CCM – 23/04/2015

Nathalie Cella

Métodos e estudo em

biologia celular e tecidual

PERGUNTASFERRAMENTAS

Perguntas de Biologia Celular

como as células formam um tecido?

como os tecidos formam órgãos?

Do que a célula é composta?

Por que/Como as células “adoecem”?

como as células se comunicam?

como as células interagem com o meio externo?

como as célula respondem a agressões?

como as células se diferenciam?

como as células se movimentam?

como o ovo (zigoto) se torna um organismo multicelular?

como as células proliferam?como as células crescem?

Qual é o aspecto de uma célula?

Theodor Schwann

Matthias Schleiden

Rudolf Virchow

https://www.youtube.com/watch?v=4OpBylwH9DU

História da Teoria Celular

ferramentas

• Imagem

• bioquímica

• Biologia molecular

• computacional

Microscopia óptica

Bright filed Phase contrast

Differencial-interference-contrast Dark field

Processamento de imagem

microscopia

óptica confocal

microscopia

óptica convencional

deconvolução

e imagem

Divisão de uma célula animal

https://www.youtube.com/watch?v=DD3IQknCEdc

Microscopia eletrônica (ME)

de transmissão

e

de varredura

Microcscopia eletrônica

Microscopia

óptica

ME

de

transmissãoME

de

varredura

Estereocílios de uma célula

do ouvido interno de um sapo

Flor de trigo

Alvéolo mamário

Célula de levedura

Imunogold

Como detectar diferentes

proteínas e mRNAs na célula?

ANTICORPOS

Imunização de animais

Figure 9-18 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

imunocitoquímica/imunohistoquímica

detecção de moléculas in situ

DAB

fluoresceína

diferentes marcadores

detecção de moléculas

na célula

Verde – proteína“V”

Vermelho – células proliferando

https://www.youtube.com/watch?v=-k2xmEUSKYk

localização da expressão

de genes diferentes

Detecção de mRNA

Dinâmica de proteínas por

microscopia óptica

https://www.youtube.com/watch?v=w0-7c8Ui84U

FRAPfluorescence recovery after photobleaching

https://www.youtube.com/watch?v=FbCHqk37yQ4

Estudo da estrutura e função da

proteína SHAKIRA

Como estudar esta proteína?

Shakira

Schlafen

“evidência correlativa”

supressão da

expressão de

Shakira

aumento da migração

aumento da proliferação

“Perda de função”

(exemplo)

Super-expressão

de Shakira

aumento da adesão

diminuição da proliferação

“ganho de função”

Pele

cérebro

Intestino

Pâncreas

glândula mamária

glândulas salivares

Expressão de Shakira

Reduzir para entender..

Cultura celular in vitro

Cultura celular (in vitro)

S

um determinado tecido

tem vários tipos celulares

SS

S

S

Anti-shakira

fluoróforo

Isolamento das células que

expressam Shakira

FACS

fluorescence activated cell sortercélulas que expressão

Shakira isoladas

Isolamento das células que expressam

Shakira

supressão da

expressão de

Shakira

Interferência de RNA (RNAi)

shakira

tubulina

Shakira tem alguma função na

proliferação celular?

Ensaio de incorporação de BrdU

Shakira tem alguma função na

proliferação celular?

Imunofluorescência

com anti-BrdU

Shakira tem alguma função na

migração celular?

time-lapse video-microscopy

https://www.youtube.com/watch?v=iFOus8ehxUc

Shakira tem alguma função na

migração celular?

Ensaio de “fechamento de ferida”

Shakira -controle

não é importante

na migração

Shakira -controle

é importante

na migração

Shakira -controle

células sem Shakira

“morrem”

E se as células isoladas não

expressarem Shakira?

Super-expressão

do gene que

codifica

Shakira

COMO ?

Clonagem de fragmentos de DNA

Propagação dos plasmídeos

Introdução de DNA em uma célula

Outras perguntas

• Há alteração da expressão gênica na

ausência de Shakira?

• Há alterações no ciclo celular?

• Há alterações na morfologia?

• Há alterações na função celular ?

• Como é animal sem Shakira (knockout)?

• Como é o animal com Shakira mutada?

• Que moléculas interagem com Shakira?

Gerando todo um organismo

geneticamente modificado (OGM)

Células-tronco embrionárias

DNA exógeno

células embrionárias com

uma cópia do DNA exógeno

Fêmea prenhe

embrião

injeção

das células

alteradas

embrião híbrido

transplante no útero

de fêmeas pseudo-prenhes

gene alterado nas gônadas

(ou seja, na linhagem germinativa)

X

F Manimais transgênicas

com 1 cópia do gene alterado

AT AT

X

AA AT AT TTanimal homozigoto

para o gene alterado

Caracterização do fenótipo resultante da

alteração de determinado gene

E se a alteração resultar em letalidade?

Mutações e deleções “tecido-específicas”

controle

knockout

Análise das células e tecidos por

microscopia

normal (“selvagem”)

alterados (mutantes

ou knockouts)

Alteração/ausência

de Shakira

resulta em letalidade

na embriogênese

Que proteínas interagem com

Shakira?

PCRpolymerase chain reaction

Biblioteca de cDNA

mRNA

Transcrição reversa

separação das fitas e

adição do segundo primer

Clonagem de fragmentos de DNA

Sistema duplo-híbrido em levedura

shakira

“isca”“presa”

proteína expressa

por um dos clones

genes recombinantes são

introduzidos em células de levedura

“isca”“presa” capturada

sítio de ativação

de trasncrição

transcrição de

gene reporter

Estudo da estrutura e função da

proteína SHAKIRA

Shakira altera a expressão de

outros genes?

Shakira + Shakira -

Genes sobre uma lâmina (DNA)

mRNA de células

Shakira -

mRNA de células

Shakira +

Microarrays de DNA

Análise dos genes alterados em

consequência da ausência de Shakira

ChIP - chromatin immunoprecipitation

Shakira atua diretamente na transcriçãod e genes?

Extração proteica

Fracionamento

celular

Figure 8-12 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

SDS-PAGESDS-polyacrylamide gel electrophresis

Detecção de proteínas no gel de

eletroforese

gel corado pelo

Coomassie blue

Western blot

Transferências das

proteínas do gel

para uma membrana

shakira

Imunodetecção (immunoblot)

2D-SDS-PAGE

2D-SDS-PAGE corado pelo Coommassie blue

Imunodetecção após 2D-SDS-PAGE

Há 4 tipos de Shakira!!!

Espectrometria de massa (MS)

• Ferramenta analítica para midir a massa de

uma molécula

• Determina a sequência de aminoácidos de

uma proteína

• Detecta alterações pós-traducionais

cristalografia de raio-Xdeterminação da estrutura tridimensional

MDALQLANSAFAVDLFKQLCEKEPLGNVLFSPICLSTSLSLAQVGAKGDTANEI

GQVLHFENVKDIPFGFQTVTSDVNKLSSFYSLKLIKRLYVDKSLNLSTEFISST

KRPYAKELETVDFKDKLEETKGQINNSIKDLTDGHFENILADNSVNDQTKILVV

NAAYFVGKWMKKFPESETKECPFRLNKTDTKPVQMMNMEATFCMGNIDSINCKI

IELPFQNKHLSMFILLPKDVEDESTGLEKIEKQLNSESLSQWTNPSTMANAKVK

LSIPKFKVEKMIDPKACLENLGLKHIFSEDTSDFSGMSETKGVALSNVIHKVCL

EITEDGGDSIEVPGARILQHKDELNADHPFIYIIRHNKTRNIIFFGKFCSP

Sequência de aa da Shakira

Três sítios de fosforilação em resíduos de tirosina (Y)

BLAST: Basic Local Alignment Search

NCBI - National Center for Biotechnology Information

Perguntas que o BLAST responde

• Que espécies de batérias têm uma proteína relacionada a uma certa

proteína cuja sequência de aminoácidos é conhecida?

• Que outros genes codificam proteínas com estrutura semelhante a uma

determinada estrutura de interesse?

• Que genes no homem se parecem com um determinado gene de

camundongo?

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1734/

Blast quickstart

Predição de sítios de fosforilação e

possíveis enzimas envolvidas

Predição de sinal de localização nuclear

Predição de outras alterações

pós-traducionais

MODELO de estudo

x

OBJETO de estudo

Modelos de estudo

vantagens e desvantagens

www.ibioseminars.org