Metabolomiks ve Anne Sütü: Anne Sütü Alan Bebeklerde

Mikrobiyotanın Gelişimi

Prof.Dr.Ferit SaraçoğluYİSAV

• İnsan Genom Projesi (2003) insan vücudunda 30,000-40,000 gen bulunduğunu, bunların %99.9’unun tüm bireylerde aynı, %0.1’inin farklı olduğunu ortaya çıkarmıştır.

• %0.1’lik fark neden bazı kişilerin hastalık riski taşıdığını, hastalıkların şiddetinin kişilerarası farklılık gösterdiğini, bazı kişilerde ilaçlara daha iyi yanıt alındığını açıklamada önemlidir

• Genlerin tanımlanması ile bilinmeyenler tamamen çözümlenememiş, bu genlerin fonksiyonları araştırılmaya başlanmış, proteomik ve transkriptomik çalışmaları yapılmıştır. Ancak bu araştırmalardan elde edilen bilgiler, klinik fenotipleri açıklamak için yeterli olmamıştır. Çünkü, klinik fenotipi belirleyen bilgi hücrede oluşan metabolitlerde saklıdır .

• Günümüze kadar biyokimyacılar bugünün normalini ve hastalıkları anlamada kullanılan metabolik yolların büyük bir kısmını bulmuştur. Bulunanlar insan hayatının kalitesini ve süresini artırmada kullanılmış ve bugün yeni teknolojiler ve veri değerlendirme yöntemleri ile daha da geliştirilmeye çalışılmaktadır

• “Metabol” = değişmek “-ome” = küme demektir.

• Metabolom = Canlıdaki metabolizmanın tümü

• Metabolomik = Metabolom un çalışılması ( metabolomdaki küçük moleküllü metabolitlerin yüksek verimli teknolojiler kullanılarak saptanması, miktarının belirlenmesi ve tanımlanmasıdır).

• İnsanlarda en az 2-3 bin en fazla 20 000 metabolit olduğu düşünülmektedir

• Metabolomik çalışmalarında iki teknoloji kullanılmaktadır; bunlar

1- NMR ( örnekteki tüm metabolitleri tanımlayabilir , konsantrasyonlarını saptayabilir)

2-Değişik kütle spektrofotometreleridir (NMR ı tamamlar, daha hassas olarak tüm metabolitlerin profilini çıkartır)

• Metabolit profilleri bilgisayarlarla uygun programlarla işlenir,saklanır, sonuçlar değerlendirilir (Biyoinformatik)

İnsan Metabolom Projesi (HMP)-Kanada,2005

• Bu proje ile insan vücudunda idrar, BOS, plazma ve lökositlerde 1 mikro molardan daha fazla konsantrasyonda bulunan tüm metabolitleritanımlamak, ölçmek ve normal-anormal değer aralığını belirlemek, bu verilerin serbestçe elektronik ortamda elde edilebilir olmasını sağlamak (Human Metabolome Data BaseHMDB) amacıyla yapılmıştır

• Tanımlanan bileşiklere halkın ulaşmasını sağlayacak bir kütüphane (Human Metabolome Library -HML) oluşturmak amaçlanmıştır.

• HMP tamamlanmıştır, sonuçlara www.hmdb.ca adresinden ulaşılabilir

• Anne ve anne sütü alan bebeğin diyeti özel bir model oluşturmaktadır. Bu modelin incelenmesi önemli verilere ulaşılmasını sağlamaktadır

• Bu amaçla sütün genomiği , kimyasal kompozisyonu, biyolojik özelliklerinin ve memeliler arasındaki ve laktasyon dönemindeki değişkenliklerinin incelenmesi gerekmektedir.

• Sadece anne sütü almayla, kullanılan değişik mamaların yapıları klinik olarak karşılaştırılmalı, sağlık ve hastalıklar üzerindeki etkileri açığa çıkartılmalıdır

• Anne sütü ve meme üzerinde yapılacak çalışmalarla bu mekanizmanın korunma ve önlemedeki rolü daha iyi belirlenmelidir

• Meme epitel hücresi biyomühendisliğin temeli olan biyoraktör kompleksini oluşturmakta ve bebekte

• bağışıklık, • büyüme ve gelişme, • metabolizma, • fizyoloji, • nörolojik gelişme, • mikrobiyotanın kolonizasyonu • Mikrobiotanın olgunlaşmasını sağlamaktadır

• Sütün bileşenlerini eski biyokimyasal yöntemlerle tam olarak açığa çıkartmak mümkün olmayıp, yeni teknolojilerin kullanılması gerekmektedir

• Omik bilimler ve özellikle metabolomik ile sütün yapısına ait tüm detaylar ortaya çıkartılabilir

• Süt meme metabolizmasının fonksiyonel çıktısıdır. Biyolojik bir sıvı olup anne genetiğinden , sağlık durumundan ve çevre koşullarından etkilenebilir

• Anne sütüne uygulanan metabolomik lerin ilke ve teknolojilerinin uygulandığı en önemli alan glikomikerdir.

• Glikomikler bol miktarda ve değişik çeşitleri olan glikanların, bunlardan gebeliğe özgü olan insan sütü oligosakkaritlerinin, glukozile proteinlerin, peptidlerin ve lipidlerin araştırılmasıdır

• Glikanlar kalın bağırsaklara kadar ulaşabilmekte, dışkıyla atılmakta ve sağlıklı bebeklerin dışkılarında ölçülebilmektedir

• Şayet süt bebek için sindirilebilir bir besin olarak düşünülüyorsa bu bir tezat oluşturmaktadır

• Bu tezat anne sütü alan bebeğin bağırsaklarında sağlıklı bir mikrobiota oluştuğunda ortadan kalkmaktadır. Çünkü mikrobiotadaki bakteriler glikanları sindirmekte ve büyümelerinde kullanmaktadır

• Anne sütü ve bağırsak bakterileri arasındaki ilişki bebeğin doğum sonrası gelişimini şekillendirmekte, patojenik bakteriler, virüsler ve toksinlerden korumaktan, nörolojik ve bağışıklık sistemlerini geliştirmeye ve bağırsak epitelinin bariyer işlevini arttırmaktadır

• Sütteki glikanlar oldukça seçici sindirilebilirliğe sahip olmanın ötesinde, steril uterustan çevre bakterilerinin ve süt kaynaklı bakterilerin oluşturduğu, son derece karmaşık bir bağırsak mikrobiyotasına geçişi düzenlemektedir

• Tüm glikanların metabolitlerinin, bakterilerin seçici metabolizmasıyla dönüşümü ve insan vücuduyla olan etkileşimleri, metabolizmanın bir diyet değişkeni olarak tanımlanmasına ve diyetle metabolizmanın bakteri gelişimi üzerindeki yapı ve fonksiyon ilişkisini incelemek için bir fırsattır .

• Bu çalışmalar yaşam boyunca, karmaşık beslenme kompleksi ve mikrobiyota ilişkisi için daha geniş bilgiler sağlar. Temelde, sütün glikan metabolomunun yapı ve kompozisyonunun kapsamlı ve doğru bir şekilde ölçülmesi yer alır.

• Glykobiyoloji, anne sütündeki protein, peptid ve lipitlere bağlı glikanları ve serbest oligosakkaridlerin ölçümü için gerekli analitik cihazların bulunması kısa süre önce gerçekleşmiştir

• Yeni cihazlar tek başına yeterli değildir. Sonuca gidebilmek için kütle spektrometrisi ile ayırma teknolojisinin , enzim biyoteknolojisinin ve biyoinformatiğin olması gerekmektedir. Böylece elde edilen sonuçlar dijital olarak ulaşılabilen kütüphanelerde depolanabilir

• Bu teknolojik gelişmeler, glikanların anne sütünün ana bileşeni olduğunu, laktasyon döneminde kadınlar arasında hem yapı hem de fonksiyonlar olarak farklılıklar gösterdiğini ortaya çıkarmıştır. (Smilowitz JT ve ark. Jnutr 2013, Molinari CE ve ark. Br J Nutr 2012, Froehlich J ve ark. J Agr Food Chem 2010, Uchiyama S ve ark. Nutrition 2011, Liao Y ve ark. J Proteome Res 2011, Ruvoeon Clouet N ve ark. Biochem J 2006)

Metabolomiks ve İnsan Sütü• Bilimsel araştırmalarla, sütün oluşumundan fonksiyonları başlayana dek ,

DNA ve RNA nın şifrelerinin çözülmesi basitleşmiştir.

• Lineer sekanslamanın basitleşmesi bilim adamlarının DNA'ya bağlı biyolojik işlemleri açıklamalarına olanak sağlamıştır. Ancak metabolizma bu basitliğe sahip değildir ve eski moda yöntemlerle karmaşık yapısının ölçülmeye çalışılması yeterli sonuç verememektedir

• Bilim adamları , günümüzde gelişen teknolojiyle ve yeni cihazlarla gerçek biyolojik durumu yansıtan doğrulukta, hassasiyette ve içeriğin tümünü ortaya koyan ölçümler yapabilmektedir

• Günümüzde gıda araştırmalarının temel amacı, tarımsal ürünlerin genetiğini, yapılarını , metabolizmalarını ve tüketicilerin sağlıkları üzerindeki etkilerini öğrenmektir

• Birinci adım, tarımsal ürünün büyümesini ve işlenmesini gösterecek, fenotip ve genetik çalışmalarla yapısının belirlenmesidir

• Sonraki adım diyetle alınan besinin insan metabolizmasını nasıl kontrol ettiğinin anlaşılmasıdır

• Özellikle yüksek organizmalarda yapı ve fonksiyonların anlaşılması oldukça zordur. Bu organizmaların 3 boyutlu yapılarının fonksiyonları çevre faktörleri de dikkate alınmak suretiyle anlaşılmaya çalışılır

• Teknikler yeni yeni ortaya çıkmaya başlamıştır.

• Süt ve mikroorganizmalar arasındaki etkileşim, diyet metabolomiği için bir model olarak kullanılabilir.

• Buradan elde edilecek bilgiler yüksek hayvanlar daki diyet ve metabolizma arasındaki ilişkinin anlaşılabilmesi için öğreticidir.

Süt Glycomiksleri

• Glikanlar filogenetik ağaçta biyopolimer grubunda yer alırlar . Enzimatik metabolizma ürünleridir. Bol miktarda bulunmalarına rağmen ihmal edilmişlerdir

• Sağlık ve hastalıklardaki önemlerine rağmen kodları sekanslanmamıştır.

• Metabolik sentezlenmenin bir sonucu olarak, sütte görülen yapısal çeşitliliğe büyük katkıları vardır

• Bir glykanın karmaşıklığı, dallanmasına, bağlanan farklı şekerlerinsayısına, bu şekerlerin stereospesifik c bağlarına ve bunların tümünün tek bir kitle içerisinde çok sayıda izomere yol açmasına bağlıdır

• Glykanlar serbest veya heterojen biçimde, ama stereospesifik bir şekilde tekrar proteinlere, peptitlere veya lipidlere bağlı olabilirler

• Biyoloji, metabolizma ve yapısal çeşitlilikleri tanımlayabilmek için glikobiyolojiden faydalanmaktadır. Belki de şaşırtıcı olmayan bir şekilde, evrim boyunca, hücrelerin yüzeyindeki glikanlar ‘’bana ait’’ ve ‘’yabancılar’’ diye ayrılarak bireyselliğin moleküler temelini oluşturmuştur

• Çeşitliliğin boyutu biyolojik organizmaların değerini belirlemektedir. Ancak bir genetik şablonlarının olmaması araştırmacıları çok zorlamaktadır. Tanımlanabilmeleri için her glikanın ayrı ayrı incelenmesi gerkmektedir

• Biyolojik ve klinik örneklerde glıkanları rutin olarak ve kapsamlı bir şekilde ölçmek için teknolojilere ve metodolojilere yönelik araştırmalar sürmektedir. Böylece glikobiyolojiye niceliksel (kantitatif) , metabolomik bir yaklaşım mümkün olabilecektir.

• Glikomiksler, bir organizmada bulunan, serbest ya da proteine veya lipidlere bağlı şeker bileşiklerinin tümünün araştırılmasıdır

• Araştırmacılar şimdi glikomiksi, diyetle sağlık arasındaki ilişkiyi anlayabilmek için, laktasyon, süt ve kompleks glikanların yenidoğanıngelişimindeki rolü yönünden araştırmaktadır.

Süt Oligosakkaridleri

• Süt glikobiyolojisi yeni bir alan olmayıp, biyolojide glikanların rollerinin çoğu süt incelenerek bulunmuştur. Ancak glikanların karmaşık yapısı ölçümlerin ötesinde yapı ve fonksiyonların ortaya çıkartılmasında büyük zorluklar yaşatmaktadır

• İnsan sütünde bolca bulunmaları ve yeni doğan tarafından sindirilememeleri nedeniyle, oligosakkaritler (% 1-2 w / v) araştırmacıların büyük ilgisini çekmiştir. Bu konuda araştırmalar yapan büyük laboratuvarlar bulunmaktadır

• Bu laboratuvarların analitik glikomikse getirdikleri devrim, ayırma biliminde, enzim biyoteknolojisinde, kütle spektrometrisinde, otomatik kütüphane geliştirmede ve hesaplama araç setlerindeki buluşların bir sonucudur

Oligosakkaritler

• Biyoteknoloji ile ekstrake edilebilen karbonhidratlardır

• Normal karbonhidratlar değildir

• Vücut için faydalı, basit şekerlerin bağlandığı 3-10 bağları vardır

• Enginar, kuşkonmaz, hindiba , soğan, mercimek ve buğday çimi gibi bitkilerde bulunur

Oligosakkaritleri Ayrıştırma Bilimi• Sıvı kromatografisi glikanları ayırmada kullanılmıştır ancak ne normal ne de

ters durağan fazlar yapı içerisindeki çeşitli glıkanları başarıyla ayrıştırmak için gerekli güce ulaşamamıştır. Yıllarca glikanları topluca ayrıştırabilmek için gözenekli grafitlenmiş karbonlar (PGC) , sabit , selektif faz olarak kullanılmıştır . Ancak kısa bir süre önce doğal oligosakaritlerin analizi içinPGC yi, HPLC nin durağan fazı olarak kullanabilmek mümkün olmuştur (Ninonuevo MR ve ark. J Agric Food Chem 2008)

• Bir HPLC sisteminde yüksek etkinlik, yüksek tekrarlanabilirlik ve sabit faz seçiciliğinin bir araya getirilmesi glikan izomerlerinin geniş olarak ayırımınıyapabilen birinci jenerasyon ayırma platformlarının temelini oluşturmuştur(De Leoz ve ark. Anal Bioanal Chem 2013)

• Oligosakkarit ve glikan analizlerinin geleceği, seçicilik, stereospesifikasyonun etkinliği ve kantitatif veri almadaki gelişmelere bağlıdır

Glikan Yapısının Stereospesifitesi

• Lycanlar bir şehir için orman ne kadar gerekli ise o kadar önemlidir ve sayıları çok büyüktür. Lycanlar glikan polimerleri olup stereospesifikenzimatik reaksiyonların tümüdür. Biyolojide bulunan gerçek yapı sayısı, modern analitik ve kütüphane sistemleri tarafından yönetilebilecek sayıda ve erişilebilir durumdadır. Yine de, kesin oligosakkarit yapıları şiral ayırma evrelerinde kesin olarak tanımlanamaz ve bunun yerine eski bir yöntem olan stereospesifik enzimlerle parçalanarak analiz yapılması kullanılır.

• Oligosakkaritlerin yapılarını açığa çıkartmada muhtemelen stereospesifikenzimlerin kullanılması en uygun yöntem olmaya devam edecektir. Çünkü biyolojik bir kaynak doğru bir şekilde tanımlandıktan sonra, her sonraki analizde stereospesifik analizleri yapmak gerekli değildir. Bunun doğruluğu değişik süt oligosakkaritlerinin sterospesifiteleri araştırılırken görülmüştür ( Sela DA ve ark. Appl Environ Microbiol 2012).

• Kullanımdaki kütle spektrofotometrilerinin ve ayrıştırma platformlarının doğruluk oranları ve glikan yapılarının karmaşıklığı göz önüne alındığında, günümüzde doğru metabolomiklerin kurulması çevrimiçi tanımlama sistemleriyle mümkün olamamaktadır.

• HMO ların yapılarının tanımlayacak etkili yöntemler kurulabilmesi için detaylı kütüphanelerin inşası gerklidir. Böylece MS, tandem MS ve exoglycosidase kombinasyonunun avantajını kullanarak yapıların analitik platformlarda haritalanması sağlanabilmektedir. (Lebrilla CB. Epub 2013)

• Bu yolla insanlarda normal ve anionik süt oligosakkaritlerinden 75 yapısal isomer gösterilebilmiştir. Diğer memelilerden elde edilen sütler de devreye sokulduğunda yaklaşık 200 değişik yapı tanımlanmıştır. Bu temel strateji insan süt biyolojisine yapılan uygulamaların büyük çoğunluğu için uygundur, çünkü 50 yapı, insan sütlerinde oligosakkaritlerin toplam% 99'unu temsil etmektedir

(Wu S ve ark. J Proteome Res 2010, Wu SA ve ark. J Proteomo Res 2011, Ninonuevo M ve ark. Electrophoresis 2005).

• Metabolomiks biyolojik örneklerin yapılarını tanımlayabilirken metabolitlerinin mutlak miktarlarını belirleyememektedir.

• Metabolomun bir alt kümesi olarak, glikanların miktarlarının saptanması glikobiyoljide metabolomiğin önemli sorunlarından birisi olmaya devam etmektedir.

• Spektral dedektörlerin olikosakkaritleri ayırt edebilmeleri için gereken kromoforları yoktur. Bu nedenle, oligosakkaritlerin ölçülebilmesi için genellikle antranilik asit (AA) veya 2-aminobenzamid (AB) ile işaretlenmeleri gerekir

• Bugüne kadar glikanların iyonizasyonlarının değişken olması nedeniyle oligosakkaritlerin kütle spektrometresiyle ölçümleri yapılamamaktadır. Bu nedenle metabolitlerin ölçümüde büyük bir sorun olarak durmaktadır (Leo F ve ark. Biosci Biotechnol Biochem 2010)

• İlk memelilerde ve keselilerde oligosakkaritlerin varlığı gösterilmiştir ( Messer Eve ark Carbonhydr Res 1980). Böylece, memelilerde emzirme süresince sindirilemeyen karbonhidrat biyopolimerlerinin varllığı avantaj sağlamaktadır. Bu avantaj insanlara gelinceye kadar devam etmiştir.

• Anne sütünde diğer memelilerin sütlerine göre daha büyük konsantrasyonlarda ve daha çeşitli , çözünebilir olikosakkaritler bulunmaktadır. Sütteki ortalama miktarı 7 g/L, kolostrumda ise 23 g/L dir ( Coppa GV ve ark. Pediatrics 1993, Gabrielli O ve ark. Pediatrics 2011).

• Çözünebilen oligosakkaritler glikoz (Glc), galaktoz (Gal), N-asetilglukosamin (GIcNAc), fukoz (Fuc) ve sialik asit (NeuAc) monosakaritlerden oluşur.

• İnsanlarda meme bezinde oligosakarit sentezi, α-lactalbumin varlığında β-galactotransferase tarafından katalize edilen glukoz ve galaktozun merkezinde yer alan bir laktoz tarafından başlatılır. HMO yapılarının büyük çoğunluğu bu laktoz çekirdeğe dayanmaktadır (23). Laktoz, daha sonra β1–3 bağıyla lacto-N-biosa, (GlcNAc, Galaktoza β1–3 bağıyla) veya β1–6 bağıyla N-acetyllactosamine (GlcNAc, β1–4 bağıyla galaktoza bağlanır

• Bu artan zincir yapısı β1-3 ve β1-6 bağlarıyla lakto-N-biose ve N-acetyllactosamine bağlanarak dahada uzayabilir; Fuc, α1–2, α1–3, or α1–4 bağlarına bağlanır ve/veya NeuAc artıkları, terminal konumlar (Şek. 8.3) de α2-3 ya α2-6 bağlarıyla bağlanmış α1-2, α1-3 veya α1-4 bağlantılar ve / veya NeuAc artıkları α2–3 veya α2–6 bağlarıyla terminal pozisyondan bağlanır

• Terminaldeki şekerler değişik memelilere ait sütleri ayırt etmede kullanılır. İnsan sütündeki HMO ların % 60-80 i fucosialize iken % 10-15 i sializedir

İnsan Sütündeki Glikanların Fonksiyonlarının Açıklanması• Anne sütündeki oligosakaritler yapıları ve bebek tarafından

tüketilememeleri nedeniyle önemli bir biyolojik değere sahiptir. Memelilerde bebeğin tek gıdası anne sütü olduğundan her annenin bebeğini emzirmesi ısrarla istenmektedir.

• Anne sütündeki oligosakaritlerin genetiği, sentez ve yapılar tümüyle saptanabilecek durumdadır. Ancak oligosakkaritlerin fonksiyonlarını tespit edebilmek kolay değildir. Bu fonksiyonların önce anlaşılması, ardından da mekanik biçimde in vivo etkinin doğruluğunun test edilmesi gerekmektedir

• İnsan sütündeki oligosakkaritlerin eylemlerini ve potansiyel fonksiyonlarını değerlendirmek için, günümüzdeki en uygun yaklaşım bakterilerin özgül suşlarının, özellikle bifidobakterilerin büyümelerini destekleyip desteklemediğidir ( LoCasico RG ve ark. J Agric Food Chem 2007, Sela DA ve ark. Trends Microbiol 2010).

• Anne sütü alan bebeklerde bağırsaklardaki mikrobiyota ve bakteriyel çeşitlilik halen yoğun olarak çalışılmaktadır. Anne sütü alan bebeklerde, mama alanlara göre bifidobakterilerin mikrobiotaya hakim olduğu saptanmıştır (Roger LC ve ark. Microbiol 2010).

• Bebeklere deneysel olarak çevreden diğer bakteri suşlarının inokulasyonubağırsaktaki hakim olan bakteri popülasyonunu değiştirmemektedir.

• Araştırmalar sütteki oligosakkaritlerin yapılarındaki stereospesifik bağlarla , stereospesifik glikozidazların genetik repertuarı ve çözünenlere bağlanan proteinler arasındaki etkileşim anne sütü alan bebeklerin bağırsaklarındaki mikroorganizmaların kompetetif büyümelerine fırsat vermektedir

Oligosakkaritler ve Bakteri Büyümesi

• Devam eden çalışmalar anne sütündeki bol miktarda ve çeşitli yapılarda bulunan oligosakkaritlerin bağırsak bakterilerinin büyümesi için gerekli bir substrat olduğunu düşündürtmektedir (Hipotez). Ancak henüz büyümenin bakteriler arasında selektif olup olmadığını gösteren hiçbir çalışma bulunmamaktadır.

• Başlangıçtaki çalışmalar , destekleyici mediumlar olmaksızın, insan sütü oligosakkaritleri yegane karbon kaynağı olduğunda bakterilerin büyümediğini göstermiştir (LoCasico RG ve ark. J Agric Food chem 2007)

• Bağırsak bakterileriyle yapılan testlerde (Lactobacillus, Clostridium, Eubacterium, E. coli, Veillonella , Enterococcus dahil ) sadece Bifidobacterium ve Bacteroides lerin yoğun olarak büyüdüğü görülmüştür (Marcobal A ve ark. Cell Host Microbe 2011).

• HMO ile seçilmiş B.bifidum ve B.longum subtiplerinin büyüdüğü, bazı B. Longum tiplerinde ve B.breve deki büyümenin yavaş olduğu, B. adolescentis ve B. animales de ise büyüme olmadığı anlaşılmıştır (LoCasico RG ve ark. Microb Biotechnol 2009).

• Sütteki oligosakkaritlerin bebeğin bağırsak ekosistemindeki bakterilerin büyümesiyle ilgili karmaşık mekanizma mikroorganizmalarla, özellikle oligosakkaritleri tüketen bifidobakterilerin substrat olarak kullanıldığı çeşitli çalışmalar yapılmasını sağlamıştır

• İzole, insan sütü oligosakkaritlerinin tüketildiği bakteri büyüme çalışmalarında B.longum un bir alt tipi olan ATCC15697 suşunun , 7 veya daha az şekere sahip oligosakkaritleri en etkin biçimde tüketen bakteri suşu olduğu bulunmuştur (LoCasico RG ve ark. J agric Food Chem 2007). İnsan sütündeki oligosakkaritlerin çok büyük çoğunluğu 10 veya daha az şeker içermektedir (Ninonuevo MR ve ark. J Agric Food Chem 2008).

• Diğer bifidobakteriler, B. longum sub tipleri, B. longum DJO10A ve B. breve ATCC15700 HMO ile yavaş büyümektedir. Bunların, çoğunlukla tek şekerli fucosiylatlanmamış / siyalatmamış tipleri kullanmaktadır. Tüm HMO düşünüldüğünde bu yapıdaki LNnT lerin insan sütündeki HMO lerinin küçük bir bölümünü oluşturmaktadır. B. breve ise HMO içerisindeki tüm monomerle büyüyebilmektedir. Bu nedenle GIS içerisindeki monosakkaritlerle rahatça büyüyebilir

• HMO ile büyüme yeteneğindeki bakterilerin, sialidaz ve fucosidaz ile karmaşık glikanları yıkan, kompleks oligosakkaritlerle olan metabolik aktiviteleri incelenmiştir

• İncelenen suşlardan fucidase aktivitesi sadece B.longum un bir alt tipi olan infantis te bulunmuştur ve HMO da büyüyen yegane bakteridir (LoCasico RG ve ark. J Agric Food Chem 2007)

• İntestinal bakterilerin karmaşık biyopolimerleri yıktığı bilinmektedir. İntestinal bakterilerin çoğu ekstraselluler glukozidaz enzim sekresyonu yaparak şekeri serbestleştirmekedir. Serbestleşen şekerler bakteri tarafından alınarak metabolize edilmektedir.

• Bifido bakteriler lacto-N-biosidase (LNB) aktivitesiyle oligosakkaritleri parçalamaltadır (30). LNB ABC transsporter ile B.bifidum içerisine taşınır ve burada LNB ye özgül solut bağlayıcı proteine bağlanarak merkezi metabolik yolda işlenir (Suzuki R ve ark.J Biol Chem 2008)

• İnsan sütü oligosakkaritlerinde büyüme yeteneğine sahip olan yegane bakteri B.longum un alt tipi olan ATCC15697 , HMO ile karşılaştığında hemen genomunu sekanslamaktadır. Bu mikroorganizmanın genetik repertuarı bilinmemektedir ve araştırma konusudur. Elde edilecek sonuçlar ATCC15697 nin, özgül glikanbüyümesinin ve fenotipinin detaylarını verecektir (Sela D ve ark. Proc NatlAcad Sci 2008)

• Bu suşa ait gen kümeleri, genomu 4 lokusta toplanmış , eşsiz bir fenotipe sahiptir. En bilgi verici olan 1. kümedir ve gerekli glukosidasları (sialidase, fucosidase, galactosidase, ve hexosaminidase) HMO ları metabolie edebilmesi için taşıyıcalaraihtiyacı vardır

• Metabolomiğin bakteriyel modeli , metabolik yolların ne kadar karmaşık olduğunu göstermektedir. Büyük HMO kümeleri içerisinde genlerin kodladığı hücre dışı bağlayıcı proteinler oligosakkaritleri bağlamaktadır.

• Bu proteinlerin anne sütüyle beslenen bebeklerin bağırsaklarında, bakteriye yönelik iki fonksiyonları vardır. Çözünmüş bağlayıcı proteinler, bebek bağırsak lumen tarafında glıkanlara bağlanarak , mikropların bağlanableceği tüm bağları doldurup, patojen mikropların bağlanmasına engel olurlar .

• Çözünmüş bağlayıcı proteinler serbest oligosakkaridleri içselleştirerek endojen metabolizmalrıyla parçalarlar. Bu parçalama mekanizması diğer mikroplara göre B.longum infantim e büyük bir avantaj sağlar. Bu aynı zamanda bebek bağırsağı için de bir avantajdır

• Bu genlerin alt grupları bifido bakterilerdeki diğer SBP aile 1 proteinlerinden farklılık gösterirler (Suzuki R ve ark. Proc Natl Acad Sci 2008). Bu genler insan vücudundaki simbiyotik bir tarzda süt oligosakkaritleriyle etkileşime girerler. B longum infantis genomu birçok bifidobakteriden farklı olarak 21 Aile 1 SBP bulundurmaktadır

• Bifidobacterin genomik analizleri nde HMO ile ilgili kümelerin B longum suşları arasında paylaşıldığını, diğer bifidobaktrilerde, B longum , B longum DJO10A ve zayıfça büyüyen B adolescentis ATCC15703 (GenBank AP009256) de bulunmadığı saptanmıştır (LoCasico RG ve ark. Microb Biotechnol 2009)

• Mikrobiyal genetik çalışmalar HMO ile ilişkili gen kümelerinin ATCC15697 ve DJO10A arasında paylaşıldığını göstermektedir.

• Bu yedi genden oluşan operon (tek promotor'un kontrolu altında bulunan ve çok sayıda genin ifadesini düzenleyen bir sistemdir. Operonda yer alan genler tipik olarak ortak bir metabolik yolda fonksiyon görürler) LNB metabolizmasında metabolik substrat kullanımını sağlar (Mattarelli P ve ark. J Syst Evol Microbiol 2008)

• HMO da zayıfça büyüyen ve glikoprofili küçük miktarda LNnT kullanan DJO10A nın bu operon vasıtasıyla HMO nıuun bir kısmını kullanmaktadır.

• Bifidobakterilerle ilgili taksonomik karmaşa ve suşlarının heterojenliği nedeniyle HMO katabolizmasının açığa çıkartılması, bazı önemli bulgular saptanmışsa da çok zor olacaktır (Falk P e ark. Proc Natl Acad Sci 1993). En yaygın bebek kaynaklı bifidobakteriler olan B. bi fi dum, B. longum subsp. infantis, B. longum subsp. longum ve B. Breve nin her birisinin HMO tüketimi farklıdır.

• B. longum subsp. İnfantis ABC nakledicileri vasıtasıyla düşük molekül ağırlıklı oligosakkaritleri hücre içerisine alarak yapısındaki monosakkaritler normal metabolizma yoluna girmeden onları glukosidazlarala katabolize ederler.

• B. Bifidum hücre dışına fucosidazları ve lact-N-biosidazları salarak HMO yapısındaki LNB nin ayrılmasını sağlar ( fucose ve sialik asit serbest kalır) (Ward RE ve ark. Mol Nutr Food Res 2007). Serbest kalan LNB yi hücre içerisine alarak katabolize eder.

• Hem B. breve hem de B. longum subsp mevcut HMO havuzundan LNnTleri kullanırlar. B breve aynı zamanda HMO lardaki çeşitli monomerbirleşiklerini tüketerek büyürler (Ward RE ve ark. Mol Nutr Food Res 2007)

• Bebek gastrointestinal sisteminde, mikrobiota içerisindeki farklı bifidobakterilerin farklı stratejileri olduğu görülmektedir. Glikan yapılarının mekanizmasını anlamada bunların tümünün bir arada düşünülmesi gerekmektedir.

Prebiyotikler ve Bebek Bağırsak Bifidobakterileri

• Anne sütü alan bebeklerde, gelişen bağırsaklarda kolonize olan bifidobakterilerin faydalı suşlarının yararlı etkileri ile patolojik bakterilerin aktiviteleri engellenmiş olur (Du XL ve ark. Proc Natl Acad Sci 2000).

• Böylece glikanların varlığı desteklenmiş olur. Henry Tissier anne sütüyle beslenen bebeklerin dışkılarında, kültür tekniği ve mikroskobik inclemeyle yaygın olarak izlediği bakterilere "Bacillus bi fidus communis" adını vermiştir (Tissier H , Naud 1900).

• 100 yıl kadar metodolojik ve teknik yetersilikler nedeniyle fazla bir gelişme kaydedilememiştir. Ancak arıtk bifidobakterilerin oksijen hassasiyetleri de dahil olmak üzere pek çok detay anlaşılmaya başlamıştır (Sakata S ve ark. Microbiol Letter 2005, Roger LC, McCartney AL. Microbiology 2010, Harmen HJ ve ark. J Pediatr Gastroenterol Nutr 2000 ).

• Günümüzde teknolojik gelişmelere paralel olarak 16s rDNA primerleri, metagenomik teknikler kullanılıp DNA sekanslaması yapılarak, kültüre ve çift kat hücre duvar bütünlüğünü korumaya gerek kalmaksızın bifidobakterilerle ve bebeğin bağırsak mikrobiotasıyla ilgili çok detaylı analizler yapılabilmektedir.

• Mevcut çalışmalar göstermektedirki anne sütü alan bebeklerin bağırsak mikrobiotası, yetişkin mikrobiotasına geçmeden önce büyük oranda bifidobakterilerden ve suşlarından oluşmaktadır. Bunlar ağırlıklı olarak Bifi dobacterium longum, B. Breve, B. bifi dum, B. pseudocatenulatum ve B. catenulatum dur ( Gyorgy P ve ark. Arch Biochem Biophys 1954)

• Gorgy ve arkadaşları ( Gyorgy P ve ark. Arch Biochem Biophys 1954), anne sütünün kendisinin mkrobiotayı etkilediğini göstermiştir. Gözlemlerinde B bifidum un (daha sonra Lactobacillus bifidum adını almıştır) insan sütü fraksiyonlarında büyümelerini sürdürdüklerini gösterdiler. Burada etkili olan faktörü açıklayamadılar ama bifidus faktörü adını verdiler

• Daha sonraki çalışmalar gerçekten insan sütünde bulunan bu faktörün, insanın kendisi tarafından sindirilerek, sindirilebilir monomerler haline getirilemediğini ve bağırsaklara kadar geldiğini gösterdi ( Coppa G ve ark. Springer. Huan Milk 2001, Chaturvedi P ve ark. Human Milk, Springer 2001, Engfer MB ve ark. Am J Clin Nutr 2000)

• İn vitro , seçici olarak insan sütü oligosakkritlerini kullanarak büyümesini sürdüren bifidobakteri suşlarını ilk Ward ve ark. Göstermiştir (Ward RE ve ark. Appl Environ Microbiol 2006, Ward RE ve ark. Mol Nutr Food Res 2007). Daha sonraki detaylı çalışmalar sadece bazı bifidobakteri suşlarının sterospesifik olarak insan sütü oligosakkaritlerini tüketebildiğini teyid etmiştir ( Smilowitz JT ve ark.J Nutr 2013, LoCascio RG ve ark. J Agric Food Chem 2007,Turroni F ve ark. Proc Natl Acad Sci 2010).

• Elde edilen sonuçlar özel suşlar olan B.infantis ve B. Breve nin, tercihen fucosile ve sialize insan sütü oligosakkaridlerini tükettiğini göstermektedir. Yani özel glikan yapılarıyla büyüyebilen bifidobakteri suşları bebeğin bağırsaklarında insan sütüyle büyümelerini sürdürebilmeleri için genetik adaptasyona uğramaktadır (Sela D ve ark. Proc Natl Acad Sci 2008, Ruiz-Moyano S ve ark. ApplEnviron Microbiol 2013)

• İnsan sütü oligosakkaritleri ve bifidobacteriler arasındaki etkileşim, insanların aldığı gıda ile genetik olarak bunu metabolik yollarıyla kullanma ve büyümeleri için faydalanmalarının haritasını çıkartmada eşsiz bir örnektir. İnsan sütü oligoskakkaritlerine özgül olarak bağlanan, enerji temini için katabolize eden bifidobakteri suşları ve onların enzimatik aktiviteleri ortaya çıkartılmıştır (LoCascio RG e ark. J Agric Food Chem 2007, Marcobal A ve ark. Cell Host Microbe 2011, Garrido D ve ark. Mol Cell Proteomics 2012, Garrido D ve ark. Food Microbiol 2013, Garrido D ve ark. Anaerobe 2013, Zivkovic AM ve ark. Funct Food Rev 2013).

• HMO ları kullanan Bifidobakterilerdeki bu farklı genler ve farklı katabolizma yolları da gösterilmiştir

• B. infantis te bulunan 43 kb gen kümesi (HMO kümesi adı verilir) süt oligosakkaritlerini hücre içine alınmasını ve taşınmasını, metabolizmasını sağlamak için glukozil hidrolazı kodlamaktadır.

• Diğer taraftan B bifidum HMO tüketimi için başka katalitik aktivite genlerine de sahiptir. Bu suş fucosidaz ve lacto-N-biosidazı hücre dışına çıkartarak İnsan süt oligosakkaritlerinde bulunan Laco N biozu hidrolize ederek bakteri içine taşınmasını ve metabolizmasını sağlamaktadır (Garrido D ve ark. Microbiology 2013, Garrido D ve ark. PlOS One 2013).

• Bifidobakterilerin insan sütü oligosakkaritlarini metabolize ediş mekanizmaları düşünülenden farklı bulunmuştur.

• Açığa çıkan metabolitler bakteri fenotipinde de değişikliğe yol açmaktadır. • Süt oligosakkaritleri B.infantis de özel bir HMO fenotipi oluşturmaktadır,

mikrobiyal ekosistem içerisinde rekabetçi bir başarı elde etmektedir. • Bakteri bağırsak epiteline daha iyi yapışmakta, epitelden de beslenmekte

ve daha iyi büyümekte, mikrobiyota daha iyi gelişmektedir

(Chicholowski M ve ark. J Pediatr Gastroenterol Nutr 2012)

• Metabolik olarak birbirinden farklı ama kendi besini tarafından indüklenen bakteri topluluğu bir model olarak ister anne sütü ister mama alsın prematüre bebeklerin beslenmesinde B.infantis desteği verilerek kullanılmaktadır.

• Anne sütü alan bebeklerde B.infantis deteği verildiğinde , mama alanalarla karşılaştırıldığında dışkılarında bifidobakteriler artarken γ -Proteobacteria lar azalmaktadır

(Underwood MS ve ark. J Pediatr 2013)

• Bu özgül bakteri grubunun, genlerinde kodlarını taşıdığı HMO yu parçalama yeteneği insan süt üretimi ve commensal bakterilerin ortak evrimini düşündürtmektedir. Buna göre anneler bebeklerine verdikleri sütle onları koruyacak olan bağırsak mikrobiotasını şekillendirmektedir (Zivkovic AM ve ark. Fuct Food Rev 2013, Bode L ve ark. Adv Nutr: Int Rev J 2012).

Metabolomiksin Geleceği

• Beslenme bilimi insan sağlığını geliştirmek gibi zor bir görevle karşı karşıyadır.

• Gerekli besinleri belirlemede çok etkili olan indirgemeci kimya ilkeleri tüm dünyada salgın olan olmayan diyet bağımlı hastalıkların daha karmaşık sorunlarını çözmede başarısızdır

• İndirgemeci kimyasal yöntemler mutlak tüketilmesi gerekli olan besinleri etkili biçimde belirleyebilirken, dünyada epidemik olarak görülen, karmaşık diyetlere bağlı sağlık sorunlarını tanımlayamamaktadır.

• Sorun toplumdaki herkese tek bir molekül verilerek çözülemez. Bir alan olarak beslenme dünyada daha bütünleştirici, ve biyolojiye uygun, miktar olarak yeterli, kişisel ihtiyaçlara cevap verebilen bir stratejiye uygun olarak geliştirilmelidir. Bunun ilk ayağı tüm doğan bebeklere anne sütü verilmesidir.

• Biyolojik araçlar olarak genomik, metabolomik , proteomik ve glikeomik çalışmalar anne sütünün kompleks yapısını ve bebeğin bağırsağındaki bakteri kolonizasyonu ve mikrobiotasını geliştirmedeki katkısını ortaya koymuştur. İnsanın evriminde sağlığın kounmasında önemli bir basamak olduğu ortaya çıkmıştır.

• İnsan, anneleri bebeklerini beslerken aynı zamanda, bilmeden onların bağırsakları içerisindeki bakterileri de beslemektedir. Annenin mikrobiotayı besleme ve geliştirmesi tüm beslenme araştırmalarında göz önünde bulundurulması gereken bir durumdur

• Anne memesi tek ve basit bir molekül değil, karmaşık oligosakkaritlerden ve glikanlardan oluşan tam bir metabolom üretmektedir. Bu metabolom bebek tarafından sindirilmemekte bağırsakta ilerleyerek bağırsak mikrobiyotasına ulaşmaktadır. Karmaşık yapıdaki glikanları, genetik olarak parçalama yeteneğindeki özgül bazı bakteriler parçalayarak onların yapısındaki şekerlere ulaşmaktadır

• Mevcut bir besin olarak glikanların kompleks yapısı , bazı bakterilerin genetik olarak kodlanmış enzimatik kapasiteleri ve mikrobiyotanın beslenmesi bir model olarak devam eden araştırmalarda kullanılmaktadır. Biriken bilgiler bebeğin vücudu içerisindeki değişik mikrobik ekosistemlerin mekanistik yanını ortaya koymaktadır.

Açıkta Kalan Sorular

1- Özel bir mikrobiota nasıl bebeği patojen bakterilerden korumaktadır ve bu sistemin zayıf yanları nelerdir ?

2- Özel bir mikrobiyota immüniteyi nasıl etkilemektedir, patojenik etkileri nasıl önlemektedir, benign değişikliklere nasıl reaksiyon vermektedir ve ne zaman başarısız olmaktadır ?

3- Mikrobiota immün sistemin masif aktivasyonunu nasıl engellemektedir ?

4- Bir bebek doğarak gerçek dünyaya geldiğinde beklenen yaygın inflamasyon nasıl engellenebilmektedir? ve aynı soruların cevabı yetişkinler için nasıl olmaktadır ?

• Nasıl bir etki tüm vücut metabolizmasını etkilemekte ? • Uygun besin alımını sağlamakta ? • Enerji periferik dokulara yönlenmekte ? • Bu mekanizmayla viseral yağlar dokulardan uzaklaştırılarak yerine bebek

yağları konulabilir mi ?

• İnsan sütü oligosakkaritleri ile bebek bağırsak mikrobiotası arasındaki ilişkileri anlamak için yapılan 1. jenerasyon metabolomik arşatırmaları biyolojinin bu yeni alanında oldukça başarılı sonuçlar vermiştir. Ancak daha yürünmesi gereken çok uzun bir yol bulunmaktadır