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Seminario de Guadalupe, diciembre 2004Seminario de Guadalupe, diciembre 2004Las Humanidades y el Patrimonio Cultural: Los Monumentos y la MeLas Humanidades y el Patrimonio Cultural: Los Monumentos y la Memoriamoria
CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTIFICAS
Métodos para el estudio de microorganismos en patrimonio
Juan M. GonzálezInstituto de Recursos Naturales y Agrobiología
Consejo Superior de Investigaciones CientíficasSevilla
Métodos para el estudio de microorganismos en patrimonio
Curso anterior (2006):
Que son los microorganismos, como crecen y otras características de interés
Muy pequeños
Son muchos
Muy diversos
En esta ocasión
Como podemos detectar y estudiar los microorganismos
El punto de partida es determinar que microorganismos participan en procesos de biodeterioro
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TTéécnicas avanzadas de diagncnicas avanzadas de diagnóóstico. Cesstico. Cesááreo reo SSááiziz
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Métodos para el estudio de microorganismos en patrimonio
I. Introducción
II. Métodos Moleculares
III. Resultados (13 Marzo)
Ecología y diversidad microbiana
Detección por cultivos
Otras técnicas
Pasos básicos
Técnicas empleadas y análisis
Cultivos vs. Técnicas moleculares
Apartados
Microscopía
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Métodos para el estudio de microorganismos en patrimonio
Recordemos que:
Son muy pequeños y están en todas partes
Muchos de ellos son desconocidos
Pueden presentar metabolismos muy diferentesAerobios, Anaerobios, Heterotrofos, Autotrofos, etc.
Microorganismos
Frecuentemente viven asociados
Existen muchos tipos diferentes de microorganismos
El biodeterioro dependeráde los microorganismos existentes
de las condiciones ambientales
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La diversidad más alta se observa entre los microorganismos
ArchaeaBacteria Eukarya
Euryarchaeota
Crenarchaeota
Animals
Fungi
Plants
Ciliates
Flagellates
Slimemolds
Entamoebae
Trichomonads
Diplomonads
Microsporidia
Termotogales
FlavobacteriaCyanobacteria
Purple bacteria
Gram positivebacteria
Green non-sulfurbacteria
Pyrodictium
HaloarchaeaMethanosarcina
Methanobacterium
ThermoproteusThermococales
Methanococcus
Diversidad Microbiana
Arbol universal de formas vivientes basado en secuencias de genes ARN ribosómicos
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Microscopía
Dibujos y microscopio
de Robert Hooke
Hongos
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Cianobacterias
Bacteria y ArchaeaHongos
Microalgas
10 µm
10 µm
Microscopía y Diversidad Microbiana
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Microscopía
Recuentos directosCámaras de recuento
(hemocitómetros o Hausser)
Recuentos directosSobre filtros
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Microscopía
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Microbiología clásica ⇒ cultivos
DilucionesMuestra
Most-Probable Number
(MPN)
Placa Petri
Incubación
Recuentos
Sólo detectamos células que somos capaces de cultivar
Cultivos de Microorganismos
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Cultivos de Microorganismos
Métodos de recuento en placa
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Cultivos de Microorganismos
Recuento de “Unidades Formadoras de Colonias” (CFU)
Recuentos totales por Microscopía
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Cultivos de Microorganismos
Cultivo de microorganismos anaerobios estrictos
Cámara de anaerobiosisCultivos anaeróbicos
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Cultivo y Aislamiento de microorganismos
Cultivos de Microorganismos
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Cultivos de Microorganismos
1. Detectar microorganismos (“CFU”)
2. Identificar esos microorganismos
(métodos moleculares)
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Cultivos vs. Técnicas Moleculares
Bacterias
cultivablesAmbiente
~1 %Suelos, monumentos
0.1-1 %Ríos y lagos
<0.1 %Mares
Bacterias totales
Número/ml
~108
~106-107
~0.5-1×106
Comparación de recuentos de microorganismos cultivables y totales
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Cultivos vs. Técnicas Moleculares
123
45
67
Técnicas Moleculares
(gen 16S rRNA)
Proteobacteria
ChloroflexiPlanctomycetes
Bacteroidetes
Acidobacteria
Actinobacteria
Técnicas
de cultivo
1234567
Proteobacteria
FirmicutesActinobacteria
Composición de comunidades microbianas de la cueva de Altamira (Cantabria)
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Técnicas Moleculares
Detección de microorganismos cultivables y no cultivables
El fragmento (gen) más utilizado: 16S (18S) rRNA
Universal
Varias copias en cada célula
Secuencia con alto valor filogenético
Buenas bases de datos
Permite fácil identificación
Técnicas moleculares no requieren cultivo de los microorganismos
Disponibilidad de primers y sondas específicas
Extracción de ADN Amplificación específica análisis
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Técnicas Moleculares
ADN
ARN
Proteinas
Información celular. Genoma
Información de los genes
Moléculas funcionales
Transcripción
Traducción
Los ácidos nucleicos (ADN) contienen la información de la célula.
Cuatro bases: Adenina (A), Citosina (C), Guanosina (G), and Timidina (T)
ADN, ARN y proteinas
Azul NRojo OBlanco CAmarillo P
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Técnicas Moleculares
1. Extracción de ADN
2. Amplificación de secuencias específicas de ADN
3. Procesar los fragmentos de ADN y “Fingerprints”
4. Identificar los fragmentos de ADN amplificados
Pasos básicos:
5. Otros análisis
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Técnicas Moleculares MuestraExtracción RNA
DNA
cDNA
DNA Amplificado
TranscripcióninversaAmplificación
por PCR
DGGE(“Fingerprint”)
Clonación(genotecas)Screening
Secuenciación
Comparación con bases de datos
Identificación de microorganismosTiempo
Protocolo
paso a paso
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Técnicas Moleculares
1. Extracción de ADN
2. Amplificación de secuencias específicas de ADN
3. Procesar los fragmentos de ADN y “Fingerprints”
4. Identificar los fragmentos de ADN amplificados
Pasos básicos:
5. Otros análisis
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Técnicas Moleculares
Muestra
Lisis celular
Extracción con fenol
Lisozima
Extracción con cloroformo
Precipitación con etanol
Disolución
Estimar la concentración de ADN
Detergentes
Proteasa
(1% Sodium Dodecyl Sulfate)
(OD at 260 nm)
(TE buffer, pH 8.0)
(2.5x vol. Ethanol 99% at –20ºC)
(24:1 Chloroform:isoamyl alcohol)
(tamponado pH 8.0)
(0.3-0.4 mg/ml, 37ºC 30 min)
(1.5 mg/ml, 50ºC 3 h)
Dos fases durante las extraccionescon fenol y cloroformo
Fase acuosacon el DNA
Fase inferior
(Suspender en TNE buffer, pH 8.0) Congelación/descongelación(3x)
Extracción de ADN. Método clásico
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Técnicas Moleculares
1. Extracción de ADN
2. Amplificación de secuencias específicas de ADN
3. Procesar los fragmentos de ADN y “Fingerprints”
4. Identificar los fragmentos de ADN amplificados
Pasos básicos:
5. Otros análisis
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Técnicas Moleculares
Objectivo:
Generar muchas copias de las secuencias de interés
Pares de primers para la amplificación del gen rRNA:
PCR o “Polymerase-chain reaction”
Bacteria:
Archaea:
27F AGA GTT TGA TCC TGG CCA G
1492R GGT TAC CTT GTT ACG ACT T
2OF TTC CGG TTG ATC CYG CCR G
1492R GGT TAC CTT GTT ACG ACT T
Eucariotas: 21F AAC CTG GTT GAT CCT GCC AGT
1392R ACG GGC GGT GTG TRC
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Técnicas Moleculares
Desnaturalización (95ºC)
Annealing(40-65ºC)
Extensión (72ºC)
25-35 ciclos
Multiples copias de lasecuencia específica
DNA (doble hebra)PCR
“Polymerase-chain reaction”
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Técnicas Moleculares
PCR o “Polymerase-chain reaction”
Componentes de la reacción
ADN molde
Tampón (Buffer)
MgCl2
Primer “Forward”
Primer “Reverse”
DNA polimerasa
H2O
10-100 ng
1x; pH 7.5-9.5
1.5 (1-5) mM
0.1-1 µM
0.1-1 µM
0.25-2 u.
1 µl
5 µl
0-5 µl
1 µl
1 µl
0.2-1 µl
hasta 50 µl
10 x
50 mM
20-50 µl
20-50 µl
1-5 u/µl
Componentes Concentración final Volumen Stocks
dNTPs 0.2 mM 1 µl 10 mM
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Técnicas Moleculares
El número de copias aumenta exponencialmente en cada ciclo
Copias = (Número de copias inicial)2 n
n = Número de ciclos
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Técnicas Moleculares
Examinando productos de PCR
Geles de agarosa (1% en 0.5x TAE)
Marcador detamaño
Productosde PCR
Unos 5 µl de la solución de amplificación + 1 µl solución de carga por pocillo
El ADN se tiñe con Bromuro de Etidio o SYBR Green I
Transiluminador
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Técnicas Moleculares
1. Extracción de ADN
2. Amplificación de secuencias específicas de ADN
3. Procesar los fragmentos de ADN y “Fingerprints”
4. Identificar los fragmentos de ADN amplificados
Pasos básicos:
5. Otros análisis
A. Perfiles de comunidades microbianas (Fingerprints). DGGE
B. Clonación
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Técnicas Moleculares
Visualizar la diversidad microbiana en la muestra
Existen diferentes técnicas:
Muy útil para comparar comunidades de distintas muestras
Util para seleccionar bandas características
DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)
TGGE (Temperature Gradient Gel Electrophoresis)
T-RFLP (Terminal Restriction Fragment Length Polymorphisms)
SSCP (Single Strand Conformational Polymorphisms)
Perfiles de comunidades microbianas (“Fingerprints”)
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Técnicas Moleculares
DGGE o “Denaturing Gradient Gel Electrophoresis”.
Separación en gradiente químico (urea y formamida)
Gra
dien
te
Un primer debe tener una cola rica en G y C
Pares de primers (16S):
Bacteria:
Archaea:
341F-GC cola GC + CCT ACG GGA GGC AGC AG
518R ATT ACC GCG GCT GCT GG
344F-GC cola GC + ACG GGG CGC AGC AGG CGC GA
518R
Cola GCFragmento de
DNA a amplificar
CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG G
Perfiles de comunidades microbianas (“Fingerprints”) por DGGE
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Técnicas Moleculares
Gra
dien
te
Gel de Agarosa DGGE
Perfiles de comunidades microbianas (“Fingerprints”) por DGGE
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Técnicas Moleculares
Unidad de electrophoresis para DGGE
Preparación de gelesPreparador de
gradientes
Cámara de
electroforesis
Fuente de alimentación
Transiluminador
Perfiles de comunidades microbianas (“Fingerprints”) por DGGE
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Técnicas Moleculares
Construcción de genotecas a partir de productos de PCR
Reacción de ligación
Fragmentos amplificados se insertan en un vector (plásmido)
Plásmido
Transformación. El plásmido se inserta en una célula huésped (E. coli)
Fragmento DNA
Célula de E. coli
Cada célula sólo contiene un plásmido sólo un fragmento amplificado
Purificación de plásmido y secuenciación
Limpieza de productos de PCR1.
2.
3.
5.
(Kits comerciales para purificación de productos de PCR)
(Kit comercial de purificación de plásmidos o por otros métodos) Ligación
Transformación
(Kit comercial TOPO-TA cloning kit; otras estrategias)
Screening genotecas. Selección de los clones a secuenciar4.
Construcción de genotecas
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Técnicas Moleculares
Purificación de plásmidos
Ligación (TA-TOPO kit)
Producto de PCR
Reacción:Vector de clonación
Incubación
5 min a temperatura ambiente
Producto de PCR
Buffer y Ligasa o Topoisomerasa
Transformar células de E.coli
y sembrar en placa (LB+Amp)
(Aproximadamente 1:30 h)
Incubar 12-24 h a 37ºC
Cultivo (una noche)
Unión a la
membrana
DNA plasmídico purificado
Resuspender
Lisar
Neutralizar
Lavado
Disolución
Vector de clonación
TA-TOPO
Clonación
Transformación
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Técnicas Moleculares
1. Extracción de ADN
2. Amplificación de secuencias específicas de ADN
3. Procesar los fragmentos de ADN y “Fingerprints”
4. Identificar los fragmentos de ADN amplificados
Pasos básicos:
5. Otros análisis
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Técnicas Moleculares
Servicios de secuenciación profesionales (ADN y 1 primer/reacción)
Electroferograma
Software: Chromas, EditView, Phred/Phrap, etc.
Ejemplo: http://www.technelysium.com.au/chromas.html
Identificación de los fragmentos de ADN amplificados
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Técnicas Moleculares
Edición de secuencias
Eliminar lectura inicial Eliminar lectura final
Si es posible, corregir las ‘N’
Eliminar la secuencia del vector (editor de texto)
Primer Vector Fragmento de DNA insertado Vector
Identificación de los fragmentos de ADN amplificados
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Técnicas Moleculares
En: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/
Búsqueda de secuencias similares en bases de datos: Algoritmo BLAST
Encontrar aquellas secuencias conocidas más cercanas a la nuestra
Guarda tus secuencias en formato “fasta” como texto
>Seq1. Description of the sequence and other information
TGGTTTTGGGTGGAAAGTTTTACGGCAATTCGGTCTGGGAA
GTGAGTAACACGTGAGTAACCTCCCCTGGA
>AY450613. Pseudomonas aeruginosa 16S ribosomal RNA GACGAACGCTGNCGGCGTGCTTAACACATACAAGTCGAACGATGAACCTGGAGCTTGCTCTGGGGGATTA GTGTCGAACGGGTGAGTAACACGTGAGTAACCTCCCCTGGACTCTGGGATAACCCCGAGAAATCGGAGCT AATACCGGATAGGACCTGGAACCGCATGGTTTTGGGTGGAAAGTTTTTTCGGTCTGGGATGGACTC
Sólo una línea
Secuencia
Identificación de los fragmentos de ADN amplificados
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Técnicas Moleculares
>gi|20429035|emb|AJ318041.1|MST318041 Nanoarchaeum equitans Kin4-M 16S rRNA gene,strain Kin4-M Length = 1500Score = 2974 bits (1500), Expect = 0.0Identities = 237/240 (99%) Gaps = 1/240Strand = Plus / Plus
Query: 1 actcccgttgatcctgcgggaggccaccgctatctccgtccggctaacccatggaaggcg 60 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct: 1 actcccgttgatcctgcgggaggccaccgctatctccgtccggctaacccatggaaggcg 60
Query: 61 agggtccccgggtaagggggcccgccgcacggctgagtaacacgtcggtaacctaccctc 120 |||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||| |||||||||
Sbjct: 61 agggtccccgggtaagggggcccgccgctcggctgagtaacacgtcggta-cctaccctc 120
Query: 121 gggacggggataaccccgggaaactggggctaatccccgataggggatgggtgctggaag 180 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||
Sbjct: 121 gggacggggataaccccgggaaactggggctaatcccagataggggatgggtgctggaag 180
Resultados:Sequences producing significant alignments: (bits) E Valuegi|20429035|emb|AJ318041.1|MST318041 Nanoarchaeum equitans ... 2974 0.0gi|18892044|gb|AE010139.1| Pyrococcus furiosus DSM 3638, se... 381 e-102gi|13435348|gb|AY017182.1| Pyrococcus sp. MZ14 16S ribosoma... 381 e-102gi|5457433|emb|AJ248283.1|CNSPAX01 Pyrococcus abyssi comple... 381 e-102gi|2982621|emb|Z70247.1|PSAL58516 Pyrococcus sp. 16S riboso... 381 e-102gi|2995286|emb|AJ225071.1|PAA225071 Pyrococcus abyssi ST549... 381 e-102
Porcentaje de similitud
Homologo más próximo
Secuencias
próximas
Alineamiento
Identificación de los fragmentos de ADN amplificados
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Técnicas Moleculares
1. Extracción de ADN
2. Amplificación de secuencias específicas de ADN
3. Procesar los fragmentos de ADN y “Fingerprints”
4. Identificar los fragmentos de ADN amplificados
Pasos básicos:
5. Otros análisis
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Técnicas Moleculares
0.1
66
100
100
9257
90
54
100
100100
99
8086
100
91
100
60
Arboles filogenéticos
0.01
D45052.
D45054.
D45053
D45056.
AB023359.
AB023356.
AF389342.
AB023357.
AB023358.X77447.
1345.
X77448.
D45061.
D45060.
100
96
75
100
0.1
99
744
8963
7589
Programas: ClustalW, Philip, ARB, treepuzzle, …
TTéécnicas avanzadas de diagncnicas avanzadas de diagnóóstico. Cesstico. Cesááreo reo SSááiziz
INSTITUTO DE RECURSOS NATURALES Y AGROBIOLOGIA, SEVILLA Y RED TEMATICA DEL CSIC DE PATRIMONIO HISTORICO Y CULTURAL
Métodos para el estudio de microorganismos en patrimonio
Técnicas Moleculares
FISH (Fluorescent In Situ Hybridization)
Utilización de sondas específicas marcadas fluorescentemente para detectar microorganismos
Microscopia de
contraste de fase
Células marcadas con
sondas fluorescentes
Identificación de células in situ
Fluorescently-labelled probe
CellDNA/RNA
5 µm 5 µm
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Métodos para el estudio de microorganismos en patrimonio
Técnicas Moleculares
Otras técnicas moleculares
Microarrays
Distintos procedimientos de amplificación
Genómica, proteómica, …
Muchos métodos y programas bioinformáticos
Hibridaciones (Northern, Southern, Western, …)
Ingeniería genética y expresión de genes recombinantes
PCR cuantitativo
Distintos tipos de PCR.
Amplificaciones con adaptadores y substracción
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Métodos para el estudio de microorganismos en patrimonio
Resultados
Métodos moleculares:
ADN Microorganismos presentes
ARN Microorganismos activos
Cultivos:
Conocer la capacidad metabólica y otras propiedades de
los microorganismos
Microscopía:
Enumeración y relaciones espaciales de los microorganismos
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Instituto de Recursos Naturales y AgrobiologíaCSIC, Sevilla
http://www.irnase.csic.es/~micro/
Juan M. González([email protected])