contaminado.

Respecto al sitio, la biorremediación se puede realizar “in situ”, es decir en el lugar contaminado o “ex situ” fuera de sitio contaminado. En la biorremediación in situ, se usan bacterias nativas o foráneas que degraden o minimicen el potencial tóxico del contaminante en el lugar afectado. Cuando se emplean cepas nativas se realiza un tipo de biorremediación intrinseca o pasiva, porque depende de la capacidad de los microorganismos para responder y metabolizar los contaminantes. Por ésto para fomentar y mejorar la capacidad del microorganismo para transformar o biodegradar el contaminante se usan estrategias de ingeniería que ayudan a hacer más eficiente el proceso de biorremediación, como el control del flujo de agua, aireación, modificaciones químicas y físicas que influyan en las poblaciones microbianas y en el contaminante. Es importante medir la eficiencia del proceso con el análisis químico del agua, aire o suelo contaminado. El lugar contaminado también puede ser modificado por excavaciones, manipulaciones hidrológicas, instalación de biorreactores o materiales que apresuren la biorremediación (Madsen, 2008). En la biorremediación ex situ, el contaminante debe almacenarse y trasladarse del lugar contaminado para ser tratado. Un ejemplo de ésto es el sistema de tratamiento de aguas municipales donde se dirigen a través de una serie de ambientes controlados que estimulan el crecimiento y actividad metabólica microbiana sobre los contaminantes en filtros, tanques, digestores o biorreactores, de tal manera que las descargas a los ríos, lagos u océanos tengan los controles físicos, químicos y microbiológicos (Madsen, 2008).

NOTA: Por favor leer el siguiente artículo: http://www.scielo.org.mx/pdf/rica/v23n3/v23n3a4.pdf

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Lección 44. Biodegradabilidad y efectos ecológicos La biodegradación de compuestos contaminantes ha sido posible gracias a la diversidad metabólica de plantas y en especial la de microorganismos; pero este proceso de descontaminación debe hacerse de manera responsable y minimizar en todo lo posible los riesgos. Existen varios aspectos que deben considerarse antes de iniciar un proceso de biorremediación, Madsen, (2008) propone los siguientes:

• Características del contaminante Estructura molecular, toxicidad, solubilidad, volatilidad y susceptibilidad al ataque microbiano. • El sitio contaminado Geología, hidrología, tipo de suelo, clima y presiones económicas y políticas del propietario o causante de la contaminación. • Microorganismos Cultivos puros, mezcla de cultivos, cepas nativas o modificadas genéticamente, condiciones para su crecimiento y actividad metabólica. Suplementos. • Selección de estrategia Bioestimulación, bioaumentación o ambas. Biorremediación in situ o ex situ. • Procedimientos de ingeniería Control del flujo de agua, aireación, sistema de biorreactores, etc. • Modificaciones químicas, físicas que influyen en la población microbiana

y en el contaminante.

Fernández, (1996) y Gómez, (2004) plantean que también se deben considerar varios aspectos que influyen en el proceso de biodegradación:

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• Biodegradabilidad del contaminante Depende de la estructura molecular, si tiene halogenación, ramificaciones en sus cadenas moleculares, solubilidad en agua lo cual determina la disponibilidad del contaminante, concentración y toxicidad. Estos aspectos son importantes porque prácticamente determinan el tiempo del proceso de limpieza en el lugar afectado. • Presencia de componente inhibidores Se deben considerar los inhibidores que puedan afectar el crecimiento de los microorganismos y las actividades enzimáticas o metabólicas de los mismos. • Poblaciones microbianas Aunque se realice un proceso de bioaumentación también es importante contar con poblaciones microbianas nativas que ayuden el proceso de recuperación usando los contaminantes como fuentes nutricionales y de energía. • Concentración de nutrientes Nutrientes inorgánicos entre ellos el nitrógeno y fósforo influyen notablemente en el crecimiento microbiano y esto a su vez favorece una mayor velocidad de biodegradación y detoxificación del medio. Para cumplir esta necesidad usualmente se emplean fertilizantes agrícolas. • Aceptores finales de electrones Cantidades suficientes en el medio de aceptores de electrones (oxígeno, nitratos, sulfatos, etc.) garantizan la oxidación enzimática del carbono proveniente de los contaminantes. • Temperatura Se debe considerar la temperatura óptima para el crecimiento de los microorganismos presentes en el medio contaminado, de las cepas foráneas y la de la actividad enzimática durante procesos metabólicos; de tal manera que la población aumente con rapidez y las enzimas no se desnaturalicen. Temperaturas lejanas a la temperatura óptima afecta el proceso de biorremediación. • pH

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Al igual que la temperatura afecta el crecimiento de los microorganismos, las enzimas y también la solubilidad del fósforo o metales pesados. Usualmente se trabaja en rangos de pH de 6 – 8. Es importante mencionar que el uso de cepas nativas es una ventaja porque ellas están adaptadas a las condiciones en las que está presente el contaminante, mientras que las cepas modificadas genéticamente deben alcanzar esta adaptación después de ser inoculadas en el medio. • Concentración de oxígeno La biorremediación se puede dar en condiciones aerobias o anaerobias dependiendo del tipo de microorganismo biorremediador. Pero es importante mencionar que la tasa de biodegradación en condiciones aerobias es mucho más eficiente, 50 a 100 veces mayor que la degradación anaerobia. Recuerde que en lecciones anteriores se estudió que el metabolismo aeróbico es más eficiente y produce más energía. • Humedad En el caso de los suelos es determinante en la movilidad de los nutrientes. Poca humedad afecta la biodegradación y demasiada humedad reduce la concentración de oxígeno y por lo tanto el crecimiento microbiano y las actividades enzimáticas sobre del contaminante. Es importante contar con un sistema de drenaje y aireación. • Textura y estructura del suelo Esta relacionada con el contenido de materia orgánica y las características físicas del suelo. Suelos de estructura franca mejoran la degradación mientras que los arcillosos la dificultan. Para solucionar problemas de humedad, drenaje y propiedades físicas del suelo se pueden usar materiales como la arena, cáscara de arroz o nuez, entre otros.

Respecto a los métodos químicos donde se aprovechan las características físicas y químicas de los contaminantes para destruirlos o aislarlos del entorno (procesos costosos y no siempre efectivos), la biorremediación es una excelente alternativa para recuperar ambientes contaminados. Coyne, (1998) plantea ventajas y desventajas de la biorremediación. Entre las ventajas están: los productos finales generalmente no son tóxicos si ocurre una mineralización completa, la actividad biológica en los sitios contaminados se hace sin muchas perturbaciones, es un proceso expansivo comparado con los métodos físicos además es menos costosa y requiere menos equipos.

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La biorremediación también tiene desventajas, la mayoría de ellas manejables y controladas. En altas concentraciones de contaminantes es necesario estimular el crecimiento de microorganismos biorremediadores, hay limitaciones a los materiales que pueden ser tratados porque algunos son inherentemente recalcitrantes o tóxicos, el destino de los compuestos xenobióticos depende de las propiedades intrínsecas del contaminante, de las poblaciones microbianas y condiciones ambientales, la biorremediación puede afectarse es condiciones extremas, está limitada por el tiempo disponible para el tratamiento y por último algunas veces se necesita más tiempo para biorremediar un sitio contaminado que para tratarlo con método físicos o químicos.

NOTA: Por favor leer el siguiente artículo: http://www.revistas.unal.edu.co/index.php/ingeinv/article/viewFile/15211/16006

Lección 45. Biorremediación de petróleo y otros contaminantes Biodegradación del petróleo El petróleo es un líquido negro viscoso de composición química diversa, mayoritariamente de la familia de los hidrocarburos. Este compuesto de gran utilidad para las actividades humanas, en los últimos años se ha convertido en uno de los contaminantes ambientales que impactan gravemente a los ecosistemas; actualmente son frecuentes los vertimientos accidentales en tierra y agua que se extienden rápidamente de manera casi incontrolable como es el caso de los océanos. Ante esta grave situación los microorganismos son una herramienta valiosa e indispensable para la descontaminación de sitios afectados por este combustible (figura 66). La biodegradación del petróleo, desechos petrolizados y sus derivados ha sido posible gracias a la actividad metabólica enzimática de una diversidad de bacterias, hongos, levaduras, cianobacterias y algas que tienen la capacidad de oxidarlo a CO2. Esta acción de los microorganismos además de descomponerlo dispersa o desaparece la mancha sobre el sitio contaminado. Es importante mencionar que para este tipo de contaminaciones es común usar varias estrategias a la vez como la bioestimulación, bioaumentación o fitorremediación.

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Figura 66 . Biorremediación de petróleo en suelos. Imagen de la izquierda en enero del 2008, imagen central en junio del 2008 e imagen de la derecha en septiembre de 2008. Tomado del siguiente enlace: http://eninteriores.com/2010/05/27/biorremediacion-opcion-contra-derrames-de-petroleo/

El petróleo es una fuente orgánica muy rica que puede ser usada como sustrato por muchos microorganismos en condiciones aerobias. Su biodegradación tiene lugar en la interfase petróleo agua donde éste compuesto está mezclado con el sustrato húmedo que facilita la acción microbiana. Para hacer más eficiente el proceso de biorremediación es importante fertilizar la zona afectada con compuestos inorgánicos como el nitrógeno, fósforo y potasio. La eficiencia de la biodegradación también depende de la disponibilidad de oxígeno y de la temperatura. Entre los factores que afectan la biodegradación del petróleo tenemos:

• Temperatura El rango de temperatura puede variar de -2 a 35 °C, donde la velocidad de degradación y volatilidad disminuye a medida que baja la temperatura y se incrementa la viscosidad. • Oxígeno La biodegradación del petróleo es mayor en condiciones aerobias que anaeróbias. En el caso de los vertimientos marinos usualmente no es un limitante pero cuando el petróleo alcanza los sedimentos marinos la biodegradación disminuye. Cuando la permeabilidad se reduce y se obstruyen los espacios intersticiales de los sedimentos se deben recurrir a

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técnicas que ayuden la aireación como la labranza, rastrillado o arado en forma periódica. • Nutrientes En muchos ambientes contaminados los nutrientes esenciales como el nitrógeno, fósforo, hierro o potasio puede ser deficientes para el proceso degradativo porque sus concentraciones no favorecen el crecimiento y el metabolismo microbiano. En estos casos es usual agregarlos al ambiente, como fertilizantes líquidos y agrícolas, o en forma de liberación lenta, briquetas, gránulos o con aspersores. Usualmente se usa una proporción de C:N:P de 120:10:1. Es importante aclarar que la fuente de carbono es el petróleo.

En la naturaleza se pueden encontrar muchos microorganismos degradadores de petróleo y su diversidad y efectividad dependen de la exposición a este tipo de hidrocarburos además de la complejidad de los componentes del petróleo, donde los más complejos demorarán más en degradarse respecto a los más simples. Es importante mencionar que hay fracciones de hidrocarburos volátiles que se evaporan rápidamente y no necesitan la participación de microorganismos, sólo los componentes de mayor complejidad son tratados con la remediación microbiana. La biorremediación del petróleo como cualquier otro proceso de limpieza tiene sus ventajas y desventajas, entre las ventajas tenemos:

• Los cambios físicos que origina sobre el sitio afectado son menores. • Si se usa correctamente no produce efectos adversos significativos. • Es útil para retirar compuestos tóxicos del petróleo • Se usan tecnología más simples y menos costosas

Entre las desventajas de la biorremediación del petróleo están:

• Para muchos tipos de vertimientos su efectividad todavía es indeterminada.

• Es un proceso largo. • Su implementación es única y específica para cada lugar contaminado. • Se requiere información sustancial del lugar contaminado y de las

características del vertido.

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NOTA: Por favor leer el siguiente artículo: http://www.unicolmayor.edu.co/invest_nova/NOVA/ARTREVIS1_5.pdf

Biodegradación de xenobióticos Los xenobióticos son compuestos desarrollados por síntesis química por el hombre y no existen en la naturaleza. Como resultado de las actividades industriales, agrícolas y mineras se han desarrollado una gran variedad de estos componentes de difícil degradación o tratamiento, los cuales son persistentes en los ambientes contaminados (recalcitrantes). Entre ellos están: insecticidas clorados (DDT, lindano, clordano), insecticidas organofosforados (palatión, malatión), herbicidas, PCB, etc. Entre los procesos más usados para degradar estos compuestos esta la fotodegradación por radiaciones solares, los procesos de oxidación y reducción química y la biorremediación o biodegradación microbiana; nos enfocaremos en esta última. Aunque no existen en la naturaleza, la estructura de los plaguicidas o xenobióticos puede estar sujeta a la actividad microbiana donde algunas sustancias sirven como fuentes de carbono y energía o como donadores de electrones. La degradación de estos compuestos puede ser total o incompleta dependiendo de la toxicidad y complejidad del contaminante. Muchos de ellos no llegan hasta los procesos de mineralización e incluso se pueden generar sustancias recalcitrantes aún más tóxicas que las originales. De la misma manera que con otros contaminantes la degradación depende de factores como temperatura, pH, aireación, contenido de materia orgánica, biodisponibilidad de oxígeno, solubilidad (muchos son insolubles en agua), entre otros. Muchas bacterias y hongos en la naturaleza tienen la capacidad de degradar xenobióticos, pero con los avances biotecnológicos la manipulación genética de microorganismos se ha convertido en una herramienta clave y muchas veces más eficiente para biorremediar ambientes contaminados con xenobióticos, petróleo, metales pesados y casi todos los contaminantes. Para el tratamiento de sitios contaminados con metales pesados (plomo, mercurio, selenio, etc) también es muy útil la fitorremediación.

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