michael t. hemann, margaret a. strong, ling-yang hao, and carol w. greider
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The Shortest Telomere, Not Average Telomere Length, Is Critical for Cell Viability and Chromosome Stability. Michael T. Hemann, Margaret A. Strong, Ling-Yang Hao, and Carol W. Greider. Presentación : Cinalli, Alejandro Holgado, María Pía Salvatierra, Damiana Scazzina, Brenda. Telómeros. - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
The Shortest Telomere, Not The Shortest Telomere, Not
Average Telomere Length, Is Average Telomere Length, Is
Critical for Cell ViabilityCritical for Cell Viability
and Chromosome Stabilityand Chromosome Stability
Michael T. Hemann, Margaret A. Strong,Ling-Yang Hao, and Carol W. Greider
Presentación: Cinalli, Alejandro
Holgado, María PíaSalvatierra, Damiana
Scazzina, Brenda
TelómerosTelómeros
• Son estructuras especializadas presentes en las terminaciones naturales de los cromosomas, que permiten la estabilidad cromosómica (Repetición TTAGGG)
• Mantienen su longitud por un equilibrio acortamiento-elongación.
¿Qué determina la pérdida de ¿Qué determina la pérdida de función telomérica?función telomérica?
En ausencia de telómeros con un
largo adecuado se observan fusiones
cromosómicas (final con final),
arresto del ciclo celular y apoptosis
en células germinales (infertilidad).
¿Qué dispara la respuesta ¿Qué dispara la respuesta celular?celular?
Dos hipótesis:
• El promedio de la longitud telomérica• El telómero más corto
OBJETIVOSOBJETIVOS
Determinar si la respuesta celular se
dispara por un promedio de longitud
telomérico bajo, o si se debe a la
presencia individual de telómeros
muy cortos.
Modelo animalModelo animal
• mTR = murine telomerase RNA (templado para la síntesis del telómero)
no presentan el RNA que sirve como templado
no tienen actividad telomerasa
Ratones mTR -/-
Inicialmente (G1) no presentan fenotipo, en generaciones más tardias (ej: G4) los telómeros son más cortos y hay eventos de fusión
Los telómeros cortos inician una rta celular en ratones mTR -/-
mTR-/- (G6)Telómeros cortos
mTR +/-X
mTR-/- (iF1) mTR+/- (iF1)
50% tel largos
50% tel cortos
TUNEL - TdT- mediated dUTP nick end labelling
ApoptosisDaño al DNA- roturas de cadenas por cortes con
endonucleasas
TdT transfiere dUTP biotinilado
Detección por streptoavidina-HRP
Incubación con DAB
mTR+/- y mTR-/- G3 no muestran infertilidad y sus niveles de apoptosis de
células germinales o fusión de cromosomas son los de un wild-type.
mTR-/- G6 es generalmente no fértil
•mTR-/- (iF1) presentó valores similares a los de un mTR-/- G6.
•mTR+/- (iF1) mostró los mismos resultados que un wild-type.
•Esto indica que el agregado de la telomerasa “rescató” a este fenotipo. Y que la respuesta celular
se debe a la presencia de telomeros cortos.
Elongación preferencial de Elongación preferencial de telómeros cortos en ratones telómeros cortos en ratones
mTR+/- (iF1)mTR+/- (iF1)
• Se comparó la distribución de longitudes de los telómeros de mTR+/- (iF1) y mTR-/- (iF1), con mTR+/-, mTR-/- G3 y mTR-/- G6 usando Q-FISH.
• La longitud del telómero esta representada como unidades teloméricas fluorescentes (TFUs).
• El resultado se expresó como distribución de frecuencias de TFUs.
Q-FISHQ-FISH
• Mide el largo individual de los telómeros
• Células arrestadas en metafase teñidas con
sonda fluorescente específica de telómeros.
• Tinción con DAPI para visualizar cromosomas.
• Medición cuantitativa de la señal fluorescente
para determinar largo de telómeros.
• Se ve un cambio significativo en el promedio entre mTR+/- y mTR-/- G3. Pero la diferencia fue mínima entre mTR -/- G3 y los mTR (iF1s).
• Entre mTR+/- (iF1) y mTR-/- (iF1) se vio una diferencia en el número de telomeros muy cortos.
• Esto mostraría que la función telomérica se restaura por la adición de repeticiones a los telómeros mas cortos y no por una elongación global.
La restitución de la actividad La restitución de la actividad de telomerasa ocurre de telomerasa ocurre
temprano en el desarrollotemprano en el desarrollo
Fibroblastos embrionarios (MEFs) de
ratones mTR -/- (iF1) y +/- (iF1) de
13,5 días de gestación.
% de terminaciones de telómeros sin
repeticiones teloméricas (signal
free ends)
Análisis citogenético:
número de fusiones por metafase
- Irradiar con Cs137 radiación beta y gamma- Medir % viabilidad con azul de tripan
Estudio de la sensibilidad a la radiación ionizante
La telomerasa restituye las La telomerasa restituye las repeticiones en los +/-repeticiones en los +/-
Probablemente la telomerasa sea dirigida específicamente a telómeros cortos y
disfuncionales
¿Reclutamiento por proteínas ausentes?
¿Reclutamiento por proteínas que reconocen telómeros disfuncionales?
Existe una distribución no Existe una distribución no azarosa de las fusiones entre azarosa de las fusiones entre cromosomas en una línea de cromosomas en una línea de
ratones mTR -/-ratones mTR -/-
• SKY (Spectral Karyotype- Cariotipo espectral en colores)
• Q-FISH(Quantitative fluorescence in situ hybridization)
SKYSKY
- Análisis de todos los cromosomas de un organismo simultáneamente, cada uno de ellos se encuentra marcado con un color diferente
- La discriminación por el color se consigue por medio del análisis espectral de las señales fluorescentes
- Se usan sondas de DNA fluorescentes que emiten entre los 200 y 700 nm
SKY – Fusión de cromosomas 19 por los brazos P
Tinción con DAPI (4',6-diamino-2-
phenylindole)
SKY (Spectrl Karyotype) en esplenocitos de mTR -/-
Cromosoma 19: 12 de 14
Cromosoma 5: 10 de 14
Cromosomas 3, 9, 10 e Y: sin eventos de fusión
Los cromosomas que frecuentemente están involucrados en fusiones son los
de telómeros más cortos
Metafases de mTR-/- G6 Q-FISH
Para determinar qué telómeros no emitían señal
SKYPara determinar la identidad
de los cromosomas
Los cromosomas que frecuentemente están involucrados en fusiones son los
de telómeros más cortos
Análisisestadístico
Un cromosoma con extremo libre de señal tiene mayor probabilidad de fusión que un cromosoma conteniendo repeticiones
teloméricas
Los cromosomas que frecuentemente están involucrados en fusiones son los
de telómeros más cortos
El telómero más corto es el más propenso a perder función y sufrir fusión con otro telómero
cortoEsto sugiere que es necesaria la presencia de dos
telómeros cortos para que se dé un evento de fusión en la célula
Estudios en células humanas
El telómero en 17p es
normalmente más corto que
los otros
El cromosoma 17 podría estar involucrado más frecuentemente en
rearreglos
La ubicación de p53 en 17p contribuiría a la frecuente pérdida de p53 en los tumores humanos
No hay secuencia telomérica presente en las uniones de la fusión en ratones
mTR-/- G5-G6
Repeticiones satélite
Repeticiones satélite
Repeticiones teloméricas
Estudios previos
No hay secuencia telomérica presente en las uniones de la fusión en ratones
mTR-/- G5-G6Clonado por PCR de la zona de la fusión
Wild-type mTR-/- G5-G6
No se generaron productos específicos
Se generaronproductos específicos
SecuenciaciónLa unión consistía en 2 pequeñas secuencias
satélite fusionadas directamente
No hay secuencia telomérica presente en las uniones de la fusión en ratones
mTR-/- G5-G6Ninguna unión mostró
secuencias de repetición telomérica
Todas mostraron secuenciasde microhomología
Características de eventos de fusióndados por mecanismos NHEJ
(non-homologous end joining)
No hay secuencia telomérica presente en las uniones de la fusión en ratones
mTR-/- G5-G6FISH
Sonda específica para repeticiones
satélite pequeñas de ratón
Todas las fusiones
mostraron una señal
disminuida en relación a satélites normales
Una línea independiente de ratones mTR -/- presenta diferentes telómeros
cortos y diferentes fusiones cromosómicas.
• Cada línea se establece por eventos al azar durante la fertilización inicial.
• La distribución de telómeros cortos vs las fusiones observadas no fue azarosa,
¿ocurre lo mismo en otras líneas?
Linea 2
El resultado es una distribución no azarosa de longitudes teloméricas respecto de las fusiones pero los
cromosomas cortos involucrados son distintos.
Las longitudes teloméricas en ratones wild-type no son
cromosoma específicas.
• SKY y Q-FISH: distribución de las longitudes teloméricas para cromosomas individuales.
• Análisis estadístico: comparación entre la distribución longitudes de cada telómero y las demás distribuciones para el resto de los cromosomas.
No hay ningún final cromosómico que tenga una distribución de longitudes teloméricas cortas más reproducible que otros
telómeros en ratones wild-type.
Conclusión:
• No es la longitud promedio de los
telómeros la que gatilla la respuesta
celular, sino la presencia de
telómeros individuales con longitudes
muy cortas.
•La presencia de telomerasa
rescata los fenotipos con
telómeros disfuncionales.
• El rol esencial de la telomerasa no
sería el mantenimiento del promedio
del largo de los telómeros, sino el
mantenimiento de la función de los
mismos, cuando alcanzan un largo
mínimo crítico.
• No hay telómeros que presenten
tendencia a ser más cortos, pero
sí los telómeros más cortos
originan fusiones cromosómicas
(final con final).