Aplicação de métodos rápidos para controle microbiológico

Neliane F.A.SilveiraITAL

SEMINÁRIO FOOD DESIGN: TENDENCIAS EM HACCP

28 DE SETEMBRO DE 2006

Métodos rápidos ou alternativos

• Para que servem?• Usados em que situações?

• O que seriam?

Grandes tendências

• Hoje: Todos preocupados com :

• Inocuidade e Qualidade dos alimentos: Monitoramento e Análise Microbiologicas

QUALIDADE DOS ALIMENTOS

• Verificado por : Indicadores• Bactérias totais• Mesófilos• Psicrotroficas• Termofilas • S. aureus - homem- portador• Fungos- limpeza do local• Contaminação fecal_ Totais- Termotolerantes e E. coli• Enterobacteriaceae

Inocuidade• Verificada pelos patogenos:• Gram-positivos-( Intoxicação)-Listeria

monocytogenes, S. aureus, C. perfringens, Bacillus cereus

• Gram negativos: (Infecção) Salmonella, Vibrio, E coli patogenicas, Campylobactyer, E,sakazakii,Shigella Aeromonas, etc,.

Verificação:

• Métodos tradicionais, culturais, clássicos

• Métodos alternativos ou rápidos : Porque a procura??????

• Culturais: Problemas: pouco elaborados, trabalhosos, demorados, muito material de laboratório, requer pessoal treinado, sujeito a falhas humanas.

Problemas com os métodos tradicionais:

• Sensibilidade insuficiente- capacidade de detectar o que o método propõe,

• Especificidade:Detecta so microrganismo procurado- nem sempre ocorre!- da falso negativos

• Repetitividade: Se o operador fizer 50 vezes-ele obtem o mesmo resultado- não ocorre

• Reprodutibilidade: Gerar resultados estatisticamente iguais - nem sempre ocorre!!

Métodos novos no mercado

• No período de 1993 ate 2000- houve uma explosão no mercado de testes alternativos começando em países desenvolvidos : ate o ano 2000- muita confusão na área!!!

• Atualmente: O mercado filtrou os que não funcionavam e hoje os que estão ai, são métodos confiáveis!

Objetivos dos métodos rápidos em análises microbiologicas

• 1.Melhorar a eficiência dos laboratórios, simplificando trabalhos, reduzindo o custo no geral, aumentando a capacidade analítica

• 2. Aumentar confiabilidade dos resultados_ não é preparado pelo analista- kit vem pronto

• 3. Aumentar a precisão dos resultados• Mesmo assim: deve ter um microbiologista

treinado

Métodos Rápidos- 3 grupos

• 1. Automação laboratorial

• 2. Métodos rápidos para avaliar a qualidade

• 3.Métodos rápidos para avaliar inocuidade

1. Automação laboratorial

• Utilizado nas etapas da analise:• a . Pesagem- Por ex, através de um

aparelho chamado DILUTER - ajustado que ao colocar a amostra, pesa a aliquota desejada, e já dilui acrescentando a água necessaria para a diluição!

• b . Homogeneização- Uso do stomacher-homogeneizador de pistão

Continuação: automação laboratorial

• c .Semeadura - Utilização de um aparelho chamado- spiral plater- a amostra é semeada na placa, atraves de uma canula, que verte o inoculo, e a placa fica numa superficie que gira.

• d .Plaqueamento-Contagens no geral - Com novos meios como os cromogenicos - uteis para identificar certos microrganismos - já seleciona melhor, evitando testes bioquimicos inúteis

2. Métodos para avaliação da qualidade

• Métodos de contagem- direta e indireta

Contagem Direta• 1. Membrana filtrante_ Utilizada para líquidos onde grande

quantidade é necessitada para amostra : utilizada em água, refrigerantes,

• 2. Métodos de contagem fluorogenicos_ como LST MUG-no caso-baseada na propriedade da E coli- o indicador procurado- adiciona-se MUG (u-metil umbeliferil beta-d-glico

• ronídeo) ao caldo da cultura (presuntivo)- O número de tubos com gás e fluorescentes apos 24 h, ou 48- sob luz ultra-violeta visível,da o numero mais provável de E.coli por grama

• E coli- tem a enzima glucoronidase que degrada o MUG e da fluorescência

Um exemplo:Colilert

Vantagens: SimplesNão requer trabalho de preparoExecução rápidaNao exige confirmaçãoNão requer equipamento de leitura

Desvantagem: ser aprovado só p/ água

Existem testes de outras marcas comerciais semelhantes(mesmo principio) a este aqui exposto,

esse foi citado como exemplo por ter sido o primeiroconhecido no mercado.

1 . Galactopiranosídeo ortonitrofenilONPG

ortonitrofenil ortonitrofenol

(Cor amarela)

oxidação

( Pó = reagente Colilert )

Onde , ONPG = enzima presente nos coliformes totais → orto nitro fenil galacturonidase

2. 4-metil umbeliferil glucoronídeoglucoronidase

( Pó = reagente Colilert )

4 metil umbeliferil

oxidação

4-metil umbeliferona

Produção de brilho fluorescente

Onde, glucoronidase = enzimas presentes nas E. coli

COLILERT

VANTAGENS DESVANTAGENS

Resultado em 24h

Praticidade na inoculação: placa de Petri, pipeta,...

Economia de tempo

Leitura após 28h fornece resultado não confiável devido

ao efeito limitado do antibiótico Solanium: leitura deve ser efetuada entre 24 -

28h após a incubação.

Apenas para amostras de água.

QUANTI-TRAY/2000 Fabricante = IDEXX Laboratories Inc.

É uma adaptação do sistema dos tubos múltiplos (NMP) , envolvendo , portanto, uma tabela de leitura com base estatística.

100ml de amostra de água

+ “Colilert ”Distribuição na cartela contendo os tubos

Leitura sob luz UV Selagem da cartelaincubação

Tabela Resultado em NMP

Contagem direta- continuação-

• 3. Sistemas prontos para uso-• Ex: Placas de simplate_ 1 placa so- com

sulcos- amostra é diluida-Ex:Contagem total• Placas de Petrifilm-3M - cartões-Coliformes,

S. aureus, Fungos, Contagem total, etc.• Placas de compact dry- Verus-Madasa- idem• Ilustração:

PETRIFILM COLIFORMES (AOAC 991.14)

Coliformes totais e E. coli em amostras de alimentos em geral

Fabricante= 3M Prods para Microbiologia

Princípio de funcionamento Modificação do método tradicional de contagem de células viáveis em placas

Placas de Petrifilm

Vista Superiorou planta

Filme de polipropileno

Adesivo c/ corante indicador

Géis hidrossolúveis a frio

Nutriente e géis hidros. A fri

adesivo

Papel quadriculado c/ polietileno

Vista lateral

Amostra diluída 1ml

Espalhar o inóculo com um difusor

1 minuto

Gelificação do meio de cultura

Incubação

Contagem de Aeróbios → colônias vermelhasContagem de coliformes → colônias vermelhas com gás

Contagem de Bolores e Leveduras

Contagem de E. coli → colônias azuis com gás

Placas para:

Leveduras = Colônias pequenas , rosa escuro a azul esverdeada;

Bolores = colônias grandes , coloração variada

SIMPLATE Fabricante =BIOCONTROL ( www.biocontrolsys.com)

Amostra na

diluição desejada

Meio de cultura

liofilizadoSimplate

+ 100ml de água destilada estéril

agitação Meio de cultura rehidratado

1ml

9ml

Homogeneização

Remoção do excesso do líquido

incubação

35oC/24h( CT ; colif.)

25oC/72h( B e L )

(Placa de plástico com 84 cavidades)

LEITURA

Colônias vermelhas: presença de

coliformes totais

Luz UVColônias

fluorescentes: presença de E.coli

Tabela de NMP

Simplate CEC

Simplate TPC = Contagem total de bactérias por fluorescência

Simplate TPC-Cl = Contagem total de bactérias por indicador de cor

Simplate SYM = Contagem de Bolores e Leveduras

Contagem Indireta

• 1. Bioluminescência

• 2. Impedância/Condutância

Contagem Indireta

• 1.Técnica de Bioluminescência

• Princípio: Quantidade de ATP detectada a partir de células

• metabolicamente ativas (residuos orgânicos, inclusive microrganismos).

• Mecanismo: reação de enzima luciferina-luciferase (cauda do vagalume)

• ATP- reage com a enzima produzindo luz, medida em um luminometro

1.Bioluminescência:

Aplicação comum: Monitoramento de Higienização em plantas processadoras de alimentos.

Equipamentos comercializados à base de bioluminescência:Lightning e Hi-Lyte.

Consistem em um swab aplicado a superfície a ser checada: introduz num tubo com os reagentes necessários e o coloca no luminometro que mede a intensidade da luz:

Quanto mais sujo, + luz!

SISTEMA LIGHTNING Fabricante =BIOCONTROL ( www.biocontrolsys.com)

Sistema Lightning monitora o processo de limpezqa e sanificação de superfícies .

Princípio do método: emissão de bioluminiscência por ATP.

1 . Luciferina + luciferase + ATP + Mg +2 Luciferil adenilato - luciferase + pirofosfato

2. Luciferil adenilato - luciferase + O2 Luciferase + Oxiluciferina + AMP+ CO2 + LUZ

O substrato Luciferina sofre fosforilação através da enzima luciferase , na presença de ATP.

A molécula de ATP pode ser encontrada em : células microbianas viáveis; células não microbianas ( sangue, carne,...)

Sistema Lightning detecta

ATP residual em superfícies

Componentes - sistema Lightning

Swab ; luminômetro ; alicate ; software

Buffer

swab

1

c

2

a

b

Luciferina +

Luciferase

Buffer

swab

1

c

2

a

b

Luciferina +

Luciferase

Procedimento de uso

1 ) Esfregaço numa determinada superfície.

2 ) Peça 1 em 2

3) Entortar a região “a” com a mão : escorrimento do buffer ao longo da haste

4) Alicate → amassar a região “c” para romper a barreira “b”: permitindo o

contato entre buffer + esfera + estremidade da haste

5 ) Agitar o conjunto 3

6) Introduzir a peça 1 no luminômetro e fazer a leitura 3

tu43

0 2,5 3 7,5

Limpa alerta suja

luminômetro

Contagem Indireta - cont.

2. Técnica de Impedãncia/Condutãncia

Principio: Microrganismos alteram a corrente elétrica de um meiode cultura: devido às atividades metabólicas: Na multiplicação, as moléculas grandes (proteínas, lípides,)se transformas em moléculas menores:aminoacidos, ac. graxos, que sao quimicamente maisativas: o acumulo destes compostos: alterações mensuráveis

Ex,: BACTOMETER- Bio_Mérieux. A quantidade de microrganiamos presentes é definida pela determinação do TEMPO DE DETECÇÃODetecção ocorre qdo. a conc. Atinge 106-107 microrg./ml.

Curva-padrão: Determina microrganismos presentes

3.METODOS RÁPIDOS PARA AVALIAÇÃO DE INOCUIDADE

A.BIOQUIMICOS

B.IMUNOLOGICOS

C.MOLECULARES

METODOS RÁPIDOS PARA AVALIAÇÃO DE INOCUIDADE• A. Bioquímicos:Métodos que a partir

de uma cepa obtida por algum metodo de detecção- é inoculada em kits- e são observadas para capacidade de realizar determinadas reações bioquimicas:

• Ex: Galerias API_ Bio-Mérieux

• BBLRapid test- Salmonella- OXOID

OXOID Salmonella RAPID TEST Fabricante = Unipath Ltd

Somente linhagens móveis

Amostra pré-enriquecida em BPW por 18h/37oC

+

Rappaport-Vassiliadis modificado

Lisina Ferro Desoxicolato modificado

Verde Brilhante modificado

Lisina Ferro Cistina Vermelho Neutro

modificado41oC / 24h

Leitura

A B

Tubo A = cor preta → produção H2S

Tubo B = vermelha ou preta → ausência fermentação da lactose

METODOS RÁPIDOS PARA AVALIAÇÃO DE INOCUIDADE

• B. Imunologicos: 4 grupos:

• B1.Imunoenzimaticos• B2.Imunocaptura• B3.Imunoimobilização• B4.Coaglutinação

B1. Imunoenzimáticos

O tipo mais empregado: sandwich.

O patógeno PROCURADO é capturado da amostra por anti-corposadsorvidos à superfície de uma matriz sólida (esferas de de polietileno, placas de micro-titulação, papel, etc).

O complexo ántigeno-anticorpo reage com o conjugado, formanovo anti-corpo específico p/ o microrganismo em teste. Ligadaa enzima cromogenica (fosfatase alcalina/peroxidase), o sandwich reage com o substrato da enzima cromogenica e mostra cor: teste positivo.

Ex. UniqueVidas- Bio Merieux- automatizado

B2- Imunocaptura• Principio: capacidade dos microrganismos aderirem à

superfície• de partículas metálicas revestidas de anti-corpos

específicos

• Ligando os antígenos bacterianos + anti-corpos: o sistema tem

• um suporte com ímã que atrai as partículas metálicas, e o que fica

• é um concentrado de microrganismos procurados: entaofaz um

• enriquecimento e plaqueamento ! Sorologia: deve ser feita em colonias suspeitas, dando assim resultado imediato,

B3- Imunoimobilização• Princípio: Bactérias móveis cultivadas em meios semi-sólidos

tem• sua mobilidade bloqueada pela adição de anti-corpos

flagelares • específicos.• Forma uma banda de precipitação visível na interface• ANTI-CORPO/BACTÉRIA.• Aplicável a qualquer microrganismo flagelado (móvel).

• Ex. Teste 1-2 da Bio-Control p/ Salmonella: Duas câmaras de plástico interligadas em L . Na câmara horizontal fica o caldo de enriquecimento seletivo p/ Salmonella e na vertical o meio semi-solido

• onde se coloca o antisoro flagelar polivalente.

B4- Coaglutinação

• Conhecido como aglutinação de látex(passiva reversa)

• Uso: toxinas microbianas

• Aglutinação de partículas de látex sensibilizadas com anti-corpos anti-toxinas.

• Ex.: RPLA kits_ OXOID p/ pesquisa deenterotoxinas estafilocócicas.

Métodos rápidos para avaliar inocuidade

• C. MÉTODOS MOLECULARES

• C1. Sondas genéticas- pouco usadas: Separa fita de DNA- sonda reage-marcador- cor- le se no colorimetro

• C2.PCR- tradicional e automatizado- BAX SYSTEM - desnatura fita dupla do DNA-94C/ -pareamento com primers-37C/-síntese da fita complementar-amplia muito o DNA do patogeno de tiver-definitivo- não confirma!

• C3.Ribotipagem-Ribotipo- Sofisticação em analises

Considerações finais

A Escolha da metodologia a ser adotada na realização da análisedeve ser norteada por:

Precisão pretendidaCusto/tempo da análiseSimplicidadeTreinamento do analistaDisponibilidade de meios e reagentesAssistência técnica do fabricanteEspaço no laboratório, entre outros fatores!Pode se utilizar qualquer método em qualquer fase da analise

Pre requisito: Microbiologista treinado sempre!

Bibliografia consultada

• FRANCO, B D G M, Métodos alternativo de análise microbiológica de alimentos: uma revisão, USP, faculdade de Ciências farmacêuticas - Depto, de Alimentos e Nutrição experimental, 1999

• FRANCO, BDGM, Métodos rápidos em microbiologia de alimentos- Curso Métodos de Analise em Microbiologia de Alimentos-ITAL, 2006

Obrigada!

• nferraz@ital.sp.gov.br