modelul mozaicului fluid

Universitatea de Medicina si Farmacie “Gr. T. Popa”

Modelul mozaicului fluid

Istoria unei descoperiri

Referat realizat de:Andries Bogdan-AlexandruSeria C, grupa 22, MG I

1


Istoric

Dupa anul 1960, acumularea expoziva de date a condus la un impas in reprezentarea globala, concretizata intr-un model al biomembranelor. In conseciinta, intre 1960 si 1970, s-a produs o inmultire exagerata a modelelor de membrane, nu totdeauna conforme cu datele experimentale. Era necesara o noua reformulare, care, fara sa ignore elementele valabile din modelele clasice Danielli-Davson si Robertson, sa ofere un nou model conceptual si in acelasi timp “rezistent ” la noile descoperiri din domeniul structurii si functiei biomembranelor.

Imediat dupa 1972 se contureaza un concurs, consecutive caruia, desi au fost implicate mai multi cercetatori, S. J. Singer si G. L. Nicolson avanseaza, in anul 1972, conceptual ultrastructurii membrane intruchipat in “ modelul mozaicului fluid ”. Acest concept a dobandit rapid acceptiunea marii majoritati a cercetatorilor si, in linii esentiale, toate rezultatele obtinute ulterior il sustin. Modelul mentine ca structura de baza stratul dublu lipidic, la nivelul caruia se afla implantate proteinele intrinseci, integrale ale membranei, asemenea unor “aisberguri” ce plutesc pe mare.

Acest model se bazeaza pe cercetari moderne de microscopie electronica, in primul rand pe asa-numita tehnica a “fracturarii prin inghetare”, care consta in examinarea unei replici fine a suprafetei descoperite in urma acestui proces. Constatarea care s-a facut este ca fracturarea are loc, de preferinta, intre cele 2 straturi lipidice, astfel ca este dezvaluita tocmai stuctura interna a membranei.

Combinate cu alte cercetari, asemenea observatii confirma ideea stratului dublu si indica faptul ca printre moleculele fosfolipidice sau la suprafata lor se afla molecule proteice. Unele dintre ele traverseaza complet membrana, iar altele numai partial. Printre acestea se afla complexe lipoproteice cu rol enzimatic sau de transport, molecule glicoproteice cu rol antigenic etc. In ceea ce priveste atribuirea insusirii de “fluid”, aceasta rezulta din observatii experimentale care atesta ca exista o miscare laterala in planul membranei, la care participa nu numai fosfolipidele, ci si proteinele.

2


In schimb, miscarea in plan perpendicular, adica schimbul de fosfolipide intre stratul intern si cel extern al membranei, este extrem de rara si de lenta.

Toate aceste observatii ne indica faptul ca membrana este un “fluid structurat”, care isi pastreaza integritatea si forma generala, dar ai carui component individuali sunt in miscare.

Proteinele integrale stabilesc in miezul stratului bilipidic interactiuni hidrofobe cu partile apolare ale lipidelor, respectiv cu lanturile acizilor grasi. Portiunea hidrofila a moleculelor proteice proemina in afara membranei, fiind in contact cu mediul apos si cu gruparile polare ale fosfolipidelor. Lantul polipeptidic al unei proteine poate traversa membrana o data sau de mai multe ori: diferitele lanturi polipeptidice pot fi asociate in sanul membranei in proteine oligomerice ori in complexe multienzimatice. Membrana este construita deci dintr-un mozaic de regiuni in strat dublu lipidic si de regiuni continand protein integrale. La acestea se adauga proteinele periferice (extrinseci) dispuse de o parte si de alta a membranei; stabilind interactiuni de tip electrostatic, fie cu partile polare ale lipidelor, fie cu partile polare expuse la suprafata ale proteinelor integrale. Notiunea de monostrat proteic, cu o structura etirata, a disparut complet.

3


Diferiti constituent lipidici si proteici ai membranei nu sunt ficsi. “Marea lipidica” in care se afla aceste “aisberguri” constituite din protein este fluida, deci, cu lipidele stratului dublu in stare de cristal lichid, iar in planul sau proteinele se pot deplasa lateral sau se pot roti in jurul axului prorpiu, perpendicular cu planul membrane. Interactiunile lipid-lipid, protein-lipid si lipid-proteina din interoriul membranei nu sunt covalente. Rezulta o miscare continua si o difuziune a constituentilor membranari in planul acesteia.

Caracteristici ale modelului

Confirmarea mozaicului fluid este foarte clara si are suport atat date ultrastructurale, cat si de ordin functional. Cand fractura consecutiva congelarii trece prin centrul membranei, separa cele 2 monostraturi ale stratului bilipidic si expune partea centrala a membranei. In general, fractura nu rupe lantul polipeptidic al unei proteine, aceasta ramanand asociata cu monostratul la care proteinele poseda interactiunile cele mai puternice. Suprafetele de fracturacorespund monostratului lipidic intern (notat P) si respectiv, monostratul lipidic extern (notat E) vor prezenta o serie de particule care reprezinta proba existentei proteinelor integrale. Cu alte cuvinte, criofractura atesta indubitabil caracterul de mozaic al membranei, matrice lipidica in care sunt inserate proteinele.

4


Cea de-a 2-a caracteristica a modelului actual al biomembranelor, fluiditatea a beneficiat de o atestare deplina, demonstrandu-se ca la temperatura fiziologica, stratul dublu este fluid, moleculele lipidice si proteinele integrale sunt libere sa difuzeze, in principal in planul membranei, deplasarea fiind in medie de 1µm sec-1 pentru lipide si de 1µm min-1 pentru proteine.

Fluiditatea globala a membranei tinde sa devina un important reper obiectiv in explicarea unor procese fiziologice. Modulatorii naturali ai fluiditatii sau al complementului sau, microvascozitatea membranei, se pot distinge in functie de natura lor, in chimici si fizici.

A. Modulatori chimici1. Concentratia colesterolului (colesterol/fosfolipide)2. Gradul de nesaturare a lanturilor acizilor grasi din fosfolipide3. Nivelul sfingomielinei (sfingomielina/lecitina)4. Fosfatdiletanolamina5. Continutul de proteine in membrana (proteine/lipide)

B. Modulatori fizici1. Temperatura2. Presiunea hidrostatica

In prezent, au inceput sa se contureze metode de manipulare a fluiditatii utile atat in cercetare cat si in practica medicala. Enumeram cateva din aceste metode: modificarea continutului in colesterol al membranei incorporarea de acizi grasi prin utilizarea hidrogenarii catalitice prin actiunea Ca2+

Utilizarea unor enzime inhibitoare Metode dietetice Metode genetice Metode de compresiune a membranei

Alterarile fluiditatii permit explicarea unor procese patologice in subtilitatea lor moleculara, in particular prin obstructia create functionarii normale a proteinelor integrale din membrana.

Acest model mai presupune ca stratul bilipidic actioneaza in principal ca o bariera permeabila, in care proteine specifice exista si mediaza majoritatea functiilor membranei. De fapt, lipidul ar trebui sa fie compus din mai multe domenii “cristaline” si mai putine domenii “lichide”. Precum alte modele, organizarea membranara nu este deloc simetrica.

Asimetria este redata de: Distributia inegala a proteinelor intramembranare Pozitia externa a carbohidratilor Enzime specific localizate exclusiv la exteriorul/interiorul membranei In unele tipuri de membrane exista o asimetrie regionala (ex. Sinapsele) Asimetria interior-exterior a fosfolipidelor

Componentele individuale membranare nu sunt statice, o gama larga de miscari pot avea loc la intervale diferite de timp (de la 10-14, la cateva ore in cazul flip-flopului lipidic)

TABELUL I

5


Tipul de miscare Timpul (sec)Vibratii ale atomilor 10-14 – 10-13

Izomerizare trans 10-10 – 10-8

Rotatia lipidelor in jurul axului 10-9

“Sarituri” laterale ale lipdelor si proteinelor 10-8 – 10-6

Rotatia proteinelor 10-4 – 10-2

Flip-flop lipidic 10 - 106

Miscarea lipidelor si proteinelor

Gramada lanturilor carbonice ale lipidelor sunt in stare fluida; exista o indoire si o rotatie a legaturilor C-C. O singura molecula fosfolipidica se poate deplasa aproximativ 2µm intr-o secunda.

Proteinele intrinseci traverseaza membrana pe toata grosimea ei. Partile intramembranare sunt structuri hidrofobe, in dublu helix, legate intre ele, in mediul apos, prin zone hidrofile, neelicoidale.

Proteinele extrinseci: Pot interactiona cu suprafata bistratului lipidic prin legaturi elecrostatice Pot fi legate prin legaturi hidrofobe, fara a patrunde prea mult in stratul lipidic sau sunt ancorate printr-un segment terminal ce penetreaza membrana

Pot fi legate covalent de o ancora lipidica Se pot atasa de alte proteine membranare

Posibilitatile de miscare sunt:A. Pentru lipide:

a) Difuzie lateralab) Rotatie in jurul unui ax propriuc) Rotatie descriind o suprafata conicad) Flexiee) Trecere dintr-un strat lipidic in celalalt

B. Pentru proteine:a. Translatie laterala prin bistratb. Rotatie in jurul unei axe perpediculare pe stratul bilipidic

Spre deosebire de lipide, care se pot misca liber in bistrat, miscarea proteinelor e conditionata, in mare masura, de interactiunea cu alte proteine.

In orice moment, o fractiune insemnata a lipidelor membranare e adiacenta proteinelor, dar exista un permanent schimb (cu o constanta de viteza de aproximativ 107 µm/s) intre lipidele limitrofe si cele din restul stratului bilipidic. Afinitatea diverselor tipuri de lipide pentru a adera de proteine variaza in raport de 1:5, deci vor exista diferente intre compozitia generala a dublului strat lipidic si a paturii adiacente proteinelor.

Fosfolipidele

6


Acestea intervin prin inducerea la nivelul stratului lipidic a tranzitiilor de faza termotropice. O membrana artificiala la nivelul careia este dispus in strat dublu un singur tip de fosfolipid trece din starea de cristal lichid in stare cristalina rigida ( sau gel ) la un punct de congelare precis si caracteristic. Schimbarea de stare se numeste tranzitie de faza. Ea depinde de natura partii polare, adica, pentru un lipid dat de natura lanturilor hidorcarbonate. Acestea pot adopta doua conformatii diferite: una dezordonata, de tip α, orientarea medie a lanturilor fiind perpendicular la stratul dublu lipidic si alta ordonata, in care lanturile sunt rigide si intinse, fie perpendicular pe stratul bilipidic (conformatie β), fie inclinate (conformatie β’). Deoarece conformatia lanturilor depinde in primul rand de temperatura, cand acesta scade suficient se va produce trecerea de la conformatia α la tipul β sau β’. Temperatura la care survine tranzitia de faza este cu atat mai joasa cu cat lanturile hidrocarbonate sunt mai scurte sau poseda mai multe legaturi duble. Aceasta deoarece lanturile scurte reduc tendinta de interactiune a cozilor hidrocarbonate, iar in cazul legaturilor duble cis in lanturile hidrocarbonate se formeaza noduri, care fac asamblarea lor dificila.

7


Colesterol

Un alt determinant al fluiditatii membranei este colesterolul, care poate ajunge ca numar de molecule in membrana la paritate cu fosfolipidele. In afara de rolul in reglarea fluiditatii, colesterolul creste stabilitatea bistratului. Moleculele de colesterol sunt orientate cu gruparile hidroxil in proximitatea gruparilor polare ale moleculelor de fosfolipide. Nucleele lor steroide, in forma de “farfurie” interactioneaza cu regiunea lanturilor hidrocarbonate cea mai apropiata de gruparile polare ale capului lipidic, lasand restul lantului flexibil. Rezulta astfel o imobilizare partial a fosfolipidelor. La concentratiile obisnuite din membrane, colesterolul exercita astfel o obstructie a apropierii si cristalizarii lanturilor hidrocarbonate. In acest mod, colesterolul inhiba tranzitiile de faza induse de temperatura si impiedica diminuarea brutala a fluiditatii in cazul unei temperature scazute.

In realitatea implicatiile comportamentului moleculei de colesterol in membrana sunt mult mai ample. Ne rezumam doar la o enumerare a acestora:

Efecte asupra ordinii moleculelor lipidiceEfecte asupra permeabilitatiiEfecte de condensare a unor fosfolipideEfecte asupra capetelelor lipidice si a regiunii carbonilActiune asupra difuziunii lateraleAsupra morfologiei membranei

Scaderea sau cresterea colesterolului din membrane deprima functia citotoxica a limfocitului.

8


O serie de bacterii, levuri si alte heteroterme isi regleaza compozitia in acizi grasi de la nivelul plasmalemei, functie de temperatura mediului, in scopul mentinerii unei fluiditati relative constant. Se ilustreaza astfel importanta biologica a acestei proprietati. A fost evidentiata o adapatare homeovascoasa, exprimata prin modificari ale compozitiei lipidice, la animalele care hiberneaza.

Tipuri de proteine membranare

Cea mai clara distinctive, cel putin pentru moment, a tipurilor de protein la nivelul membranei este sugerata de raporturile acestora cu dublul strat lipidic. Se accepta existent a doua cai de interactiuni a proteinelor cu matricea lipidica: ele pot fi associate cu capetele polare ale lipidelor sau cu regiunea nepolara a stratului dublu. Aceasta supozitie este sustinuta de existenta a doua clase generale de proteine. Prima clasa consta din proteine care pot fi deplasate din membrane prin metode “blande” cu solventii hipotoni, solutiile saline puternice, sau cationii divalenti. Aceste protein au fost denumite extrinseci sau periferice membranei. Explicatia cea mai simpla a indepartarii lor usoare consta in asocierea cu capetele polare ale lipidelor. A doua clasa cuprinde proteinele care nu pot fi extrase din membrana decat prin detergent. Aceste proteine au fost denumite intrinseci sau integrale. Deoarece structura detergentilor utiizati se aseamana cu a lipidelor membranare, in sensul ca acestia sunt de asemenea amfifili, se presupune ca partea nepolara a detergentului inlocuieste regiunile nepolare ale lipidelor din asocierea lor cu proteinele membranare. Se accepta, deci, ca proteinele intrinseci sunt asociate in principal cu regiunile nepolare ale stratului dublu lipidic. Pentru simplificare, fiecare proteina a fost inclusa in una din cele doua clase, dar in realitate exista proteine membranare care au partial proprietati intrinseci si deopotriva extrinseci.

Proteinele membranare mai pot fi distinse si functie de compozitia chimica, respectiv, continutul lor in glucide. Pe aceasta baza ele au fost clasificate in proteine negliconjugate si glicoproteine. Reziduurile glucidice ale glicoproteinelor sunt expuse exclusiv la nivelul fetei externe a membranelor. Dispozitia asimetrica a partii hidrocarbonate reflecta anizotropia a celor doua suprafete ale membranei. Totusi, clasificarea functie de conditiile extractiei din membrana este deocamdata cea mai logica, deoarece ofera sugestii asupra naturii legaturilor proteinelor cu stratul dublu lipidic.

Proteinele extrinseci

Ca urmare a existentei celor doua fete ale biomembranei, se accepta existenta a doua tipuri de proteine extrinseci: unele prezente la nivelul suprafetei externe a membranei si altele localizate la nivelul fetei citoplasmatice. Se cunosc putine proteine extrinseci din prima categorie, probabil datorita indepartarii lor conscutive procedeelor de izolare a biomembranelor. O proba in favoarea prezentei unor proteine extrinseci pe fata externa a membranei ar putea fi constituita de modul in care functioneaza receptorii de la nivelul plasmalemei. Se stie ca la nivelul acestora se leaga specific diferite molecule, inclusiv de natura proteica (hormorni, anticorpi, lecitina), devenind astfel episodic proteine extrinseci ale membranei.

O serie de proteine ca enzimele sau antigenele sunt probabil ancorate la suprafata membranei in scopul localizarii actiunilor specifice. Evident, enzimele sunt asociate membranei la nivelul ambelor fete, in raport cu functia specifica, pe cand antigenele sunt dispuse exclusiv pe fata externa. Existenta proteinelor extrinseci de la nivelul fetei citoplasmatice a membranei este definitiv demonstrata in cazul scheletului membranei eritrocitare.

9


Mai multe lucrari recente semnaleaza prezenta si in alte celule a unor proteine asemanatoare cu spectrina, sindeina su banda 4.1 eritrocitare. De aici concluzia unei similitudini a citoscheletului la nivelul tuturor celulelor.

Proteinele intrinseci

Proteinele intriseci sunt in parte incluse, incastrate la nivelul lipidelor din membrana, iar suprafata lor interactioneaza cu zona nepolara a stratului dublu lipidic. Pentru demonstrarea acestui fapt, J. Clarke a elaborat o metoda prin care se masoara cantitatea de detergent Triton X-100 legata la proteina nativa. Proteinele intrinseci leaga cantitati substantiale de detergent, intre 0,2-1g /g proteina si in felul acesta pot fi identificate. Metoda se sprijina pe faptul ca detergentii, molecule mici amfifile, cand sunt amestecati cu membranele se leaga pe regiunile hidrofobe ale proteinelor membranare, dislocandu-se de moleculele lipidice. Cealalta extremitate a moleculei de detergent fiind polara, fixarea conduce la extractia proteinelor in solutie, sub forma de complex detergent-proteina.

Dupa eliminarea detergentului, proteinele solubilizate temporar devin de obicei foarte insolubile si precipita in mediu apos, sub forma unui amestec de specii diferite. Proteinele membranare sunt, deci, mult mai dificil de purificat si de studiat decat proteinele hidrosolubile. In plus, in timpul extractiei ele pot fi denaturate, prin alterarea structurii conformationale. Totusi, in conditiile utilizarii de detergenti slabi, in concentratie redusa se poate reusi o prezervare a proteinelor in forma nativa.

In prezent prin combinarea actiunii detergentilor cu separarea prin electroforeza s-a realizat un avans metodologic exceptional. Cea mai productiva metoda este electroforeza in gel de poliacrilamida in prezenta detergentului dodecilsulfat de sodiu (SDS). In acest scop, membranele sunt mai intai incalzite la 100º C intr-o solutie de SDS 1%. Detergentul fiind puternic, rupe toate interactiunile noncovalente dintre proteine, sau dintre proteine si lipide. Apoi se efectueaza, timp de mai multe ore, electroforeza in gel de poliacrilamida continand SDS. Rolul SDS anionic consta in neutralizarea sarcinilor negative ale proteinelor. Ca urmare, proteinele vor migra exclusiv functie de masa proprie; cu cat o proteina este mai voluminoasa, cu atat migrarea sa va fi mai lenta datorita obstructiei create de reteaua de poliacrilamida.

10


Tipuri de proteine intriseci

Se pot distinge 2 tipuri de proteine intrinseci, pornind de la deosebirile substantiale ale proprietatilor si dispunerea de la nivelul membranei. Acestea sunt tipurile de proteine I si II.

Proteinele intrinseci de tip I prezinta cea mai mare parte a masei in mediul apos de la nivelul fetei necitoplasmatice a membranei, unde isi exprima proprietatile functionale. Portiunea intramembranara a proteinei serveste doar la ancorarea in stratul dublu lipidic. Ea are forma de bastonas constand dintr-un lant strans cu infasurare de tip alfa helix. Glicoforina eritrocitara este cea mai cunoscuta proteina din acest grup. In prezent se cunosc numeroase proteine membranare legate la suprafata celulei printr-o simpla elice alfa hidrofoba si ancorate in citoplasma printr-o coada hidrofila. Frecvent, au rol de receptori specifici ai moleculelor extracelulare sau sunt antigene de histocompatibilitate. Structura unor receptori este in prezent foarte bine cunoscuta, pana la nivel de lant polipeptidic primar si organizare conformationala.

Majoritatea proteinelor de tip I prezinta gruparea –NH2 terminala la exterior, iar –COOH terminal este situat in citoplasma. Dimpotriva, unele proteine, ca izomaltazsucraza intestinala si nueraminidaza virusului gripal sunt ancorate invers.

Proteinele intrinseci de tip II prezinta 2 caractersitici majore:a) Cea mai mare parte din masa lor se afla situate in citoplasma si numai o fractiune foarte

redusa din resturile de aminoacizi este expusa la nivelul fetei externe a stratului bilipidicb) Mecanismul de insertie in stratul dublu este diferit

Acumularea rapida a datelor incepe sa “complice” distingerea celor 2 tipuri de protein. Astfel, in cadrul tipului II, se contureaza mai multe grupe de proteine. Un prim grup cuprinde citocromul b5, reductaza citocromului b5 si stearil-CoA-reductaza. Proteinele grupului au o caracteristica similara cu cele de tipul I, in sensul ca prezinta domeniile lor functionale situate in intregime in compartimentul apos. In ceea ce priveste, insa, atasarea la membrana, ea este mai ampla decat in cazul tipului I. Astfel, citocromul b5 este atasat la membrana prin intermediul zonei hidrofobe a moleculei care prezinta terminal grupul COOH si contine 44 de aminoacizi. Portiunea intramembranara a polipeptidului contine 2 aranjamente, unul prin care se traverseaza stratul dublu in intregime, iar al doilea localizat numai la nivelul stratului monopolic intern.

Toate proteinele intrinseci membranei sunt glicoproteine, iar glicolizarea are loc in timpul tranzitului la nivelul reticulului endoplasmatic si sistemului Golgi.

In concluzie, modelul mozaicului fluid, reprezinta un exemplu desavarsit despre modul in care un concept inspirat, desi sprijinit in parte pe o serie de ipoteze, poate propulsa cercetarea stiintifica din domeniul pentru care a fost elaborat.

11


Bibliografie

D. G. Margineanu, M. I. Isac, C. Tabra (1980) - Biofizica

Valeriu Rusu; Traian Baran; Dumitru D. Branisteanu - Biomembrane si patologie,

Editura Medicala

Cipriana Stefanescu; Valeriu Rusu - Biophysics and Medical Physics: an Introduction

Constantin Dimoftache; Sonia Herman - Biofizica medicala

Benga Gheorghe – Biologia moleculara a biomembranelor, Editura Dacia, Cluj-

Napoca, 1979

Chapman D. , Benga Gheorghe – Biological Membranes , vol.5, D.Chapman, Editura

Academic Press, Londra, pag 1-56

Harrison R. , Lunt G. G.- Biological Membranes, Editia a II-a, Blackie, Glasgow si

Londra, 1980

Shinitzky M. – Membrane fluidity, vol. I, II, CRC Press, Boca Raton, Florida, 1984

Warren G. – Membrane Structure, Elsevier/North- Holland Biomedical Press, 1981,

pag 215-257

Weissmann G. , Claiborne R. – Cell Membranes-Biochemistry, Cell Biology &

Pathology, HP Publishing, New York, 1975

12


Cuprins

Istoric 2

Caracteristicile modelului 4

Miscarea lipidelor si proteinelor 6

Fosfolipide 7

Colesterol 8

Tipuri de proteine membranare 9

Proteine extrinseci 9

Proteine intrinseci 10

Tipuri de proteine intrinseci 11

13

modelul mozaicului fluid

Documents