metodos inmunologicos directos e indirectos

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sección de inmunología y hematóloga, material para universidades y facultad de medicina

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  • TEMA 14

    Mtodos inmunolgicos para laidentificacin microbiana

  • Tema 14. Mtodos inmunolgicos para la identificacin microbiana

    1. Introduccin2. Deteccin de antgenos

    2.1. Obtencin de anticuerpos2.2. Marcado de las inmunoglobulinas2.3. Tcnicas de deteccin

    2.3.1. Aglutinacin indirecta2.3.2. Inmunofluorescencia2.3.3. Enzimoinmunoanlisis (ELISA)

    3. Deteccin de anticuerpos3.1. Clases de antgenos3.2. Muestras de suero3.3. Pruebas serolgicas

    3.3.1. Aglutinacin directa3.3.2. Inmunofluorescencia3.3.3. Enzimoinmunoanlisis (ELISA)

  • 1. Introduccin

    Antgenos y anticuerpos son complementarios

    antgeno posible detectar anticuerpo especfico (suero)

    anticuerpo posible detectar antgeno especfico (muestra)

    Pruebas para deteccin de anticuerpos: pruebas serolgicas (suero)

    Reacciones inmunolgicas

    portaobjetos

    tubos convencionales (plsticoo vidrio) 12 x 100 mm

    placas de microtitulacin(micropocillos 8 mm y 12mm alto)

  • 2. Deteccin de antgenos

    Algunas de estas tcnicas son muy tiles para el diagnstico

    rpidas (confirmadas por otras)

    tcnicas de referencia (elevada eficacia)

    Muy tiles para identificacin de virus y clamidias (ms rpidas, sencillas, econmicas y sensibles que el cultivo) (algunas automatizadas)

    Se investiga un nico microorganismo en cada prueba (caro y laborioso)

    establecer cuidadosa evaluacin clnica del paciente

    solicitar la prueba para detectar microorganismo responsable (mayorprobabilidad)

  • AnticuerpoSitio deunin

    Antgeno

    Fragmento o regin Fc

    2.1. Obtencin de anticuerpos

    Anticuerpos

    policlonales (animales inmunizados)

    monoclonales (producidos in vitro)

    Todos los anticuerpos pueden fijarse a travs de su fragmento Fc a:

    base de un pocillo de plstico

    superficie de una membrana

    partculas inertes (ltex, gelatina, oro coloidal)

  • 2.2. Marcado de las inmunoglobulinas

    Inmunoglobulinas marcadas sirven para detectar antgenos y otros anticuerpos

    Marcado del fragmento Fc con:

    Enzimas (-galactosidasa, fosfatasaalcalina, peroxidasa de rbano)

    - actan sobre sustrato

    - transformacin en producto coloreado (o diferente color)

    Sustancias fluorescentes (isotiocianato de fluorescena, rodamina,umbeliferona, lantnidos)

    - producen luz cuando son excitadas por radiacin incidente

    Sustancias lumnicas (luminol, isoluminol, steres de acridina, adamantildioxietano)

    - producen luz (reaccin qumica, oxidacin, quimioluminiscencia)

  • 2.3. Tcnicas de deteccin

    Si el microorganismo buscado no est en la muestra

    los anticuerpos no se unen a l

    no se produce seal

    Si el microorganismo est presente en la muestra

    los anticuerpos se unen a l

    se producir el efecto o la seal correspondiente

    - aglutinacin

    - cambio de color del sustrato

    - fluorescencia

    - luz

  • 2.3.1. Aglutinacin indirecta

    Anticuerpos adheridos porregin Fc a:

    partculas grandes de ltex (poliestireno, 1-5 m)

    otras partculas inertes

    Facilita la observacin de la aglutinacin:

    formacin de grumos (degran tamao)

    Permite deteccin de antgenos solubles (polisacrido)

    Realizable sobre portaobjetos

  • 2.3.1. Aglutinacin indirecta

    Rpida (minutos)

    Generalmente menos sensible que enzimoinmunoanlisis

    Salvo excepciones no muy adecuada para detectar antgenos vricos (menorcantidad que bacterianos)

  • 2.3.2. Inmunofluorescencia

    Directa (IFD)

    Anticuerpos marcados con sustancias fluorescentes

    se fijan a los microorganismos

    Microscopio de fluorescencia

    microorganismo brillantesobre fondo oscuro

    Virus

    no pueden ser observados(pequeo tamao)

    se pueden detectar protenas vricas (producidas durante multiplicacin)

    - anticuerpos especficos para esas protenas

  • 2.3.2. Inmunofluorescencia

    Indirecta (IFI)

    Utiliza dos anticuerpos:

    - Primero

    no marcado

    se une al antgeno

    - Segundo

    dirigido contra el primero(anti-anticuerpo)

    est marcado

    permite revelar diferentesanticuerpos especficos no marcados

  • 2.3.2. Inmunofluorescencia

  • 2.3.3. Enzimoinmunoanlisis (ELISA)

    ELISA: enzyme linked immunosorbent assay

    Mtodo directo

    Anticuerpos fijados en base de pocillo de placa de microtitulacin o membrana de nitrocelulosa (especficos del antgeno buscado).

    Se aade muestra al pocillo: antgeno presente reaccin Ag - Ac

    Se aade segundo anticuerpo

    dirigido contra el antgeno

    marcado con enzima

  • 2.3.3. Enzimoinmunoanlisis (ELISA)

    Tcnica en pocillos

    Tcnica sobre nitrocelulosa

  • Antgeno diana

    Anticuerpo de fijacin(o de captura)

    Anticuerpode deteccin

    Anticuerpo anti-Igunido a enzima

    Productocoloreado

    Sustratoincoloro

    2.3.3. Enzimoinmunoanlisis (ELISA)

    Mtodo indirecto (sandwich)

    Anticuerpos (generalmente monoclonales) fijados en base de pocillo de placa demicrotitulacin o membrana de nitrocelulosa (especficos del antgeno buscado).

    Se aade muestra al pocillo

    antgeno presente reaccin Ag - Ac

    Se aade un segundo anticuerpo

    generalmente policlonal

    dirigido contra el antgeno

    Se aade un tercer anticuerpo

    dirigido contra el segundo anticuerpo

    marcado con enzima

  • Sustratosin color

    Productocoloreado

    Segundoanticuerpo(o tercero)

    Enzima

    2.3.3. Enzimoinmunoanlisis (ELISA)

    Se aade sustrato (incoloro)

    Acta enzima sobre sustrato

    Aparece color

    se puede medir intensidad(colormetro)

    Si no existe antgeno buscado

    no es retenido en el pocillo

    es eliminado mediante lavado

    al aadir sustrato no seproduce color

  • 3. Deteccin de anticuerpos

    Mtodo de diagnstico indirecto

    Detectan anticuerpos formados frente al microorganismo (en suero del paciente)

    Tcnicas semejantes a las descritas para la deteccin de antgenos

    La mayora permiten cuantificar los anticuerpos del suero

    3.1. Clases de antgenos

    Naturales

    microorganismos ntegros

    extractos antignicos (ms o menos purificados) obtenidos de ellos

    Recombinantes

    se obtienen por ingeniera gentica

  • 3.2. Muestras de suero

    Extraer sangre (5-10 mL)

    Dejarla coagular (temperatura ambiente, 20 minutos)

    Centrifugar 1.000-1.200 g, 10 minutos (separar el suero)

    Guardar suero 4-6C (una semana; -20C (aos, si se evita descongelar y congelarrepetidamente)

    3.3. Pruebas serolgicas

    Todos los resultados se refieren a anticuerpos totales

    Aglutinacin directa, inmunofluorescencia y enzimoinmunoanlisis (msutilizadas)

    3.3.1. Aglutinacin directa

    Portaobjetos, tubos de ensayo o placas de microtitulacin

    Antgeno (suspensin del microorganismo); si hay anticuerpos en el suero, se produce aglutinacin

  • 3.3.1. Aglutinacin directa

    Patrn caracterstico

    Tubo

    - sobrenadante transparente

    - formacin de muchosgrumos (al resuspenderel sedimento)

    Pocillos

    - sedimento amplio y granulado(reaccin positiva)

    - botn puntiforme central (reaccinnegativa)

    Permite la cuantificacin de anticuerposmediante el clculo del ttulo de anticuerpos

  • 3.3.2. Inmunofluorescencia

  • Sustrato sin color

    Producto coloreadoPocillo o membrana

    Antgeno

    Anticuerpo primario del paciente producidocontra el antgeno (microorganismo)

    Anticuerpo secundarioanti-anticuerpo del paciente

    Enzima

    3.3.3. Enzimoinmunoanlisis (ELISA)