METODI ALTERNATIVI PER LA VALUTAZIONE DI : IRRITAZIONE OCULARE, IRRITAZIONE CUTANEA

E FOTO-TOSSICITA’ Marisa Meloni

SITOX 5 GIUGNO 2012

CONTESTO NORMATIVO ed utilizzo delle ALTERNATIVES

• COSMETICO • REACH • FARMACEUTICO • DISPOSITIVI MEDICI

IRRITAZIONE CUTANEA e OCULARE FOTO-TOSSICITA’

• Protocolli • Parametri • Interpretazioni • Sistema di Qualità-GLP

2009 2004 2013

DIVIETO DI TEST SU ANIMALI

- Prodotti cosmetici finiti - Ingredienti nei casi in cui i Metodi Alternativi sono a) convalidati b) previsti dalla legislazione EU

DIVIETO DI COMMERCIALIZZARE

DIVIETO DI TEST SU ANIMALI

Tutti gli endpoints di Sicurezza per l’uomo per i quali sono disponibili Metodi Alternativi

•  Tossicità ripetuta •  Carcinogenesi •  Sensibilizzazione •  Tossicità riproduttiva •  Tossico-cinetica

- Prodotti cosmetici finiti testati su animali - Ingredienti testati su animali

nei casi in cui i Metodi Alternativi sono a) convalidati b) previsti dalla legislazione EU

Endpoints di Sicurezza per l’uomo con l’eccezione di

CONTESTO NORMATIVO : COSMETICO

!"#$%&'&(")(*$&+,-+&

CONTESTO NORMATIVO : CHIMICO &

"  Regolamento REACH :1° Giugno 2008 "   Innocuità per uomo ed ambiente "   Lista di saggi : Allegati VII-X-XI "  Concetto di metodi idonei = Suitables "   “Elaborati sufficientemente bene secondo criteri per lo sviluppo di test

riconosciuti a livello internazionale per l’immissione di un saggio nel processo

di pre-convalida “

!"#$%&'&(")(*$&+,-+&

CONTESTO NORMATIVO : FARMACEUTICO

"  Nessun obbligo Normativo cogente "  Esigenza per Hazard identification e Safety "  Pre-clinica : in aumento "  Articolo 47, DIRETTIVA 2010/63/UE del

22.09.2010 "   “La Commissione e gli Stati membri contribuiscono allo sviluppo e alla

convalida di approcci alternativi idonei a fornire lo stesso livello, o un livello più alto d’informazione di quello ottenuto nelle procedure che usano animali, ma che non prevedano l’uso di animali utilizzino un minor numero di animali o che comportino procedure meno dolorose, e prendono tutte le misure che ritengono opportune per incoraggiare la ricerca in questo settore.

!"#$%&'&(")(*$&+,-+&

I metodi alternativi convalidati : dove non sono applicabili

!"#$%&'&(")(*$&+,-+&

METODO ALTERNATIVO LINEA GUIDA (inclusi in Annex V, Direttiva 67/548/EEC)

CLASSIFICAZIONE

Local Lymph Node Assay for skin sensitization (LLNA)

OECD TG 429 (Luglio 2010)

SENSIBILIZZANTE H317 (EU CLP)

3T3 NRU phototoxicity test OECD TG 432 (Aprile 2004)

FOTOTOSSICO (PIF !5; MPE ! 0,1)

SKIN CORROSIVITY TEST EpiSkinTM / EpiDermTM / Skinethic

OECD TG 431 (Aprile 2004 /Novembre 2006/Giugno 2009)

CORROSIVO R35 e R34 (EU DSD) H314 (EU CLP)

Rat TER skin corrosivity test OECD TG 430 (Aprile 2004)

CORROSIVO R35 e R34 (EU DSD) H314 (EU CLP)

SKIN IRRITATION TEST EpiSkinTM / EpiDermTM / Skinethic

OECD TG 439 (Luglio 2010)

IRRITANTE CUTANEO R38 (EU DSD) H315 (EU CLP)

In vitro tests for percutaneous absorption

OECD TG 428 (Aprile 2004)

Bilancio di Massa dell’attivo 100% ± 10%

In vitro Genotoxicity Tests OECD TG 471, 473, 476 etc.

GENOTOSSICO

In Vitro Mammalian Cell Micronucleus test

OECD TG 487 (Luglio 2010)

GENOTOSSICO

EU DSD (European Dangerous Substances Directive)

!"#$%&'&(")(*$&+,-+&

SISTEMI DI CLASSIFICAZIONE

!"#$%&'&(")(*$&+,-+&

EU DSD = EUROPEAN DANGEROUS SUBSTANCES DIRECTIVE

EU CLP = EUROPEAN REGULATION 1272/2008 for CLASSIFICATION, LABELLING & PACKAGING

IRRITAZIONE CUTANEA :OECD TG439

!"#$%&'&(")(*$&+,-+&

ALTERNATIVA DI SOSTITUZIONE DEL DRAIZE RABBIT TEST: OECD TG404 ACUTE DERMAL IRRITATION

DESCRIZIONE IRRITAZIONE PRIMARIA CUTANEA

OBIETTIVO Alterazioni reversibili della pelle in seguito ad applicazione acuta

STATO Alternativa di sostituzione convalidata OECD 439

MODELLO BIOLOGICO EPIDERMIDE RICOSTRUITA (3 diversi protocolli)

ENDPOINT IN VIVO ALTERAZIONE DELLA FUNZIONE BARRIERA, ROSSORE, EDEMA

ENDPOINT IN VITRO VITALITA’ CELLULARE con test MTT

CAMPO DI APPLICAZIONE TUTTI INGREDIENTI ECCETTO AEROSOL /GAS

IMPIEGO NELLA VALUTAZIONE HAZARD IDENTIFICATION R38 (EU DSD) / H315 (EU CLP)

!"#$%&'&(")(*$&+,-+&

METODO IRRITAZIONE PRIMARIA CUTANEA

MODELLO BIOLOGICO EPISKIN

CONTROLLO POSITIVO SDS 5% con RIDUZIONE 80 % VITALITA’ DS < 18%

CONTROLLO NEGATIVO PBS

TEMPO DI CONTATTO 15MIN + 42 H POST INCUBAZIONE

ENDPOINT IN VITRO VITALITA’ CELLULARE -MTT TEST

MODELLO PREDITTIVO > 50% VITALITA’ = NON IRRITANTE (NI) In caso di valori borderline e se 50% IL-1! RILASCIATA < 50 pg/mL (NI)

!"#$%&'&(")(*$&+,-+&

METODO IRRITAZIONE PRIMARIA CUTANEA

MODELLO BIOLOGICO RHE SKINETHIC

CONTROLLO POSITIVO SDS 5%

CONTROLLO NEGATIVO PBS

PROTOCOLLO 42 min + 42H POST INCUBAZIONE

ENDPOINT IN VITRO VITALITA’ CELLULARE- MTT TEST

MODELLO PREDITTIVO > 50% VITALITA = NON IRRITANTE (NI)

!"#$%&'&(")(*$&+,-+&

METODO IRRITAZIONE PRIMARIA CUTANEA

MODELLO BIOLOGICO EPIDERM

CONTROLLO POSITIVO TRITON 1%

CONTROLLO NEGATIVO PBS

PROTOCOLLO 60 min + 42H POST INCUBAZIONE

ENDPOINT IN VITRO VITALITA’ CELLULARE MTT - ET 50

MODELLO PREDITTIVO > 50% VITALITA = NON IRRITANTE (NI)

!"#$%&'&(")(*$&+,-+&

3 METODI A CONFRONTO

!"#$%&'&(")(*$&+,-+&

ESAC Replacement of

Draize test for skin irritation: Cat2/No cat

(EU TM B.46 & OECD TG 439)

CORROSIVITA’ CUTANEA: OECD TG 431 OECD TG 430 ….

!"#$%&'&(")(*$&+,-+&

DESCRIZIONE CORROSIVITA’ CUTANEA

OBIETTIVO Alterazione irreversibile conseguente all’applicazione acuta

STATO Alternativa di sostituzione OECD 431

MODELLO BIOLOGICO • EPIDERMIDE RICOSTRUITA • PELLE RATTO

ENDPOINT IN VIVO Perdita FUNZIONE BARRIERA

ENDPOINT IN VITRO VITALITA’ CELLULARE /TEER

CAMPO DI APPLICAZIONE INGREDIENTI (specifiche)

IMPIEGO NELLA VALUTAZIONE HAZARD IDENTIFICATION R35 E R34 (EU DSD) / H314 (EU CLP)

!"#$%&'&(")(*$&+,-+&

IRRITAZIONE OCULARE

!"#$%&'&(")(*$&+,-+&

TG OECD 405 IN VIVO DRAIZE TEST (RABBIT)

Eye irritation: is the production of changes in the eye

following the application of a test substance to the anterior

surface of the eye, which are fully reversible within 21 days of

application.

EU classification: •  NI = non-irritant

•  R36 (EU DSD)/ CAT 2 (EU CLP) = irritating to eyes

•  R41 (EU DSD)/ CAT 1 (EU CLP) = risk of serious damage to eyes

Replacement Alternatives: ESAC statement April 2007 and ICCVAM retrospective validation

Classification!"!Severe (R41)/ Irritants (R36)!!

•  BCOP : BOVINE CORNEAL OPACITY and PERMEABILITY •  ICE : ISOLATED CHICKEN EYE!&

!"#$%&'&(")(*$&+,-+&

Irritazione oculare

•  BCOP ed IRE applicabili solo per classificazione R41: distinzione tra fortemente irritanti ed irritanti

•  Pre-convalida su Human Corneal Epithelium sponsorizzata da Colipa per discriminare tra irritanti e non irritanti (dal 2008).

!"#$%&'&(")(*$&+,-+&

IRRITAZIONE OCULARE :HCE MODEL

!"#$%&'&(")(*$&+,-+&

METODO IRRITAZIONE OCULARE

MODELLO BIOLOGICO HCE HUMAN CORNEAL EPITHELIUM COLIPA ECVAM PRE-VALIDATION 2008-2012

CONTROLLO POSITIVO ETANOLO

CONTROLLO NEGATIVO SOLUZIONE SALINA

PROTOCOLLO 1H +16H POST INCUBAZIONE

ENDPOINT IN VITRO VITALITA’ CELLULARE

MODELLO PREDITTIVO >50% NON IRRITANTE

!"#$%&'&(")(*$&+,-+&

FOTOTOSSICITA’: OECD 432

!"#$%&'&(")(*$&+,-+&

!"#$%&'&(")(*$&+,-+&

DESCRIZIONE FOTOTOSSICITA’ 3T3 NRU

OBIETTIVO Identificare composti foto-tossici in seguito ad esposizione a una dose non citotossica di radiazione UVA: 5J /cm2

STATO Alternativa di sostituzione OECD 432

MODELLO BIOLOGICO BALB 3T3 - fibroblasti murini

ENDPOINT IN VITRO Vitalità cellulare tramite Neutral Red Uptake

CAMPO DI APPLICAZIONE SOSTANZE CHIMICHE IDROSOLUBILI O OPPORTUNAMENTE SOLUBILIZZATE

IMPIEGO NELLA VALUTAZIONE

Potenziale fototossico: PIF >2 (Photo Irritation Factor)

PROCEDURA

!"#$%&'&(")(*$&+,-+&

Confronta l’effetto di una sostanza in presenza ed in assenza di UVA AD UNA SINGOLA CONCENTRAZIONE

quella che determina citotossicità nel 50% delle cellule = EC 50.

PIF = EC50 (–UVA) / EC50 (+UVA)

SOSTANZA CON POTENZIALE FOTOTOSSICO: PIF = > 5.0

SOSTANZA CON PROBABILE POTENZIALE FOTOTOSSICO: PIF > 2.0 e < 5.0

CONTROLLO POSITIVO: CLORPROMAZINA - PIF > 6

!"#$%&'&(")(*$&+,-+&

SOSTANZA CON POTENZIALE FOTOTOSSICO MPE > 0.150

SOSTANZA CON PROBABILE POTENZIALE FOTOTOSSICO MPE > 0.100 e < 0.150.

SOSTANZA NON FOTOSSICA MPE < 0,1

Tale modello sopperisce ai limiti del modello PIF nei casi in cui sia impossibile ottenere una EC50.

Il modello utilizza il “Mean Photo Effect (MPE), una misura basata sul confronto delle curve complete concentrazione-risposta. = MAGGIORE SENSIBILITA’

Per l’applicazione di tale modello si utilizza il Photo Prediction software versione 2.0*

*(Holzhutter, 2002) In Vitro Phototoxicity Testing: Development and Validation of a New Concentration Response Analysis Software and Biostatistical Analyses Related to the Use of Various Prediction Models"

!"#$%&'&(")(*$&+,-+&

LIMITI DEL METODO OECD 432

OECD TG 432 : 3T3BALB NRU-PHOTOTOXICITY ASSAY su monostrato di fibroblasti murini ha alcune riconosciute

• non è adatto a valutare concentrazioni superiori a 1000 µg /ml

• non è adatto a valutare miscele complesse di ingredienti o formulazioni a causa della loro non solubilità nel mezzo acquoso che porterebbe ad artefatti e/o precipitazione della sostanza e quindi risultati non attendibili

• è un sistema biologico eccessivamente semplificato rispetto alla complessità della reazione fototossica epidermica e non permette di tenere conto della distribuzione ed assorbimento della sostanza applicata topicamente.

La linea guida OECD TG 432 indica chiaramente che :

in casi di risultati di potenziale fototossico discordanti ed in generale per la valutazione di prodotti finiti sia necessario confermare il dato ottenuto con il 3T3-NRU utilizzando un modello biologico diverso.

!"#$%&'&(")(*$&+,-+&

FOTOTOSSICITA’

Il metodo Episkin Phototoxicity Assay utilizza epidermide umana ricostruita in vitro

!"#$%&'&(")(*$&+,-+&

Medina et al.2001 : Assessment of the Phototoxic Potential of Compounds and Finished Topical Products Using a Human Reconstructed Epidermis In vitro molecular toxicology, vol 14 N° 3

Liebsch et al : 2005 Alternative Methods for Cosmetic testing ( Editors Chantra Esckes and Valerie Zuang ) chapter 3.8 Uv-induced effects ATLA 33 Suppl131-146

Lelievre et al . 2007 Toxicology in vitro 977-995 .The Episkin phototoxicity assay (EPA): Development of an in vitro tiered strategy using 17 reference chemicals to predict phototoxic potency

Una riduzione della vitalità cellulare > 25% nei tessuti irradiati classifica il prodotto come foto-tossico.

!"#$%&'&(")(*$&+,-+&

GLP

LA COMPLIANCE GLP E’ SEMPRE RICHIESTA QUANDO

IL METODO ALTERNATIVO CONVALIDATO O IN CORSO DI CONVALIDA

VENGA UTILIZZATO IN STUDI PER

LA CLASSIFICAZIONE REGOLATORIA O PER LA REGISTRAZIONE

IMPLEMENTAZIONE DELLE OECD TG Organization for Economic Cooperation and Development

!"#$%&'&(")(*$&+,-+&

1. INTRODUCTION 2. INITIAL CONSIDERATIONS 3. PRINCIPLE OF THE TEST METHOD 4. DESCRIPTION OF THE METHOD 5. PROCEDURE 6. DATA AND REPORTING 7. LITERATURE 8. DEFINITIONS

IMPLEMENTAZIONE LINEE GUIDA NEL CENTRO DI SAGGIO > SOP

DIREZIONE DEL CENTRO DI SAGGIO

Strumento di training

SOP

TECNICI

ESPERIENZA AZIENDALE

Tracciabilità degli studi

Aggiornamento continuo

Capitalizzare esperienza aziendale

Standardizzazione Monitoraggio CN e CP

Creazione di competenze e responsabilità

Ruolo del QA: - integrità dei dati - compliance Successo della convalida interna

PROCEDURE OPERATIVE STANDARD

!"#$%&'&(")(*$&+,-+&

QUID MENSURA MENSURATUR UT QUOD NON MENSURATUR

“Misura quello che è misurabile e rendi misurabile ciò che non lo è”

Galileo Galilei,1564-1642

I metodi alternativi … anche nella Ricerca