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Microarrays y Biochips de ADNInforme de VigilanciaTecnolgica

Microarraysy Biochips de ADNInforme de VigilanciaTecnolgica

4

MICROARRAYS Y BIOCHIPS DE ADN

El presente informe de Vigilancia Tecnolgica ha sido

realizado en el marco del convenio de colaboracin

conjunta entre Genoma Espaa y la Fundacin General

de la Universidad Autnoma de Madrid (FGUAM), entidad

que gestiona el Crculo de Innovacin en Biotecnologa

(CIBT), perteneciente al Sistema de Promocin Regional

de la Innovacin MADRI+D.

Los autores de este informe agradecen la colaboracin

ofrecida por toda la comunidad cientfica y empresarial

para la realizacin de este informe. Un especial

agradecimiento al Dr. Fernando Martn Snchez (ISCIII),

Dra. Ana Dopazo (CNIO), Dr. Laureano Simn (Medplant

Genetics, S.L.), Dr. Juan Bernal (IIB), Dr. Juan Carlos

Tercero (Pharmagen, S.A.), Dr. Carlos Briones y

Dr. Victor Parro (Centro de Astrobiologa),

a D. Pedro M. Franco de Sarabia (Biotools B&M Labs, S.A.),

Dr. Jos Manuel Guisan (CSIC), Dr. Joaqun Dopazo

(CNIO), Dr. Jos Mara Carazo (CNB-CSIC)

y Dr. Manuel Navarro (CIEMAT).

La reproduccin parcial de este informe esta autorizada

bajo la premisa de incluir referencia al mismo, indicando:

Microarrays y Biochips de ADN, Informe de Vigilancia

Tecnolgica. GENOMA ESPAA / CIBT-FGUAM.

Genoma Espaa no se hace responsable del uso

que se realice de la informacin contenida

en esta publicacin. Las opiniones que aparecen

en este informe corresponden a los expertos consultados

y a los autores del mismo.

Copyright:Fundacin Espaola para el Desarrollo

de la Investigacin en Genmica y

Protemica/Fundacin General de la Universidad

Autnoma de Madrid.

Autores: Marta Lpez (CIBT-FGUAM)

Paloma Mallorqun (CIBT-FGUAM)

Miguel Vega (Genoma Espaa)

Referencia: GEN-ES02001

Fecha: Octubre 2002

Depsito Legal: M-52478-2002

ISBN: 84-607-6228-9

Diseo y realizacin: Spainfo, S.A.

ndice de contenido

RESUMEN EJECUTIVO 7

1. INTRODUCCIN 8

2. TECNOLOGAS DE MICROARRAYS 10

2.1. Tipo de Sonda 10

2.2. Marcaje de Sondas 11

2.3. Material de Soporte 14

2.4. Inmovilizacin de ADN 16

2.5. Fabricacin 17

2.6. Escaneado y Software 21

2.7. Breves cuestiones tcnicas 23

2.8. ltimas tendencias en desarrollos tecnolgicos 24

3. APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS Y BIOCHIPS EN SALUD HUMANA 26

3.1. Monitorizacin de la Expresin Gnica 27

3.2. Cribado de compuestos activos y validacin de dianas teraputicas 28

3.3. Farmacogenmica 30

3.4. Diagnstico molecular 31

Chips para identificacin de SNPs 31

Chips de caracterizacin gentica 31

Chips de deteccin de enfermedades infecciosas 32

4. ASPECTOS DE MERCADO: APLICACIN DE MICROARRAYS DE ADN

Y BIOCHIPS EN SALUD HUMANA 34

4.1. Arrays de alta densidad 34

4.2. Arrays de media y baja densidad 35

4.3. Mercados: Affymetrix 36

4.4. Mercados: empresas que compiten con Affymetrix 38

4.5. Estrategias de desarrollo e implantacin 40

4.6. Modelos de negocio 41

4.7. Tendencias: lab-on-a-chip 42

5


5. CASOS PRACTICOS 43

Caso Prctico 1: Biotools B & M Labs, S.A 43Caso Prctico 2: Centro de Astrobiologa, CSIC-INTA 44Caso Prctico 3: PharmaGen S.A. 45Caso Prctico 4: Instituto de Investigaciones Biomdicas, CSIC-UAM 46Caso Prctico 5: Medplant Genetics, SL 47Caso Prctico 6: Instituto de Salud Carlos III 48Caso Prctico 7: Centro Nacional de Investigaciones Oncolgicas (CNIO, ISCIII) 49

6. CONCLUSIONES 50

ANEXO I: Breve glosario de trminos en genmica 53

ANEXO II: ndice de Tablas, Cuadros y Figuras 54

ANEXO III: Referencias 55

6

Los microarrays de ADN y biochips se definencomo una matriz bidimensional de materialgentico, que permite la automatizacinsimultnea de miles de ensayos encaminados aconocer en profundidad la estructura yfuncionamiento de nuestra dotacin gentica,tanto en los distintos estados de desarrollo comopatolgicos del paciente.

Hasta la fecha no puede establecerse un autnticoestndar en microarrays de ADN, sino lacoexistencia de distintas tecnologas con el mismofin: el anlisis de la expresin y la variabilidadgnica. La decisin final sobre la tecnologa aaplicar (ej. cDNA vs. Oligos; depsito vs. Sntesisin situ de sondas) depender de la aplicacin uobjetivo final del ensayo.

Algunas tendencias de desarrollo prometedoraspretenden eliminar el paso de amplificacin de lamuestra e incluso la integracin de todas lasoperaciones en un solo dispositivo (Lab-on-a chipo LOAC). En este sentido, los principales motoresde la nueva generacin de microarrays y biochipssern la integracin, la fiabilidad y la sensibilidaddel ensayo.

A continuacin se enumeran las principalesaplicaciones de microarrays y biochips en saludhumana:

Monitorizacin de la expresin gnica. Cribado de compuestos activos y validacin de

dianas teraputicas. Farmacogenmica. Medicina personalizada. Diagnstico molecular y prognosis de

enfermedades. Deteccin de agentes infecciosos.

Respecto a los aspectos de mercado, no hay dudaque Affymetrix es el actual lder del mercado,sobre todo en la venta de arrays de alta densidadpara expresin gnica. Sin embargo, y para laprctica clnica, donde se necesitan arrays demenor densidad y coste, existen otras compaasque hacen de la fiabilidad, rapidez ysimultaneidad del ensayo, sus principales valores.

Las alianzas en este sector, con objeto decompartir bases de datos, licencias de secuenciasy tecnologas desarrolladas, son la constante delsector en EE.UU. Adems, actualmente existe unaautntica carrera tecnolgica entre las distintasempresas que fabrican microarrays o suscomponentes, para posicionarse como lderes deeste importante mercado de futuro.

No obstante existen todava importantesdificultades para transferir los resultadosobtenidos con microarrays o biochips a la prcticaclnica, es decir, para que los pacientes sebeneficien de este desarrollo tecnolgico. En estecontexto, quizs la dificultad ms importanteresida en la variabilidad de los resultadosobtenidos en los ensayos, si bien se estrealizando un importante esfuerzo para laestandarizacin de los protocolos de ensayo,como paso previo y necesario para obtenerprocedimientos y dispositivos clnicos fiables.

7


Resumen ejecutivo

A finales de los aos 80 cuatro cientficos,Stephen Fodor, Michael Pirrung, Leighton Read yLubert Stryer desarrollaron una revolucionariatecnologa para la determinacin y cuantificacinde ADN en una muestra. Esta tecnologadesembocara posteriormente en la primeraplataforma de microarrays de ADN, denominadaentonces GeneChip de Affymetrix.

La principal ventaja de esta novedosa tecnologafrente a los mtodos tradicionales (Northern,Southern, etc.), resida en la alta densidad deintegracin (cantidad) de material biolgico quese consigue inmovilizar, es decir, la posibilidad deanalizar simultneamente miles de genes.Actualmente esta tecnologa se est aplicandoentre otros al anlisis de la expresin gnica,deteccin de mutaciones y polimorfismos,secuenciacin, seguimiento de terapia, medicinapreventiva, screening y toxicologa de frmacos, ydiagnstico molecular.

8

1. Introduccin

9


Clasificacin de microarrays segn:

Caractersticas Nombre

Material inmovilizado

Oligonucletidos.

cDNAs.

Protenas.

Tejidos.

Gene Chips.

cDNA Array.

Protein Chip.

Tissue Chip.

Diseo del arrayo surtido

Personalizado Arrayers

Industrial Cassettes

Alta: microarraysDensidad de integracin

Generacin de la sonda

Fabricacin

Impresin

Baja: macroarrays

in situ

depositadas

Soporte rgido(Cristal y Plstico)

Membranas

No poroso / Covalente

Poroso / No covalente

Soporte / Tipo de unin

Aplicacin

Secuenciacin por hibridacin.

Deteccin de cambios en laexpresin gnica.

Cuantificacin de la expresingnica.

Chips de secuenciacin.

Chips de hibridacincomparativa.

Chips de expresin.

Una coleccin (array) de ADN consiste en un gran nmero de molculas de ADN ordenadas sobre unsustrato slido de manera que formen una matriz de secuencias en dos dimensiones. Estosfragmentos de material gentico pueden ser secuencias cortas llamadas oligonucletidos, o de mayortamao, cDNA (ADN complementario, sintetizado a partir de mRNA), o bien productos de PCR(replicacin in vitro de secuencias de ADN mediante la reaccin en cadena de la Polimerasa). A estosfragmentos de ADN de una sola hebra inmovilizados en el soporte, se les denomina a menudosondas. Los cidos nucleicos de las muestras a analizar se marcan por diversos mtodos(enzimticos, fluorescentes, etc.) y se incuban sobre el panel de sondas, permitiendo la hibridacin(reconocimiento y unin entre molculas complementarias) de secuencias homlogas. Durante lahibridacin, las muestras de material gentico marcadas, se unirn a sus complementariasinmovilizadas en el soporte del chip, permitiendo la identificacin y cuantificacin del ADN presenteen la muestra (mutaciones, patgenos, etc.). Con posterioridad, el escner y las herramientasinformticas nos permiten interpretar y analizar los datos obtenidos.

Cuadro 1. Definicin de microarray o biochip.

Tabla 1. Criterios de clasificacin en Biochips (adaptado de http://infobiochip.isciii.es).

DEFINICIN DE MICROARRAY O BIOCHIP

http://infobiochip.isciii.es

2.1. Tipo de Sonda

El diseo de las sondas y su produccin sonelementos clave a la hora de hacer posible lahibridacin en el biochip. Sin la riqueza deconocimiento y datos de secuencias disponiblesen diversas bases de datos y proyectosgenmicos, la generacin de estas sondas seraimposible. Fsicamente, las sondas tienen tresformas diferentes: clones de cDNA, productos dePCR, y oligonucletidos.

Las sondas basadas en clones se depositan en lasuperficie del array en forma de fragmentos ogenes completos generalmente procedentes delibreras gnicas1. El tamao de estas sondaspuede ser de varios cientos de pares de baseshasta varias kilobases. Los productos de PCRconsisten en fracciones de genes generados porPCR procedentes de clones de cDNA, librerasgenmicas, o RNA. La longitud de estosfragmentos suele ser de 200 a 500 pares de

bases. Las sondas consistentes enoligonucletidos difieren de las anteriores en queel nmero de pares de bases es ms limitado, 20-25 para anlisis de expresin diferencial yhasta 100 para anlisis de expresin gnica.

10

2. Tecnologas de microarrays

Fig.1. Operaciones y tecnologas necesarias para la elaboracin de microarrays y biochips de ADN (elaboracin propia).

cido nucleico DIANA:cido nucleico procedente de la muestraproblema, cuya secuencia genmica sepretende detectar.

SONDAS de hibridacin:Fragmentos de cidos nucleicos marcadoscuya secuencia es complementaria a la delADN diana.

1 International Nucleotide Sequence Database Collaboration [engloba DNA Data Bank of Japan (DDBJ), EuropeanMolecular Biology Laboratory (EMBL/EBI) Nucleotide Sequence Database, (GenBank, USA)].http://www.ncbi.nlm.nih.gov/collab

OPERACIONES A REALIZARTECNOLOGAS/

TCNICAS A EMPLEAR

Eleccin del tipo de ADN

Marcaje de sondas o muestras

Material de soporte

Inmovilizacin de sondas

Fabricacin

Deteccin de la hibridacin

Procesamiento de datos

Sondas, oligos, cDNA

Enzimtico, fluorescente

Vidrio, plstico, membranas

Activa, pasiva, covalente

Impresin, sntesis in situ

Escneres, fluorimetras

Software

DISEO DE MICROARRAYS

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/collab

2.2. Marcaje de Sondas

La deteccin de la hibridacin entre las sondas de ADN inmovilizadas en el soporte y los fragmentos dematerial gentico de la muestra, requiere un marcaje previo para su posterior deteccin. Este marcajepuede ser directo o indirecto:

11


Marcaje Lectura Caractersticas Ventajas Desventajas

MARCAJE DE SONDAS Y MUESTRAS PARA DETECCIN DIRECTA

Enzi

ma

(Ej.

Fosf

atas

a al

calin

ay

per

oxid

asa)

Isto

po R

adia

ctiv

o(E

j. 3

3P

o e

l 125I)

Fluoro

crom

o(E

j. F

luore

sce

na)

Cro

mogn

ica

Auto

-rad

iogra

fa

Fluorim

etra

Se pone en contactoa la muestramarcada con laenzima con unsustrato cromognicocapaz de absorberradiacin.

Se incorporan a laestructura molecularde la sonda istoposradiactivos.

Un marcadorfluorescente emiteluz al ser excitadomediante unadeterminada longitudde onda.

No se necesitanreactivosauxiliares en elproceso dedeteccin.

No se necesitanreactivosauxiliares en elproceso dedeteccin.

Gransensibilidad,facilidad deuso,reproducibilidad,flexibilidad.

Las enzimas puedenconfundirse conenzimas nativaspresentes en lamuestra, aumentandoel ruido de fondo.

Necesidad del uso dereactivos auxiliares enel proceso dedeteccin.

Radiactividad.

Baja resolucin.

Los escneresnecesarios para ladeteccin encarecen elcoste del ensayo.

Algunos materialescomo el plsticoproducenfluorescencia.

La seal se atena conel tiempo.

Tabla 2. Mtodos de marcaje de ADN en microarray para deteccin directa (elaboracin propia).

12

Marcaje Lectura Caractersticas Ventajas Desventajas

MARCAJE DE SONDAS Y MUESTRAS PARA DETECCIN INDIRECTAQ

um

ico

Enzi

mt

ico

Fluorim

etra

Quim

io-l

um

inis

cenci

a o

Fluorim

etra

La sonda se une abiotina (indicador), yse aade a lamuestra avidina oestreptavidinaconjugada confluorocromos(marcador).

La sonda se une adigoxigenina(indicador) y seaade a la muestraun anticuerpo anti-DIG conjugadocon enzima(marcador). Elsustrato de la enzimase transforma en unproductoluminiscente.

Altamentesensible.

Disponibilidadcomercial decidosnucleicosmarcados conbiotina.

Altamentesensible.

Disponibilidadcomercial decidosnucleicosmarcados condigoxigenina.



Tabla 3. Mtodos de marcaje de ADN en microarrays para deteccin indirecta.

Sin duda los mtodos ms utilizados para marcajede sondas o dianas en microarrays son losqumicos o enzimticos, utilizndose comnmentelos fluorforos2 Cy3 y Cy5 (cianinas). El uso defluorforos permite analizar varias muestras en elmismo array, eliminando la variabilidad que seproduce cuando se comparan los resultados de lahibridacin de diferentes array, adems dehacer posible el escaneado de mltiplesmarcadores simultneamente, si bien presentandos inconvenientes:

Tan solo son capaces de analizar dos patronesde expresin de genes, y adems el patrn deincorporacin de los mismos no es uniforme3.

El gran tamao de los fluorforos contribuye adificultar la incorporacin enzimtica de losnucletidos que compondrn la sonda.

Algunos de estos inconvenientes se estnsolucionando en la actualidad por medio de variasestrategias. Una de ellas consiste en la adicinposterior a la sntesis de nuevos fluorforos a lassecuencias, consiguindose el escaneado de ms dedos longitudes de onda que permiten obtener mayorcantidad de datos4. Adems otras compaas comoClontech han diseado protocolos de modificacincon grupos amino previa incorporacin de lasmolculas fluorescentes.

Otros marcadores que se estn utilizandoactualmente son los fluorforos de la serie Alexa que estn dando buenos resultados en microarrays,y segn la compaa Molecular Probes5,especializada en el rea de la tecnologa defluorescencia, tienen una mayor fotoestabilidad yproporcionan una seal ms clara que otrosmarcadores, incluyendo Cy3 y Cy5.

2 Osborn J. (2000). A review of radioactive and non-radioactive-based techniques used in life science applications. Part I:Blotting techniques. Innovations Forum Life Science News 6, Amersham Pharmacia Biotech.1-4.

3 Handbook of Fluorescent Probes and Research Products. Molecular Probes [Actualizacin: 11 Dic. 2001]:http://www.probes.com/handbook/print/0805.html

4 Call D. (2001). DNA microarrays: their mode of action and possible applications in molecular diagnostics. VeterinarySciences Tomorrow, Issue 3, August, 1-9.

5 Molecular Probes: http://www.probes.com

http://www.probes.com/handbook/print/0805.htmlhttp://www.probes.com

La tcnica de deteccin de cidos nucleicos noradiactiva ms sensible hasta el momento es aquellaque utiliza sondas de ADN marcadas con biotina ydetectadas a travs de conjugados enzimticos deAvidina. Adems, para amplificar an ms la sealse puede acoplar una segunda enzima a la molculade avidina y estreptavidina2. Despus del uso de laBiotina como marcador indirecto, la Digoxigenina esel marcador ms utilizado en la actualidad.

Algunos expertos consultados para la realizacinde este informe mencionan la enorme importanciaque puede tener la desaparicin del marcaje

de las sondas para el desarrollo de nuevasplataformas de biochips. Segn estos expertos,nuevos mtodos de deteccin no basados en el marcaje de las sondas, tales como deteccinptica, electroqumica, o espectrometra de masas MALDI-TOF6 sern determinantes a la hora de desarrollar biochips con nuevasaplicaciones. Estas tcnicas permitiran una mayorsensibilidad y reduciran las cantidades demuestra necesarias, y en mayor grado deimportancia, simplificara el proceso depreparacin de la muestra al omitir pasos previosde amplificacin (PCR).

13


Cuadro 2. ltimas tendencias en deteccin de la hibridacin de ADN en Biochips (elaboracin propia).

6 Matrix-assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight Mass Spectrometry.

DETECCIN DE LA HIBRIDACIN SIN MARCAJE DE SONDAS:

Deteccin ptica: Resonancia de Plasmones en Superficie (SPR).

Tcnica basada en fenmenos pticos que tienen lugar sobre la superficie de un metal,permitiendo la deteccin de cambios en la concentracin de masas del chip.Ejemplo: Biacore (http://www.biacore.com/technology/technology.lasso).

Deteccin ptica: Tecnologas Avanzadas de Resonancia de Espejos.

Miden pequeas variaciones en el ndice de refraccin y grosor de la superficie del sensor.Ejemplo: IAsys, propiedad de Thermo Labsystems

(http://www.affinity-sensors.com/technol.htm).

Deteccin por Mtodos Electroqumicos.

La deteccin de la hibridacin puede ser directa, por medio de fenmenos de oxidacin del ADN atravs de electrodos, o indirectamente mediante indicadores redox activos que se unenfuertemente al ADN de cadena doble (N. Popovich, Mediated electrochemical detection of nucleicacids for drug discovery and clinical diagnostics. IVD Technology, 2001, 7, 36-42). Por medio demolculas mediadoras se extraen electrones del ADN que amplifican la seal. Se consigue unaalta sensibilidad y requiere protocolos sencillos e instrumentos de deteccin relativamenteasequibles.Ejemplo: Xanthon Inc., NanoChip de Nanogen, Codelink de Motorola.

Deteccin por Espectrometra de Masas MALDI-TOF.

Mediante un espectrmetro de masas se predice la secuencia de los fragmentos de ADNbasndose en su masa molecular.Ejemplo: SpectroCHIP de Sequenom.

http://www.biacore.com/technology/technology.lassohttp://www.affinity-sensors.com/technol.htm

Tradicionalmente los sustratos slidos de los

biochips se dividen en porosos y no porosos.

Los chips porosos son chips en los que las

interacciones entre el material a inmovilizar y el

soporte slido de inmovilizacin no tienen por lo

general carcter covalente7. Los soportes ms

comnmente empleados son pequeas porciones de

geles, o membranas porosas de nylon o

nitrocelulosa presentes sobre portaobjetos de cristal.

El uso de superficies porosas como soporte para

inmovilizar cidos nucleicos supone una gran

ventaja al ofrecer mayor superficie de unin que los

soportes lisos.

Los chips lisos o no porosos son aquellos en los

que el material se encuentra por lo general

inmovilizado covalentemente a la superficie slida

que le sirve de soporte y que puede ser cristal o

cualquier otra superficie como silicio, plstico u oro.

Aunque las membranas de nylon y nitrocelulosa

siguen utilizndose en la actualidad, han sido

sustituidas en la mayora de los casos por

alternativas que permiten mayor resolucin de los

puntos, adems del uso de la fluorescencia como

mtodo de deteccin y el uso de dos fluorocromos

simultneamente. Sin embargo, algunos biochips

utilizan membranas o sustancias porosas que

recubren la superficie de un cristal, mejorando la

resolucin de los puntos. El uso de

micropartculas (slice o agarosa) en la mayora

de los casos es complementario al de

membranas.

Existe un buen nmero de alternativas a estos

soportes que estn todava en desarrollo, como la

inmovilizacin del ADN sobre geles de acrilamida

(http://www.motorola.com), o sobre matrices de

oro (http://www.interactiva.de). Adems, Nanogen

(http://www.nanogen.com) ha desarrollado un tipo

de soporte totalmente diferente a las plataformas

que utilizan membranas o cristal como soporte.

Estos biochips consisten en un conjunto de

electrodos cubiertos por una fina capa de agarosa.

Los microelectrodos generan un campo elctrico

que controla la deposicin de las sondas y la

hibridacin con las secuencias diana.

14

7 Hoheisel, J.D.; Diehl, F.; Scheideler, M.; Hauser, N.; Aign, V.; Matysiak, S.; Beier, M. (2001). Improving DNA-chipTechnology; Chemical Aspects.

8 Lee, G.; Chen, S.; Huang, G.; Sung, W.; Lin, Y. (2001). Microfabricated plastic chips by not embossing methods andtheir applications for DNA separation and detection. Sensors and Actuators B 75. 142-148.

CARACTERSTICAS DE LOS SOPORTES

Superficies Porosas Superficies Lisas

Membrana de NylonMembrana deNitrocelulosa

Cristal/CuarzoMicropartculas Plstico8

Las interacciones entre el material ainmovilizar y el soporte slido deinmovilizacin no tienen carctercovalente.

Suelen inmovilizarse fragmentos de cDNAo productos de PCR.

El mtodo de marcaje suele ser porradiactividad o enzimtico.

Amplio rango decaractersticasfsico-qumicas.

Los cidosnucleicos seadhieren apartculas que asu vez quedanatrapadas en laestructura de lamembrana.

El material se encuentracovalentemente inmovilizadoa la superficie slida que lesirve de soporte.

Pueden inmovilizarseoligonucletidos ofragmentos de cDNA.

El mtodo de marcaje sueleser por fluorescencia.

Alto ruido de fondoMenor ruido

de fondo

Tabla 4. Tipos de soportes utilizados en microarrays y biochips de ADN (elaboracin propia).

2.3. Material de Soporte

http://www.motorola.comhttp://www.interactiva.dehttp://www.nanogen.com

Segn los expertos consultados, a continuacin se enumeran las ventajas y los inconvenientes de losdistintos soportes:

15


SOPORTES PARA MICROARRAYS Y BIOCHIPS

Tipo de soporte Ventajas Desventajas

Tabla 5. Ventajas y desventajas de soportes utilizados en microarrays y biochips de ADN (elaboracin propia).

Membranas de Nylon y deNitrocelulosa

Mayor capacidad de soportede ADN debido a susuperficie porosa.

Reutilizables.

Bajo coste.

Mayor ruido de fondofluorescente.

Capacidad de miniaturizacinlimitada.

Deformacin de la membrana.

Baja resolucin.

Superficies porosas demicropartculas

Mayor flexibilidad

Superficies lisas de cristal

Mnimo volumen dehibridacin.

Mayor capacidad deminiaturizacin.

Soporte inerte.

Permite el uso de dosfluorocromos a la vez.

Alta resolucin.

Capacidad para aguantaraltas temperaturas ylavados de elevada fuerzainica.

En el caso del cuarzo,hidroxilado de formanatural.

Restriccin de la capacidad decarga.

Limitacin del nmero deexperimentos por surtido.

Superficies lisas de plstico

Mnimo volumen dehibridacin.

Gran capacidad de soportede ADN.

Mayor capacidad deminiaturizacin.

Soporte inerte.

Ruidos de fondo porfluorescencia.

Generalmente, para conseguir la inmovilizacinespecfica de las sondas se requiere adems unamodificacin previa del oligonucletido o cDNApor medio de la activacin mediante gruposamino, tiol o biotina (en este caso es necesariocubrir la superficie del soporte conestreptavidina). No obstante, algunos expertosconsultados sealan la existencia de problemas deprdida de activacin durante los procesos delavado, y la necesidad de desarrollar mtodosms estables.

La forma ideal de inmovilizacin de cidosnucleicos a la superficie del soporte sera aquellaque controlase la distancia a la cual se une cada

cido nucleico, de modo que cada una de lassondas tenga total libertad para interaccionar demanera especfica e independiente con lamuestra. Para ello se debe incorporar a la sondauna molcula espaciadora que la ancle al soportey que a su vez permita su interaccin con lamuestra.

Tanto la activacin de la sonda como el soporterequieren tiempo y esfuerzo, lo que supone unproblema a la hora producir a gran escala. En estoscasos, existe la posibilidad de adquirircomercialmente soportes ya activados (Ej. CorningInc., Motorola), si bien esta opcin puede resultarcostosa en laboratorios de investigacin.

16

9 Medical Device Link. IVD Technology [Actualizacin: Oct. 2001]: http://www.devicelink.com/ivdt/archive/01/09/002.html

Pasiva Activa

Activacin de la superficie Electrnica.

Grupos aldehdo.

Grupos amino.

Estreptavidina.

Activacin de la sonda

Grupos amino.

Grupos tiol.

Biotina.

Tabla 6. Inmovilizacin de ADN (elaboracin propia).

2.4. Inmovilizacin de ADN

En los ltimos aos se han desarrollado mltiples tcnicas de inmovilizacin de sondas sobre la superficiede los microarrays. Estos procedimientos dependern de la aplicacin final del microarray y del tipo desoporte utilizado9.

Las tcnicas de inmovilizacin no covalentes (adsorcin fsica, irradiacin ultravioleta) no sonrecomendadas en el uso de microarrays ya que se dan fenmenos de hibridacin no especfica. Noobstante, la inmovilizacin electrnica de sondas es una tcnica no covalente que actualmente estdisponible comercialmente (Nanogen). Los mtodos utilizados en la inmovilizacin de sondas sobre lasuperficie slida de microarrays, se basan en la unin covalente de las mismas al sustrato por medio deprocedimientos qumicos.

La preparacin de los soportes de cristal o silicio generalmente implica un tratamiento previo con gruposreactivos amino o aldehdo, de manera que formen una capa uniforme de grupos reactivos qumicamenteestables, hidroflicos, para evitar uniones no especficas de las sondas con el soporte.

http://www.devicelink.com/ivdt/archive/01/09/002.html

17


10 Schena, M. (2000). Microarray Biochip Technology. Chapter 2. Microfluidic Technologies and Instrumentation for PrintingDNA Microarrays. Telechem International. Eaton Publishing.

Existen dos tcnicas10 para inmovilizar los fragmentos de ADN en el soporte del array, sintetizar losoligonucletidos en el propio soporte, mediante ciclos sucesivos o depositar mediante un brazo robotizadoel fragmento presintetizado que corresponda.

2.5. Fabricacin

Bases de datospblicas

Anlisis de lavariacingnica

Anlisis de laexpresin

gnica

Sntesis deOligos

mediantefotolitografa

Bases de datospropias

Compra deproductos de

PCR

Sntesis deproductos de

PCR

Hibridacin de lamuestra con ADNdiana marcado

Lavado, deteccinde la seal,

interpretacin dedatos

Construccin de libreras de cDNA

Deposicin de fragmentos de ADN

en el soporte mediante tcnicas de espoteado

FABRICACIN DE MICROARRAYS Y BIOCHIPS

Fig. 2. Proceso de fabricacin y utilizacin de un microarray o biochip de ADN (elaboracin propia).

Los parmetros que definen las caractersticas de cada tecnologa de fabricacin de biochips vienendeterminados por la densidad y diseo del chip, composicin bioqumica, versatilidad, reproducibilidad,eficacia, calidad, coste y facilidad de automatizacin.

Identificacinde secuencias

de ADN deinters

Chip comercial(Affymetrix)

18

Mtodos para la fabricacin de Microarrays y Biochips

Principios tcnicos Empresas

Impresin sin contacto (Ink-Jet)

Impresin por contacto

Sntesis in situ

Otras tcnicas

Inyectorespiezoelctricos

Cristales piezoelctricos (cermicas) selocalizan en las cercanas del capilar devidrio que contiene la muestra. Se generaun pulso elctrico mediante la aplicacinde voltaje, lo que causa la deformacindel cristal, presiona el capilar y expulsauna pequea cantidad de fluido por laextremidad del capilar.

Esta tecnologa combina una bomba yjeringa con una vlvula microsolenoideque suministra cantidades de muestra delorden de los nanolitros.

Las agujas o pins se empapan en la solucinque contiene la muestra, con lo que unapequea cantidad de sta se transfiere alextremo de la aguja. Cuando este extremotoca la superficie del chip, una gota de lamuestra queda impresa en ella.

Incyte PharmaCombion

Agilent

Roseta

ProtoGene

PerkinElmer

Cartesian Technologies

Affymetrix

Arrayit.com

GeneMachines

Genetix

Jeringa-Solenoide(Syringe-solenoid)

Pin printing oMicrospotting

Fotolitografa

Qumica directa

En el soporte slido se une covalentementeuna molcula que tiene en un extremo unagente protector fotodegradable. La luz sedirige a travs de una mscara, degradandoel agente qumico protector, y permitiendola unin de los nucletidos, cada uno con unnuevo agente protector, con el enlacecovalente del soporte. El proceso se repitecon distintos nucletidos y distintasmscaras, hasta conseguir el oligo con lasecuencia adecuada.

Cada punto de ensayo contiene unsegmento de ADN inmovilizado en unsoporte poroso. Por medio de unoselectrodos se activa una reaccinelectroqumica por la cual se incorporansucesivos nucletidos nuevos.

Affymetrix

Combimatrix

Microarrays 3D

Micro impresin hmeda

XNA on Gold

Utilizan soportes tridimensionales.

Permite la sntesis in situ y est basadaen tcnicas fotolitogrficas.

Basada en tcnicas fotolitogrficas. La superficie de cristal est cubierta por unacapa de oro recubierta de un grupo tiol alque se le une una segunda capa demolculas de biotina y estreptavidina. Lamscara utilizada para su diseo consiste enuna capa hidrofbica de tefln.

PamgeneAmersham plc

CLONDIAGTechnologies

Interactiva

Tabla 7. Mtodos para la fabricacin de microarrays y biochips (elaboracin propia).

19


Mtodos para la fabricacin de Microarrays y Biochips

Ventajas Desventajas

Impresin sin contacto (Ink-Jet)

Impresin por contacto

Sntesis in situ

Otras tcnicas

Inyectorespiezoelctricos

Jeringa-Solenoide(Syringe-solenoid)

Rapidez, sencillez, coste moderado, altasvelocidades de deposicin (varios miles demuestras por segundo), buena capacidad de miniaturizacin de los puntos (20-80 m) y densidad de integracin (10.000 puntos/cm2). Se puedeninmovilizar oligos y cDNAs.

Mtodo sencillo y fiable, bajo coste. Sepueden inmovilizar oligos y cDNAs.

Burbujas de aire quereducen la fiabilidad delsistema, necesidad deutilizar volmenes demuestra relativamentegrandes.

Volumen de muestranecesario demasiadogrande, tan solo escapaz de dispensar unvolumen mnimo delorden de 4-8 nL, con que la capacidadde miniaturizacin (250-500 m) ydensidad de integracin(200-400 puntos/cm2)est limitada.

Pin printing oMicrospotting

La impresin mediante pins se puederealizar sobre placas multipocillo o biensobre portaobjetos. Alta densidad deintegracin (10.000 puntos/cm2) ymoderada capacidad de miniaturizacin(100 m). Se pueden inmovilizar oligos ycDNAs. Relativo bajo coste y flexibilidad.

Alta densidad de integracin (244.000puntos/cm2) y capacidad de miniaturizacin (

20

PRINCIPALES ARRAYERS DISPONIBLES EN EL MERCADO

Empresa Producto Enlace web

Affymetrix Affymetrix 417 Arrayer http://www.affymetrix.com

Biomerieux http://www.biomerieux.com

Biorobotics MicroGrid II, Pro, TAS http://www.biorobotics.com

Cartesian technologies PixSys, ProSys, PegaSys

PA systems PixSys andProsys NQ systems

http://www.cartesiantech.com

Clontech http://www.clontech.com

DNAmicroarray http://www.dnamicroarray.com

Genetix http://www.genetix.co.uk

GeneMachines OmniGrid microarrayer http://www.genemachines.com

GenomeSystems http://www.genomesystems.com

Genometrix http://www.genometrix.com

GenomicSolution http://www.genomicsolutions.com

Genpak genpakARRAY 21

micro-arrayer systemhttp://www.genpakdna.com

G Sim http://www.gesim.de

Hitachi GeneticSystems

SPBIO MicroarraySpotting Station

http://www.hitachi-soft.com/gs

Labman AutomationLtd

http://www.labman.co.uk

Molecular Dynamics GEN III Array Spotter http://www.mdyn.com

Packard BioChip Arrayer http://www.packardinst.com

TeleChem International ChipMaker 2 and 3 http://arrayit.com

Medway ADVANCE-2000-I http://www.medway.ch

Eurogentec EuroGridder SDDChttp://www.eurogentec.be/catalog/dna_array/index.html

RoboDesign RoboArrayer http://www.robodesign.com

Tabla 8. Relacin de las Empresas ms relevantes dedicadas a la comercializacin de Arrayers (elaboracin propia).

Entre los componentes principales de un arrayer estn los robots controlados por ordenadores, estacionesde lavado y de secado. Los robots estn diseados para recolectar automticamente las muestraslocalizadas en placas multipocillo mediante distintas agujas simultneamente.

http://www.affymetrix.comhttp://www.biomerieux.comhttp://www.biorobotics.comhttp://www.cartesiantech.comhttp://www.clontech.comhttp://www.dnamicroarray.comhttp://www.genetix.co.ukhttp://www.genemachines.comhttp://www.genomesystems.comhttp://www.genometrix.comhttp:://www.genomicsolutions.comhttp://www.genpakdna.comhttp:://www.gesim.dehttp://www.hitachi-soft.com/gsLtd http://www.labman.co.ukhttp:://www.mdyn.comhttp:://www.packardinst.comhttp:://arrayit.comhttp://www.medway.chhttp://www.eurogentec.be/catalog/dna_array/index.htmlhttp://www.robodesign.com

21


Mientras que la industria est continuamentebuscando la alternativa que le proporcionemayores beneficios, el mundo acadmiconecesita soluciones ms baratas ya que susnecesidades de beneficio son menores. En unintento por atender ambas demandas, empresascomo Perkin-Elmer y Axon estn trabajando enla elaboracin de escneres de alta tecnologa y

a su vez desarrollando modelos de gama bajaque sean adecuados para su uso en pequeascompaas o centros de investigacin.

Por tanto, la diversidad en cuanto a lasdemandas est causando gran divergencia en losproductos desarrollados por los fabricantes deescneres.

2.6. Escaneado y Software

Tabla 9. Relacin de alguna de las Empresas ms relevantes dedicadas a la comercializacin de Escneres con aplicacinen Microarrays (elaboracin propia).

PRINCIPALES ESCNERES DISPONIBLES EN EL MERCADO

Empresa Producto Enlace web

Affymetrix Inc. Affymetrix 428 scanner http://www.affymetrix.com

Alpha Innotech AlphaArray Reader http://www.alphainnotech.com

Amersham/Pharmacia http://www.apbiotech.com/application/microarray

Applied Precisin

ArrayWoRx microarrayscanner

ArrayWoRx microarrayreader

http://www.api.com/dvarrayworx.html

Axon Instruments GenePix 4000B

microarray scannerhttp://www.axon.com/GN_Genomics.html

BiomedicalPhotometrics Inc.

MACROscope, confocalmicroscope

http://www.confocal.com

Curagen GeneScape software

suite http://www.curagen.com

Fuji Medical BAS phosphorimagers http://www.fujimed.com

GeneFocus DNAscope scanner http://www.genefocus.com

General Scanning ScanArray 4000 http://www.gsilumonics.com

Genomic Solutions GeneTAC Biochip

Analyzershttp://www.genomicsolutions.com

Molecular Dynamics Avalanche Microscanner http://www.mdyn.com

MWG Biotech GMS 418 array scanner http://www.mwgdna.com

PerkinElmer LifeSciences

ScanArray Lite, 4000,4000XL, 5000, 5000XL

http://lifesciences.perkinelmer.com/index.asp

Virktek Vision Int. Inc. ChipReader ChipReader Extreme

http://www.virtek.ca

http://www.affymetrix.comhttp://www.alphainnotech.comhttp://www.apbiotech.com/application/microarrayhttp://www.api.com/dvarrayworx.htmlhttp://www.axon.com/GN_Genomics.htmlhttp://www.confocal.comhttp://www.curagen.comhttp://www.fujimed.comhttp://www.genefocus.comhttp://www.gsilumonics.comhttp://www.genomicsolutions.comhttp://www.mdyn.comhttp://www.mwgdna.comhttp://lifesciences.perkinelmer.com/index.asphttp://www.virtek.ca

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EMPRESAS QUE DESARROLLAN SOFTWARE PARA GENMICA

EmpresaInstitucin

Aplicacin Producto Enlace web

BioDiscoveryBases de datos; arraysde ADN

GeneDirector http://www.biodiscovery.com

Affymetrix Affymetrix LIMS,MicroDB http://www.affymetrix.com

BioDiscory

Media Cybernetics

Scanalytics, Inc.

Imaging Research, Inc.

Imaging Research, Inc.

BioDiscovery, Inc.

Rosetta Biosoftware

Silicon Genetics

Applied Maths

GeneData AG

LION Bioscience AG

OmniViz, Inc.

Affymetrix

Gene NetworkSciences

Informax, Inc.

AcadmicaFarmacuticas

Otros

Partek, Inc.

Invitrogen ResGen

The WhiteheadInstitute for GenomeResearch

Stanford Univ.

TIGR

Berkeley University

Bioconductor

Universidad de Mlaga

Eisen Labsoftware

Software tools

Dr. Terry Speed'sMicroarray DataAnalysis Group

Bioconductorproject

engene

http://rana.lbl.gov/EisenSoftware.htm

http://www.tigr.org/softlab

http://www.stat.berkeley.edu/users/terry/zarray/Html/index.html

http://www.bioconductor.org

http://www.engene.cnb.uam.es

Pre-procesamiento dearrays de ADN

Anlisis dedatos

ImaGen

Array-Pro

MicroArray Suite

ArrayVisionTMsystem

ArrayStat

GeneSight

Rosseta Resolver

GeneSpringTM

GenMaths

GeneDataExpressionist

arraySCOUT-

Omniviz FunctionalGenomics

Data Mining Tool(DMT)

BioMine

Xpression NTI

Partek Pro

Pathway 4Software

GeneCluster

Calidadalta

Calidadmedia

Anlisis de imagen dearrays de ADN

http://www.mediacy.com/arraypro.htm

http://www.scanalytics.com/product/hts/microarray.html

http://www.imagingresearch.com/products/ARV.asp

http://www.imagingresearch.com

http://www.biodiscovery.com/genesight.asp

http://www.rosettabio.com/products/resolver/default.htm

http://www.sigenetics.com/GeneSpring/index.html

http://www.applied-maths.com/ge/ge.htm

http://www.genedata.com/products/expressionist

http://www.lionbioscience.com/solutions/arrayscout

http://www.omniviz.com/products/index.htm

http://www.affymetrix.com

http://www.gnsbiotech.com/biomine.shtml

http://www.informaxinc.com/solutions/xpression/index.html

http://www.partek.com

http://pathways.resgen.com/tour/

http://www.genome.wi.mit.edu/cancer/software/genecluster2/gc2.html

Tabla 10. Relacin de alguna de las Empresas ms relevantes dedicadas a la comercializacin de Software con aplicacinen microarrays (Fuente: Dr. Jos Mara Carazo).

El anlisis de los datos y la interpretacin de los mismos mediante herramientas software, es sin duda uno de losprincipales escollos en la utilizacin de la tecnologa de microarrays y biochips. Los avances en la capacidad degestin y almacenamiento de las bases de datos son esenciales para mejorar la calidad de la informacin obtenidamediante tcnicas de Minera de Datos o Data Mining, que permiten la elaboracin de modelos de anlisis comopor ejemplo aquellos que agrupan genes o experimentos en funcin de diferentes patrones (clustering).

http://www.biodiscovery.comhttp://www.affymetrix.comhttp://www.mediacy.com/arraypro.htmhttp://www.scanalytics.com/product/hts/microarray.htmlhttp://www.imagingresearch.com/products/ARV.asphttp://www.imagingresearch.comhttp://www.biodiscovery.com/genesight.asphttp://www.rosettabio.com/products/resolver/default.htmhttp://www.sigenetics.com/GeneSpring/index.htmlhttp://www.applied-maths.com/ge/ge.htmhttp://www.genedata.com/products/expressionisthttp://www.lionbioscience.com/solutions/arrayscouthttp://www.omniviz.com/products/index.htmhttp://www.affymetrix.comhttp://www.gnsbiotech.com/biomine.shtmlhttp://www.informaxinc.com/solutions/xpression/index.htmlhttp://www.partek.comhttp://pathways.resgen.com/tour/http://www.genome.wi.mit.edu/cancer/software/genecluster2/gc2.htmlhttp://rana.lbl.gov/EisenSoftware.htmhttp://www.tigr.org/softlabhttp://www.stat.berkeley.edu/users/terry/zarray/Html/index.htmlhttp://www.bioconductor.orghttp://www.engene.cnb.uam.es

23


2.7. Breves cuestiones tcnicas

Adems de los gastos derivados de la adquisicin directa del arrayer, hay que considerar otros costes notan obvios pero igualmente importantes. Imprimir un array de alta densidad requiere un gran nmero desondas, lo que resulta muy caro para un laboratorio de investigacin. En algunos casos se recomiendarealizar previamente la secuenciacin de las sondas para la verificacin de sus secuencias, lo queencarece an ms su obtencin. Algunas empresas como Clontech, Incyte y Operon proporcionan oligosya verificados u oligos de diseo. Otro factor a tener en cuenta es el uso necesario de la PCR en loslaboratorios que posean microarrays de ADN. Esta tcnica es esencial para controles de calidad yverificaciones de las secuencias, y aunque en la actualidad la mayora de los centros poseen lainstrumentacin, hay que considerar los gastos derivados de su uso recurrente.

EMPRESAS QUE COMERCIALIZAN SONDAS PARA MICROARRAYS

Empresa Nombre del producto Enlace web

Operon technologies Array-Ready Oligo sets http://www.operon.com/arrays/arraysets.php

Lion Bioscience arrayTAGhttp://www.lionbioscience.com/eng/index_c_1_7.htm

ClontechAtlas Ready-to-print LongOligo

http://www.clontech.com/products/literature/pdf/brochures/AtlasReadytoPrint.pdf

Incyte Genomics Easy to spot products http://www.incyte.com/index.shtml

Research GeneticsGeneStorm expression-ready full-length clones

http://www.resgen.com/full_length/index.php3

StratageneGeneConnection Discoveryclone collection QuikSpotPCR products

http://www2.stratagene.com/gc/discoveryclones.asp

I.M.A.G.E.Consortium cDNAlibraray

Biological resources fromUK Human GenomeMapping Project ResourceCentre

http://www.hgmp.mrc.ac.uk/Biology/descriptions/image.html

Tabla 11. Relacin de alguna de las Empresas ms relevantes dedicadas a la comercializacin de sondas con aplicacin enmicroarrays (elaboracin propia).

Adems de los costes asociados a lasinfraestructuras y materiales, el diseo y manejode microarrays es laborioso y consume grancantidad de tiempo y recursos, por lo que esnecesaria la incorporacin de personal dedicado atiempo completo. Segn expertos consultados elnmero de personas destinadas al mantenimientode la plataforma de microarrays es de una media

de 4, mientras que el tiempo medio necesariopara la puesta en marcha de las infraestructurasde microarrays es de 6 a 12 meses, pudiendo enocasiones necesitar de 1 a 2 aos. Este periodose correspondera al tiempo que se requiere parala adquisicin de datos experimentalessatisfactorios a partir de la adquisicin delinstrumental.

http://www.operon.com/arrays/arraysets.phphttp://www.lionbioscience.com/eng/index_c_1_7.htmhttp://www.clontech.com/products/literature/pdf/brochures/AtlasReadytoPrint.pdfhttp://www.incyte.com/index.shtmlhttp://www.resgen.com/full_length/index.php3http://www2.stratagene.com/gc/discoveryclones.asphttp://www.hgmp.mrc.ac.uk/Biology/descriptions/image.html

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Genechip de Affymetrix (http://www.affymetrix.com): biochips de ADN fabricados mediantetcnicas fotolitogrficas. Pese a ser una denominacin comercial en ocasiones es empleada parareferirse a los biochips de ADN en general.

GEM arrays de Incyte (http://www.incyte.com): biochips para el anlisis de la expresin gnica.

Spectrochip de Sequenom, (http://www.sequenom.com): son chips de silicio de 2 x 3 cmaproximadamente, con un surtido de puntos para al anlisis de ADN mediante espectrometra demasas (MALDI-TOF). Se utilizan para el genotipado y secuenciacin.

Nanochip de Nanogen (http://www.nanogen.com). Combinan la tecnologa de microarrays con loslab-ona chip, de los cuales hablaremos ms adelante. Esta tcnica utiliza la microelectrnica paramover y concentrar molculas cargadas hacia los sitios diseados en el microchip, por lo quetambin se denominan matrices electrnicamente activas.

Cuadro 3. Terminologa de empresas que fabrican chips.

2.8. ltimas tendencias en nuevos desarrollos tecnolgicos

Las tendencias hacia nuevos desarrollos tecnolgicos se pueden clasificar en tres grupos segn elobjetivo que persigan:

Tendencia 1 FIABILIDAD

Tecnologa Bioelectrochips

DescripcinMtodo electrnico que mantiene las hebras de DNA unidas debido a lacarga negativa de stas, y lo obliga a hibridar bajo condiciones controladas,moviendo y concentrando las muestras solo en los puntos deseados.

Ventajas

Permite al cliente disear el chip. Puede reutilizarse e incluso cambiar lassecuencias de las muestras. Rapidez (resultados en varios minutos) yprecisin (mayor que en los GeneChips de Affymetrix segn expertosconsultados).

DesventajasTan solo est catalogado por el momento para su uso en investigacin dedeterminadas enfermedades.

EjemploNanogen (http://www.nanogen.com) comercializa Active MicroelectronicDevices o Matrices Electrnicamente Activas.

http://www.affymetrix.comhttp://www.incyte.comhttp://www.sequenom.comhttp://www.nanogen.comhttp://www.nanogen.com

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Tendencia 2 SENSIBILIDAD

Tecnologa PNAs (peptide nucleic acid)

DescripcinUnidades repetidas de N- (2-aminoetil)-glicina unidas por enlaces amino, ybases nucleotdicas unidas a la estructura.

VentajasMs estables frente a proteasas y nucleasas, y producen una mayor seal.

DesventajasSe ha observado una prdida de especificidad en la hibridacin (segnexpertos consultados).

Ejemplo Radius BioSciences (Microarrays de ADN y PNA).

Tendencia 3 INTEGRACIN

Tecnologa Dispositivos microfludicos o LOAC* (Lab-on-a-chip)

Descripcin

Dispositivos que emplean campos elctricos para mover molculas, clulas,partculas o lquidos a travs de microcapilares construidos sobre chips decristal, plstico, silicio o cuarzo. Este tipo de chip contiene un conjunto demicrocanales y microcmaras donde tienen lugar las reacciones quepermiten el anlisis de la muestra. El mtodo predominante para laseparacin de los productos de reaccin es la electroforesis, ya que lacromatografa es muy complicada de miniaturizar.

Ventajas

El volumen de fluidos y de muestra que se necesita es mnimo,consiguiendo as que el ensayo se realice en menos tiempo, y que el preciodel dispositivo se reduzca debido al ahorro en reactivos. Eliminacin de laetapa de inmovilizacin de sondas. Mtodo de deteccin porttil, de usar ytirar, que adems permita realizar tanto la preparacin de la muestra, comoel anlisis y la deteccin de los reactivos dentro de un mismo dispositivo defcil manejo.

Desventajas

El coste final del ensayo se encarece debido principalmente a laminiaturizacin, no obstante, la tecnologa de microsistemas est avanzandode tal modo que en un futuro cercano se conseguirn sistemas mseficientes.

Ejemplo

Agilent (http://www.agilent.com), en colaboracin con Caliper(http://www.caliper.com), ha desarrollado el LabChip11, un dispositivo quecombina materiales de cristal, cuarzo y plstico, y que contiene mltiplescapilares que permiten el acceso a las muestras. Las aplicaciones de estoschips se centran principalmente en ensayos enzimticos y celulares, ascomo en ensayos de ARN y ADN. Agilent ofrece adems un servicio deasesoramiento y de diseo del chip, principalmente orientado a la eleccinde las sondas ms adecuadas para la deteccin de la diana en la queestemos interesados.

Tabla 12. Tendencias para futuros desarrollos tecnolgicos (elaboracin propia).

11 Krishnan, M.; Namasivayam, V.; Lin, R.; Pal, R.; Burns, M.A. (2001). Microfabricated reaction & separation systems. Curr. Op. Biotech., 12, 92-98.

http://www.agilent.comhttp://www.caliper.com

Tras la secuenciacin del genoma humano, la demanda de instrumentos tecnolgicos que facilitarn labsqueda de genes y sus patrones de expresin ha sido espectacular. Las aplicaciones de losmicroarrays en el sector de la salud humana se pueden resumir en la siguiente tabla:

26

3. Aplicaciones de los microarrays y biochips en Salud Humana

APLICACIONES DE MICROARRAYS Y BIOCHIPS

Objetivo Tcnica Aplicacin

Caracterizacindel ADN

Cuantificacindel ADN

Comparacindel ADN

Secuenciacin por Hibridacin(Sequencing by Hybridization o SBH).

Identificacin por hibridacin.

Anlisis de la expresin gnica.

Descubrimiento de nuevosfrmacos.

Identificacin de polimorfismos.

Diagnstico molecular.

Farmacogenmica.

Comparacin de secuenciashomlogas.

Genmica (funcionalidad degenes).

Deteccin de mutaciones yvariaciones en el genoma.

Diagnstico molecular.

Caracterizacin del perfil genticode enfermedades.

Farmacogenmica.

Validacin de dianas teraputicas.

Caracterizacin de la accinmolecular de compuestos activos.

Tabla 13. Aplicaciones de microarrays y biochips (elaboracin propia).

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DIFERENCIAS ENTRE MICROARRAYS Y BIOCHIPS

Chip de ADNMicroarray de ADN

Tipo de impresin

Material genticoinmovilizado

Densidad deintegracin

Coste

Ventaja

Desventaja

Impresin por deposicin.

Fragmentos de cDNA.

10.000-15.000 / microarray(aunque pueden alcanzarsedensidades mucho mayores).

Bajo.

Se pueden caracterizar genesnuevos al inmovilizarsecuencias annimas.

Necesita un paso previo de PCR.

Impresin por sntesis.

Oligonucletidos.

200.000-300.000 / chip.

Alto.

Puede no necesitar PCR previa. Sistema ms utilizado para el anlisis

del transcriptoma.

Genes de inters y regiones nocodificantes deben ser identificadaspreviamente.

Tabla 14. Diferencias entre microarrays y biochips (elaboracin propia).

Desde un inicio los microarrays y biochips seutilizaron para analizar patrones de expresin degenes con el fin de vislumbrar las bases molecularesde los procesos de la vida (ej. el ciclo celular). Sibien con posterioridad se han ido incrementando susaplicaciones haca la comprensin del desarrollo detejidos y rganos e incluso la caracterizacin deenfermedades de base molecular como el cncer.

El anlisis de la expresin gnica es til en eldiagnstico y tratamiento de enfermedades ligadas apatrones de expresin gentica particulares. Losarrays de ADN son especialmente tiles para laclasificacin de tumores y la identificacin deparmetros (marcadores) que permitan estimar elpronstico de la enfermedad. Se puede estudiar lafuncin de los genes al facilitar la identificacin deaquellos genes activados, inhibidos o mutados(polimorfismos) de forma diferencial cuando secomparan tejido sano y enfermo.

Sin embargo, los datos procedentes del anlisis dela expresin gnica tienen sus desventajas, ya quelos niveles de mRNA pueden no reflejar los niveles

de protena, y la expresin de una protena nosiempre tiene una consecuencia fisiolgica. As pues,sera necesario utilizar una tcnica de anlisis conindicadores ms sofisticados como la localizacin delas protenas y sus tasas de recambio, cambiosestructurales y modificaciones de protenas.

Existen otras tecnologas que no estn basadas enarrays de ADN, como por ejemplo TOGA12 (TotalGene Expresion Analysis), SAGE13 (Serial Analysisof Gene Expresion), READS (Restriction Analysisof Differentially Expressed Sequences), y RT-PCR(Real Time PCR), que permiten el anlisis de laexpresin gnica a media o baja densidad, esdecir, el nmero de genes que se pueden analizaren un solo experimento es de menor magnitudque en el caso de tcnicas que permitenresultados a gran escala, como los microarrays deADN. El caso de TOGA es diferente, ya que pese ano estar basado en tecnologas de arrays, spermite un anlisis de la presencia yconcentracin de mRNA por medio de un sistemaautomatizado y de alta resolucin por el cual secuantifica el cDNA total.

3.1. Aplicacin 1:Monitorizacin de la Expresin Gnica

12 Digital Gene Technologies Inc.: http://www.dgt.com13 Genzyme Molecular Oncology: http://www.genzymemolecularoncology.com

http://www.dgt.comhttp://www.genzymemolecularoncology.com

La aproximacin tradicional al proceso de descubrimiento de nuevos frmacos, su posterior desarrollo yanlisis toxicolgico, est evolucionando en los ltimos aos debido al mayor conocimiento del genomahumano y a la utilizacin de tcnicas de cribado a gran escala como son los microarrays de ADN.

28

Anlisis de la expresin gnica en clulas y tejidos normales

El patrn de expresin de un gen proporciona informacin indirecta acerca de su funcin. Si llegamosa caracterizar las secuencias homlogas de una familia gnica, as como los procesos quedesencadenan la expresin selectiva de sus genes, podremos disear frmacos que activen dichaexpresin de manera especfica, minimizando los efectos secundarios.

Anlisis comparativo de la expresin gnica en condiciones patolgicas

La regulacin negativa o positiva de la expresin de un gen puede ser la causa de la patologa o bienel resultado de la misma. Aunque el principal objetivo sea actuar sobre el gen cuya expresin causala patologa, tambin se busca modificar la actividad de alguno de los genes que se expresan comoconsecuencia de la enfermedad con el fin de aliviar sus sntomas. Por lo tanto, la posibilidad decomparar la expresin de miles de genes en tejidos o clulas enfermas y normales, permitir laidentificacin de mltiples dianas teraputicas potenciales.

Anlisis de la expresin gnica en sistemas modelo

El uso de animales como modelos de enfermedades proporciona gran cantidad de informacin y laposibilidad de comparar sus patrones genticos de expresin. Estos experimentos se suelen realizar conratones transgnicos que o bien sobre expresan genes especficos, o bien carecen de alguno de estosgenes (mutaciones puntuales, knockouts, etc). Otros modelos ms sencillos que tambin se utilizan sonlas levaduras (Saccharomyces cerevisiae), o gusanos (Caenorhabditis elegans) y peces (Zebrafish).

Anlisis de la expresin gnica en patgenos

Una de las ventajas que presenta el trabajo con genomas procedentes de microorganismos es supequeo tamao, lo que ha permitido la secuenciacin de un gran nmero de ellos en poco tiempo.Entre sus genes se hallan los que codifican factores de virulencia que se encuentran regulados poragentes ambientales tales como la temperatura. Los microarrays pueden ser aplicados igualmente enel estudio de la expresin de los genes virales durante el curso de la infeccin y periodo de latencia,as como en el estudio de la respuesta del organismo hospedador frente al patgeno.

Cuadro 4. Aplicaciones derivadas del anlisis de la expresin gnica (elaboracin propia).

Cuadro 5. Etapas en el descubrimiento de nuevos frmacos (elaboracin propia).

Mtodotradicional

Dianabiolgica

Clonacin Frmaco

GenmicaSecuencia

gnicaDiana

teraputicaFrmacocandidato

Genmicareversa

Dianateraputica

GenFrmacocandidato

3.2. Aplicacin 2: Cribado de compuestos activos y validacin de dianas teraputicas

29


Las aplicaciones de microarrays y biochips en elmbito de la generacin de frmacos sonespecialmente numerosas: contribuyen a laidentificacin de dianas teraputicas msefectivas; permiten conocer mejor el mecanismode accin de medicamentos, mejorando sueficacia y eficiencia; e incluso pueden determinarlos efectos secundarios de un frmaco endesarrollo, evitando la entrada en ensayos clnicosen caso de detectar toxicidad.

Los arrays de ADN son una herramienta potencial para la investigacin de los mecanismospor los cuales actan distintos frmacos, su implicacin en rutas metablicas, y posiblesefectos secundarios.

La monitorizacin de la expresin de genes conpotencial txico puede ser de especial interspara las industrias farmaceticas. La identificacinde los productos expresados por estos genespueden ser usados para el seguimiento de untratamiento farmacolgico y el efecto de distintasdosis del mismo, haciendo ms fcil el desarrollode nuevos compuestos. El uso de arrays de ADNen este caso presenta grandes ventajas cuando elfrmaco es difcil de rastrear por mtodosconvencionales, o bien los efectos esperadosrequieren largos periodos de tiempo.

PAPEL DE LOS MICROARRAYS DE ADN:DESCUBRIMIENTO DE NUEVOS FRMACOS

En este campo se persigue en primer lugar, la identificacin de genes y mecanismosmoleculares nuevos14 que permitan el desarrollo de un abordaje teraputico totalmente diferente alos ya existentes, o bien la mejora de los mismos.

La identificacin de nuevas dianas teraputicas mediante microarrays de ADN ha seguido dosestrategias durante los ltimos 4 aos, la mayora relacionadas con el cncer.

Estrategia 1: Identificacin de compuestos con patrones de expresin de la actividad celular nicos,con el objetivo de que estos indiquen la presencia de un nuevo compuesto con alguna de lasactividades conocidas.

De esta forma, el Instituto Nacional de Cncer de Estados Unidos ha analizado la actividad inhibitoria del crecimiento celular de aproximadamente 70.000 compuestos frente a un panel de 60clulas tumorales humanas15.

La estrategia a seguir en este tipo de estudios comprende la creacin de bases de datos de anlisisde expresin gnica con el objetivo de realizar clusters que renan los genes segn su implicacinen determinados procesos relacionados con el proceso cancergeno. As, se elaboran microarrays conmarcadores genticos especficos de proliferacin celular, progresin del ciclo celular, regulacin de lasntesis proteica, metabolismo de frmacos, etc. La batera de compuestos disponibles se analizamediante este microarray, lo que dar lugar a un conjunto de datos relacionados con los cambios enla expresin gnica inducidos por cada compuesto.

Nuevo Gen Nueva diana Nuevos frmacos

14 Debouck, C.; Goodfellow, P.N. (1999). DNA microarrays in drug discovery and development. Nature GeneticsSupplement. Vol 21, Jan. 48-50.

15 Scherf, U.; Ross, D.T.; Waltham, M.; Smith, L.H.; Lee, J.K.; Tanabe, L.; Kohn, K.W.; Reinhold, W.C.; Myers, T.G.;Andrews, D.T.; Scudiero, D.A.; Eisen, M.B.; Sausville, E.A.; Pommier, Y.; Botstein, D.; Brown, P.O.; Weinstein, J.N. (2000). A gene expression database for the molecular pharmacology of cancer. Nat Genet; 24:23644.

30

Estrategia 2: Utilizacin del genoma de levaduras como modelo para el screening de dianasteraputicas.

El genoma completo de S. Cerevisiae se conoce extensamente, y ha sido sujeto a numerosos anlisisde mutaciones. La identificacin de nuevos compuestos activos es posible mediante la comparacinde la expresin gnica en mutantes con alteraciones conocidas expuestos a bateras decompuestos16.

En segundo lugar la implementacin de nuevas tecnologas que aumenten la eficiencia delproceso de descubrimiento y desarrollo de nuevos frmacos. El uso de los microarrays de ADNpodra reducir el tiempo empleado en realizar estas etapas, y disminuir el nmero de compuestos que sedescartan tras haber consumido tiempo y medios econmicos en ensayos clnicos.

De esta forma, los microarrays de ADN se utilizan en el anlisis de la expresin gnica para lavalidacin de dianas, el estudio del perfil de activacin e inactivacin de dianas durante el proceso deoptimizacin de agentes teraputicos, mejor conocimiento de los mecanismos moleculares yrelaciones entre la actividad y la estructura, as como la prediccin de efectos secundarios, ydescubrimiento de marcadores de diagnosis, prognosis, y otros marcadores moleculares17.Adicionalmente, el anlisis de la expresin gnica por medio de microarrays de ADN permite laobservacin del modo de accin del frmaco, y la identificacin de los factores responsables de lasensibilidad, toxicidad, y resistencia de los frmacos18.

Cuadro 6. Objetivos de la utilizacin de microarrays de ADN en el proceso de descubrimiento y desarrollo de nuevosfrmacos (elaboracin propia).

16 Gray, N.S.; Wodicka, L.; Thunnissen, A.-M.W.H.; Norman, T.C.; Kwon, S.; Espinoza, F.H.; Morgan, D.O.; Barnes, G.;LeClerc, S.; Meijer, L.; Kim, S.-H.; Lockhart, D.; Shultz, P.G. (1998). Exploiting chemical libraries, structure, andgenomics in the search for kinase inhibitors. Science; 281:5338.Brachat, A.; Pierrat, B.; Brungger, A.; Heim, J. (2000). Comparative microarray analysis of gene expression duringapoptosis-induction by growth factor deprivation or protein kinase C inhibition. Oncogene; 19:5073-82.

17 Clarke, P.A.; Poele, R.; Wooster, R.; Workman, P. (2001). Gene expression microarray analysis in cancer biology,pharmacology, and drug development: progress and potential. Biochemical Pharmacology 62:1311-1336.

18 Workman, P. (2001). New drug targets for genomic cancer therapy: success, limitations, opportunities and futurechallenges. Curr Cancer Drug Targets; 1:3347.Turton, N.J.; Judah, D.J.; Riley, J.; Davies, R.; Lipson, D.; Styles, J.A.; Smith, A.G.; Gant, T.W. (2001). Gene expressionand amplification in breast carcinoma cells with intrinsic and acquired doxorubicin resistance. Onco-gene.; 20:1300-6.Robert J (2001). Resistance to cytotoxic agents. Curr Opin Pharmacol; 1:3537.

La presencia de formas gnicas alternativas oexpresiones atpicas de genes implicados en laaccin de un frmaco o el metabolismo, puedemanifestarse como una resistencia a la terapia obien una respuesta atpica a la misma. Losestudios farmacogenmicos correlacionan el perfilgentico de los individuos con la repuesta de cadauno de ellos a un frmaco determinado. Lainformacin obtenida con estos resultados seutiliza para disear arrays de ADN que puedan serutilizados en la seleccin de frmacos a medida, ycon ello se consigan tratamientos ms eficaces yatenuar posibles efectos secundarios en elpaciente.

La respuesta de cada paciente a un frmaco estintrnsecamente ligada a las caractersticas genticasdel paciente, moduladas por factores fisiolgicos,patolgicos y ambientales. As, la particular dotacingentica del paciente incide tanto en los factoresfarmacocinticos, determinantes de la concentracindel frmaco en su lugar de accin, como en losfactores farmacodinmicos (accin especfica delfrmaco) ligados a la manifestacin propia de laenfermedad y a la reaccin adversa. Lafarmacogenmica pretende realizar una teraputicaindividualizada al determinar el frmaco de eleccinpara la manifestacin especfica de la enfermedaden el paciente, y la dosis apropiada para conseguirel efecto teraputico minimizando el riesgo dereacciones adversas.

3.3. Aplicacin 3:Farmacogenmica

31


Herramientas Tradicionales

Desarrollo de un conocimientoms global de los cambios queconducen a los procesos demalignidad.

Mejor conocimiento delmecanismo molecular durante losprocesos de identificacin,optimizacin y ensayos clnicos.

Identificacin y validacin de nuevas dianas teraputicas. Prediccin de pacientes tratados con frmacos con mayor posibilidad de xito. Desarrollo de terapias a medida para cada paciente.

Microarrays y biochips

Descubrimiento de indicadores dediagnstico y pronstico as comomarcadores de respuesta adistintas terapias.

Identificacin de genesimplicados en la resistencia afrmacos.

INTEGRACIN DE MICROARRAYS EN LA LUCHA CONTRA EL CNCER: FRMACOS A MEDIDA

Fig. 3. Herramientas y estrategias utilizadas para el desarrollo de terapias contra el cncer (elaboracin propia).

La gran promesa que presentan los microarrays en la investigacin del cncer es la clasificacin detumores en clases basadas en los patrones de expresin de los mismos. Estas clasificaciones se realizanpor medio de un clustering u organizacin de los genes en mapas de expresin gnica a modo de rbolesfilogneticos. Clases diferentes de tumores pueden presentar distintos comportamientos clnicos, y portanto deben abordarse mediante terapias diferentes, apropiadas para cada clase o subclase.

La obtencin de informacin til a travs detcnicas genmicas tradicionales (ej. PCR) o bienmediante el uso de microarrays o bichips de ADN,tiene una clara explotacin comercial, en elmbito del diagnstico y prognosis deenfermedades. Los chips que se estndesarrollando en la actualidad con aplicaciones endiagnstico molecular son de distinta naturaleza:

Chips para identificacin de SNPs

La deteccin de mutaciones y polimorfismospermite el estudio de todas las variantes de unmismo gen, caractersticas de cada individuo, y ladeteccin de mutaciones en genes que participanen enfermedades complejas. Se pretendeconseguir la identificacin de marcadoresespecficos para determinadas enfermedades orepuestas a frmacos, mediante la identificacinde SNPs19 (polimorfismos de un solo nucletido).

En este tipo de chips de ADN, lo que se fija alsoporte son oligonucletidos sintticos de 7 a 30bases, pues con mayor nmero es difcilidentificar mismatch. Cada uno de ellosrepresenta un fragmento de un determinado gen,de modo que se puedan localizar variantes degenes conocidos, as como detectar mutacionespor delecin o insercin. Este tipo de anlisis serealiza fijando a la matriz secuencias quecontengan mutaciones conocidas (por ejemplo,todas las de un determinado gen), para detectarcul es la que tiene ese gen en la muestraproblema.

Chips de caracterizacin gentica

Los anlisis genticos se emplean para encontrarla posible predisposicin de una persona haciauna enfermedad basndose en el anlisis demutaciones en un individuo o en una familia.

3.4. Aplicacin 4: Diagnsticomolecular

19 Single Nucleotide Polymorfism (Polimorfismo de un solo nucletido).

32

Para elaborar un chip de diagnstico ycaracterizacin tumoral, se utilizan secuencias quecontienen distintas mutaciones en protooncogeneso en genes supresores de tumor, cuya presenciaen las clulas tumorales atribuye distintascaractersticas al tumor en cuestin.

El Centro Nacional de Investigaciones OncolgicasCarlos III, (CNIO), ha sido el primer centroespaol que fabrica y utiliza sus propios biochipspara su aplicacin en cncer. Los oncochips delCNIO contienen un total de 6.514 genes,seleccionados por su implicacin en procesostumorales a partir de los 35.000 genesidentificados por el Proyecto Genoma Humano.Entre sus aplicaciones se encuentran la prediccindel desarrollo clnico de un tumor y de su posiblerespuesta a distintos frmacos, as comoinformacin fundamental para los investigadoresque trabajan en el campo de la oncologa bsica.

Chips de deteccin deenfermedades infecciosas

Actualmente existen varias lneas de desarrollo dechips para diagnstico molecular de enfermedadesinfecciosas, como el SIDA o la hepatitis,convergiendo todas ellas hacia la integracin yfacilidad de ensayo. Estos chips permiten elgenotipado de las cepas infecciosas a partir demuestras del paciente.

Si las herramientas de amplificacin de ADN hansupuesto una primera revolucin para eldiagnstico molecular de enfermedadesinfecciosas (kits de PCR), al permitir un anlisisms rpido y fiable que los ensayos tradicionalesmediante anticuerpos (ensayos serolgicos), loschips de diagnstico molecular de enfermedadesinfecciosas, que estn actualmente en fase dedesarrollo, supondrn una segunda revolucin deigual o mayor magnitud.

33


DESARROLLO DE CHIPS PARA APLICACIONES EN MICROBIOLOGA20

Virus Estatus en 2001 Soporte y sondas

Genotipado Virus de lahepatitis C

Resistencia al virus del VIH

Disponiblecomercialmente

En desarrolloindustrial



En desarrolloacadmico

Oligos en membrana de nitrocelulosaGenotipado Virus de lahepatitis B


Oligos en membrana de nitrocelulosaGenotipado Papilomavirus


Oligos en membrana de nylonIdentificacin de mycobacterias


Productos de PCR en membrana denylon

Identificacin de Enterococcus


Oligos en membrana de nitrocelulosaGenotipado de Helicobacterpylori



Patognesis de E. Coli



Identificacin de Streptococcus


Oligos en membrana de nitrocelulosaIdentificacin de especies deCampylobacter


Oligos en membrana de nitrocelulosaDeteccin de Listeria


Oligos en membrana de nitrocelulosaDeteccin de Brucella

Oligos en membrana de nitrocelulosa

Oligos en array microelectrnico

Oligos en membrana de nitrocelulosa

Sntesis in situ de oligos

Resistencia de mycobacterias a rifampicina



Sntesis in situ de oligos

Oligos en membrana de nylon

Tabla 15. Desarrollo de chips para aplicaciones en microbiologa (elaboracin propia).

20 Anthony, R.M.; Brown, J.T.; French, G.L. (2001). DNA array Technology and Diagnostic Microbiology. Expert. Rev. Mol.Diag. 1(1). 30-38.

34

Los microarrays de ADN o biochips que se comercializan actualmente se dividen en alta y baja densidad21,teniendo ambos aplicaciones distintas de acuerdo al usuario final.

Compaas farmacuticas y biotecnolgicas

Comunidad acadmica e investigadores

Tabla 16. Usuarios de las Tecnologas de Microarrays (elaboracin propia).

4. Aspectos de mercado: aplicacin de microarrays de ADN y biochips en salud humana

Centran sus esfuerzos en acelerarlos niveles de produccin.

Caractersticaprincipal

Necesidades mucho menores encuanto a resultados a gran escala.

Problemas de automatizacin yobtencin de resultados a gran escala.

Debilidades Medios econmicos restringidos.

Altos presupuestos.Fortalezas Recursos humanos bien formados

y con bajo coste.

Caracterizacin de la accinmolecular de compuestos activos.

Verificacin y validacin de dianasteraputicas.

Farmacogenmica.

Arrays de media/alta densidad

Identificacin de genes de inters.

Caracterizacin de mecanismospatolgicos.

Anlisis de la expresin gnica.

Diagnstico molecularArrays de baja

densidad

21 La densidad de un array hace referencia al nmero de puntos activos sobre una superficie en donde se depositan lassondas o oligos de ADN.

22 Gottlieb, S. (2001). The Coming Biochip Boom: Gene Chips Go Clinical. Gilder Biotech Report, Oct., Vol. 1, n 1.

La empresa lder en arrays de alta densidad es

hasta el momento Affymetrix, con un 60% del

mercado total de chips de ADN, y que tiene a los

investigadores entre sus principales clientes. Este

tipo de arrays permite una gran densidad de

integracin y la realizacin de un importante nmero

de ensayos de manera simultnea. El GeneChip de

Affymetrix se usa de manera relativamente

frecuente en laboratorios de investigacin,

vendindose ms de 100.000 unidades

anualmente22 a un precio que oscila entre los 50 y

2.280 dependiendo del chip. Entre los principales

productos que se comercializan estn los chips VIH

que pueden detectar cepas resistentes a

determinados frmacos, los chips p53 que se utilizan

para la deteccin de mutaciones asociadas a una

mayor predisposicin a desarrollar procesos

cancerosos, y el chip citocromo P450 que es capaz

de identificar aquellos individuos que tengan ms

dificultades para metabolizar los frmacos de uso

comn.

Las tcnicas fotolitogrficas utilizadas por

Affymetrix para la sntesis in situ de oligos,

permiten obtener hoy por hoy chips

comercializables con los tamaos de punto ms

pequeos (390.000 puntos/cm2 segn fuentes de

la propia compaa).

4.1. Arrays de alta densidad

35


Fig. 4. Comparacin de las densidades de los arrays producidos por diferentes compaas en el ao 2000.

100.000

10.000

1.000

100

10

Alta densidad

Media densidad

Baja densidad

Aff

ym

etr

ix

Vysi

s Clo

nte

ch

CM

S Mo

toro

la

Cep

heid

Nan

og

en

Ag

ilen

t

DENSIDAD DE ARRAYS COMERCIALES 23

Los arrays de media y baja densidad suelen utilizarse para trasladar a una escala ms prctica, los resultados obtenidos (ej. secuencias de inters o mutaciones) con arrays de alta densidad. Las caractersticas de precisin y velocidad de anlisis de los arrays de media y baja intensidad, permiten

que se posicionen en sectores de mercado conmayor margen de negocio, como por ejemplo elsector clnico. El punto fuerte de los chips deAffymetrix, la alta densidad de integracin, tienemenor valor en estos sectores donde se buscafiabilidad, rapidez, simultaneidad y flexibilidad paraabordar los problemas concretos del cliente.

Proveedores de instrumental

GeneMachines, BioRobotics, Molecular Dynamics, Nanogen,Packard Biosciences.

Proveedores de chips

Stratagene, Clontech, Tahara, MWR, Perkin elmer/NEN.

Proveedores de soluciones integradas

Genomic Solutions.

Cuadro 7. Proveedores de arrays de baja y media densidad (elaboracin propia).

4.2. Arrays de media y baja densidad

23 Nelson, T.R. (2000). Chip, Chip, Array! An Analysis of DNA Chip Technology. Equity Capital Markets, Dain RauscherWessels. Dec. 7.

Los expertos consultados para la realizacin de este

informe, corroboran los datos y tendencias

expuestos en los informes de mercado realizados

por importantes consultoras, si bien un nmero

importante de ellos piensa que se han subestimado

las posibilidades que presentan los microarrays de

baja densidad, sobre todo a la vista de los

importantes desarrollos que se estn produciendo en

microfludica, electrnica y microsistemas. Estos

desarrollos permitiran la integracin de todas las

operaciones necesarias para llevar a cabo ensayos y

prctica clnica, de manera rpida y precisa

(ej. Tecnologa Lab-on-a-chip).

Hasta la fecha, los microarrays de ADN ms

utilizados segn la encuesta realizada por ABRF

(Association of Biomolecular Resource Facilities) en

el 200125 son los de Affymetrix26. Esta compaa

sigue una estrategia de implantacin en el

mercado parecida a la que mantuvo Microsoft con

sus programas informticos, manteniendo

acuerdos con diversas compaas que se dedican

al mismo sector, con el fin de crear una plataforma

comn y forzar al mercado a utilizar su modelo,

aunque este no sea tan flexible para el sector

clnico como otras plataformas. Para el mercado

sanitario, un sector de grandes mrgenes y alto

valor aadido, la mejor plataforma sera aquella

que no solo fuese la ms rpida y precisa, sino

tambin la que atrajera a la mayor coleccin de

sondas de ADN con aplicaciones en diagnstico

molecular, es decir, la ms flexible.

36

24 Electronics Journal. January/February (2002): http://www.electronicsjournal.com/content/backissues/0201/0201frame.html25 2000/2001 ABRF Microarray Research Group Study: A Current Profile of Microarray Laboratories. G. Grills, C.;

Griffin, A.; Massimi, K.; Lilley, K.; Knudtson, J. Van E.26 Affymetrix no solo se centra en aplicaciones farmacuticas, sino que adems est interesado en trasladar su plataforma

a otros sectores, como el de los anlisis de calidad de agua. Por este motivo tiene un acuerdo con Lyonnaise des Eaux,una de las principales empresas que suministra agua a los pases europeos, para el desarrollo de chips especficos queincluyan bacterias, virus y parsitos ms frecuentes.

1999

86

86

79

912

2004

Microarrays

Otros Biochips

Microfludica

Fig. 5. Estimacin de la cuota de mercado de Microarrays y Biochips (Frost & Sullivan).

Productos Descripcin Tendencias

GeneChips (sntesis in situ)Gene Array escners

Microarrays deoligonucletidos yescner.

Fuerte crecimiento.

Arrays por deposicin (spotted)Arrayer Ping & Ring y Escner lser confocal

Microarrayspersonalizados.

Bajo crecimiento.

Tabla 17. Tendencias de implantacin de microarrays en el Mercado. Adaptado de: Fronline Strategic Consulting, FunctionalGenomics Report, A Strategic Market Analysis (2002).

4.3. Mercados: Affymetrix

Segn las estimaciones de la firma Frost &Sullivan del ao 200124, el valor del mercado demicroarrays y biochips de ADN en el ao 2000 fuede 531 millones de dlares, mientras que losanlisis financieros y pronsticos de mercado deesta consultora sealan que la tasa decrecimiento para los prximos aos ser del 65%anual. Del total de este mercado, el 60%corresponde a microarrays de alta densidad cuyafinalidad principal es la investigacin encaminadaa la bsqueda de nuevos frmacos y la minera dedatos genmicos.

http://www.electronicsjournal.com/content/backissues/0201/0201frame.html

37


27 Affymetrix: http://www.affymetrix.com/products/index.affx

Producto

Arrays catalogados

Arrays personalizados

Instrumental

Arabidopsis Genome Array. Drosophila Genome Array. E. Coli Genome Array. Human Genome Focus Array. Human Genome U133 Set. Human Genome U95 Set. Murine Genome U74 Set. Rat Genome U34 Set. Rat Neurobiology U34 Array. Rat Toxicology U34 Array. Test3 Array. Yeast Genome S98 Array.

El GeneChip permite el anlisiscuantitativo y cualitativo de los niveles deexpresin gnica de organismos biolgicosrelevantes.

Los chips son redundantes, el materialinmovilizado consiste en oligos deaproximadamente 25 nucletidos, y slopueden ser analizados medianteinstrumentos de Affymetrix.

Custom Arrays. Permite la posibilidad de usar GeneChips

con los parmetros y secuencias que sedeseen.

CustomExpress Arrays. Permite el diseo del chip usando el

catlogo de sondas disponibles.

Made-to-Order Arrays.

Cartridge Carriers.

CYP450 Assay.

HuSNP Mapping Assay p53 Assay.

GenFlex Tag Array.

Arrays deanlisis de ADN

Arrays no disponibles en catlogos.

Cartucho.

Fluidics Station 400. Cmaras de hibridacin.

Hybridization Oven 640. Horno de hibridacin.

Scanner System with Workstation. Escner.

Complete GeneChip InstrumentSystem.

Contiene el set completo con la cmara,horno de hibridacin, escner y soporteinformtico.

Data Mining Tool (DMT).

Laboratory InformationManagement System (LIMS).

Microarray Suite Software.

MicroDB Software.

NetAffx Analysis Center.

Software and Computer Packages.

Soporte informtico para el anlisis yorganizacin de los datos.

Software

Componentesadicionales

Genotipado (deteccin de SNPs), anlisisdel gen p53, anlisis de CYP450.

Permite el diseo de arrays personalizados.

Anlisis de laexpresin

gnica

Aplicacin Descripcin

TECNOLOGAS DE AFFYMETRIX27

Tabla 18. Catlogo de productos y tecnologas de Affymetrix (elaboracin propia).

http://www.affymetrix.com/products/index.affx

38

28 Trilateral Project B3b. Comparative study on biotechnology patent practices. Patentability of DNA fragments:http://biotech.about.com/cs/patentdebate/

29 Japan Patent Office: http://www.jpo.go.jp/30 European Patent Office: http://www.european-patent-office.org31 U.S. Patent and Trademark Office: http://www.uspto.gov/32 DeCode Genetics: http://www.decodegenetics.com33 Agilent Technologies: http://www.agilent.com34 Incyte Genomics: http://www.incyte.com/index.shtml35 Motorola Life Sciences: http://www.motorola.com/lifesciences36 http://www.motorola.com/lifesciences/news

El uso de fragmentos de ADN como sondas generaun gran nmero de dudas acerca de la propiedadintelectual de las mismas. Segn un estudioconjunto28 publicado por la Oficina de PatentesJaponesa (JPO29), Europea (EPO30), yEstadounidense (USPTO31), un fragmento de ADNcon una utilidad determinada, por ejemplo, unasonda para el diagnstico de una enfermedadespecfica, es potencialmente patentable siempreque cumpla los tres criterios fundamentales de unapatente: novedad, invencin y aplicacin industrial.De esta forma, no basta con caracterizar unfragmento de ADN basndose en su homologa conuna protena de funcin conocida, y suponiendo quela secuencia formar parte de un gen estructural.Por tanto, el diseo de un kit de diagnstico conmltiples sondas debe tener en cuenta la propiedadintelectual de estas, y las licencias de uso necesariaspara su comercializacin.

Dentro de este contexto, Affymetrix tiene unacuerdo con DeCode Genetics32 para teneracceso a la base de datos genmica que estosltimos poseen y Agilent Technologies33

tambin tiene un proyecto de colaboracin conIncyte Genomics34, por el cual esta compaapermite la disponibilidad de su base de datos degenes patentada denominada Life-Seq.

Por ltimo remarcar que actualmente Affymetrixest interesado en fabricar unos biochips con losque se pueda analizar cmo responden lospacientes a distintos tratamientos frente aenfermedades como la depresin, asma,hipertensin, cncer de mama, migraas,hipercolesterolemia y otros.

4.4. Mercados: empresas quecompiten con Affymetrix

Varias compaas de tamaos muy diversos se estnposicionando paulatinamente en el mercado de losmicroarrays y biochips haciendo competencia aAffymetrix por el liderazgo del sector de la

genmica. Estas compaas son principalmenteMotorola, Corning, Agilent Technologies (spin-off deHewlett-Packard), Incyte y Nanogen, que tienen encomn pertenecer al sector de los semiconductores,y que estn extendiendo sus actividades al sector delos biochips:

Motorola35 est utilizando su experiencia ensensores y circuitos para producir biochips quecontengan microelectrodos conectados afragmentos de ADN. Esta plataforma consiste enla fabricacin de chips de baja densidad quepueden canalizar 36 dianas de ADN o ARNsimultneamente. El sistema usa molculasorgnicas que forman circuitos electrnicos,proceso que se conoce como bioelectrnica, y quepermite detectar la hibridacin de las molculasde ADN. De esta manera, no es necesario el usode fluorescencia y por tanto no precisanescneres. Esta compaa tiene acuerdos conPackard Instrument Company y el ArgonneNational Laboratory para comercializar biochips.

Todos los productos de Motorola Life Sciences estndesarrollados a partir de una tecnologa de la que espropietaria la empresa, denominada Codelink 3DGel Platform. Se basa en la utilizacin de matricestridimensionales de poliacrilamida que permiten unamayor superficie de contacto para la posteriorinmovilizacin de oligos.

No obstante, las ltimas informacionesconsultadas indican que Motorola ha vendido laplataforma Codelink bioarray a la compaaAmersham plc36.

bound target

oligonucleotide probe

linker

polyacrylamide matrix

free target

aqueous environment

http://biotech.about.com/cs/patentdebate/http://www.jpo.go.jp/http://www.european-patent-office.orghttp://www.uspto.gov/http://www.decodegenetics.comhttp://www.agilent.comhttp://www.incyte.com/index.shtmlhttp://www.motorola.com/lifescienceshttp://www.motorola.com/lifesciences/news

39


37 Corning Life Sciences: http://www.corning.com/lifesciences/Greater_Europe/en/38 Nanogen: http://www.nanogen.com39 Gottlieb, S. (2001). The Coming Biochip Boom: Gene Chips Go Clinical. Gilder Biotech Report, Oct., Vol. 1, n 1.40 Incyte Genomics: http://www.incyte.com/index.shtml41 Hyseq Pharmaceuticals Inc: http://www.hyseq.com

Corning Inc.37 Una de las compaas ms

importantes en la industria de la fibra ptica, ha

formalizado una alianza a finales del ao 2001

con Genencor para crear una nueva plataforma

llamada Silicon Biotechnology, la cual pretende

desarrollar chips biolgicos de deteccin ptica y

biochips.

Nanogen38, como ya ocurra con Motorola,

tambin hace uso de la bioelectrnica, pero en

este caso tambin a la hora de fabricar el biochip.

La deteccin de la hibridacin se realiza utilizando

las propiedades elctricas naturales del ADN, que

est cargado negativamente. Mediante la

aplicacin de corriente elctrica se consigue que

las molculas cargadas de ADN se muevan y

concentren en los lugares de anlisis, controlando

as las muestras que queramos analizar. Esta es

una gran ventaja a tener en cuenta por los

usuarios, quienes pueden usar el chip ms de una

vez e incluso cambiar las secuencias de las

muestras.

Los estudios que han analizado la plataforma de

Nanogen y de Motolora39 sealan que los

NanoChips de Nanogen son ms precisos que los

GeneChips de Affymetrix, ya que estos ltimos

tienen un porcentaje de falsos negativos que no

seran aceptables en aplicaciones diagnsticas, donde

se requiere una precisin cercana al 100%. Adems

otra de las ventajas que presenta la plataforma de

Nanogen es el hecho de que sus biochips analizan

directamente el ADN en lugar del ARN.

La aplicacin actual del NanoChip se centra enla deteccin de mutaciones y marcadores que por

el momento tan solo est catalogado para uso en

investigacin, relacionado con enfermedades

como el cncer, la talasemia, patologascoronarias y vasculares, hipertensin,

metabolismo y resistencia a frmacos.

Incyte Genomics40 es una compaa posicionadaen el sector de la bioinformtica que desarrolla

para su uso comercial bases de datos genticos y

moleculares (LifeSeq y LifeExpress), as como

software especfico para manejar informacin

biolgica (LifeTools). Adems de estos

productos la compaa comercializa clones y

productos de PCR listos para ser utilizados en

arrays de ADN. Incyte ofrece tambin un conjunto

de chips de alta densidad denominados

LifeArray, con aplicaciones potenciales en

anlisis de la expresin gnica y toxicidad de

frmacos.

Incyte lleva 5 aos implicado en litigios con

Affymetrix, con relacin a las patentes de

microarrays, litigio que ha desembocado en un

acuerdo entre ambas compaas, a la vista de la

nulidad de algunas reivindicaciones contenidas en

las patentes de Affymetrix.

Hyseq Pharmaceuticals Inc.41 cre CallidaGenomics a finales del ao pasado con el objetivo

de centrarse en la comercializacin y desarr

microarrays y biochips de adn · arrays de alta densidad 34 ... in situ de sondas) ......

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