ISTRAIVANJE MIKROORGANIZAMA MIKROSKOPIMA

Mikroskop (gr. mikros=malen, sitan; skopeo= gledam) je optiki instrument koji se upotrbljava za promatranje objekata, kao to su mikroorganizmi, koji su presitni da bi se mogli vidjeti golim okom - to je osnova primjene mikroskopa za stvaranje slike mikrobnog svijeta. razvoj: 1600. god. Zacharias i Hans Janssen konstruirali prvi sloeni mikroskop 1625.god. Giovanni Faber - daje naziv mikroskopu 1665.god. Robert Hooke primitivnim mikroskopom otkrio ive stanice 1674.god. Antony van Leeuwenhoek pomou jednostavnog mikroskopa (bikonveksna lea umetnuta izmeu mjedenih ploa) otkrio nevidljive oblike ivota - najsitnije ivotinje tj. mikroorganizme

Mikroskopi koji se danas koriste sastavljeni su od niza optikih i mehanikih djelova, a u osnovi razlikujmo dva tipa: svjetlosne i elektronske mikroskope. Svjetlosni ili optiki mikroskopi: mikroskop s svjetlim vidnim poljem mikroskop s tamnim vidnim poljem fluorescentni mikroskop fazno-kontrastni mikroskop

Elektronski mikroskop transmisijski mikroskop pretrani elektronski mikroskop

Grafiki prikaz tipova uzoraka to se istrauju esto upotrebljavan im mikroskopim au mikrobiologiji i srodnim podrujima. Prikazan je i djelotvoran domet tih instrumenata.

JEDNOSTAVNI MIKROSKOP

SAMO JEDNA LEA

Figure 1.2b

Sloeni svjetlosni mikroskop

sastoji se najmanje dvaju sustava lea: objektiva koji poveava uzorak i okulara koji poveava sliku to je dobivena od objektiva. - kao izvor svjetlosti u sloenom mikroskopu se upotrebljava vidljivi dio spektra - upotrbljava se za istraivanje vrlo sitnih objekata, a i njihove fine detalje ili ultrastrukture - ukupno poveanje mikroskopa dobiva se tako da se pomnoi poveanje objektiva s poveanjem okulara Mehaniki dijelovi mikroskopa: postolje (podloga) stativ (ruica) tubus s revolverom stoli mikroskopa makrovijak i mikrovijak ureaj za osvjetljavanje

-

Optiki dijelovi - slue za uveavanje i osvjetljavanje predmetakoji se promatraju 1. OKULAR - kratka cijev koja sadri dvije lee (gornja ili okularna i donja ili sabirna lea) - nalazi se na gornjem kraju tubusa - poveanja okulara su: 1x, 2x, 5x, 10x, 15x

2. OBJEKTIV - najvaniji optiki dio mikroskopa - lee objektiva slue za skupljanje i koncentriranje zraka svjetlosti koje dolaze iz preparata i za poveavanje stvorene slike predmeta - MO RAZDVAJANJA - najvanija osobina objektiva -sposobnost lee da istakne fine detalje i strukturu - veina mikroskopa ima 3 objektiva s razliitim poveanjima: malo poveanje (10x) srednje poveanje (40x) veliko poveanje (100x)

Prema nainu promatranja preparata razlikujemo 2 sistema objektiva: a) SUHI sistem objektiva - za promatranje gljiva, algi, protozoa - izmeu frontalne lee i preparata nalazi se zrak - zrak nema isti indeks refrakcije kao staklo te dolazi do prelamanja svjetlosnih zraka - malo i srednje poveanje

b) ULJNO IMERZIONI (MOKRI) sistem objektiva - za promatranje bakterija, njihovih oblika i rasporeda stanica - izmeu preparata i frontalne lee nalazi se imerzijska tekuina (anisol, cedrovo ulje i sl.) kojoj je indeks refrakcije blizu indeksa refrakcije stakla - veliko poveanje

3. KONDENZOR I IRIS-ZASLON - kondenzor se nalazi ispod stolia mikroskopa izmeu izvora svjetla i promatranog preparata - sastoji se od sustava lea koje sabiru svjetlosne zrake i usmjeravaju ih prema promatranom preparatu - iris-zaslon slui za kontrolu intenziteta svjetla tj. za reguliranje koliine svjetla koja ulazi u kondenzor

SVIJETLO POLJE

TAMNI OBJEKTI SU VIDLJIVI U ODNOSU NA SVIJETLU POZADINU.

TAMNO POLJE

SVIJETLI OBJEKTI SU VIDLJIVI U ODNOSU NA TAMNO POLJE

Figure 3.4a, b

FAZNO KONTRASNI MIKROSKOP

POJAAVA DIFRAKCIJU SVIJETLA KOJE PROLAZI KROZ UZORAK

Figure 3.4c

FLUORESCENTNI MIKROSKOPUPOTREBLJAVA SE UV SVIJETLO. FLUORESCENTNE TVARI ADSORBIRAJU UV SVIJETLO I EMITIRAJU VIDLJIVO SVIJETLO STANICE SE MOGU BOJATI FLUORESCENTNIM BOJAMAFigure 3.6b

KONFOKALNI MIKROSKOPUPOTREBLJAVAJU SE FLUOROKROMI I LASERI. LASER OSVJETLJAVA SVAKI SLOJ UZORKA I STVARE SE 3 D SLIKA

Figure 3.7

ELEKTRONSKI MIKROSKOP

UPORABA ELEKTRONA UMJESTO SVIJETLA NIA VALNA DULJINA ELEKTORNA DAJE BOLJU REZOLUCIJU.

TRANSMISIJSKI ELEKTRONSKI MIKROSKOP (TEM)ULTRA TANKE SEKCIJE UZORKA SVIJETLOST PROLAZI KROZ UZORAK, ONDA KROZ ELEKTORMAGNETSKU LEU DO FILMA. UZORKA SE MOE OBOJITI SA SOLIMA TEKIH METALA.

TRANSMISIJSKI ELEKTRONSKI MIKROSKOP (TEM)10,000-100,000; rezolucija 2.5 nm

Figure 3.8a

SKENIRAJUI ELEKTRONSKI MIKROSKOP (SEM)SNOP ELEKTRONA SKENIRA POVRINU CJELOKUPNOG UZORKA. ELEKTRONI EMITRIANI OD UZORKA STVARAJU SLIKU.

SKENIRAJUI ELEKTRONSKI MIKROSKOP (SEM)1000-10,000; rezolucija 20 nm

Figure 3.8b

Priprava uzorka za mikroskopiranje svjetlosnim mikroskopom

Mikroskopski preparati slue nam za promatranje morfolokih karakteristika mikroorganizama. Dijelimo ih u dvije kategorije: 1. NEOBOJENI (NATIVNI) PREPARATI 2. OBOJENI PREPARATI

1. NEBOJENI (NATIVNI) PREPARATI - koriste se za mikroskopiranje ivih mikroorganizama gdje se jasno vide vei mikroorganizmi (kvasci, plijesni, alge, vee bakterije). Mikroskopiraju se pod poveanjem od 400x Vrste nebojenih preparata: a) vlani preparati b) visea kap - za odreivanje pokretljivosti bakterijskih stanica

Priprema preparata visea kap

2. OBOJENI PREPARATI -veina mikroorganizama je bezbojna, a da bismo ih mogli istraivati svjetlosnim mikroskopom, moramo ih obojati Obojeni preparati omoguuju: - bolje i detaljnije izuavanje mikroorganizama - bolje uoavanje pojedinih struktura (spore, st. stjenka) - razlikovanje razliitih tipova mikroorganizama

MIKROBIOLOKE BOJE Bojila za bojanje mikrobnih stanica najee su u obliku soli, u kojima je jedan od iona nosilac boje kromogeni dio. Sposobnost bojila da se vee na makromolekulske komponente stanice ovisi o elektrinom naboju na kromogenom dijelu, a i o staninim komponentama koje se boje. a) KISELA (anionska) bojila imaju negativan naboj i afinitet prema pozitivno nabijenim dijelovima stanice - kiseli fuksin (crveno), eozin (crveno), eritrozin (crveno), fluorescein (uto), nigrozin (crno)

b) BAZINA (kationska) bojila imaju pozitivan naboj te afinitet prema negativno nabijenim dijelovima stanice - metilensko modrilo (plava), gentiana violet (ljubiasta), karbol fuksin (crveno)

Vrste postupaka bojenja: -JEDNOSTAVNO bojenje koristi se jedno bojilo, slui za vizualizaciju morfolokog oblika -DIFERENCIJALNO bojanje upotreba dvaju kontrasnih bojila - izdvajanje u skupine (bojanje po Gramu) - vizualizacija struktura (bojanje ahura, spora, bieva, jezgre)

JEDNOSTAVNO BOJANJE postupak: 1. Priprema preparata za bojanje - odmaivanje stakalca - nanoenje kapljice vode - nanoenje mikrobne kulture u kap vode - ezom se nanesena kap razmae po povrini predmetnice - suenje na zraku - fiksiranje 2. Bojanje s jednom mikrobiolokom bojom 3. Ispiranje vodom nakon bojanja 4. Suenje pomou upijajueg papira 5. Mikroskopiramje uz kap anisola i najvee poveanje mikroskopa

Postupak bojenja po Gramu

Bojanje bakterijskih endospora po Schaeffer Fultonovoj metodi

Bojanje bakterijskih ahura (kapsula)

Hranjive podloge za uzgoj mikroorganizama

Hranjive podloge slue nam za uzgoj mikroorganizama u laboratorijskim uvjetima. Svojim sastavom i karakteristikamaosiguravaju mikroorganizmima onakve uvjete ivota koje bi oni imali u prirodnim sredinama.

Dijelimo ih prema: a) nainu primjene b) kemijskom sastavu C) konzistenciji

a)Hranjive podloge prema nainu primjene dijelimo: obine podloge - slue za izolaciju i uzgoj veeg broja mikroorganizama specijalne podloge - slue za uzgoj tono odreene grupe mikroorganizama

Za utvrivanje specifinosti koristimo selektivne i diferencijalne podloge. SELEKTIVNE hranjive podloge imaju takav sastav koji potie rast eljenih vrsta, a onemoguava rast neeljenih mikroorganizama. Njihova seletivnost se postie dodatkom neke inhibicijske tvari. DIFERENCIJALNE hranjive podloge omoguavaju lake razlikovanje kolonija eljenog mikroorganizma od drugih kolonija koje rastu na istoj hranjivoj podlozi.

b)Hranjive podloge prema kemijskom sastavu dijelimo na: PRIRODNE hranjive podloge - toan kemijski sastav takvih podloga nije poznat, a prireuju se od produkata biljnog (plodovi, sokovi) ili ivotinjskog (mlijeko, krvni serum, u) porijekla UMJETNE (SINTETSKE) hranjive podloge - pripremaju se iz istih kemijskih spojeva po odreenim recepturama ije komponente mogu biti organskog ili anorganskog sastava

KOMPLEKSNE hranjive podloge slue za uzgoj veine heterotrofnih gljiva i bakterija. Kemijski sastav takvih podloga varira i djelomino je poznat.Komponente su im kvasni i mesni ekstrakt. Svaka hranjiva podloga mora osiguravati mikroorganizmima izvor ugljika, duika, fosfora, aminokiselina, vitamina.

c)Hranjive podloge prema konzistenciji dijelimo: TEKUE, KRUTE (VRSTE) I POLUTEKUE. vrstoa podloge postie se dodavanjem agara tekuim hranjivim podlogama. Agar je heteropolisaharid koji se dobiva iz morsih algi roda Gelidium. Zagrijavanjem agara (koji je u obliku praka) na temperaturu 95-98C on se otopi u tekuoj podlozi, a prilikom hlaenja kod temp. 40-45C uzrokuje skruivanje hranjive podloge. Koncentracija agara u vrstim hranjivim podlogama je 1-2%, a u poluvrstim podlogama 0,1-0,5%.

Bez obzira na pripadnost pojedinoj skupini nabrojenih hranjivih podloga, svaki hranjivi supstrat mora imati:

sve hranjive sastojke koji su potrebni za rast i razmnoavanje dovoljnu koliinu vode povoljanu pH vrijednost supstrat mora biti sterilan supstrat mora biti prozraan

STERILIZACIJA

Sterilizacija podrazumijeva svaki proces, kemijski ili fiziki, pomou kojeg se ubijaju svi oblici ivota, osobito mikroorganizmi.

Prema sredstvu kojim se sterilizacija provodi razlikujemo: 1) STERILIZACIJA TOPLINOM 2) STERILIZACIJA FILTRACIJOM 3) STERILIZACIJA ZRAENJEM 4) STERILIZACIJA ULTRAZVUKOM

Sterilizacija kemijskim putem vri se pomou nekih kemijskih agensa (dezinficijensi) koji suzbijaju rast mikroorganizama (npr.bakteriostatici) ili ubijaju mikroorganizme i endospore. - alkoholi, kiseline, halogeni, fenoli, soli tekih metala, oksidirajui agensi

STERILIZACIJA TOPLINOM A) Suha sterilizacija - sterilizacija plamenom - sterilizacija vruim suhim zrakom - vri se u suhom sterilizatoru (Pasterovoj pei)

B) Vlana sterilizacija- sterilizacija kuhanjem - sterilizacija vodenom paroma) sterilizacija strujeom vodenom parom - odvija se u Kochovu loncu - primjena: sterilizacija hranjivih podloga s tvarima koje ne podnose temperature iznad 100C - viekratna sterilizacija u Kochovu loncu naziva se TINDALIZACIJA ili FRAKCIONA STERILIZACIJA b) sterilizacija strujeom vodenom parom pod tlakom odvija se u autoklavu

Slika: Kochov lonac

i

autoklav

STERILIZACIJA FILTRACIJOMprimjena: za sterilizaciju tekuina koje ne podnose sterilizaciju nekim drugim nainom jer bi im se izmjenila fizikalna i kemijska svojstva postupak: tekuine se filtriraju pod tlakom kroz filtre poznate veliine pora vrste filtra: Chamberlandovi (porculanski) filteri Berkefeldovi filteri Seitzovi azbestni filteri Membranski ili ultrafilteri

STERILIZACIJA ZRAENJEMa) ultraljubiasto zraenje (UV) b) ionizacijsko zraenje - elektromagnetske x-zrake i gama zrake STERILIZACIJA ULTRAZVUKOM - zvuni valovi visoke frekvencije

METODE ZA IZOLACIJU ISTIH KULTURA

IZOLACIJA je znaajna mikrobioloka tehnika kojom se izdvajaju iste kulture mikroorganizama iz mjeovite populacije Za prouavanje morfolokih i fiziolokih osobina mikroorganizama, kao i njihove identifikacije, potrebno je imati njihove iste kulture Pod istom kulturom se podrazumijeva kultura mikroorganizama koje sadre samo jedan tip stanica.

Za dobivanje istih kultura koriste se slijedee metode:

METODA RAZRJEENJA METODA ISCRPLJENJA

Metoda razrjeenja

Metoda razrijeenjaDaje nam brojnost ivih, aerobinh mikroorganizama Nije ukljuenoObligatni Anaerobi Mikroaerofili

Metoda razrijeenjaPretpostavkasvaka kolonija potijee iz jedne stanice ponekad neke kolonija potjeu iz vie stanica

Izraava seColony Forming Unit (CFU)/gramu ili ml NE kao ukupne bakterije (mikroorganizmi)

Organienja metode razrijeenjaMogu se prebrojati samo aerobni mikroorganizmi nije poznata nijhova vrsta podloge nisu univerzalne ljudska greka ponekad je teko razlikovati estice hrane i kolonije kolonije mogu biti premale da se vide

Tipovi uzorkatekuiNe viskozni-mjerenje pipetom Viskozni-vaganje

Krutivaganje

prsotorpomou sterilinh tapia odreena povrina

Slika: Metoda iscrpljenja

IDENTIFIKACIJA BAKTERIJA

- identifikacija je praktian dio taksonomije koji svrstavaizolat u odreene taksone - do danas je klasificirano i identificirano vie od 2000 vrsta bakterija -Fischer i Muller napravili prvu klasifikaciju i sistematizaciju -1923. izalo prvo izdanje Bergeyeva prirunika za bakterija. Tokom godina zabiljeena su sva vanija dostignua, zabiljeene nove vrste, kriteriji klasifikacije i poboljane sheme klasifikacije. Danas prirunik sadri 4 podvolumena, a svaki od njih prikazuje specifine skupine bakterija

Karakteristike koje se koriste u klasifikaciji i identifikaciji mikroorganizama: 1. MORFOLOKE KARAKTERISTIKE KOLONIJA - svaka vrsta bakterija ima karakteristian tip kolonija na hranjivoj podlozi 2. MORFOLOKE KARAKTERISTIKE BAKTERIJA- oblik staice, veliina, ultrastrukture, bojanje po Gramu, pokretljivost, raspored cilija i flagela, oblik i smjetaj edospora, stanine inkluzije 3. FIZIOLOKE I BIOKEMIJSKE KARAKTERISTIKE - odnose se na prirodu i aktivnost bakterijskih enzima i transportnih proteina. Neke od fizioloke i biokemijske karakteristike koje se ispituju su: izvor C i N, sadraj st. stjenke, izvori energije, produkti fermentacije,sekundarni metaboliti, osmotska tolerancija, osjetljivost na metabolike inhibitore i antibiotike, pH optimum

Enzimatska aktivnost se iroko primjenjuje za diferencijaciju bakterija jer i relativno srodne bakterije se mogu razlikovati na osnovu BIOKEMIJSKIH TESTOVA: a)sposobnost iskoritavanja C iz razliitih spojeva (monosaharida,polisaharida) b)tvorba indola, amonijaka, H2S c)hidroliza kroba, elatine, kazeina, eskulina d) iskoritavanje citrata, malonata e)aktivnost glukozidaze, katalaze, oksidaze, peptidaze, celulaze, fosfataze, esteraze f) redukcija nitrata

4. EKOLOKE KARAKTERISTIKE- razlike izmeu mikroorganizama s obzirom na ekoloke uvjete (temperatura, pH, svjetlost, slobodan kisik)

5. SEROLOKE KARAKTERISTIKE- imunoloke tehnike koriste se za komparaciju proteina razliitih mikroorganizama

6. GENETIKE I MOLEKULARNE KARAKTERISTIKE- jedan od najvanijih pristupa taksonomiji nastao kroz: - analize proteina -- analize nukleinskih kiselina