métodos de estudio en biología celular1
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Primera ClaseTRANSCRIPT
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OBJETIVOSDescribir los fundamentos de las siguientes metodologías:
Identificar las utilidades de cada una, evaluando su grado de complejidad
- microscopía óptica y electrónica
- centrifugación total y fraccionada - ultracentrifugación
Bibliografía: H. Curtis, B. Alberts
- cultivos celulares
- electroforesis
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‘micros’ = pequeño
‘scopein’ = ver
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Kepler1611
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SimpleUtilizan una sola lente (lupas)
Compuesto
Utilizan dos sistemas de lentes
ocular objetivo
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LUPA La lente se sitúa entre el ojo y el objeto
Aumenta el ángulo visual 4 a 60 aumentos
Aumento
Cantidad de veces que se ve mayor el objeto
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0,1 a 0,2 mm
Resolución
Capacidad de percibir dos puntos de una muestra separadamente (criterio Rayleigh)
Identifica objetos que estén separados al menos 100 micrones
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Óptica
Electrónica
Transmisión (TEM)
Barrido (SEM)
Campo claro
Campo oscuro
Contraste de fase
Fluorescencia
Aportan información descriptiva y estructural
Confocal
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Microscopio óptico
Campo claro
Campo oscuro
Contraste de fase
Fluorescencia
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Microscopio electrónico de transmisión
TEM
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SEM
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Microscopía Laser Confocal
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SEM Aumenta 10X sobre MO
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TEM
Aumento de 1000 x sobre MO
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TEM
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Preparación de las muestras para microscopía
• Fijación
• Teñidos
•Deshidratados
•Incluidos
•Cortes finos
De transmisión De barrido
MOME
Réplicas de superficie
habitualmente bañadas en oro
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Rotor
Motor
Cabezal
Refrigeración
Vacío
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Unidades Rpm.
La fuerza centrífuga está determinada por el diámetro del rotor y la velocidad de rotación.
TOTAL
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FRACCIONADA
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FRACCIONADA
Separación en base a
• tamaño
• densidad
Utilidad:
separación de organelas celulares
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EN GRADIENTE DE CONCENTRACIÓN
Muestra de Proteínas
Moléculas lentasMoléculas rápidas Separa en base a
• tamaño
• forma
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EN GRADIENTE DE CONCENTRACIÓN
Utilidad separación de diferentes proteínas
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Separación de proteínas y ADN por su PM
SOPORTES
Acetato de
celulosaUso clínico
Acrilamida
(Proteínas)
Agarosa
(ADN)
Investigación
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Buffer
Ánodo (+)
Caja acrílica
MuestraCátodo (-)
Acrilamida (gel)
SDS-PAGE
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SDS-PAGE
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3EIMMBLOT.MOV
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Células frecuentemente utilizadas
• fibroblastos
• macrófagos
•células de tumores
Utilidad
• interacción célula-célula.
• Procesos celularesVentaja
Estudio sobre células vivas
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Células CHO - Rab22-GFP
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MÉTODOS PARA ÁCIDOS NUCLEICOS
![Page 40: MéTodos De Estudio En BiologíA Celular1](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022020123/5595b6121a28abd3118b4808/html5/thumbnails/40.jpg)
ADN
Aislamiento Del Material Genético
ARN
RibosomasCromosómicos - Minicírculos,
• Detección de ADN/ARN
Fenol/cloroformo
Lisis celular y extracción con resina
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Amplificación de ADN
• Detección de ADN/ARN
Reacción en Cadena de la Polimerasa
Hebras = cadenas
Polimerasa
Nucleótidos
Iniciadores = cebadores = primers
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Estructura del ADN
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Amplificación de ADN
• Detección de ADN/ARN
Reacción en Cadena de la Polimerasa
Iniciadores = cebadores = primers
Hebras = cadenas
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Amplificación de ADN
• Detección de ADN/ARN
Reacción en Cadena de la Polimerasa
PolimerasaNucleótidos
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Amplificación de ADN
• Detección de ADN/ARN
Reacción en Cadena de la Polimerasa
PCR
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Amplificación de ADN
• Detección de ADN/ARN parasitario
Reacción en Cadena de la Polimerasa
PCR anidada
PCR en tiempo real
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![Page 48: MéTodos De Estudio En BiologíA Celular1](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022020123/5595b6121a28abd3118b4808/html5/thumbnails/48.jpg)
Bromuro de etidio
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![Page 50: MéTodos De Estudio En BiologíA Celular1](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022020123/5595b6121a28abd3118b4808/html5/thumbnails/50.jpg)
ANÁLISIS DE LAS BANDAS DE AMPLIFICACIÓN OBTENIDAS.
REA (restriction enzime analysis)
RFLP (restriccion fragment length polymorphims)
RADP-PCR (randomprimed)
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![Page 52: MéTodos De Estudio En BiologíA Celular1](https://reader030.vdocuments.mx/reader030/viewer/2022020123/5595b6121a28abd3118b4808/html5/thumbnails/52.jpg)