métodos de purificação de proteínas - fcav.unesp.br · a 280 • a colorimetria é uma técnica...
TRANSCRIPT
![Page 1: Métodos de Purificação de Proteínas - fcav.unesp.br · A 280 • A colorimetria é uma técnica que avalia a capacidade dos solutos absorverem a luz em comprimentos de onda específicos](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081401/5bb13f9809d3f255638cd1d2/html5/thumbnails/1.jpg)
Disciplina de Engenharia de Proteínas
Curso de Ciências Biológicas
2º Semestre de 2018
Aula 2: Purificação de Proteínas
(revisão) e Determinação de Estruturas
(difração de raio-X)
Prof. Marcos Túlio de Oliveira [email protected]
Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias de Jaboticabal
Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”
![Page 2: Métodos de Purificação de Proteínas - fcav.unesp.br · A 280 • A colorimetria é uma técnica que avalia a capacidade dos solutos absorverem a luz em comprimentos de onda específicos](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081401/5bb13f9809d3f255638cd1d2/html5/thumbnails/2.jpg)
Trabalhando com Proteínas
• Compreensão sobre estrutura e função de proteínas proteínas individuais.
• Separadas de outras de forma pura considerando suas propriedades.
• Proteína pura essencial para que suas propriedades e atividades sejam determinadas.
![Page 3: Métodos de Purificação de Proteínas - fcav.unesp.br · A 280 • A colorimetria é uma técnica que avalia a capacidade dos solutos absorverem a luz em comprimentos de onda específicos](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081401/5bb13f9809d3f255638cd1d2/html5/thumbnails/3.jpg)
Análise de Proteínas
• Absorbância;
• Eletroforese em gel desnaturante;
• Western blot (imunoblot).
![Page 4: Métodos de Purificação de Proteínas - fcav.unesp.br · A 280 • A colorimetria é uma técnica que avalia a capacidade dos solutos absorverem a luz em comprimentos de onda específicos](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081401/5bb13f9809d3f255638cd1d2/html5/thumbnails/4.jpg)
A280
• A colorimetria é uma técnica que avalia a capacidade dos solutos absorverem a luz em comprimentos de onda específicos.
• A medida da luz absorvida permite interferir sobre a concentração de soluto em uma determinada solução ou material biológico.
![Page 5: Métodos de Purificação de Proteínas - fcav.unesp.br · A 280 • A colorimetria é uma técnica que avalia a capacidade dos solutos absorverem a luz em comprimentos de onda específicos](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081401/5bb13f9809d3f255638cd1d2/html5/thumbnails/5.jpg)
Métodos de Quantificação Proteica
Principais ensaios de quantificação de proteínas
Fonte: http://www.labome.com.br/method/Protein-Quantitation.html
![Page 6: Métodos de Purificação de Proteínas - fcav.unesp.br · A 280 • A colorimetria é uma técnica que avalia a capacidade dos solutos absorverem a luz em comprimentos de onda específicos](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081401/5bb13f9809d3f255638cd1d2/html5/thumbnails/6.jpg)
Eletroforese de Proteínas (SDS-PAGE)
• Eletroforese: separação com base na migração de proteínas carregadas em um campo elétrico.
• Não é utilizado para purificar proteínas porque afetam sua estrutura e a função.
![Page 7: Métodos de Purificação de Proteínas - fcav.unesp.br · A 280 • A colorimetria é uma técnica que avalia a capacidade dos solutos absorverem a luz em comprimentos de onda específicos](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081401/5bb13f9809d3f255638cd1d2/html5/thumbnails/7.jpg)
Eletroforese de Proteínas
• Géis de polímero de acrilamida - poliacrilamida.
• Migração afetada pela massa-carga e forma da proteína.
![Page 8: Métodos de Purificação de Proteínas - fcav.unesp.br · A 280 • A colorimetria é uma técnica que avalia a capacidade dos solutos absorverem a luz em comprimentos de onda específicos](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081401/5bb13f9809d3f255638cd1d2/html5/thumbnails/8.jpg)
Eletroforese de Proteínas
SDS-PAGE
• SDS (sodium dodecyl sulfate)
• 1 molécula de SDS para cada 2
resíduos de aminoácidos.
• Contribui com grande carga negativa.
• SDS desdobra parcialmente as proteínas, assumindo forma semelhantes.
![Page 9: Métodos de Purificação de Proteínas - fcav.unesp.br · A 280 • A colorimetria é uma técnica que avalia a capacidade dos solutos absorverem a luz em comprimentos de onda específicos](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081401/5bb13f9809d3f255638cd1d2/html5/thumbnails/9.jpg)
Eletroforese de Proteínas
• Método analítico: útil tanto para separar quanto para visualizar proteínas.
• Estimar rapidamente o número de diferentes proteínas presentes em uma amostra ou o grau de pureza.
• Permite determinação da
massa molecular
aproximada.
![Page 10: Métodos de Purificação de Proteínas - fcav.unesp.br · A 280 • A colorimetria é uma técnica que avalia a capacidade dos solutos absorverem a luz em comprimentos de onda específicos](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081401/5bb13f9809d3f255638cd1d2/html5/thumbnails/10.jpg)
Eletroforese de Proteínas
• Visualização com Coomassie ou Nitrato de Prata.
• Aproximação da massa
molecular para proteínas
desconhecidas.
![Page 11: Métodos de Purificação de Proteínas - fcav.unesp.br · A 280 • A colorimetria é uma técnica que avalia a capacidade dos solutos absorverem a luz em comprimentos de onda específicos](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081401/5bb13f9809d3f255638cd1d2/html5/thumbnails/11.jpg)
Western blot (imunoblot)
![Page 12: Métodos de Purificação de Proteínas - fcav.unesp.br · A 280 • A colorimetria é uma técnica que avalia a capacidade dos solutos absorverem a luz em comprimentos de onda específicos](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081401/5bb13f9809d3f255638cd1d2/html5/thumbnails/12.jpg)
Trabalhando com Proteínas
Como purificar uma proteína
Métodos clássicos
Diferença de propriedades das proteínas: carga,
tamanho, ligantes.
Métodos modernos
Clonagem de DNA, sequenciamento
genômico, proteínas recombinantes, etc.
![Page 13: Métodos de Purificação de Proteínas - fcav.unesp.br · A 280 • A colorimetria é uma técnica que avalia a capacidade dos solutos absorverem a luz em comprimentos de onda específicos](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081401/5bb13f9809d3f255638cd1d2/html5/thumbnails/13.jpg)
Trabalhando com Proteínas
• Proteína nova precedentes estabelecidos e bom senso.
• Mais de um método de purificação utilizado.
• Escolha do método: empírico.
• Levar em consideração métodos descritos para proteínas semelhantes.
• Iniciar com métodos de baixo custo.
![Page 14: Métodos de Purificação de Proteínas - fcav.unesp.br · A 280 • A colorimetria é uma técnica que avalia a capacidade dos solutos absorverem a luz em comprimentos de onda específicos](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081401/5bb13f9809d3f255638cd1d2/html5/thumbnails/14.jpg)
Purificação Proteica: Fonte Proteica
![Page 15: Métodos de Purificação de Proteínas - fcav.unesp.br · A 280 • A colorimetria é uma técnica que avalia a capacidade dos solutos absorverem a luz em comprimentos de onda específicos](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081401/5bb13f9809d3f255638cd1d2/html5/thumbnails/15.jpg)
Estratégia Geral para Obtenção da
Proteína Purificada
• Extração Isolamento
1. Material de Partida ------ Extrato Bruto
2. Desintegração celular
Fracionamento
•Solubilidade
•Tamanho
•Carga
•Afinidade Ligação
Separação
Diálise
Ultra filtração
Coluna Cromatografica
![Page 16: Métodos de Purificação de Proteínas - fcav.unesp.br · A 280 • A colorimetria é uma técnica que avalia a capacidade dos solutos absorverem a luz em comprimentos de onda específicos](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081401/5bb13f9809d3f255638cd1d2/html5/thumbnails/16.jpg)
Purificação Proteica: Isolamento
Extrato Bruto
![Page 17: Métodos de Purificação de Proteínas - fcav.unesp.br · A 280 • A colorimetria é uma técnica que avalia a capacidade dos solutos absorverem a luz em comprimentos de onda específicos](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081401/5bb13f9809d3f255638cd1d2/html5/thumbnails/17.jpg)
![Page 18: Métodos de Purificação de Proteínas - fcav.unesp.br · A 280 • A colorimetria é uma técnica que avalia a capacidade dos solutos absorverem a luz em comprimentos de onda específicos](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081401/5bb13f9809d3f255638cd1d2/html5/thumbnails/18.jpg)
Métodos Cromatográficos
• Poderoso método de fracionamento.
• Diferença de tamanho, carga, afinidade de ligação e outros.
• Velocidade da migração depende da propriedade da proteína.
Cromatografia em Coluna
![Page 19: Métodos de Purificação de Proteínas - fcav.unesp.br · A 280 • A colorimetria é uma técnica que avalia a capacidade dos solutos absorverem a luz em comprimentos de onda específicos](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081401/5bb13f9809d3f255638cd1d2/html5/thumbnails/19.jpg)
Lehninger, 6ª ed. 2010
![Page 20: Métodos de Purificação de Proteínas - fcav.unesp.br · A 280 • A colorimetria é uma técnica que avalia a capacidade dos solutos absorverem a luz em comprimentos de onda específicos](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081401/5bb13f9809d3f255638cd1d2/html5/thumbnails/20.jpg)
Métodos Cromatográficos
Tipos de Cromatografia em Coluna:
o Troca Iônica (Aniônica e Catiônica);
o Gel-filtração ou Exclusão por tamanho;
o Afinidade;
o Cromatografia Líquida de Alta Performance (HPLC).
![Page 21: Métodos de Purificação de Proteínas - fcav.unesp.br · A 280 • A colorimetria é uma técnica que avalia a capacidade dos solutos absorverem a luz em comprimentos de onda específicos](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081401/5bb13f9809d3f255638cd1d2/html5/thumbnails/21.jpg)
![Page 22: Métodos de Purificação de Proteínas - fcav.unesp.br · A 280 • A colorimetria é uma técnica que avalia a capacidade dos solutos absorverem a luz em comprimentos de onda específicos](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081401/5bb13f9809d3f255638cd1d2/html5/thumbnails/22.jpg)
![Page 23: Métodos de Purificação de Proteínas - fcav.unesp.br · A 280 • A colorimetria é uma técnica que avalia a capacidade dos solutos absorverem a luz em comprimentos de onda específicos](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081401/5bb13f9809d3f255638cd1d2/html5/thumbnails/23.jpg)
![Page 24: Métodos de Purificação de Proteínas - fcav.unesp.br · A 280 • A colorimetria é uma técnica que avalia a capacidade dos solutos absorverem a luz em comprimentos de onda específicos](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081401/5bb13f9809d3f255638cd1d2/html5/thumbnails/24.jpg)
Blue-Sepharose
C+ Ind S FT W1
0.25 M NaSCN Gradient 0.4-1.2 M NaSCN 1.5 M NaSCN
Fosfocelulose
S FT W1 W2
Gradient 60-100 mM KPO4 150 mM KPO4
1 2 3 4
![Page 25: Métodos de Purificação de Proteínas - fcav.unesp.br · A 280 • A colorimetria é uma técnica que avalia a capacidade dos solutos absorverem a luz em comprimentos de onda específicos](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081401/5bb13f9809d3f255638cd1d2/html5/thumbnails/25.jpg)
Coloração com Prata
Yuxun Wang et al. J. Biol. Chem. 1997;272:13640-13646
©1997 by American Society for Biochemistry and Molecular Biology
Western Blot
![Page 26: Métodos de Purificação de Proteínas - fcav.unesp.br · A 280 • A colorimetria é uma técnica que avalia a capacidade dos solutos absorverem a luz em comprimentos de onda específicos](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081401/5bb13f9809d3f255638cd1d2/html5/thumbnails/26.jpg)
Proteínas Recombinantes
![Page 27: Métodos de Purificação de Proteínas - fcav.unesp.br · A 280 • A colorimetria é uma técnica que avalia a capacidade dos solutos absorverem a luz em comprimentos de onda específicos](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081401/5bb13f9809d3f255638cd1d2/html5/thumbnails/27.jpg)
Cromatografia de Afinidade
![Page 28: Métodos de Purificação de Proteínas - fcav.unesp.br · A 280 • A colorimetria é uma técnica que avalia a capacidade dos solutos absorverem a luz em comprimentos de onda específicos](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081401/5bb13f9809d3f255638cd1d2/html5/thumbnails/28.jpg)
Fonte:V. Gaberc-Porekar, V. Menartr, 2001.
![Page 29: Métodos de Purificação de Proteínas - fcav.unesp.br · A 280 • A colorimetria é uma técnica que avalia a capacidade dos solutos absorverem a luz em comprimentos de onda específicos](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081401/5bb13f9809d3f255638cd1d2/html5/thumbnails/29.jpg)
Cromatografia de Afinidade – Ni-NTA
![Page 30: Métodos de Purificação de Proteínas - fcav.unesp.br · A 280 • A colorimetria é uma técnica que avalia a capacidade dos solutos absorverem a luz em comprimentos de onda específicos](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081401/5bb13f9809d3f255638cd1d2/html5/thumbnails/30.jpg)
Cromatografia de Afinidade – Ni-NTA
![Page 31: Métodos de Purificação de Proteínas - fcav.unesp.br · A 280 • A colorimetria é uma técnica que avalia a capacidade dos solutos absorverem a luz em comprimentos de onda específicos](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081401/5bb13f9809d3f255638cd1d2/html5/thumbnails/31.jpg)
Cromatografia de Afinidade – Ni-NTA
Coloração com
Coomassie Blue Western Blot
![Page 32: Métodos de Purificação de Proteínas - fcav.unesp.br · A 280 • A colorimetria é uma técnica que avalia a capacidade dos solutos absorverem a luz em comprimentos de onda específicos](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081401/5bb13f9809d3f255638cd1d2/html5/thumbnails/32.jpg)
Cromatografia de Afinidade – Ni-NTA
Coloração com
Coomassie Blue Western Blot
Anticorpos que
reconhecem
Poli-histidina!!!
![Page 33: Métodos de Purificação de Proteínas - fcav.unesp.br · A 280 • A colorimetria é uma técnica que avalia a capacidade dos solutos absorverem a luz em comprimentos de onda específicos](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081401/5bb13f9809d3f255638cd1d2/html5/thumbnails/33.jpg)
Como produzir a proteína contendo
a cauda de poli-histidina?
![Page 34: Métodos de Purificação de Proteínas - fcav.unesp.br · A 280 • A colorimetria é uma técnica que avalia a capacidade dos solutos absorverem a luz em comprimentos de onda específicos](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081401/5bb13f9809d3f255638cd1d2/html5/thumbnails/34.jpg)
![Page 35: Métodos de Purificação de Proteínas - fcav.unesp.br · A 280 • A colorimetria é uma técnica que avalia a capacidade dos solutos absorverem a luz em comprimentos de onda específicos](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081401/5bb13f9809d3f255638cd1d2/html5/thumbnails/35.jpg)
Sistemas de Expressão
![Page 36: Métodos de Purificação de Proteínas - fcav.unesp.br · A 280 • A colorimetria é uma técnica que avalia a capacidade dos solutos absorverem a luz em comprimentos de onda específicos](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081401/5bb13f9809d3f255638cd1d2/html5/thumbnails/36.jpg)
Representação Esquemática de um Vetor
de Expressão Procariótico
Fonte: Hanning e Makrides, 1998.
![Page 37: Métodos de Purificação de Proteínas - fcav.unesp.br · A 280 • A colorimetria é uma técnica que avalia a capacidade dos solutos absorverem a luz em comprimentos de onda específicos](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081401/5bb13f9809d3f255638cd1d2/html5/thumbnails/37.jpg)
Representação Esquemática de um Vetor
de Expressão Procariótico
Fonte: Hanning e Makrides, 1998.
![Page 38: Métodos de Purificação de Proteínas - fcav.unesp.br · A 280 • A colorimetria é uma técnica que avalia a capacidade dos solutos absorverem a luz em comprimentos de onda específicos](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081401/5bb13f9809d3f255638cd1d2/html5/thumbnails/38.jpg)
Representação Esquemática de um Vetor
de Expressão Procariótico
Fonte: Hanning e Makrides, 1998.
6 códons para His (CAT ou CAC)
ou
![Page 39: Métodos de Purificação de Proteínas - fcav.unesp.br · A 280 • A colorimetria é uma técnica que avalia a capacidade dos solutos absorverem a luz em comprimentos de onda específicos](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081401/5bb13f9809d3f255638cd1d2/html5/thumbnails/39.jpg)
Inclusão dos códons de His
![Page 40: Métodos de Purificação de Proteínas - fcav.unesp.br · A 280 • A colorimetria é uma técnica que avalia a capacidade dos solutos absorverem a luz em comprimentos de onda específicos](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081401/5bb13f9809d3f255638cd1d2/html5/thumbnails/40.jpg)
Representação Esquemática de um Vetor
de Expressão para Células Sf9
![Page 41: Métodos de Purificação de Proteínas - fcav.unesp.br · A 280 • A colorimetria é uma técnica que avalia a capacidade dos solutos absorverem a luz em comprimentos de onda específicos](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081401/5bb13f9809d3f255638cd1d2/html5/thumbnails/41.jpg)
Representação Esquemática de um Vetor
de Expressão para Células Sf9
![Page 42: Métodos de Purificação de Proteínas - fcav.unesp.br · A 280 • A colorimetria é uma técnica que avalia a capacidade dos solutos absorverem a luz em comprimentos de onda específicos](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081401/5bb13f9809d3f255638cd1d2/html5/thumbnails/42.jpg)
Representação Esquemática – Vetor de
Expressão para Células Humanas
![Page 43: Métodos de Purificação de Proteínas - fcav.unesp.br · A 280 • A colorimetria é uma técnica que avalia a capacidade dos solutos absorverem a luz em comprimentos de onda específicos](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081401/5bb13f9809d3f255638cd1d2/html5/thumbnails/43.jpg)
Tags de Fusão de Proteína Comuns
![Page 44: Métodos de Purificação de Proteínas - fcav.unesp.br · A 280 • A colorimetria é uma técnica que avalia a capacidade dos solutos absorverem a luz em comprimentos de onda específicos](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081401/5bb13f9809d3f255638cd1d2/html5/thumbnails/44.jpg)
Proteínas Recombinantes então
resolvem dois problemas comuns da
purificação de proteínas nativas:
1 - Abundância
2 - Especificidade pela Coluna
Cromatográfica
![Page 45: Métodos de Purificação de Proteínas - fcav.unesp.br · A 280 • A colorimetria é uma técnica que avalia a capacidade dos solutos absorverem a luz em comprimentos de onda específicos](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081401/5bb13f9809d3f255638cd1d2/html5/thumbnails/45.jpg)
Exemplo: a DNA polymerase γ de
Drosophila melanogaster
Nativa Recombinante
Expressão em Sf9
Extrato Celular
Coluna de Fosfocelulose
Precipitação com (NH4)2SO4
Sedimentação em Gradiente de Glicerol
Coluna de Ni-NTA
Quilos de ovos de D. melanogaster
Centrifugação diferencial
Coluna de Fosfocelulose
Precipitação com (NH4)2SO4
Sedimentação em Gradiente de Glicerol
Coluna de DNA-celulose
Extrato Celular Coluna de Octil-sefarose
Coluna de Blue-agarose
![Page 46: Métodos de Purificação de Proteínas - fcav.unesp.br · A 280 • A colorimetria é uma técnica que avalia a capacidade dos solutos absorverem a luz em comprimentos de onda específicos](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081401/5bb13f9809d3f255638cd1d2/html5/thumbnails/46.jpg)
Exemplo: a DNA polymerase γ de
Drosophila melanogaster
Nativa vs
Recombinante
![Page 47: Métodos de Purificação de Proteínas - fcav.unesp.br · A 280 • A colorimetria é uma técnica que avalia a capacidade dos solutos absorverem a luz em comprimentos de onda específicos](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081401/5bb13f9809d3f255638cd1d2/html5/thumbnails/47.jpg)
Determinação da Estrutura Tridimensional de Proteínas por
Difração de Raios-X
![Page 48: Métodos de Purificação de Proteínas - fcav.unesp.br · A 280 • A colorimetria é uma técnica que avalia a capacidade dos solutos absorverem a luz em comprimentos de onda específicos](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081401/5bb13f9809d3f255638cd1d2/html5/thumbnails/48.jpg)
Níveis estruturais das proteínas
Fonte: Lehninger, 2010. 5ªed.
![Page 49: Métodos de Purificação de Proteínas - fcav.unesp.br · A 280 • A colorimetria é uma técnica que avalia a capacidade dos solutos absorverem a luz em comprimentos de onda específicos](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081401/5bb13f9809d3f255638cd1d2/html5/thumbnails/49.jpg)
Estrutura proteica
• A conformação tridimensional (3D) depende da sequência de aminoácidos
• A função depende da estrutura
• Cada proteína existe em um ou em pequeno número de formas estruturalmente estáveis
• As principais forças para a estabilização de estruturas são forças não-covalentes
![Page 50: Métodos de Purificação de Proteínas - fcav.unesp.br · A 280 • A colorimetria é uma técnica que avalia a capacidade dos solutos absorverem a luz em comprimentos de onda específicos](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081401/5bb13f9809d3f255638cd1d2/html5/thumbnails/50.jpg)
Estrutura tridimensional
• Arranjo espacial de todos os átomos de uma proteína conformação
• As conformações possíveis de uma proteína incluem qualquer estado estrutural que ela possa assumir sem a quebra das ligações covalentes.
• Porém, poucas são as conformações nativas.
• Algumas proteínas são formadas por mais de um complexo polipeptídico (quaternária)
![Page 51: Métodos de Purificação de Proteínas - fcav.unesp.br · A 280 • A colorimetria é uma técnica que avalia a capacidade dos solutos absorverem a luz em comprimentos de onda específicos](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081401/5bb13f9809d3f255638cd1d2/html5/thumbnails/51.jpg)
Determinação da estrutura
tridimensional proteica
• O primeiro passo para o estudo sobre as propriedades de um composto orgânico é a determinação de suas estruturas cristalinas.
• Diversas propriedades estão intimamente ligadas à maneira como os átomos estão dispostos pela molécula.
![Page 52: Métodos de Purificação de Proteínas - fcav.unesp.br · A 280 • A colorimetria é uma técnica que avalia a capacidade dos solutos absorverem a luz em comprimentos de onda específicos](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081401/5bb13f9809d3f255638cd1d2/html5/thumbnails/52.jpg)
Mas...o que são cristais?
• Cristais são arranjos atômicos ou moleculares cuja estrutura se repete numa forma periódica tridimensional.
• Exemplo: NaCl, cuja estrutura consiste em átomos de Sódio e Cloro dispostos de forma que um átomo de sódio terá sempre átomos de cloro como vizinhos e vice-versa.
![Page 53: Métodos de Purificação de Proteínas - fcav.unesp.br · A 280 • A colorimetria é uma técnica que avalia a capacidade dos solutos absorverem a luz em comprimentos de onda específicos](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081401/5bb13f9809d3f255638cd1d2/html5/thumbnails/53.jpg)
Sólidos cristalinos
• Formas regulares e simétricas assim como a ordenação das partículas que os formam.
![Page 54: Métodos de Purificação de Proteínas - fcav.unesp.br · A 280 • A colorimetria é uma técnica que avalia a capacidade dos solutos absorverem a luz em comprimentos de onda específicos](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081401/5bb13f9809d3f255638cd1d2/html5/thumbnails/54.jpg)
Como observar os cristais?
• O estudo da estrutura cristalina não é possível através da microscopia óptica.
• Os microscópios ópticos possuem uma limitação
física, ditada pelo comprimento de onda da luz visível.
![Page 55: Métodos de Purificação de Proteínas - fcav.unesp.br · A 280 • A colorimetria é uma técnica que avalia a capacidade dos solutos absorverem a luz em comprimentos de onda específicos](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081401/5bb13f9809d3f255638cd1d2/html5/thumbnails/55.jpg)
Como observar os cristais?
• Para resolver objetos tão pequenos quanto proteínas, precisamos usar raios X, que possuem comprimentos de onda na faixa de 0,7 a 1,5 Å (0,07 a 0,15 nm).
![Page 56: Métodos de Purificação de Proteínas - fcav.unesp.br · A 280 • A colorimetria é uma técnica que avalia a capacidade dos solutos absorverem a luz em comprimentos de onda específicos](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081401/5bb13f9809d3f255638cd1d2/html5/thumbnails/56.jpg)
Cristalografia de raios-x
• Uma das técnicas mais conhecidas para a determinação dos padrões de uma estrutura é cristalografia por difração de raios-X.
• O primeiro passo é obter proteína com alto grau de pureza!!!
• Segundo, obter cristais!!!
![Page 57: Métodos de Purificação de Proteínas - fcav.unesp.br · A 280 • A colorimetria é uma técnica que avalia a capacidade dos solutos absorverem a luz em comprimentos de onda específicos](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081401/5bb13f9809d3f255638cd1d2/html5/thumbnails/57.jpg)
Cristalografia de raios-x
![Page 58: Métodos de Purificação de Proteínas - fcav.unesp.br · A 280 • A colorimetria é uma técnica que avalia a capacidade dos solutos absorverem a luz em comprimentos de onda específicos](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081401/5bb13f9809d3f255638cd1d2/html5/thumbnails/58.jpg)
Cristalografia de raios-x
• Raio X incide no cristal, onde parte de sua energia é absorvida e reemitida em todas as direções (cada átomo se torna uma fonte secundária de raios X);
![Page 59: Métodos de Purificação de Proteínas - fcav.unesp.br · A 280 • A colorimetria é uma técnica que avalia a capacidade dos solutos absorverem a luz em comprimentos de onda específicos](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081401/5bb13f9809d3f255638cd1d2/html5/thumbnails/59.jpg)
Padrão de difração dos raios x
Fonte: Paula Kuser Falcão.
![Page 60: Métodos de Purificação de Proteínas - fcav.unesp.br · A 280 • A colorimetria é uma técnica que avalia a capacidade dos solutos absorverem a luz em comprimentos de onda específicos](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081401/5bb13f9809d3f255638cd1d2/html5/thumbnails/60.jpg)
Cristalografia de raios-x
• Não há lentes que reagrupem os raios X para formar a imagem.
• Ao invés disso, o padrão de difração dos raios X é coletado diretamente e a imagem é reconstruída por técnicas matemáticas.
![Page 61: Métodos de Purificação de Proteínas - fcav.unesp.br · A 280 • A colorimetria é uma técnica que avalia a capacidade dos solutos absorverem a luz em comprimentos de onda específicos](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081401/5bb13f9809d3f255638cd1d2/html5/thumbnails/61.jpg)
Cristalografia de raios-x
• A difração de raios-X aplicada à análise de cristais de macromoléculas biológicas tem influenciado a bioquímica estrutural, tendo contribuído para o conhecimento da estrutura 3D de proteínas, ácidos nucleicos, vírus e outras macromoléculas.
![Page 62: Métodos de Purificação de Proteínas - fcav.unesp.br · A 280 • A colorimetria é uma técnica que avalia a capacidade dos solutos absorverem a luz em comprimentos de onda específicos](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081401/5bb13f9809d3f255638cd1d2/html5/thumbnails/62.jpg)
Padrão de difração dos raios x
![Page 63: Métodos de Purificação de Proteínas - fcav.unesp.br · A 280 • A colorimetria é uma técnica que avalia a capacidade dos solutos absorverem a luz em comprimentos de onda específicos](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081401/5bb13f9809d3f255638cd1d2/html5/thumbnails/63.jpg)
Cristalografia de raios-x
• A quantidade de informação obtida em uma cristalografia por raios X depende do grau de organização estrutural da amostra.
• Informações da estrutura 3D detalhadas precisam de cristais proteicos altamente ordenados.
• Dificuldade em cristalizar várias proteínas.
![Page 64: Métodos de Purificação de Proteínas - fcav.unesp.br · A 280 • A colorimetria é uma técnica que avalia a capacidade dos solutos absorverem a luz em comprimentos de onda específicos](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081401/5bb13f9809d3f255638cd1d2/html5/thumbnails/64.jpg)
Cristalografia de raios-x
• O ambiente físico em um cristal não é idêntico ao em solução ou na célula viva.
• Poucas informações são fornecidas em termos de movimentos moleculares no interior da proteína.
![Page 65: Métodos de Purificação de Proteínas - fcav.unesp.br · A 280 • A colorimetria é uma técnica que avalia a capacidade dos solutos absorverem a luz em comprimentos de onda específicos](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081401/5bb13f9809d3f255638cd1d2/html5/thumbnails/65.jpg)
A partir da cristalografia de raios-x, é
possível...
• Compreender melhor os princípios básicos da arquitetura proteica;
• Estudar em nível atômico os centros catalíticos de enzimas;
• Compreender a especificidade das reações que as enzimas catalisam;
• Compreender a relação existente entre sequencia primária, estrutura e função.
![Page 66: Métodos de Purificação de Proteínas - fcav.unesp.br · A 280 • A colorimetria é uma técnica que avalia a capacidade dos solutos absorverem a luz em comprimentos de onda específicos](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081401/5bb13f9809d3f255638cd1d2/html5/thumbnails/66.jpg)
ESQUEMA DA DETERMINAÇÃO DA ESTRUTURA 3D DE PROTEÍNAS
![Page 67: Métodos de Purificação de Proteínas - fcav.unesp.br · A 280 • A colorimetria é uma técnica que avalia a capacidade dos solutos absorverem a luz em comprimentos de onda específicos](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081401/5bb13f9809d3f255638cd1d2/html5/thumbnails/67.jpg)
Exemplo de proteínas cristalizadas
Fonte: Paula Kuser Falcão.
![Page 68: Métodos de Purificação de Proteínas - fcav.unesp.br · A 280 • A colorimetria é uma técnica que avalia a capacidade dos solutos absorverem a luz em comprimentos de onda específicos](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081401/5bb13f9809d3f255638cd1d2/html5/thumbnails/68.jpg)
Oliveira et al. 2015. Genome Biol Evol.
![Page 69: Métodos de Purificação de Proteínas - fcav.unesp.br · A 280 • A colorimetria é uma técnica que avalia a capacidade dos solutos absorverem a luz em comprimentos de onda específicos](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022081401/5bb13f9809d3f255638cd1d2/html5/thumbnails/69.jpg)
Disciplina de Engenharia de Proteínas
Curso de Ciências Biológicas
2º Semestre de 2018
Próxima aula 21/08: Prática – Entendendo Cristalografia
e Visualizando Estruturas Proteicas