I 23

Meting van imrnuniteit tegen Toxoplasmose met behulp van vrije curven

S u m m x r y

plasma1)

door C. A. G. Noss

Free-hand curves in estimating the potency of human sera against Toxo-

The observations of 70 human sera, selected on clinical and epidetniological grounds, where the only material available. Three doses of every serum, with ratios I : 5 : 25, were subjected to the "Sabin-test", counting the number of killed Toxoplasmas out of 50, exposed to every.dose.

The chief problem was the estimation of the active dose in every medizcm serum dose. The percentage kill was used as response y (table I). For the active doses x, a logarithmic scale was used, with the origin a t the median letal dose and the dilution I : 5 as unity. The three active doses of every serum were named x-I , x and x +- I. The problem was solved by fitting three parallel free-hand curves, Y ( X - I ) , Y ( X ) a n d Y ( X + I), to .the 3 x 14 mean responses 5 of f.ve subse- quent sera, when ranked in order of magnitude of Zy (table 2, figure 3 ) . The x of every single serum was estimated in principle by shifting the responses y (x - I), y (x) and y ( x + I ) along the abscis till the condition Xy ZY was satisfied; and in practice by reading from a previous ~1 prepared double scale with Z y and x .

The chief dificulty in drawing figure 3, the mknown value of x , was cwercome by means of two accessory figures. In figure I, 3' (x) is plotted on the abscis f o r the points and Y (X) f o r the curves. The points in this figure a r e not in the right position because the condition Z$ = ZY is not satisfied. Their shifting to the right position, or the substitution of their ubscis j (x) by Y (x), was rather cumber- some, because every correction of the curves would imply corrections of the rrbscisses. Therefore figure 2 was drawn, with Z$ = ZY plotted on the abscis, to avoid the need of shgting.

Because the curves of figure 3 should be parallel, the curves of figures I and 2 shorild satisfy the following condition: Of any rectangle, parallel to the axes, with two diagonal summits on the medium curve and one summit on the uppa 'r curve, the fourth summit Zhou'd ly upon the lower curve. In each figure a sei; of such rectangles is drawn, yielding the positions of x ~7 -4, -3, -2, -r, 0, I , 2,

which were used for the construction of figure I. Every correction in one of the

- - .

I ) From the Institute for Preventive Medicine, Leiden. Contributed paper to the second international conference of the Hiometric Sxiety, rewritten and somewhat extended for Sta- tistica. An abstract has appeared in Biometrics 6, 345-346, 1948. In the original paper the sample size was stated as 100 instead of 50. This error is due to insufficient contact, caused by Dr W i n s s e r ' s military service in Indonesia.

cuives, caused corresponding. corrections in the other curves. The three graphs were jointly accomplished.

The most remarkable feature about figure 3 is an upper asymptote at about 82%. It is suggested that about 18% of the Toxoplasmas would be colored after death, or that the active component would have a maximum concentration, corres- ponding to some chemical balance in the staining mixture, which would be survived by 18y~ of the Toxoplasmns.

The differences y - Y have only two degrees of freedom for every serum. One of this was used to construct an orthogonal component X b , designed to absorb individual diferences of dose response curves. The remaining component xa was iised for error variance. These components appeared to be independent (figure 4).

I . The variance of za is somewhat larger than would follow from the binomial

a. The variance of x b is larger than that of xa. 3. The distribution of x b is negatively skew (table 3). 4. A serial correlation exists among the signs of X b (table 4). 5. A serial correlation exists among the values of x b 2 (table 5). It is apparent that the individual dose response curves do not possess the same shape. So the curves of figure 3 represent some kind of a mean dose response curve and the Toxoplasma killing properties cannot be fully described by a single para- meter x . X b may be considered as an estimate of a second parameter.

The following significant results were found:

distribution of y.

Inleiding Toxoplasma is een microscopische parasiet, die 0.a. in het menselijk

lichaam kan voorkomen en daar een gevaarlijke ziekte, toxoplasmose genoemd, kan veroorzaken. In ons land werd de toxoplasmose pas in 1941 door wijlen Professor C o r n e 1 i a d e L a n g e bij de mens geconstateerd en dienten- gevolge is ze nog betrekkelijk slecht bekend.

In het bijzonder is het onderzoek naar de besmettingswijze nog in volle gang en daarbij is het 0.a. van bzlang om te kunnen vaststellen of een bepaalde persoon een besmetting met toxoplasmen heeft opgelopen. Nu heeft een be- smetting een meer of mindere sterke immuniteit tegen toxoplasmose tot ge- volg, doordat zich in het bloed van de betreffende persoon stoffen ontwikkelen, hier antiserum genoemd, die een dodende uitwerking op de toxoplasmen uitoefenen. Bijgevolg is het van belang om het gehalte aan antiserum in het bloedserum van een bzpaalde persoon zo goed mogelijk te kunnen meten.

Nog niet zo lang geleden kon men dit het beste doen met een huidreactie bij konijnen, volgens A. B. S a b i n. Deze reactie werd indertijd in het In- stituut voor Praeventieve Geneeskunde door Dr J. W i n s s e r toegepast ( I )

en de statistische kant van dit onderzoek werd in dit tijdschrift besproken (2).

Iomiddels is er een betere methode ontwikkeld, eveneens door 5 a b i n , waarbij e m bepaald volumen van een toxoplasmaculture wordt blootgesteld aan een bzpaald volumen van een serummonster en na enige tijd in een tel- kamer onder het microscoop geteld wordt hoeveel toxoplasmen uit een steek- proef van 50 deze behandeling overleefd hebben. De dode organismen worden van de levende onderscheiden door een z.g. vitale kleuring, welke uit- sluitend (?) de levende toxoplasmen blauw kleurt. Met deze methode heeft W i n s s e r, bij telkens drie doses in de verhouding van I : 5 : 25, van 70 menselijke sera, de daarin aanwezige hoeveelheid antiserum gemeten. Als eenheid voor het antiserum werd de z.g. mediaan-lethale dosis geko.zen, die juist voldoende is om de helft van de toxoplasmen te doden.

Stelt men de middelste dosis op 6 van zulke eenheden, dan zijn cle beide andere doses 6 : 5 en 56. Het was echter verre van eenvoudig om uit de waar- nemingen voor iedere persoon een goede schatting van de onbekende 6 te berekenen. Dat komt omdat deze methode nog in het pioniersstadium ver- keert, waarin de onderzoeker jaagt naar snelle practische resultaten en geen lust heeft in tijdrovende proeven om eerst de nodige biometrische kennis te verzamelen omtrent het gedrag van- en de wisselwerking tussen het anti- serum en dn toxoplasmen. De ter beschikking staande gegevens waren van biometrisch standpunt even primitief als in het geval van de , ,rabbitskintest” (I). Zij bestonden alleen uit de waarnemingen bij de genoemde 70 personen, die uitsluitend op clinische en epidemiologische gronden waren onderzocht. Er waren geen duplicaat-tellingen verricht, geen contrdes zonder serum of met serum van personen waarvan a priori met redelijke zekerheid bekend was dat zij nimmzr een besmetting hebben opgelopen. Dat laatste was in dit stadium trouwens nauwelijks mogelijk omdat juist deze S a b i n-test het be- langrijkste criterium was om uit te maken of iemand a1 of niet besmet is ge- weest. Er waren ook geen waarnemingen gedaan bij een groter aants.1 doses van eenz.1fde serum om de algemene gedaante van de dosis-werkingscurve te leren kennen. Het probleem was dus om uit dit gebrekkige materiaal zo goed mogzlijk voor iedere persoon een schatting van 6 en van de betrouw- baarheid daarvan te berekenen en bovendien nog zoveel mogelij k biometrische gegevens, die voor het toekomstige onderzoek van belang kunnen zijn.

Waarom een logarithmische dosis-schaal? Om hzt probleem te vereenvoudigen werd een logarithmische-dosis-schaal

gekozen, met het nulpunt bij de mediaan-lethale dosis en met een verdunning van I : 5 als eenheid. Stelt men nu de middelste dosis op 5 van zulke logarith- mische eenheden, dan worden de beide andere doses resp. t - I en t + I.

I26

Desgewenst zou men, als t eenmaal gzvondm is, daaruit b kunnen berekenen met de formule log 6 = E log 5. Als de id-ale (of ware, of verwachte) responsie r] wordt het ideale percentage dode toxoplasmen gekozen, dat is dus in dit geval tweemaal het ideale aantal dode toxoplasmen uit een steekproef van 50. De drie responsies op een bepaald serum worden resp. voorgesteld door r] (6 - I), r] ( 5 ) en r ] ( E + I). Men kan a priori verwachten, dat de responsie bij geleidelijke stijging van zeer lage tot zeer hoge antiserum-doses, eerst horizontaal zal verlopen, vervolgens eerst sneller en dan weer langzamer zal stijgen, om tenslotte bij de maximale responsie weer horizontaal te gaan lopen. Men kan dus aannemen dat de ideale dosis-werkingscurve r] (6) een begrensde strak-continue functie is, die asymptotisch tot zijn beide grenzen nadert. De opgave wordt dus om drie gelijkvormige curven van dit type te vinden, op gelijke hoogte en met gelijke horizontale afstanden, zodanig dat de 3 maal 70 waarnemingen daar zo goed mogelijk bij aansluiten. Het nulpunt van de abscis wordt dan bepaald door het punt, waar de middelste curve de 50% dode toxoplasmen passeert en de eenheid van de abscis is de constante horizontale afstand tussen de curven.

Deze opgave is nog moeilijk genoeg, maar het zou nog veel moeilijker geweest zijn als er geen logarithmische dosis-schaal gebruikt was, omdat in dat geval de drie curven niet gelijkvormig en dus ook niet evenwijdig ge- weest zouden zijn. Het gebruik van een logarithmische dosis-schaal was dus in dit geval vrijwel gedwongen doordat de drie doses van ieder serum een meetkundige reeks vormen.

Waarom vrije curven? Wanneer men voor de taak staat om door een aantal punten een passende

curve te trekken, dan kiest men daarvoor gewoonlijk een analytische curve: Men kiest eerst een bepaald curvetype, dat op enige parameters na, door een wiskundige formule bepaald is en waarvan men verwacht dat er een behoor- lij ke aanpassing mee bereikt zal worden. Daarna worden de ontbrekende parameters uit de steekproef berekend, b.v. zodanig dat de a1 of niet gewogen som van de quadraten der verschillen tussen de waargenomen responsies en de curve zo klein mogelijk wordt. Een curventype dat bij biologische titraties vaak goed voldoet is dat van de bekende cumulatieve normale kansverdeling (3). De bijbzhorendo, voornamelijk door C. I. B 1 i s s ontwikkelde ,,probit”- methode wordt dan ook zeer veel toegepast en er is een uitstekende mono- grafie over verschenen (4).

In het onderhavige geval is het niet mogelijk om van te voren een curven- type te kiezen dat met redzlijke zekerheid een goede aanpassing zal geven, omdat er van te voren te weinig van de werkelijke dosis-werkirigscurve be-

kend is. Zoals blijken zal, zouden noch het normale, noch het logistische type hier voldoen. In een dergelijk geval zit er niets anders op dan eerst maar eens uit de hand een or+ curve te trekken, die op het oog redzlijk voldoet. Ziet men daarna kans om een wiskundige formule te vinden waaraan die vrije curve min of meer beantwoordt, dan kan men alsnog tot een analytische aanpassing overgaan, maar die kans werd in dit geval niet gezien. I>e vrije aanpassing werd hier dus bij gebrek aan beter toegepast en de daaraan ver- bonden nadelen moesten op de koop toe genomen worden.

Dat een vrije aanpassing in het algemeen wat onnauwkeuriger :zal zijn .dan een goed gekozen analytische is geen groot nadeel. Erger isdat devrije aanpassing een sterker subjectieve inslag heeft (de analytische aanpassing heeft 66k iets subjectiefs, nl. de keuze van het type, maar het is gewoonte om dit door de vingers te zien). De aanpassingsfout kan dus niet berekend worden. Volgens de persoonlijke mening van schrijver dezes is echter de subjectieve speling die men heeft bij het tekenen van een vrije monotone strak- continue curve met twee asymptoten, aangepast bij een groot aantal l~unten, zeer gering. Het is echter niet gemakkelijk om zo’n mening aan anderen over te dragen. Misschien is het nodig dat men een dergelijk proc6d6 zelf heeft toegepast om in te zien dat het menselijk oog nog zo’n kwaad aanpassings- instrument niet is. Het enige voordeel dat een vrije aanpassing veelal heeft boven een analytische, nl. de geringere bewerkelijkheid, die onder omstandig- heden zelfs ruimschoots tegen de genoemde nadelen kan opwegen, is in dit geval van weinig belang. Die vrije aanpassing wint het hier op dit punt nauwe- lijks van de toch we1 heel bewerkelijke p probit"-methode.

Het procidi van de aanpassing Tabel I geeft in de kolommen y (x - I ) y ( x ) en y ( x + I ) de dr-ie door

W i n s s e r waargenomen responsies bij ieder van de 70 onderzochte sera. Aangezien iedere y het percentage ongekleurde toxoplasmen uit een steek-

proef van 50 voorstelt, behoorden alley’s even getallen te zijn. Evenwel werd in enkele twijfelgevallen een exemplaar als half gekleurd genoteerd, waar- door 9 van de 210 y’s oneven zijn geworden. De kolom Zy geeft de som van deze drie responsies. De kolom x geeft de schatting van de dosis anliserum in de middelste serumdosis. Deze x werd telkens gevonden uit de bijbehorende Zy door aflezen in een dubbelschaal met x en Zy, die pas geconstrueerd kon worden nadat de vrije aanpassing voltooid was. In de kolommen Y (:u - I), Y ( x ) en Y (x + I ) staan de ,,aangepaste” responsies d.w.z. de responsies die volgens de aangepaste curven zouden behoren bij de schatting x . Men kan gemakkelijk verifieren dat de som van de aangepaste responsies steeds gelijk is aan de som van de waargenomen responsies. De schattingswijze van x kan

128

I

2

3 4 5

6 7 8 9

I0

I1

12

I3 I4 15

16 I7 18 19 20

21

22

23 24 25

26

28

29 30

31 32 33 34 3s

27

-

0

0

0

0

0

0

0

0

2

2

4 4 4

6

6

2

0

2 6 4

8 0

I2

I0

0

2

4 2

I0

I0

24 20

I2

I0

I2

0 0

0 0

0 2

2 2

2 2

2 2

2 4 2 6 4 4 6 4

4 4 2 8 6 4

6 4 2 I2

12 6 16 12

12 16 8 16

16 12

10 16 4 36

I 2 20

14 20

10 38

I4 32 1 0 44 8 54

1 5 52 20 50

74 40 20 48 22 54 24 56

0

0

2

4 4

4 6 8

I0

I2

I 2

I4 14 16 16

24 28 30 30 32

34 40 44 44 48

48 58 64 77 80

88 88 88 90

do FA 106

TABEL I Schattingen Toetsen

-4.63 -4h3

-4.63 -4, I4 -330 -3p49 -3.23

-3J3 -3,oI -3,oI -2,81 -2,81

-2,25

-2,07 -1p99 --Is99 --I,92

-1,86 -1,70 -1,60 -1,60 --1,52

--I,52 --I ,3 I

-1,zo -0.98 -0t93

-030

-0,80

-0,80

4 ! 7 7

tang Schattingen

x Y(x-I) Y ( x ) Y ( X + I )

36 37 38 39 40

41 42 43 44 45

46

48 47

49 50

51 52

53 54

Toetsen x.' xb'

12 34 60 106 6 24 80 110

14 40 56 I I O

6 50 66 122

4 50 70 124

14 60 90 164 20 58 88 166 28 62 76 166 5 2 54 60 166

56 57 58 59 60

40 59 72 171 22 80 82 184 66 60 60 186 52 68 68 188 42 72 74 188

61 54 72 66 192 62 I 58 67 74 199 63 52 62 92 206 64 40 82 84 206 65 , 56 72 80 208

66 57 67 85 209 67 66 70 75 211

68 70 74 76 220

69 ~ 70 80 82 232 70 ~ 78 88 92 258

_.______

I O , ~ 30,s 64,8 11,2 32,6 66,2 11,2 32,6 66,2 150 38,9 70~1 1393 4 O J ' 7Ot7

253 60,8 77,4 267 61,6 77.7 267 61,6 77,7 267 61,6 77.7 28,7 63,3 78.0

~- - Totaal Vriiheidser. 63 ,6 3

dus als volgt worden omschreven: Nadat de drie evenwijdige curven Y (X- I), Y (X) en Y (X + I ) getekend zijn, werden de drie ordinaten y ( x - I),

y ( x ) en y (x + I ) evenwijdig aan de X-as verschoven, totdat zij in een positie komen waarbij Zy = ZY. Het punt van de X-as waarbij dit het geval is, is de schatting x . Deze schattingswijze is zeker niet 1ooy0 efficient, maar we1 heel geriefelijk in het gebruik. Men behoeft immers niets anders te doen dan de drie waargenomen responsies op te tellen en dan uit een dubbelschaal of een tabel de bijbehorende x af te lezen.

Het feit dat van de waarnemingen alleen de ordinaat y bekend is en niet de abscis x , is de cardinale moeilijkheid voor de vrije aanpassing. Om de punten in de juiste positie te kunnen tekenen, moeten eigenlij k eerst de curven getekend zijn en om de curven te kunnen aanpassen, moeten eigenlijk eerst de punten in de juiste positie gebracht worden. Men is dus gedwongen tot een of ander systeem van successievelijke verbeteringen van de posities met behulp van voorlopige curven en vice versa.

Om deze taak wat te verlichten werden de 3 x 70 punten vervangen door 3 x 14 gemiddelden uit telkens 5 punten. Daartoe werden de 70 series in de eerste kolom van tabel I voorzien van rangnummers naar opklimmende Cy. Bij series met gelijke Zy werden de rangnummers verloot. Deze gemiddelden staan in tabel 2.

TABEL I1 Gemiddelden van telkens 5 waarnemingen

Rangnummers

I - 5 6 - 10

I 1 - 15 16 - 20

21 - 25 26 - 30 31 -35

41 - 45 46 - 50 51 - 55 56-60 61 - 65 66 - 70

36-40

5 (X - I)

Omdat de x-waarden van deze gemiddelden onbekend zijn, moeten ze, om te beginnen, zodanig in beeld gebracht worden, dat men x niet nodig heeft, b.v. door langs de abscis j ( G ) uit te zetten en langs de ordinaat (X -I >, (x) en 5 (G + I ) (Zie figuur I). Men kan dan op het oog zo goed mogelijk

passende krommen Y (X - I), Y (X) en Y (X - I ) tekenen. Vanzelfsprekend behoort Y ( X ) samen te vallen met de diagonaal. h4inder vanzelfsprekend is dat Y (X- I ) en Y (X+ I) onderling symmetrisch t.0.v. die diagonaal moeten zijn. Immers als Y (X+ I ) = Y (X'), dan behoort X+ I = X' te zijn en bijgevolg Y ( X ) = Y (X'- I). Meetkundig betekent dit dat een vierkant, met een diagonaal op Y ( X ) en een hoekpunt op (X+ I), noodzakelijk het vierde hoekpunt op Y (X - I ) moet hebben. Bij het verdere aanpassingsproces wordt de abscis waarden van iedere serie een weinig langs de abscis verschoven worden zodat ZF = ZY wordt. In

(i) vervangen door Y (X), d.w.2. dat de drie

Fig. I .

figuur I is deze bewerking nog niet uitgevoerd. De punten 5 (Z) liggen dien- tengevolge nog precies op de diagonaal. Die verschuiving gaat intussen niet gemakkelijk, want vrijwel iedere verschuiving maakt een correctie van de curven nodig en iedere correctie veroonaakt weer nieuwe verschuivingen.

Daarom werd ook figuur 2 getekend met 22' = Zj langs de abscis, waarbij men althans van die verschuivingen geen last heeft. De curven Y (X - I),

Y ( X ) en Y (X + I ) moeten nu zodanig getekend worden dat Zj = Z7', wat weinig bezwaar oplevert. Een duidelijk nadeel is echter dat deze figuur de eigenschap moet hebben dat een rechthoek die evenwijdig is met het assen- kruis, twee overstaande hoekpunten op Y ( X ) heeft en een derde h d p u n t Y (X + I), noodzakelijk het vierde hoekpunt op Y (X- I ) moet hebben, wat moeilijk op het oog te zien is.

In figuur I en 2 zijn een serie vierkanten resp. rechthoeken getekend, met telkens een gemeenschappelijk hoekpunt, die de genoemde eigenschappen van deze figuren demonstreren. Omdat er in beide series een hoekpunt valt in het punt Y (X) = 50 wordt hierdoor de positie van de punten X = -4, -3, -2, -I, 0, I en 2 op de Y- en 23'-schalen vastgelegd. Deze punten kunnen dus gebruikt worden voor de constructie van figuur 3, waarbij X langs de abscis is uitgezet. Ieder van de drie figuren kan uit iedere andere geconstrueerd worden, zodat iedere correctie in een figuur overeenkomstige correcties in .de beide andere nodig maakt. Zij werden gelijktijdig afgewerkt.

y(P) - - - - - - -

0

Fig. 2.

De dosis-werkingscurve Het meest opvallende feit in de figuren I -3 is dat de bovenste asymptoot

zeker niet bij Y = roo ligt, maar ergens bij Y = 82. Naar de verklaring kan men bij gebrek aan gegevens slechts raden. Het lijkt nogal vreemd dat 18% van de toxoplasmen tegen onbegrensd grote doses antiserum bestand zou zijn. Andere mogelijkheden zijn b.v. dat 18% na de dood toch blauw gzkleurd wordt, of dat het antiserum boven een bepaalde concentratie chemisch ge- bonden wordt. De waarnemingen wijzen ook op een onderste asymptoot ongeveer bij Y = 0,4. Dit is gemakkelijk verklaarbaar, doordat een kleine fractie kan sterven, zonder dat er antiserum aan te pas hoeft te komen.

‘33

Verder blijkt uit de figuren dat de getekende dosis-werkingscurve niet de symmetrie heeft van een cumulatieve normale- of van een logistische curve, want in dat geval zouden alle drie de figuren een symmetriecentrum moeten hebben: De ,,ste.zl” en de ,,top” van de beide bladvormige figuren I en 2 z0ud.m dan dezelfdz vorm moeten hebben, terwijl in figuur 3 de onderste asymptoot even snel benaderd zou moeten worden als de bovenste. Het ge- lukte niet om de figuren zodanig te wijzigen dat aan deze voorwaarden was voldaan, terwijl toch een redelijke overeenstemming met de waargenomen gemiddelden bewaard bleef. De bedoeling van deze poging was om achteraf

-5 -4 -3 -2 -1 Fia. 3.

toch nog tot een analytische aanpassing te komen met 4 parameters, 2 voor de beide asymptoten en z voor de cumulatieve normale- of 1ogistisch.e curve tussen de asymptoten. Een poging om het gewenste resultaat te lxreiken door middel van een formule met 5 parameters, mislukte eveneens.

Iedere aanpassing heeft de neiging om nog beter dan het universum zelf met de steekprosf overeen te stemmen, waardoor allerlei statistische toetsen achteraf geflatteerd dreigen te worden. Zoals bekend, heeft R. A. F i s h e r getoond hoe men dit bezwaar bij een analytische aanpassing vaak theoretisch onbcrisp2lijk kan opheffen, door zg. meest-efficiente schattingsmethoden te gebruiken en evenveel zg. vrijhcidsgraden af te trekken als er parameters geschat zijn. Bij een vrije aanpassing heeft men evenwel helemaal geen para- meters geschat. Men kan zich dan hoogstens afvragen hoeveel paxameters

men nodig gehad zou hebben voor een analytische curve van dezelfde gedaante als die, welke men uit de hand getekend heeft. Het is echter niet mogelijk om een tegenstander dwingend te overtuigen dat men het aantal parameters goed heeft geschat en dat de tekening zo goed is uitgevoerd, dat hij gelijk- gesteld kan worden met het resultaat van meest-efficiente schattingsmethoden van die denkbeeldige parameters. Het belang hiervan blijft voor dit onderzoek beperkt, omdat bij iedere strakke curve het aantal echte of denkbeeldige parameters weinig gewicht in de schaal zal leggen tegenover het aantal waar- nemingen; omdat de invloed daarvan nog tegengewerkt wordt door een even- tueel minder efficiente vrije aanpassing; en omdat b.v. bij de hierna te be- spreken toetsen op kettingen van gelijke tekens, die invloed met de beataande methoden toch niet in rekening gebracht zou kunnen worden, a1 was er geen gebruik gemaakt van vrije aanpassing.

Uit de vorm der curven van figuur 3 kan men opmaken dat het ,,aantal vrijheidsgraden” dat door de vrije aanpassing is verbruikt ongeveer 6 be- draagt: Een voor de positie op de abscis, twee voor de asymptoten, een voor de algemene stcilheid en twee voor de bijzondere curvatuur van de onderste en de bovenste tak.

Steekproeffouten Een bruikbaar uitgangspunt is de onderstelling dat de waargenomen

responsies y binomiaal verdeeld zijn met de bijbehorende schattingen Y als centrum en dat bijgevolg de verdeling van de grootheden T gedefinieerd als

(1) T = c ( y - Y ) en c2 = 50 : {Y (100 - Y ) }

enigszins nadert tot de normale met centrum o en variantie I.

Hier volgen enige opmerkingen over deze onderstellingen: I ) Het is van te voren lang niet zeker dat de y’s binomiaal verdeeld zijn,

want dit vereist 0.a. een perfecte techniek van menging, kleuring, steek- proefneming en beoordeling of een bepaalde Toxoplasma als gekleurd of ongekleurd beschouwd moet worden. Men zou zich verder kunnen voorstel- len dat een aanzienlijk gedeelte van de toxoplasmen op het critieke ogenblik in verschillende stadia van sterven verkeren en dat kleine oorzaken grote verschuivingen in de verhouding van gekleurde en ongekleurde exemplaren kunnen veroorzaken. Het lijkt dus verstandig om er niet a1 te zeer a priori op te vertrouwen dat de standaarddeviatie van de T’s beslist gelijk moet zijn aan I.

2) Het is bekend dat een binomiale verdeling beter tot een normale nadert, naarmate n (het aantal waarnemingen) groter is en naarmate de bide kansen P en Q van het binomium dichter bij elkaar liggen. De overeenstemming

hangt voornamelijk af van het kleinste der producten P n en Qn. Een binomiale verdzling met P = O , I , Q = 0,9 en n = 50 ligt, wat de overeenstemming met een normale verdeling betreft ergens tussen een binomiale verdeling met P = 4, Q = 4 en n = 10 en een Poisson verdeling met ,u (= Pn) == 5; en dichter bij de laatste dan bij de eerste. Noemen we nu de overeenstemming goed als P n en Q n minstens gelijk zijn aan 5 en slecht als dit niet zo is, dan is dus de overeenstemming van de in formule ( I ) gedefinieerde T goed als Y tussen 10 en 90 ligt en slecht als dit niet zo is. Bij inspectie van tabel I bl.ijken er 62 van de 198 Y ' s kleiner dan 10 te zijn en de betreffende T's dus slecht met da normale verdeling overeen te stemmen.

De gebruikelijke toetsen van de variantieanalyse zijn echter wcinig ge- voelig voor deze afwijking van de basisthesen, zolang de toetsfuncties een groot aantal waarnemingen omvatten, wat hier het geval is.

3) De Y's zijn slechts schattingen van de ideale centra 7 en voldoen aan de betrekking Zy = ZY. De drie T's van iedere persoon zijn dus gebonden aan de voorwaarde

die ken vrijheidsgraad verbruikt, zodat er voor iedere persoon twee over- blijven. Er zijn ook twee corresponderende complexen van oorzakeri te be- denken voor de verschillen tussen y en Y bij iedere persoon. Een van die complexen veroorzaakt de variabiliteit van J J ten opzichte van de ware q ( 5 ) curve van een bepaalde persoon. Het andere complex veroorzaakt de even- tuele variabiliteit van de q (5 ) curven van verschillende personen t.13.v. een soort gemiddelde 77 (6) curve van alle personen. Kort gezegd zijn lde twee complexen dus verantwoordelijk voor de variabiliteit binnen en tussen de personen. Dat men de mogelijkheid van een variabiliteit tussen de personen hier niet van te voren mag uitsluiten blijkt als volgt: Tot dusver was gemaks- halve aangenomen dat het szrum-antiserummengsel zich ten aanzien van de uitwerking op toxoplasmen gedraagt als een simpele oplossing van kkri actieve component in een indifferent medium, zodat men twce ongelij ke mengsels identiek zou kunnen maken door eenvoudige verdunning en twee ongelijke dosis-werkingscurven door eenvoudige verschuiving langs de abscis. Er zou dan geen plaats zijn voor enige variabilitcit tussen de individuen. Inderdaad is dit bij de grote meerderheid der biologische titraties het geval en dat is verwonderlijk genoeg, als men bedenkt hoe gecompliceerd de betireffende mengsels meestal zijn. Als er twee actieve componenten zijn, ieder met een eigen dosis-werkingscurve, of als er een actievz component is, die enige wissel- werking vertoont met een op zichzelf indifferente component, b.v. het gehalte aan het een of andere eiwit, dan moet dit a1 onherrocpelijk tot een inter-

-

individuele variabiliteit leiden. Dit komt b.v. voor bij diphterie antitoxine (5). De dosiswerkingscurven kunnen daar, doordat de analytische formule be- kend is, tot rechte lijnen getransformeerd wordw, maar deze zijn van verschil- lende personen niet evenwijdig. De eigznschappen van een diphterie anti- toxine kunnen dus niet door CCn parameter beschreven worden (de werkzame dosis), maar we1 door twee parameters.

Het ligt nu voor de hand om een van de twee vrijheidsgraden te gebruiken voor een component X b , die zo goed mogelijk de eventuele interindividuele verschillen zal opvangen en onafhankelijk (orthogonaal) is t.0.v. voorwaarde (2). De tweede component x,, is dan volledig bzpaald door de orthogonali- teitsvoorwaarden en zal tamelijk onafhankelij k zijn van inter-individuele verschillen.

O m een x b te construeren die aan de gestelde eisenvoldoet, werd de volgende redenering gevolgd: Stel dat er inderdaad verschillen tussen de werkelijke individuele dosis-werkingscurven bestaan en dat bijgevolg de curve I' ( x ) van figuur 3 slechts een soort gemiddelde van de werkelijke individuele curven voorstelt. Stel verder dat men van een bzpaald serum de ware respan- sies q ( x - I ), q ( x ) en q ( x + I ) zou kennen, maar niet de waarde van x . Hoz kan men dan nagaan in hoeverre deze ware individuele curve van de curve Y ( x ) zal verschillen? Aangezien men de positie op de abscis niet kent, zal men de indivi- duele curve horizontaal moeten verschuiven, totdat Zq = 27.' wordt. Als er nu in deze positie een verschil bestaat tussen de betreffende fragmenten der beide curven, dan zal dit in de eerste plaats een verschil in steilheid zijn. Is de individuele curve steiler, dan zal q ( x + I ) groter zijn dan Y ( x + I ) en tegelijk zal q ( x - I ) kleiner zijn dan Y ( x - I ) . Bijgevolg zal in dit geval T,,, de neiging hebben om positief uit te vallen en tegelijk zal T,, de nziging hebben om negatief uit te vallen. Is de individuele curve vlakker, dan zal het omgekeerde het geval zijn. In het algemeen kan men zeggen, dat bij aanwezig- heid van individuele verschillen TX-, en T,+, n e g a t i e f gecorreleerd zullen zijn. Wat T, in dit geval zal doen, valt a priori niet te zeggen, zodat men om dit mogelijk effect op te vangen het bzste een lineaire functie van all&n T>-, en T,,, kan nemen met coefficienten van tegengesteld teken. Heeft men een- maal aldus beslist, dan volgt de waarde van die coefficienten uit de orthogo- naliteit met formule ( 2 ) .

Dit leidt tot de volgende formules:

'37

In combinatie met ( I ) en (2) kunnen deze formules geschreven worden als

De waarden van 312 en x b 2 in tabel I zijn met dc formules (4) berekend. De tekens van x,, en x,, zijn tussen haakjes tongevoegd. Omdat er 6 ,,vrijheids- graden" door de vrije aanpassing verbruikt worden, ligt het voor de hand om aan de 66 xn's en de 66 xb's ieder 63 vrijheidsgraden toe te kennen.

Statist ische toetsen

individuele variantie van x b resp. gelijk zijn aan I . Uit tabel I blijkt dat de intra-individuele variantie van xa en de inter-

s,' = 85,6/63 = 1,359 sb2 = 200,3163 = 3,1;9

De laatste blijkt significant groter te zijn dan de eerste:

OE 2 ("log S 2 - lolog S2) 0,8686 = 0,4249 I-

uZ = \ 1/63 = 0,1260 ziUz = 3,37

Hieruit volgt dat de individuele dosis-werkingscurven niet gelijk zijn. Men zou dit experimented kunnen verifieren door met ieder van de twee personen met de grootste en de klcinste x b (nr. 51 met x,, = 2,9 en nr. 58 met xa =: - 5,3) een langz reeks metingen te verrichten. Dit betekent dat de individuele dosis-wzrkingscurven niet identiek zijn. Ook in dit opzicht vormt het serum- antiserum-mengsel tegen Toxoplasma een uitzondering op de regel. De middhte curve van figuur 3 is dus slechts een soort gemiddelde van de individuele curven der onderzochte personen. Men bedenke hierbij dat die personcn gcenszins als een homogene vrije steekproef te beschouwen zij n.

2. De intra-individuele variantie is zwak significant groter dan I :

z = '"log s2/0,8686 = 0,1534 o,= I' 11126 = 0,0891 Z/OZ = ',74

De eeiizijdzge overschrijdingskans bedraagt ongeveer 4y:A.Voor zover men deze significantie niet aan het towal wil wijteii kan de oorzaak daarvan o.a. zijn: I . Een minder goede aanpassing 2 . Een niet-binomial2 verdzling van de y's 3. Inter-individuele variabiliteit, die niet door x ,, geabsorbeerd is. Eeii bevredigende keuze tussen deze mogelijkheden ver2ist speciale aanvul- lende experimenten, maar sommige van de volgende toetsen zijn enigszins ontlastend voor de mogelijkheden I en 3.

3. Er kan geen afhankelijkheid worden aangetoond tussen xn en x b . Dit volgt zonder gereken uit figuur 4 en het is ontlastend voor een mogelijke rest van inter-individuele variabiliteit in xn. Bestond er zo’n rest, dan zou men ,enige afhankelijkheid tussen xo en x,, verwachten.

-3

-212 0 .,

In tabel 3 zijn een aantal toetsen samengevat die betrekking hebben op de verdelingen van za en x b afzonderlijk, gebaseerd op cumulanten. Hierin stellen kl en k, eenvoudig het gemiddelde en de variantie voor, k, en k, modi- ficaties van het derde en vierde moment, g, en g, maten voor scheefheid en

,curtose (6 blz. 153-155). TABEL 111

Curnufanten van xR en X b

kl k*

4. De toetsfunctie k, %/n : k, is niets anders dan het gemiddelde gedeeld door zijn standaardfout en dient om te toetsen of het gemiddelde significant van o afwijkt. Dit blijkt noch bij xa, noch bij x b het geval te zijn. Het zou be- lastend voor de aanpassing zijn, als dit niet zo was.

5. De toets op g, levert alleen een significante negatieve scheefheid van x b op. 6. De afwijking van de curtose g, is in geen van beide gevallen significant. De uitkomsten van de toetsen 5 en 6 zijn in twee opzichten opmlzrkelijk:

Dat er we1 een afwijking van de normaliteit bij x b werd geconstateerd, maar niet bij xn , kan geredelijk worden toegeschreven aan een sterke inter-indivi- duple component in x b , die bij dit heterogene mensenmateriaal misschien helemaal geen kansverdeling heeft en zeker geen normale. Dat er bij xa met deze toetsen gCCn afwijking werd geconstateerd, is overigens niet vanzelf- sprekend, gezien het grote aantal responsies, waarvan de binomiale vcxdeling slecht of zeer slecht met de normale overeenstemt. Men kan het zien als een illustratie van de ongevoeligheid voor oorspronkelijke afwijkingen van de normaliteit, die kenmerkend is voor vele toetsen uit de variantie-analyse. De xn ’s zijn ieder samengesteld uit drie responsies (formules I en 3 1, waar- door de normaliteit verbeterd wordt. Verder is de verzamling van 66 x,,’s niet CCn steekproef, maar een verzameling van 66 steekproeven van toevallige variabelen, die we1 alle hetzelfde centrum en dezelfde standaarddeviatie hebben maar overigens in verschillende mate van de normale verdeling afwijken. Men kan zich licht voorstellen dat een dergelijk aggrzgaat, als 66n steekproef beschouwd, beter met de normale verdeling overeenstemt dan de afzonderlij ke variabelen.

Iets scherpere toetsen om de aanpassing zo mogelijk te comprornitteren zijn af te leiden uit de kettingen (runs) van gelijke tekens van xfl en : [ a . Hoe langer deze kettingen zijn, of hoe geringer in aantal, hoe meer de aanpassing gecompromitteerd wordt. Tabel 4 geeft hiervan enige gegevens,

TABEL IV I’ositieue en negntieue kettingen -

Aantal positieve en negatieve

Alleen positieve tekens

tekens 66

Aantal tekens n1 ’ 38 29

Langste ketting S1 7 (nrs 1j-21) 5 (nrs 4-81 Aantal kettingen 71 ~ I 7 14

Aantal tekens ti2 I 28 37 Alleen negatievz tekens 1

Aantal kettingen 72 1 6 13 Langste ketting s2 4 (nrs 65-65) 8 (nrs 29-36)

7. Het kleinste aantal kettingen (r, = 13) vindt men bij de negatieve tekens van X b . Het centrum en de variantie van r, bij een toevallige teken- verdzling en bij gegeven nl en n,, volgt uit de volgende formules (8, 205):

87, = n2 (nl +- I) / n = 37.30/66 = 16,818 Vax r, = n, ( n p I ) (nl+I) nI/na (n-I) = 37.36.30.29 / (66.66.65) = 4,093 (72 - 8 7 2 ) / (d%t T S ) = - 3,818 / 2,023 = - 1,89.

Aangezien men bij een minder goede aanpassing een lage r, moet ver- wachten, behoort hier de eenzijdige (linkse) overschrijdingskans genomen te worden en deze bedraagt ongeveer 3% voor T = - 1,89. Dat is dus geen goede beurt voor de nauwkeurigheid van de aanpassing. Er zijn echter ver- zachtende omstandigheden: Deze 13 negatieve kettingen van X b zijn het ongunstigste van 4 mogelijkheden. Het aantal positieve kettingen van x b en de aantallen positieve en negatieve kettingen van x,, zijn niet significant kleiner dan de verwachting. Bovendien betrefi het de X b , waarin zeer waar- schijnlijk inter-individuele verschillen tot uiting komen en van deze behoeft niet verwacht te worden dat ze in een dergelijk geselecteerde groep van personen toevallig verdeeld zijn.

8. De langste ketting (8 tekens) treft men eveneens aan onder de negatieve tekens van X b en dit is natuurlijk een vmrname reden geweest waarom het aantal kettingen daar zo klein was. Wanneer echter eenmaal gegeven is dat voor de negatieve tekens van X b geldt n = 37 en r = 13, dan is de kans op een langere ketting ongeveer 50%. De complementaire kans, dat alle kettingen kleiner zijn dan s = 8, vindt men met de volgende formule (Zie appendix):

r! (n-r)! +) {n - I - j (s - I)}! j ! (r-j)! {n-r-j (s-I)}!

~ w S (Kettingen < s [ r, n) = z (-1y (n-I)! +o

22!

Oak in de andere 3 groepen is de langste ketting niet langer dan volgens het toeval verwacht kan worden.

9. Daar er enig verband tussen x en de tekens van X b blijkt te bestaan, ligt het voor de hand om ook nog te speuren naar correlatie tussen x en de abso- lute waarden xa2 resp. ~ 2 . Dit kan men doen door de waarden van x2 en xf naar de rangnummers in 6 groepen van 11 stuks te verdelen, voor alle groepen Z2 te berekenen en vervolgens de significantie van de verschillen tussen die 6 somsnen te bepalen. Iedere som gedeeld door I I is te beschouwen als een steekproef-variantie met 11 vrijheidsgraden van x,, of xa. Omdat de

*) Summatie voortzetten tot een der faculteitsargumenten negatief zou worden.

x ' s reeds ten opzichte van de aangepaste curve berekend werden, is het n.1. niet nodig om de quadratensom telkens ten opzichte van het groepsgemid- delde te berekenen en daarvoor een vrijheidsgraad af te trekken. Het toetsen van de verschillen tussen de 6 sommen staat dus gelijk met het toetseri van de verschillen tussen 6 steekproef-varianties met ieder I I vrijheidsgradcen, het- geen men met de toets van Bartlett (6, 83 - 84 of 7) kan uitvoeren. De nodige gegevens voor de twee toetsen van x," en xbz afzonderlijk en de uitkomsten daarvan zijn in tabel 5 vermeld.

TABEL V Bartlett's toets

Nrs

4-14 15 - 25

26- 36 37 - 47 48 - 58 59 - 69

Som

Log som

N P

X Z = zLf

0,8751 1,3344 0,9191 112553 1,1818 1,1761

6,7418 -~

0.8976 1.4594 1,5888 1,1903 1,8819 1,5198 -- 8,5378

De functie 2Lx is bij benadering verdeeld als x2 met (k - I ) vrijheids- graden, als k het aantal steekproef-varianties voorstelt en wordt in h.et alge- meen berekend met de formule:

2Lx = {N log Sz - Z (ni !og s:)} (log e)-l { I + (Zni-l--N-l) (3k-3)-1}.-x

Hierin betekent s: de steekproefiariantie in een afzonderlijke groep, met ni vrijheidsgraden, tenvijl P de gecombineerde steekproefvariantie over alle groepen voorstelt, met N vrijheidsgraden. Hiervoor geldt dus:

NS2 = en N = Zn,. De sommaties lopen steeds van i = I tot i = k.

In ons geval zijn alle nifs gelijk aan 11, en s: = Zx2 : 1 1 . Substitueert men dit in de formule van B a r t 1 e t t, dan kan deze herleid worden tot:

zLx = (66 log ZZxz - 1 1 ,Y log Zx2 - 66 log 6) (log e)-l { I + (6 : 1 1 - I : 66) : 15}-l

= (66 log ZZx2 - 1 1 Z log -Ex2 - 5 1 , 358) : 0,450.

De enige getallen die hierin nog uit tabel 5 gesubstitueerd moeten worden zijn:

log zzx(I" = 1,9325 log zzxp2 = 2,3017

Z log ~2 = 6,7418 2 log xa2= 8,5378

waarna de b i d e in tabel 5 vermelde waarden van 2L* ontstaan. De significante verschillen tussen 2%: moeten weer op rekening van de

inter-individuele variabiliteit gesteld worden. Deze is blijkbaar verschil- lend in verschillende horizontale z8nes: Bij lage doses is er weinig verschil tussen de hellingen der individuele dosis-werkingscurven (nrs. 4 - 14) en in de buurt van X = 0,s zijn de verschillen bijzonder groot (nrs. 48 - 58).

De nauwkeurigheid van de schatting x Overziet men de significante resultaten van de statistische toetsen, dan

blijkt dat aan xo slechts een variantie, die iets te groot is voor de binomiale verdeling, ten laste kan worden gelegd, waarvan de interpretatie verhinderd wordt door een overmaat van mogelijke verklaringen. Daarentegen kan het strafregister van xa (een scheve verdeling met een variantie die groter is dan van xa, benevens afhankelijkheid van x , zowel in teken als in absolute waarde) geredelijk aan inter-individuele variabiliteit worden toegeschreven. Het is dus vrijwel zeker dat de individuele dosis-werkingscurven niet gelij kvormig zijn. Een gevolg hiervan is dat x geen zuivere schatting is van de ,,ware" logarithmische dosis 6, maar we1 van een gemodifieerde dosis 6 die het serum zou bevatten als de betreffende individuele dosis-werkingscurve zou samen- vallen met een soort gemiddelde dosis-werkingscurve 6 (6) van de onderzochte personen. Alleen voor de afwijking van x ten opzichte van 6 heeft men de bepalingsfout onder contrde, want x is een bekende functie van Zy en de variantie daarvan volgt uit

-

-

-

sZy2 = sa2 ZC-~, wegens formule ( I ).

Over het verschil tussen 6 en 6 tast men in het duister. Misschien bestaan de ,,ware" individuele doses 6 zelfs helemaal niet, n.1. in het geval dat de inter- individuele variabiliteit veroorzaakt zou worden door twee verschillende antisera, waarvan de doses niet totaal gecorreleerd zijn. xl, is te beschouwen als een onnauwkeurige schatting van een tweede parameter naast Zj of x.

-

APPENDIX

A p r a c t i c a l f o r m u l a f o r t h e l o n g e s t r u n In the textbook of W i 1 k s, a formula of M o s t e 1 1 e r is recorded

(p. 204), for the probability that all runs of one kind will be shorter than s, if only the numbers nl and n2 of the two kinds of elements are fixed. For prac- tical application the formula has two draw-backs: It requires that n, = n2, which is seldom the case and it contains a double summation, which often makes the computation impracticably heavy. Both objections may be avoided by considering n, and r, as fixed. In this case the runs and elements of the other kind are no longer of importance and the suffix may be omitted.

The following formula may be easily derived from certain results, recorded by Wilks:

{n-I-j (s-I)}! J! (r-j)! {n-r-j (s-I:)}!

__ r! (n-r)! *) 9’d (all runs < s 1 r, n) = z (-1)i 7- (n-I)! i=,,

Derivation Joint distribution of the rlj, W i 1 k s page 202, (d):

Distribution of r,, W i 1 k s page 202, (e):

P (71) = (nF) r - I (5) / (i). Joint distribution of the rlj, given 71:

Probalility of all runs shorter than s, given 71 :

Summation of multinomial coefficients over all partitions satisfying

= rl,s+l = . . . = 0, w i 1 k s page 204, line 6 :

If this is substituted in the previous formula, the formula of 9?. (runs < 5: 1 7, n) stated above follows, if the suffix, which is no longer of use, is omitted.

*) Continue summation till at least one factorial argument would become negative. . . ~ ~ _ _