Ministère de l’enseignement supérieur et de la recherche scientifique

université Mohamed Heider -Biskra 

EXPOSE SUR

SOMMAIRE 

Introduction Généralité I-Conservation des souches

microbiennes 1-Définition de conservation 2-Les types de conservation 2-1-Conservation de courte durée 2-2-Conservation de longue durée

3-Les méthodes de conservation 3-1- La lyophilisation 3-2-La conservation par congélation 3-3-La conservation sur gélose 3-4-La réfrigération 3-5-Ultra congélation 3-6-La repiquage des souches II-Conservation des champignons III-Conservation des virus IV-Les applications de la conservation

en générale Conclusion

INTRODUCTION

En biologie, la culture cellulaire désigne un ensemble de technique utilisée pour faire croître des cellules lors de leur organisme ou de leur milieu d’origine, dans un but d’expérimentation scientifique.

Lorsque en microorganisme ou un virus a été sélectionné ou construit dans un but spécifique, il doit être conservé dans son état original pour usage ultérieur et l’étude donc :

Toutes les souches bactériennes↓

L’identifier↓

Confirmer↓

Et a l'afin : Conserver 

A lors comment on fait une conservation des souches

microbienne ? 

Généralité 

Les milieux de culture sont des préparations stériles, solides, semi solides ou liquides utilisées pour la croissance, repiquage ou la conservation des microorganismes, ils offrent sous forme assimilable toutes les substances indispensables leur nutrition dans des conditions physico-chimiques optimum.

Plusieurs centaines de milieux de culture ont été décrits a ce jour

Ils doivent apporter tous les éléments nécessaire a l’élaboration du protoplasme cellulaire. De ce fait, le micro-organismes doivent trouver dans le milieu du culture et son atmosphère toutes les substances requise pour leur croissance: l’eau, une source d’énergie, le carbone, l’azote, de même que des ions essentiels: phosphate, sulfate, sodium, calcium, magnésium, potassium, fer ainsi que des traces d’élément divers sous forme appropriée (Zn, Mn, Mo, Co, Cu etc.)

Un bon milieu doit :-Etre stérile.-Etre nutritif.-avoir un PH convenable.-Contenir une quantité d’eau suffisante. Ces organismes différent les uns des

autres par leur propriétés nutritionnelles et leur adaptation aux conditions physiques de leur milieu de vie (ph, température, disponibilité en O2, salinité….) et sont divisés en différant groupes nutritionnels. Les ingrédients apportés aux milieux de culture dépendent donc des exigences de chaque espèce.

I. Conservation des souches microbienne:

1-Définition de conservation:C'est le maintien de toutes les propriétés

morphologiques et génétiques des souches microbiennes aussi assure la survie de ces dernier et indispensable les aux études taxonomiques.

En microbiologie, ou on travaille avec des organismes conserver viable a l'identique.

La conservation doit évidemment exclure les contaminations.

2-Les types de conservation:

Il y a 02 types de conservation

2-1-conservation de courte durée: Certains souches sont rapidement

perdues, il s'agit par fois des souches de culture délicate.

Exemple: Neissericeae, streptococcus, H.influenzae….

2-2-Conservation de longue durée:Pour les souches plus résistances

comme les Psudomonas se sont souvent des bactériophages qui sont responsable de distraction lors de la conservation tue tous les survivants. Ces souches nécessitent donc d'autre techniques des conservations des souches

3-Les méthode de conservation:

Définition:Est le procédé qui fait tout d'abord

intervenir une congélation a basse température (entre -40 et -80 C0) suivie d'une dessiccation puis d'une sublimation sous vide poussé. La sublimation est le passage direct de l'état solide à l'état gazeux direct.

LA LYOPHILISATION

La lyophilisation comporte généralement trois étapes:

La congélation, la sublimation (dessiccation primaire) et la dessiccation secondaire.

La durée de cette méthode est plusieurs années. C'est la meilleure technique de conservation et du transport mais peut conduire a la perte des plasmides présent dans ces souches lyophilisées et onéreuse.

La lyophilisation n'est pas compatible avec tous les microorganismes dans certain cas elle occasionne des altérations cellulaire et génétique.

La lyophilisateur: 

Se fait par appareille ou par des produits lyophilisée tels que les plasmas oxalate de lapin qui après réhydratation.

Exemple: staphylococcus……. Des microorganismes lyophilisés

tels que la souche bactérienne lyophilisée de collection internationale.

LA CONSERVATION PAR CONGÉLATION

Définition:Est un technique de conservation

visant à faire passer un produit a l'état solide par des technique de refroidissement forcé. La température de conservation sont en générale -20 C0 (congélateur standard), -80C0.

*Type de congélation:1-La congélation à (-18 C0) des cadavres

des animaux injecte expérimentalement (ou fragment d'organe) permet notamment la conservation des streptococcus

pneumoniae.2-La congélation à (-80 C0) de billes

imprégnées de culture.3-La congélation à (-80 C0) en billon

glycérolé a 20%-30% permet une excellente conservation de la plupart des souches cette technique est applicable à (-18 C0).

Exemple: une méthode de congélation

a- Préparation le bouillon trypticase soja et l'additionner de 20% de glycérol.

b- Le répartir dans des tubes à essai contient des souches pures a conserver sur gélose.

c- Stérilisation les tubes à 121 C0 pendant 15 min.

d-Le refroidissement du bouillon dans le congélateur -20 C0→-80 C0

Les congélateurs:

Capacité verticaux ou horizontaux, ventilés ou non, fonctionnant de -18 C0 à -25 C0, de -25 C0 à -35 C0 ou -40 C0 (pour une température ambiante de 35 C0).

LA RÉFRIGÉRATIONDéfinition : Se fait par des réfrigérateurs de

laboratoire de microbiologie dans ce cas qui concerne la bactérie

Il y a 02 types de réfrigération:a-Réfrigérateur: pendant la conservation des

souches bactérienne. b-Réfrigérateur: assure la conservation

échantillons.Destinée à l'analyse microbiologique à 2±2

C0. Exemples: la réfrigération a 4 C0 d'une suspension de souches dans un sang stérile permet une bonne conservation de Streptococcus pneumoniae.

LA CONSERVATION SUR GÉLOSE

(DES MILIEUX DE CONSERVATION) 

Ce sont des milieux pauvres qui maintiennent les micro-organismes dans un état de vie ralentie. Ce type de milieu dit "gélose pour conservation des souches bactériennes "

Les cultures d'un milieu gélose incliné en tube a essai se conservation mieux, se contaminent moins, mais la surface est beaucoup plus réduite.

Lorsqu'une culture pure a été obtenue elle peut transférer sur/dans un milieu gélosé adapté pour constituer une "culture stock" qui sera repiquée a intervalles réguliers sur/dans un milieu frais. Il est primordial de conserver de telles cultures à l'état ascénique (culture pure).

Généralement il y a 02 types de

gélose plus utilisées pour la

conservation

1-Une gélose nutritive inclinée

ensemencée en plusieurs points.

2-Une gélose nutritive en culot

ensemencée par piqure centrale.

Des exemples de milieu de conservation :A- Une gélose de type VF (milieu complexe

gélosé utilisé pour la détermination du type respiratoire des microorganismes) en particulier pour les bactéries anaérobies stricts.

Leur composition: Viande foie………30gGlucose ………….02g Agar Agar………...06gEau distillée…….1000mlPH ……………….. 7.4-Le gradient de pression partielle en oxygène

peut permettre une conservation optimale de certaines souches aéro-anearobies.

B- L'utilisation de bio-Rad qui distinguer a la conservation des entérobactéries mais aussi des vibrionaceae, du Pseudomonaceae…

-Leur composition chimique (en g/l):Extrait de viande…..…5Peptone ……………..10Chlorure de sodium ......5Agar …………………10Ph……………………7.3Température ………..25 C0

*Ces milieux est disponible en tube prêts.

Pour les bactéries aéro-anaerobies facultatives, utiliser une culture sur milieu gélosé (gélose nutritive on gélose tryplicase soja) a l'aide d'une anse de platine bien chargée en germes effectuer plusieurs piqures centrales.

-Pour les bactéries aérobies ensemencer en surface incubé à 37C0 maximum pendant 24 heures.

*Les milieux de culture continue :

Définition :C'est un phénomène de

renouvellement régulier de milieu de culture avec l’élèmentation des métabolites toxique en même temps.

Par exemple: Chimiostat

ULTRA CONGÉLATION

Par l'utilisation de l'azote liquide à

-196 C0des souches se

microorganismes exigeants ont

ainsi été conservées pendant plus

de 15 ans.

REPIQUAGE DES SOUCHES

Définition :

Est la transplantation d'une culture

pure sur un milieu de culture neuf.

*Méthode de conservation: 

Il est nécessaire de bien connaitre le milieu le plus convenable: la température la plus favorable et la durée de stockage.

La dessiccation du milieu de culture est évitée en bouchant saignement l'orifice des tubes de cultures.

La culture est conservée à l'abri de la lumière on à la température de laboratoire.

Remarque :La conservation se fait naturellement

par la sporulation des bactéries capable de sporulées pour éviter leur destruction dans les conditions défavorables.

Comme chez les Endospores Bacillus qui est Thermorésistantes a la chaleur humide et les Exospores des Streptomyces qui ne possède pas un thermorésistantes a la chaleur humide mais quand même du solide sur de très longues durée.

Souche

bactérienne

Mode de

conservation

Température

de

conservation

Staphylocoque Gélose stock +

congélation

Température

ambiante, -20

C0

Pseudomocoqu

e

Congélation -20 C0, -80 C0

Neisseria

gonorrhoeae

Congélation -20 C0

Entérobactérie

s

Gélose stock +

congélation

Température

ambiante, -20

C0

Listeria Gélose stock +

congélation

Température

ambiante, -20

C0

II- Conservation des champignons:

La conservation des champignons, y compris les dermatophytes, peut se faire de la même façon, que pour les bactéries. Une gélose Sabouraud (milieu complexe gélosé, pour l'isolement des champignons).

Conservée à température ambiant et à l'obscurité convient généralement.

Dans le cas de champignon provenant de produits pathologiques, il faut se méfier de l'éventuelle présence d'acariens qui risquent d'envahir, le souchier. Une quarantaine et des repiquages fréquents permettront d'éviter cette désagréable présence. Il est possible aussi de mettre de l'antimite dans le souchier.

III- Conservation des virus:

Généralement par l'utilisation de

lyophilisation.

IV- Les applications de la conservation en générales:

1- Dans le domaine de génie biologique : Par exemples: une souche destinée a la

production industrielles d'antibiotique ou d'une molécule a très haute valeur ajoutée.

Conserver les caractéristiques d'intérêt biotechnologique pour tous l’inoculum qui devant être gérés pendant la période d'exploitation de la souche.

Pour limitées la contamination par les espèces microbienne dangereuses….

2- En médecine :

La conservation d’une souche

isolée sur un patient et transmise

pour étude complémentaires.

(Études des réactions particulières

vis s vis d’antibiotiques)

CONCLUSION La conservation est une méthode nécessaire et

étape importante dans le protocole d'études des

souches microbienne pour le but de :

1-La fabrication des vaccins qui rend aussi

nécessaire pour la conservation des souches

vaccinales.

2-La recherche et comme un centre de référence.

3-L'étude dans le domaine de contrôle de qualité.

MERCI POUR VOTRE ATTENTION