Taller UITB-201128 de Noviembre de 2011

Fernando AlcaideFernando Alcaide

Servei de Microbiologia. Hospital Universitari de Bellvitge-IDIBELLDepartament de Patología i Terapéutica Experimental. Universitat de

Barcelona (UB)

MMéétodos de deteccitodos de deteccióón rn ráápida de pida de resistencias en resistencias en M. tuberculosisM. tuberculosis

DetecciDeteccióón de las resistenciasn de las resistencias

Método de las concentraciones absolutasMMéétodo de las concentraciones absolutastodo de las concentraciones absolutas

Método de la relación de resistenciasMMéétodo de la relacitodo de la relacióón de resistenciasn de resistencias

Método de las proporciones múltiplesMMéétodo de las proporciones mtodo de las proporciones múúltiplesltiples

•• ClCláásico de Canetti, sico de Canetti, RistRist y y GrossetGrosset (Rev Tuberc Pneumol 1963;27:263-72)

•• RadiomRadioméétricotrico ((BactecBactec 460TB)460TB)• Métodos automatizados NO radiométricos (MGIT960 y VersatreK)

MMéétodos Convencionales (Fenottodos Convencionales (Fenotíípicos)picos)

1. MTBC: Crecimiento MUY LENTOMUY LENTO– Tiempo de duplicación: 1515--20 h20 h

– Colonias visibles: 33--4 s4 s

2. MTBC: Crecimiento NO UNIFORMENO UNIFORME en los medios de cultivo

3. Métodos laboriosos

MMéétodos convencionales (fenottodos convencionales (fenotíípicos)picos)

LIMITACIONESLIMITACIONESLIMITACIONES

Resultados 2 - 5 semanas

Importante“manejo” de MDR -

XDRTto precoz

Optimización del ttoPrevenir Transmisión

DetecciDeteccióón de las resistenciasn de las resistencias

Fagos

TLA (Microcolonias Agar-capa fina)

Anyplex plus MDR-TB Detection®Colorimétrico tipo Redox

GenoFlow DR-MTB Array Test®Nitrato Reductasa (NRA)

Otros: MODS

Secuenciación genes de resistenciaVersatrek®

GeneXpert MTB/RIF®MIGT960®

GenoType MTDDRplus y MTDDRsl®Radiométrico (Bactec 460TB®)

INNO-LiPA Rif. TB®Proporciones LJ y 7H10 o 7H11

Pruebas genotípicasPruebas fenotípicas

MMéétodos fenottodos fenotíípicos sencillos y econpicos sencillos y econóómicosmicos

Indicadores Colorimétricos RedoxIndicadores Indicadores ColorimColoriméétricostricos RedoxRedox

Observación Microscópica de Sensibilidad a Fármacos (MODS)ObservaciObservacióón Microscn Microscóópica de Sensibilidad a Fpica de Sensibilidad a Fáármacos (MODS)rmacos (MODS)

Detectan R a INH y RMP en cultivo mediante Resazurina.No comercial, requiere cierto entrenamiento pero poco equipo.

Detectan R a INH y RMP en cultivo líquido mediante microscopio de luz invertida (formación de cuerdas).No comercial, requiere entrenamiento importante y un cierto equipo.

Método de la Nitrato reductasa (NRA)MMéétodo de la Nitrato reductasa (NRA)todo de la Nitrato reductasa (NRA)Detectan R a INH y RMP en cultivo sólido (ensayos en M. líquido).No comercial, requiere cierto entrenamiento y poco equipo.

Detección de Microcolonias en Agar (TLA)DetecciDeteccióón de n de MicrocoloniasMicrocolonias en Agar (TLA)en Agar (TLA)Detectan cultivo positivo y R a INH y RMP en cultivo sólido (capa fina Middlebrook 7H11) mediante microscopía.No comercial, requiere entrenamiento importante y cierto equipo.

BacteriBacterióófagosfagosLUCIFERASALLUCIFERASAUCIFERASA

LRPLRPLuciferaseReporter

Phage assay(FASTPlaque-TB®)

PhaBPhaBPhage

AmplifiedBiollogically

Assay

MABMABMycobacteriophage-based assay

MICOBACTERIÓFAGOMMICOBACTERIICOBACTERIÓÓFAGOFAGO

• Resolver:– Falsos Pos no explicados (algunos estudios)– Contaminación potencial– Detección de bajo nivel de R a la INH – Resultados indeterminados

Alteraciones genéticas puntuales en los genes del cromosoma que codifican la diana del

fármaco o enzimas implicadas en su activación

Resistencia ADQUIRIDA en MTBC

•• NONO existen elementos genéticos MMÓÓVILESVILES (No

transmisión horizontal de genes de R)

•• MDRMDR--XDRXDR: acumulación secuencial de mutaciones en

diferentes genes

MDR-TB Distribución Mecanismos de resistencia

INH

RMPrpoB

KatG

inhA

0102030405060708090

100

INH RMP PZA SM EMB FQ

gyrAgyrA

embBembB

pcnApcnA

ahpCahpC

inhAinhA

katGkatGrpsLrpsL

rrsrrs

Frecuencia de las Frecuencia de las MutacionesMutaciones

rpoBrpoB

DNA

PCR

Hibridación

DetecciDeteccióón Molecularn Molecular

ElectroforésisPCR-SSCP

Secuenciación G A T C

Referencia

1. Hibridación en TirasTiras

2. Hibridación en Microplacas

(ELISA - RMP)

3.3. PCR Tiempo RealPCR Tiempo Real (TaqMan,

Beacons, FRET, SybrGreen)

4.4. ChipsChips de DNA – Microarrays

Basadas en Basadas en HibridaciHibridacióónnBasadas en Basadas en HibridaciHibridacióónn

HibridaciHibridacióón en n en Tiras Tiras InnoLiPA®HibridaciHibridacióón en n en Tiras Tiras InnoLiPA®HibridaciHibridacióón en n en Tiras Tiras INNO-LiPA Rif.TB®

rpoB

HibridaciHibridacióón en n en TirasTirasMétodo GenoType® MTBDRMTBDRplusplus 2.0

HibridaciHibridacióón en n en TirasTirasMétodo GenoType® MTBDRMTBDRslsl 2.0

HibridaciHibridacióón en n en TirasTirasMétodo GenoType® MTBDRMTBDRplusplus

HibridaciHibridacióón en n en TirasTirasMétodo GenoType® MTBDRMTBDRplusplus

HibridaciHibridacióón en n en TirasTirasMétodo GenoType® MTBDRMTBDRplusplus (rpoB, KatG, InhA)

Buena correlación (Seq-Fenotípico): 2 - 4 % discrepantes

Aislamientos clAislamientos clíínicosnicos

(Johansen et al. JCM 2003)SENSIBILIDADSENSIBILIDAD

BAAR positivas : 77,7%BAAR negativas: 41,6%

Muestras clMuestras clíínicasnicas

HibridaciHibridacióón n -- INNOLiPAINNOLiPA RifRif. TB . TB

Ling et al. ERRM 2008 – Sensibilidad 80%

FQ: sensibilidad 89% - especificidad 100%AMK: sensibilidad 75% - especificidad 100%CP: sensibilidad 87,5% - especificidad 99,1%EMB: sensibilidad 38,5% - especificidad 100%

MTBDRMTBDRslsl -- Muestras clínicas (Hillemann et al. JCM 2009)

HibridaciHibridacióón n –– GenoTypeGenoType

RMP: sensibilidad 98,9%INH: sensibilidad 94,7%

MTBDRMTBDRplusplus –– Muestras clínicas (Barnard et al. AJRCCM 2008)

Especificidad 100%

• La aprobación de la utilización de estas pruebas de hibridación en tiras (Line probe) para la detección rápida de la MDR-TB debería ser decidida por los ministerios de salud de cada país en el contexto de los planes nacionales para el manejo adecuado de los pacientes con TB-MDR.

• Estas pruebas han sido adecuadamente validados para su utilización en esputos con esputos con baciloscopiabaciloscopia positivapositiva y en cepascepas del complejo M. tuberculosis.

• Se recomienda la utilización de mméétodos comercialestodos comerciales.• Usar en centros con experienciacentros con experiencia y dotacidotacióón adecuadan adecuada. •• No sustituyenNo sustituyen las pruebas de sensibilidad fenotpruebas de sensibilidad fenotíípicaspicas.

Molecular Beacon

TaqMan

FRET

PCR Tiempo RealPCR Tiempo Real

PCR Tiempo Real:PCR Tiempo Real: Muestras clínicas

Ruiz et al (JCM 2004), Marín et al (AAC 2004) Espasa et al (JAC 2005)

Muestras BAAR Positivas:Muestras BAAR Positivas:• Mutaciones incluidas en el ensayo:

– S: 95-99% E: 100%• Resistencia a la INH:

– S: 52-53% E: 100%• Resistencia a la RMP:

– S: 100% E: 100%Muestras BAAR Negativas:Muestras BAAR Negativas:• Mutaciones incluidas en el ensayo:

– S: 30-35% E: 100%

Estudios Métodos Caseros RMP - INH: rpoB, KatG e inhA

1) inactivación de la muestra (15 min)

2) Dispensación de la muestra en el cartucho

3) Carga del cartuchoen el modulo

Detección de MTBC y mutaciones en rpoB (MDR)

PCR a Tiempo Real PCR a Tiempo Real -- XpertXpert MTB/RIFMTB/RIF

≈ total 2 h(2-3 min

“manipulación técnica”)

1) Extracción DNA

2) AAN (Heminested PCR)

3) Hibridación del amplificado con 5 sondas complementarias de la región core del rpoB

XpertXpert MTB/RIF MTB/RIF –– Evidencia Evidencia (selección OMS 2011)

Xpert MTB/RIF(Trabajos relevantes)

SENSIBILIDAD (MTBC cultivo +)

ESPEC. (Cultivo MTBC -)

RESPIRATORiO EXTRARRESPIRAT.

RMP - R

BAAR + BAAR - BAAR + BAAR -

ARTICULOS

Helb et al, JCM Ene 2010 100% 71,7% - - 9/9 (100%) 100%

Boehme et al, NEJM Sep 2010 98,2% 72,5% - - 200/205 (97,6%) 99,2%

Moure et al, JCM Mar 2011 - 78,2% - 42,8% 6/6 (100%) 100%

Hillemann et al, JCM Abr 2011 - - - 79,5% - 98,2%

Marlowe et al, JCM Abr 2011 98% 72% - - - 100%

Armand et al, JCM May 2011 100% 57% 100% 37% - -

Theron et al, AJRCCM Jul 2011 95% 55% - - 6 de 1

Boehme et al, Lancet Abr 2011 98.3% 76.9% - - 236/250(94,4%) 99%

POSTERS

Tórtola et al, ECCMID 2010 100% 66,7% - 98,1%

Ioannidis et al, ECCMID 2010 96,9% 85,7% 100% - - -

Baron et al, New Delhi 2010 -50-100%

(≠ sites and sampletypes)

66.6% -

Naidoo, Lancet, South Africa 100% 99,7% 93,4% 100% 99,5%

≈100% ≈75% ≈60% ≈100%

XpertXpert MTB/MTB/RIFRIF-- PolicyPolicy StatementStatement

XpertXpert MTB/MTB/RIFRIF-- PrerequisitesPrerequisites

• Polimorfismo en el codón 514 (rpoB) – Cepas: Alonso et al J Clin Microbiol 2011– Muestras clínicas: Moure et al J Clin Microbiol 2011

PCR a Tiempo Real PCR a Tiempo Real -- XpertXpert MTB/RIFMTB/RIF

Mutaciones silentes en rpoB en M. tuberculosis sensibles a la rifampicina

• Concepto: Sistemas miniatuarizados con oligonucleótidosadheridos a una placa de sílica

• Mecanismo: hibridación del segmento de DNA amplificado (diana) con las sondas específicas

Chips de DNA Chips de DNA -- MicroarraysMicroarrays

A B

C

Chips de DNA Chips de DNA –– MicroarraysMicroarraysRifampicina e Isoniazida

Aragón et al. JAC 2006

Montemayor et al. SEIMC 2010

Chip de ADN vs SecuenciaciónSensibilidad Especificidad VPP VPN

Isoniacida KatG 98,5% 99,3% 98,5% 99,3%

inhA 94% 99,4% 97,9% 98%

Rifampicina rpoB 98,4% 98,7% 96,4% 98,7%

Chip de ADN vs Antibiograma fenotípico

Sensibilidad Especificidad VPP VPN

Isoniacida 68,8% 100% 100% 47,4%

Rifampicina 91,4% 98,6% 96,4% 96,7%

205 cepas: 160 INH-R, 58 RMP-R, 50 MDR y 37 S

Chips de DNA Chips de DNA –– MicroarraysMicroarraysRifampicina e Isoniazida

201020102010

Colorimétrico tipo Redox Nitrato Reductasa (NRA) MODS

Pruebas fenotípicas

201020082008

GeneXpert MTB / RIF®GenoType MTDDRplus y MTDDRsl®INNO-LiPA Rif. TB®

Pruebas genotípicas

MMéétodos respaldados por la OMStodos respaldados por la OMS

DetecciDeteccióón rn ráápida de resistenciaspida de resistenciasMMéétodos de AAN e Hibridacitodos de AAN e Hibridacióónn

(Recomendaciones OMS)

Hibridación reversaINNOLiPA-Rif.TB

HibridaciHibridacióón reversan reversaINNOLiPAINNOLiPA--Rif.TBRif.TB

Hibridación reversaGenoType MTBDRplus/sl

HibridaciHibridacióón reversan reversaGenoTypeGenoType MTBDRMTBDRplusplus//slsl

PCR Tiempo real - GeneXpertPCR Tiempo real PCR Tiempo real -- GeneXpertGeneXpert

• RMP• PCR + Hibridación (semiautomatizada) • Buena relación coste-beneficio

• RMP• PCR + Hibridación (semiautomatizada) • Buena relación coste-beneficio

• RMP-INH y FQ-AG/PepCíclicos-EMB• PCR + Hibridación (manual) • Buena relación coste-beneficio

• RMP-INH y FQ-AG/PepCíclicos-EMB• PCR + Hibridación (manual) • Buena relación coste-beneficio

• RMP• PCR + Hibrid. simultánea (automatizada) • Rápida, poco laboriosa y muy Sencilla• Cara

• RMP• PCR + Hibrid. simultánea (automatizada) • Rápida, poco laboriosa y muy Sencilla• Cara

UITBUITB-- GEMB GEMB (Grupo de Estudio de (Grupo de Estudio de MicobacteriasMicobacterias de Barcelona)de Barcelona)

Hospital Clínic: Julià González, Griselda Tudó, Emma Rey

Hospital de Sant Pau: Pere Coll, Montserrat Español,

Hospital de la Vall d’Hebrón: Teresa Tórtola, Nuria Martín

Laboratori de Referencia de Catalunya: Margarita Salvadó, Eva Vicente

Hospital de Bellvitge: Raquel Moure, Miguel Santín, Laura Muñoz

AgradecimientosAgradecimientos