Interacción ácidos nucleicos-proteína

Sergio Iván Angles Falconi

DNA/RNA-proteínas

En el siglo 19, los científicos observaron microscópicamente los asociación deproteínas con cadenas de ADN en la célula. Desde entonces, los investigadores handemostrado a través de una variedad de ensayos in vitro e in vivo ensayos que lasproteínas interaccionan con el ADN y ARN para influir la estructura y la función delácido nucleico correspondiente. Elucidar los papeles que estos complejos proteína:ácido nucleico desempeñan en la regulación de la transcripción, la replicación del ADNtraducción, reparación y recombinación, y el procesamiento del ARN y la translocacióncontinúa revolucionando nuestra comprensión de la biología celular, normal eldesarrollo de células y los mecanismos de la enfermedad.

Un número de técnicas de laboratorio se han desarrollado

para estudiar estas complejas interacciones cada uno con una

historia única, variando en su utilidad, las fortalezas y

debilidades distintas.

Assays for Protein:DNA Interactions

DNA Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA)

DNA Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA)

•EMSA se utiliza para estudiar la unión de una proteína a una sonda de

oligonucletidos de ADN que se conoce.

• Se puede utilizar para evaluar la afinidad de la interacción.

•La detección de una interacción importante se basa en la movilidad más

lenta del complejo proteína: ADN sobre una molécula de ADN libre moléculas

sobre electroforesis en gel de agarosa o piliacrilamida no desnaturalizante.

DNA Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA)

• La adición de un anticuerpo contra la proteína target crea un

complejo aún mayor (anticuerpo: proteína: ADN) que migra más

lentamente. Este resultado se conoce como supershift y se utiliza para

confirmar la identidad de las proteínas.

•Antes de que EMSA fuera desarrollado, las interacciones proteína:

ADN Se han estudiado principalmente por ensayos en filtro de

nitrocelulosa utilizando marcado radiactivo de sondas.

DNA Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA)

Fortalezas:• detectar proteínas de unión al ADN de baja abundancia de lisados.• Test de afinidad de unión a través de análisis de ADN sonda mutacional• EMSA no radioactivo es posible usando biotina o sondas de ADN marcadas con fluorescencia

Limitaciones:• analiza las interacciones proteína: ADN in vitro• difícil de cuantificar• necesidad de realizar supershift con anticuerpos para confirmar la identidad de la proteína en un complejo.

Marcadores del DNA

• Radioisótopos Autoradiografía

• Fluorocromos fluorescencia

• Biotina quimioluminiscencia

32P fosfato. Barato, sensibilidad (≤10 -18 moles),y no introduce estructuras artificiales.

32PDNA/RNA

Competidores no específicos

• Acido nucleico no marcado usado como agente bloqueador en la reacción de unión para minimizar la unión de proteínas no especificas a el DNA marcado.

• Mas usados poly(dl.dC)

• DNA de esperma de salmón sonicado

Competidores específicos

• Importante control usado para verificar la especificidad de una banda resultante de la unión de proteínas a la sonda marcada.

• Secuencia idéntica a la sonda marcada ó

• Contiene secuencias de uniones conocidas a la proteína blanco.

• 200 moles de exceso son suficientes para competir

Utilidad EMSA

Caracterizar los mecanismos de regulación transcripcional de varios genes.

Caracterizar eventos transcripcionales conocidos para determinar el efectode diversos estímulos u otras proteínas que se requieren para llevar a cabola interacción

Identificar la unión proteínas implicadas en procesos dereplicación, recombinación y reparación.

o No puede identificar si son varias proteínas las que se unen al RNA/DNA

o No puede saberse con exactitud que proteína se une al DNA/RNA

Super Retardamiento

• El ensayo EMSA es lo suficientemente sensible como para añadir unanticuerpo específico que causa un “super-retardamiento” al unirse a laproteína que esta unida al DNA/RNA.

• La movilidad de el complejo; anticuerpo-proteína-RNA/DNA es mucho

menor a la de la proteína-RNA/DNA que sirve como control, y a la del

DNA/RNA libre.

Utilidad

Identificar particularmente la proteína que se esta uniendo al complejo DNA/RNA.

o Reconocer complejos de proteínas que se unen al DNA/RNA

o Conocer el peso molecular de las proteínas o de los complejos proteína/DNA-RNA

Entrecruzamiento (Crosslinking)

• Técnica para detectar el peso molecular del complejo RNA/DNA-proteína.

Cuando se forma el complejo y se irradia con luz UV, ocasiona la formación de enlaces covalentes entre pirimidinas y ciertos residuos de a.a que

están cercanos al DNA.

SDS page

• Por el SDS (sodium dodecyl sulfate)page, desnaturaliza y da carga negativa a lasproteínas revelando el peso molecular del complejoformado.

Pasos

1. Contacto proteína recombinante o pull de proteínas con DNA/RNA

2. Laser UV

3. Poner complejo en contacto con SDS

4. Correr electroforesis

Preparación de la muestra

Electrophoresis

Utilidad

Determinar el peso molecular de complejo formado

Medir la afinidad de DNA-proteína por constantes de unión

Cuantificar la cantidad de DNA que se une a proteínas especificas

Revelar complejos heteroméricos y cofactores envueltos en la unión.