İMMUNOLOJİK İMMUNOLOJİK TANI YÖNTEMLERİTANI YÖNTEMLERİ

PresipitasyonPresipitasyon

G)İMMUNOASSAY TESTLERG)İMMUNOASSAY TESTLER İşaretli antikorların kullanılmasıylaİşaretli antikorların kullanılmasıyla

19421942’’de; de; FAFA Fluoresan Antikor (Fluorokromlar) Fluoresan Antikor (Fluorokromlar)

19541954’’de; de; IFAIFA (İndirekt Fluoresan Antikor) (İndirekt Fluoresan Antikor)

19601960’’da; da; RIARIA (Radyoizotopla- iyotla) (Radyoizotopla- iyotla)

19701970’’de; de; EIAEIA (enzimle) kullanıma girmiştir (enzimle) kullanıma girmiştir

Antikor yada antijen saptamak için Antikor yada antijen saptamak için kullanılırlar kullanılırlar

I- İmmun Fluoresan (IF) testlerI- İmmun Fluoresan (IF) testler FLUORESANSFLUORESANS

FluorokromFluorokrom veya veya floroforflorofor boyaların boyaların

UltraviyoleUltraviyole ışık altında ışık enerjisini ışık altında ışık enerjisini emerek bu enerjiyi emerek bu enerjiyi farklı dalga farklı dalga boyuna boyuna çevirmesine denir çevirmesine denir

Antikorlar en sık fluoresin isotiyosiyanat Antikorlar en sık fluoresin isotiyosiyanat ((FITCFITC) ile işaretlenir. ) ile işaretlenir. BUNA GÖRE;BUNA GÖRE; Direk fluoresan antikor (DFA)Direk fluoresan antikor (DFA)

Katı fazda klinik örnek (Ag)Katı fazda klinik örnek (Ag) Üzerine FITCÜzerine FITC’’li Abli Ab Pozitif sonuç (Pozitif sonuç (fluoresan-yeşilfluoresan-yeşil

görüntü)görüntü) Bakteri ve virusleriBakteri ve virusleri hızlı tanıda hızlı tanıda

♣♣ KuduzdaKuduzda negri cisimciği negri cisimciği ♣♣ Kolera Kolera tanısındatanısında

İndirek fluoresan antikor (İFA)İndirek fluoresan antikor (İFA) Katı fazda hazır AgKatı fazda hazır Ag Hasta serumu(Hasta serumu(aranan Abaranan Ab)) FITCFITC’’li Anti-Igli Anti-Ig Pozitif sonuç (Pozitif sonuç (fluoresan görüntüfluoresan görüntü))

Birçok bakteri virus enf ve Birçok bakteri virus enf ve otoimmun hast.otoimmun hast.

IF yöntemiyle klinik örneklerden IF yöntemiyle klinik örneklerden hemhem AgAg hemhem AbAb aranır aranır

Fluoresan mikroskobu olması ve uzman Fluoresan mikroskobu olması ve uzman kişi gereklidirkişi gereklidir

II-Radioimmuno Assay (RIA)II-Radioimmuno Assay (RIA)

Yöntem aynı Yöntem aynı IFIF ve ve EIAEIA gibidir gibidir Antikorda Antikorda işaretliyici madde olarakişaretliyici madde olarak

Radyoaktif maddeRadyoaktif madde

I. 125 ve I. 132I. 125 ve I. 132 kullanılır kullanılır

Gamma sayaçlarında değerlendirilirGamma sayaçlarında değerlendirilir

Radyoaktif madde kullanımından Radyoaktif madde kullanımından dolayı sınırlıdırdolayı sınırlıdır

Özellikle hormon testlerinde (Özellikle hormon testlerinde (TSH, TSH, T3, T4T3, T4) kullanılır) kullanılır

Radyo allergo sorbent (Radyo allergo sorbent (RASTRAST) ) deneyideneyi

Allerjene spesifik IgE tayininde Allerjene spesifik IgE tayininde kullanılırkullanılır

Radioimmunosorbent (Radioimmunosorbent (RISTRIST))

Serumda total IgE tayinindeSerumda total IgE tayininde

VI. ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent VI. ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)Assay)

Plastik yüzeylere yapıştırılmış bilinen antijenler üzerine, önce araştırılacak serumun (antikor) ilavesi; sonra yıkanması, daha sonra ise peroksidazlı insan antiglobulini ilavesi ve buna da renk veren bir substrat’ın eklenmesi esasına dayalı kolorimetrik deneylerdir. 

Antikoru ENZİMLE İŞARETLEME Antikoru ENZİMLE İŞARETLEME yöntemidiryöntemidir

Peroksidaz, alkalin fosfataz ve beta Peroksidaz, alkalin fosfataz ve beta galaktozidaz gibi enzimlergalaktozidaz gibi enzimler

Spesifik substratları renkli ürünlere Spesifik substratları renkli ürünlere çevirirler.çevirirler.Peroksidaz/OrthofenilendiaminPeroksidaz/OrthofenilendiaminAlkali fosfataz/Nitrofenil fosfatAlkali fosfataz/Nitrofenil fosfat

Renkli ürünler spektrofotometrede Renkli ürünler spektrofotometrede belirli dalga boylarında olurlar.belirli dalga boylarında olurlar.

Yöntemin;Yöntemin;Kullanılan reaktifler uzun ömürlü Kullanılan reaktifler uzun ömürlü

olmasıolmasıArtık maddelerle ilgili radyasyon Artık maddelerle ilgili radyasyon

sorunu olmamasısorunu olmamasıUygulamasının basit ve otomatize Uygulamasının basit ve otomatize

edilebilmesi yönleriyleedilebilmesi yönleriyleAynı prensipli (işaretleme) RIA ve Aynı prensipli (işaretleme) RIA ve

IFIF’’ye göre avantajlıdırye göre avantajlıdır

Dezavantajları ise;Dezavantajları ise;Antijen saptamada klinik örneğin Antijen saptamada klinik örneğin

uygunluğunun değerlendirememesiuygunluğunun değerlendirememesiBazı viral enfeksiyonlarda düşük Ag Bazı viral enfeksiyonlarda düşük Ag

yoğunluğu saptanmamasıyoğunluğu saptanmamasıIgM saptanmasında RF-IgM ile IgM saptanmasında RF-IgM ile

çatışmanın olmasıçatışmanın olmasıBunun için Absorblama işlemi olmasıBunun için Absorblama işlemi olması

Antijen veya antikorun çeşitli vücut Antijen veya antikorun çeşitli vücut sıvılarında <5pg düzeyinde saptandığı için sıvılarında <5pg düzeyinde saptandığı için yüksek yüksek ANALİTİK DUYARLILIKTAANALİTİK DUYARLILIKTA olması olması

UYGULAMA PRENSİPLERİUYGULAMA PRENSİPLERİAg ve Ab (sınıfa özgül) saptayabilirAg ve Ab (sınıfa özgül) saptayabilir Katı faz olarak;Katı faz olarak;

Plastik tabanlı mikrotitrasyon plaklarıPlastik tabanlı mikrotitrasyon plaklarıBoncuk veya filtre kullanılırBoncuk veya filtre kullanılır

Bazı ELISA uygulama şekilleri:Bazı ELISA uygulama şekilleri: 1)İNDİREK ELISA ile Ab Tayini1)İNDİREK ELISA ile Ab Tayini AgAg kaplı kuyucuk kaplı kuyucuk Hasta serumu (Aranan Hasta serumu (Aranan AbAb)) YıkamaYıkama Enzim işaretli ikincil Enzim işaretli ikincil AbAb YıkamaYıkama SubstratSubstrat H2SO4H2SO4 (Reaksiyonu durdurur) (Reaksiyonu durdurur) Spektrofotometre Spektrofotometre

Yarışmasız İndirekt ELISA ileYarışmasız İndirekt ELISA ileAb saptamaAb saptama

2)Sandwich ELISA ile Ag Tayini2)Sandwich ELISA ile Ag Tayini Katı yüzeyde capture monoklonal yada Katı yüzeyde capture monoklonal yada

poliklonalpoliklonal AgAg içeren hasta serum örneği içeren hasta serum örneği YıkamaYıkama Enzimle işaretli saptayıcı monoklonal yada Enzimle işaretli saptayıcı monoklonal yada

poliklonalpoliklonal YıkamaYıkama SubstratSubstrat H2SO4H2SO4 (Reaksiyonu durdurma) (Reaksiyonu durdurma) Spektrofotometrede okumaSpektrofotometrede okuma

3) İNDİREK SANDWİCH ELISA ile Ag 3) İNDİREK SANDWİCH ELISA ile Ag TayiniTayini

Katı yüzeyde capture Katı yüzeyde capture AbAb AgAg içeren hasta serum örneği içeren hasta serum örneği YıkamaYıkama Spesifik bir saptayıcı antikor ilave edilir antijene Spesifik bir saptayıcı antikor ilave edilir antijene

bağlanırbağlanır Ag Ag iki antikor arasında kalıriki antikor arasında kalır

Enzimle işaretli ikincilEnzimle işaretli ikincil Ab Ab saptayıcı antikora Fc saptayıcı antikora Fc bölgesinden bağlanırbölgesinden bağlanır

HRP ile işaretliHRP ile işaretli

YıkamaYıkama SubstratSubstrat H2SO4 H2SO4 (Reaksiyonu durdurma) (Reaksiyonu durdurma) Spektrofotometrede okumaSpektrofotometrede okuma

4) YARIŞMACI (KOMPETATİF)ELISA:4) YARIŞMACI (KOMPETATİF)ELISA:Serumda Ag Arama (Sıklıkla kullanılır)Serumda Ag Arama (Sıklıkla kullanılır)

Katı yüzeyde Ab Katı yüzeyde Ab Şüpheli serum (Ag aranan klinik Şüpheli serum (Ag aranan klinik

örnek) ve enzimli işaretli antijenin örnek) ve enzimli işaretli antijenin beraber konulduğu antijen beraber konulduğu antijen rekabet rekabet (Competetive) (Competetive) yöntemidir.yöntemidir.

İşaretli antijen katı yüzeye İşaretli antijen katı yüzeye bağlanırsa, substratla da birleşir bağlanırsa, substratla da birleşir RENK OLUŞUR.RENK OLUŞUR.

Bu sonuç klinik örnekteki AgBu sonuç klinik örnekteki Ag’’nin nin olmadığı bir sonuçtur.olmadığı bir sonuçtur.

Fakat klinik örnekteki antijen katı Fakat klinik örnekteki antijen katı faza bağlanırsa enzim faza bağlanırsa enzim olmadığından substratla olmadığından substratla reaksiyon olmaz. reaksiyon olmaz. RENK RENK OLUŞMAZ.OLUŞMAZ.

5) YAKALAMALI (CAPTURE)ELISA:5) YAKALAMALI (CAPTURE)ELISA:Sıklıkla; Sıklıkla;

Enfeksiyoz etkene yönelik,Enfeksiyoz etkene yönelik, Spesifik IgM ve IgGSpesifik IgM ve IgG saptama testidir saptama testidir

1)Spesifik Ag saptama1)Spesifik Ag saptama Katı faza poliklonal veya M.abKatı faza poliklonal veya M.ab’’lar konulur lar konulur

Poli Ab Poli Ab’’ler, ler, M AbM Ab’’lere göre lere göre Farklı Ag epitoplarını bağladığı için Farklı Ag epitoplarını bağladığı için

güvenilirdirgüvenilirdir

2)Spesifik Ab (IgM) saptama2)Spesifik Ab (IgM) saptamaKatı faz formuKatı faz formu

IgMIgM’’in Fc bölgesine karşıt anti-IgM in Fc bölgesine karşıt anti-IgM Ab katı faza Ab katı faza

bağlanırbağlanır Üzerine hasta serumu (IgM?) Üzerine hasta serumu (IgM?)

konulurkonulur Üzerine viral antijenÜzerine viral antijen Enzimle işaretli antikorEnzimle işaretli antikor Substrat… Substrat…

Konjugat faz formuKonjugat faz formu Katı fazda viral AgKatı fazda viral Ag Hasta serumu (IgM?)Hasta serumu (IgM?) ENZİMLE İŞARETLİ anti IgM Ab ENZİMLE İŞARETLİ anti IgM Ab

(KONJUGAT)(KONJUGAT) Substrat…Substrat…